Departamento de GenéticaDepartamento de Genética

Universidade de São Paulo/ESALQUniversidade de São Paulo/ESALQ

Email: ptlacava@esalq.usp.brEmail: ptlacava@esalq.usp.br

http://www.esalq.usp.brhttp://www.esalq.usp.br

Manipulação de Bactérias Endofíticas Manipulação de Bactérias Endofíticas para o Controle Biológico da para o Controle Biológico da Xylella Xylella fastidiosafastidiosa, Agente Causal da Clorose , Agente Causal da Clorose

Variegada dos CitrosVariegada dos Citros

Paulo Teixeira LacavaPaulo Teixeira Lacava

Clorose Variegada dos Citros Clorose Variegada dos Citros (CVC)(CVC)

Bactéria Xylella fastidiosa

Reduz a produção e

pode causar a

morte das plantas

Coloniza vasos do xilema e

forma biofilme

Brasil perde cerda US$ 200 milhões por ano com a CVC !!!

Estado de São Paulo

Áreas com sintomas de

CVC

Simtomas da CVC

Fruto sadio

FrutoafetadoCVC

Desenvolvimento da Xylella fastidiosa em pomares de citros

Microscopia eletrônica de varredura (MEV), de um corte transversal dos vasos xilemáticos de plantas sintomáticas

Xylella fastidiosa subsp. pauca

Bucephalogonia xanthophis

Acrogonia citrina

Dilobopterus costalimai

Oncometopia facialis

Insetos vetores da X. fastidiosa (CVC)(Homoptera, Cicadellidae, subfamily Cicadellinae)

Petrini (1991): em pelo menos uma fase de seu ciclo de vida colonizam o interior de tecidos vegetais aéreos sem causar danos ao hospedeiro (exclui bactérias fixadoras de N2 e os fungos micorrízicos).

Hallmann et al. (1997): isolados de tecidos vegetais desinfectados superficialmente ou do interior destes e que não causam danos às plantas.

Azevedo et al. (2000): são microrganismos que residem dentro de tecidos de plantas sem causar doenças e sem produzir estruturas externas visíveis.

Microrganismos Microrganismos EndofíticosEndofíticos

Planta hospedeira

Centro de estoque de microrganismos

Microrganismos epifíticos

Microrganismos endofíticos

Endófitos colonizam um nicho ecologicamente semelhante ao dos fitopatógenos

Aplicações dos Microrganismos Endofíticos

Controle biológico de patógenos

Promoção de crescimento

Maior resistência contra estresse

Produção de moléculas bioativas

Interação Endófitos x Interação Endófitos x Xylella Xylella fastidiosafastidiosa Araújo et al. (2001). Diversity of endophytic bacterial

population and their interaction with Xylella fastidiosa in citrus plants. Applied and Environmental Microbiology. 68:4906-4914.

Bactérias endofíticas em folhas de citros

- Pantoea agglomerans

- Bacillus pumilus

Interação Endófitos x Interação Endófitos x Xylella Xylella fastidiosafastidiosa

Araújo et al. (2002). Diversity of endophytic bacterial

population and their interaction with Xylella fastidiosa in citrus plants. Applied and Environmental Microbiology. 68:4906-4914.

Bactérias endofíticas em ramos de citros

- Pantoea agglomerans

- Methylobacterium spp.

- Curtobacterium flaccumfaciens

Incidência de bactérias endofíticas em ramos de C. sinensis.

Araújo et al. 2002

Interação Endófitos x Interação Endófitos x Xylella fastidiosaXylella fastidiosa Lacava et al. (2004). Interaction Between Endophytic Bacteria

from Citrus sinensis and Xylella fastidiosa, Causal Agent of Citrus Variegated Chlorosis. Letters in Applied Microbiology 39, 55–59.

Methylobacterium

Curtobacterium

Interação Endófitos x Interação Endófitos x Xylella fastidiosaXylella fastidiosa Lacava et al. (2004). Interaction Between Endophytic Bacteria

from Citrus sinensis and Xylella fastidiosa, Causal Agent of Citrus Variegated Chlorosis. Letters in Applied Microbiology 39, 55–59.

X. X. fastidiosafastidiosa

X. fastidiosa Methylobacterium Methylobacterium sp.

(endophytic bacterium)(endophytic bacterium)

Methylobacterium sp.

Interação com Xylella fastidiosa, estimula o crescimento sendo isolada principalmente de plantas afetadas pela CVC.

Xylella fastidiosa

Pode interagir com bactérias endofíticas de citros, sendo estimulada ou inibida por estas bactérias.

Curtobacterium flaccumfaciens

Interação com Xylella fastidiosa retardando seu crescimento sendo isolada principalmente de plantas resistentes à CVC.

Interação Endófitos x Interação Endófitos x Xylella fastidiosaXylella fastidiosa

• Os sintomas da CVC podem ser alterados pelas interações entre bactérias endófitos e Xylella fastidiosa;

Interação Endófitos x Interação Endófitos x Xylella fastidiosaXylella fastidiosa

• O balanço populacional entre Methylobacterium, Curtobacterium e Xylella pode influenciar os sintomas da CVC;

• Estes resultados reforçam evidências de que esta seja uma abordagem promissora para o entendimento da CVC.

Interação Endófitos x Interação Endófitos x Xylella fastidiosaXylella fastidiosa

Endófitos podem atuar como agentes no controle biológico

da CVC

Seleção de bactérias endofíticas para controle biológico da CVC;

Desenvolver um sistema modelo para estudar a interação entre bactérias endofíticas e X. fastidiosa;

O controle da CVC depende da localização das bactérias endofíticas no mesmo nicho que X. fastidiosa.

Catharanthus roseus (Madagaskar periwinkle)

Monteiro, P.B., Reunaudin, J., Jagoueix-Eveillard, S., Ayres, A.J., Garnier, M., and Bové, J.M. 2001. Catharanthus roseus, an experimental host plant for the citrus strain of Xylella fastidiosa. Plant Dis. 85: 246–251.

Interaction between C. flaccunfaciens (endophytic bacteria) and X. fastidiosa inside of host plant (C. roseus). Different letters on bars show statistic difference by Tukey’s test at 5% of significance

0

4

8

12

16

PW Csp Xf Xf/Csp

Nu

me

ro d

e F

lore

sN

um

ber

s o

f F

low

ers

A

A

BA

B

PW: media; Csp: C. flaccunfaciens; Xf: X. fastidiosa; Xf/Csp: X. fastidiosa and C. flaccunfaciens

0

6

12

18

PW Csp Xf Xf/Csp

Alt

ura

Hei

gh

t (c

enti

met

ers)

AA

BA

B

PW: media; Csp: C. flaccunfaciens; Xf: X. fastidiosa; Xf/Csp: X. fastidiosa and C. flaccunfaciens

Interaction between C. flaccunfaciens (endophytic bacteria) and X. fastidiosa inside of host plant (C. roseus). Different letters on bars show statistic difference by Tukey’s test at 5% of significance

Um novo conceito de transformação genética chamado paratransgênese tem sido proposto para a prevenção de transmissão de patógenos por inseto vetores (Beard et al., 2001; Rio et al., 2004);

Paratransgênese nesse tipo de aplicação significa a alteração genética de microrganismos simbióticos que possam ser transmitidos via vetor. Esta estratégia de prevenção de doença vêem sendo chamada de controle simbiótico, como uma variação da chamada terapia simbiótica (Ahmed, 2003);

Controle Controle SimbióticoSimbiótico

A chave do controle simbiótico está em achar um microrganismos candidato que co-exista no mesmo nicho ou ecossistema onde reside o problema, isto é, para o agente controlador ter acesso ao patógeno e atuar no seu controle ou eliminação.

1- Identificação de um simbionte

2. Transformação simbionte3. Reintrodução GM simbionte

Paratransgênese: Doença de Chagas

R. prolixus

Rhodococcus rhodnii

GM R. rhodnii

Fonte: slide J.L. Ramirez

Estratégias para controle da CVC utilizando Estratégias para controle da CVC utilizando endófitosendófitos

Curtobacterium inibi in vitro Xf (Lacava et al, 2004)

Testado em planta modelo (Lacava et al, 2007)

Próximos passos: testar em campo e em plantas

de citros

Controle Biológico Clássico

Controle Simbiótico

Curtobacterium

(bactéria endofítica de citros)

Methylobacterium

(bactéria endofítica de citros)

Methylobacterium coloniza tecido de planta e inseto

vetor (Andreote et al, 2006 and Gai, 2006)

Transformação de Methylobacterium (GFP)

Próximos passos: produção de anti-Xylella

efeitos

• Prof. Dr. João Lúcio de Azevedo, Departamento de Genética Universidade de São Paulo/ESALQ;

• Profa. Dra. Aline Ap. Pizzirani-Kleinner, Departamento de Genética Universidade de São Paulo/ESALQ;

• Prof. Dr. Welington L. de Araújo, Departamento de Genética Universidade de São Paulo/ESALQ;

• Profa. Dra. Sui Mui Tsai, Centro de Energia Nuclear na Agricultura, CENA/USP;

• Dr. Jonh S. Hartung, USDA-BARC, Beltsville, MD, USA

• Prof. Dr. Thomas A. Miller, University of California Riverside, Riverside, CA, USA

• Prof. Dr. João Roberto Spotti Lopes, Universidade de São Paulo/ESALQ

• Dr Cláudia Santos Gai, INRA/CNRS, Castante – Tolosan, France

Agradecimentos

OBRIGADO !!!OBRIGADO !!!E-mail:ptlacava@esalq.usp.brE-mail:ptlacava@esalq.usp.br