Desenvolvimento de

Medicamentos Oncológicos

Aspectos Gerais dos Estudos Não-Clínicos in

vitro e in vivo de Eficiência e Segurança

Programação

• Introdução

• Modelos in vitro

• Modelos in vivo

Introdução

Desenvolvimento de Medicamentos Oncológicos - Aspectos

Gerais dos Estudos Não-Clínicos in vitro e in vivo de Eficiência

e Segurança

O que é o Câncer?

www.inca.gov.br

+ de 100 tipos diferentes de doenças com características comuns de crescimento desordenado de

células, invasão de tecidos e órgãos adjacentes, podendo ou não atingir outras regiões do corpo.

Tumor

(Hiperplasia)

Tumor Invasivo

(Câncer)

Homeostase

Célula

Normal

Diferenciação

Melino, Nature 412: 23, 2001.

Célula

Normal

Célula com acúmulo de erros

Mitoses sucessivas

Ativação de

Processos de

Morte Celular

Programada

Anoikes;

Apoptose

intrínseca ou

extrínseca;

Autofagia;

Catástrofe mitótica;

Necroptose;

Entre outras.

Homeostase

Melino, Nature 412: 23, 2001; Kroemer et al., Cell Death and Differentiation 16: 3-11, 2009; Galluzzi et al., Cell Death and Differentiation 19: 107-120, 2012.

Mehta et al. Pharm Res 27: 950–961, 2010; Barcellos-Hoff et al. Nature Reviews Cancer 13: 511–518, 2013; Kotecha et al., Oncotarget 7 (32): 52517–52529, 2016.

Carcinogênese

Tecido

normal

Iniciação

Construção

Promoção

Expansão

Progressão

Maturação

Câncer e o

microambiente

tumoral Carcinógenos;

Predisposição

genética

Hanahan & Weinberg. Cell 144, 646, 2011.

Principais

Características

(“Hallmarks”)

do Câncer

Proliferação

autossustentada

Evasão dos supressores

de crescimento

Evitar destruição pelo

sistema imune

Imortalidade replicativa

Microambiente

inflamatório

Mecanismos de invasão

e metástase Indução de angiogênese

Instabilidade genômica

e mutações

Resistência à morte

celular

Desregulação do

metabolismo celular

Hartung, T.; Daston, G. Toxicological Sciences 111(2): 233–237, 2009.

Como avaliar o potencial antitumoral de uma

substância?

Fase Pré-clínica

Modelos in vitro

Reações químicas,

Cultura de células e microrganimos;

Modelos in vivo

Fase Clínica

Fases I, II, III e IV

Fases

Métodos in vitro

Desenvolvimento de Medicamentos Oncológicos - Aspectos

Gerais dos Estudos Não-Clínicos in vitro e in vivo de Eficiência

e Segurança

Amostra

+

Reagente Condições de

Reação

(tempo,

Temperatura,

agitação)

Análise do Resultado:

* UV/Vis;

* fluorescência;

* luminescência.

Avaliação de (principalmente):

atividade antioxidante (Apak et al., J. Agric. Food Chem. 2016, 64: 997−1027, 1028−1045 e

1046−1070.)

ação sobre enzimas (Bisswanger, Perspectives in Science 2014, 1: 41–55.)

Métodos in vitro - Reações Químicas

DPPH NN

NO2

NO2O2N

a) Amostra

b) Amostra + Reagente

1. Desenvolvimento

da CCD

2. Nebulização com

Revelador

Métodos associados a Cromatografia:

Exemplo – Teste de DPPH

Métodos in vitro - Reações Químicas

Vantagens:

* Simplicidade e robustez ;

* Baixo custo relativo;

* Reprodutibilidade;

* Permite automação do processo.

Limitações:

* Limite de detecção;

* Substâncias interferentes;

* O reagente é biologicamente relevante?;

* Sistema homogêneo;

* Lipofilicidade/Hidrofilicidade.

Prior et al, Journal of Agricultural and Food Chemistry 53: 4290-4302, 2005.

Reações Químicas

Células primárias e finitas;

Células imortalizadas;

Alteração espontânea

Alteração induzida: Agentes químicos ou biológicos (vírus).

Células tumorais.

UACC 62 (melanoma)

VERO

(célula epitelial - rim)

Freshney, R. I. Culture of animal cells : a manual of basic technique and specialized applications. 6th ed., Hoboken, New Jersey: John Wiley & Sons (2010).

Métodos in vitro - Cultura de Células

Congelamento

Descongelamento

Experimento

Cultivo

Métodos in vitro - Cultura de Células

Freshney, R. I. Culture of animal cells : a manual of basic technique and specialized applications. 6th ed., Hoboken, New Jersey: John Wiley & Sons (2010).

Etapas:

1. Escolha da Linhagem Celular

2. Tempo de Exposição

Realização da Curva de Crescimento Celular

Determinar qual a densidade de inoculação necessária para que

durante o experimento as células estejam em fase de

crescimento adequada.

Métodos in vitro - Cultura de Células

Freshney, R. I. Culture of animal cells : a manual of basic technique and specialized applications. 6th ed., Hoboken, New Jersey: John Wiley & Sons (2010).

Curva de Crescimento

HT29 (cólon)

Densidades:

1 x 103 cel/compartimento

2 x 103 cel/compartimento

3 x 103 cel/compartimento

4 x 103 cel/compartimento

5 x 103 cel/compartimento

Métodos in vitro - Cultura de Células

Etapas:

1. Escolha da Linhagem Celular

2. Tempo de Exposição

3. Preparo prévio das células e do material

Expandir a linhagem para preparação do inóculo;

Cultura de células: preparo das placas com as células 24h antes da aplicação das

amostras.

Métodos in vitro - Cultura de Células

1. Escolha da Linhagem Celular

2. Tempo de Exposição

3. Preparo prévio das células e do material

4. Diluição da amostra

Uso de agente dispersor:

DMSO, Etanol, misturas de solventes.

Métodos in vitro - Cultura de Células

Etapas:

Les

Lab

ora

toir

es S

ervie

r

1. Escolha da Linhagem Celular

2. Tempo de Exposição

3. Preparo prévio das células e do material

4. Diluição e Inter valo de concentração da amostra

Uso de agente dispersor :

DMSO, Etanol , misturas de solventes.

Cuidado com a escolha da faixa de concentração.

Produção de artefatos (p. ex.: H2O2);

Pressão Osmótica.

Métodos in vitro - Cultura de Células

Etapas:

Cuidado com escolha das concentrações!

Á c i d o Ro s ma r í n i co

C o n c . = 1 mM ≈ 3 6 0 µ g / m L

3 7°C , 5 % C O 2

Long et al. Archives of Biochemistry and Biophysics 501: 162-169, 2010.

Métodos in vitro - Cultura de Células

1. Escolha da Linhagem Celular

2. Tempo de Exposição

3. Preparo prévio das células e do material

4. Diluição e Inter valo de concentração da amostra

5. Desenho Experimental :

Les

Lab

ora

toir

es S

ervie

r

Métodos in vitro - Cultura de Células

Etapas:

Material de

Estudo

Células

Intactas

Meio de

cultura

Técnica Microscopia

Citometria de Fluxo

Outras Técnicas

(Espectrofotometria, LC, CG, EM, Eletroforese, PCR)

Galluzzi et al., Cell Death and Differentiation 16: 1093-1107, 2009.

Células

Lisadas

Métodos in vitro - Cultura de Células

Células

Intactas

Viabilidade Celular

Les

Lab

ora

toir

es S

ervie

r

Controle de células sem tratamento, ao

final do tempo de exposição (T1)

Células com diferentes tratamentos (A)

Métodos in vitro - Cultura de Células

100% ─ T1

X% ─ A

X (%) = viabilidade celular

Resultado

Células

Intactas

10-1

100

101

0

25

50

75

100

IC50

Via

bili

da

de

Ce

lula

r (%

)

Concentração (g/mL)

MCF-7

HaCat

Doxorrubicina

MCF-7: IC50 = 0,17 µg/mL HaCaT: IC50 = 0,077 µg/mL

Métodos in vitro - Cultura de Células

Proliferação celular (protocolo NCI60)

Les

Lab

ora

toir

es S

ervie

r

Controle de células sem tratamento ao

final do tempo de exposição (T1)

Células com diferentes tratamentos (A)

Les

Lab

ora

toir

es S

ervie

r

Placa T1 Placa T0

Controle de células sem

tratamento no início do tempo de

exposição (T0)

Células

Intactas Métodos in vitro - Cultura de Células

Se T0 ≤ A

X (%) = proliferação celular

100% ─ (T1-T0)

X% ─ (A-T0)

Se T0 > A

X (%) = proliferação celular

100% ─ (T0)

X% ─ (A-T0)

Resultado

10-1

100

101

-100

-75

-50

-25

0

25

50

75

100

TGI

LC50

Concentração (g/mL)

Pro

life

raçã

o C

elu

lar

(%)

MCF-7

HaCat

GI50

Doxorrubicina

MCF-7:

GI50 = 0,055 µg/mL

TGI = 2,38 µg/mL

LC50 = > 25 µg/mL

HaCaT:

GI50 = 0,035 µg/mL

TGI = 0,88 µg/mL

LC50 = 25 µg/mL

Células

Intactas Métodos in vitro - Cultura de Células

Métodos de Detecção

Método Não-Clonogênico:

Avaliação de parâmetros celulares para inferir indiretamente a viabilidade ou a

proliferação celular.

Corantes de exclusão (integridade da membrana celular);

Corantes que avaliam a atividade enzimática celular;

Quantificação de proteínas totais;

Quantificação de ATP;

Corantes de DNA.

Células

Intactas Métodos in vitro - Cultura de Células

Método Não-Clonogênico:

Vantagens:

Facilidade operacional (“adicionar, misturar, medir”);

Aplicação em formato multicompartimentos (placas de 96 ou 384 compartimentos);

Possibilidade de automatização do processo (protocolos para triagem de alto

rendimento, high-throughtput screening – HTS).

Limitações:

Limite de detecção;

Presença de interferentes e reações secundárias (variam de acordo com o método

escolhido).

Métodos de Detecção

Células

Intactas Métodos in vitro - Cultura de Células

Métodos in vitro - Cultura de Células

Stokes, et al. Current Protocols in Toxicology 36: 20.4.1-20.4.20, 2008; OECD. Series on Testing and Assessment no. 129. Guidance document on using cytotoxicity tests to estimate

starting doses for acute oral systemic toxicity tests, 2010.

Les

Lab

ora

toir

es S

ervie

r

Concentração

(g/mL ou menor)

Dose

(mg/Kg ou menor)

Métodos in vitro - Cultura de Células

Stokes, et al. Current Protocols in Toxicology 36: 20.4.1-20.4.20, 2008; OECD. Series on Testing and Assessment no. 129. Guidance document on using cytotoxicity tests to estimate

starting doses for acute oral systemic toxicity tests, 2010.

Como transpor o resultado, em concentração (m/v), do teste in vitro para as doses (m/m) do teste in vivo?

Les

Lab

ora

toir

es S

ervie

r

Concentração

(g/mL ou menor)

Dose

(mg/Kg ou menor)

Estimativa de potencial dose letal (DL50) por via oral através do valor de IC50 (teste de viabilidade

celular) para a amostra na linhagem 3T3 (fibroblasto embrionário de camundongo):

log LD50 (mmol/kg) = 0.439 log IC50 (mM) + 0.621 para IC50 em mM;

OU

log LD50 (mg/kg) = 0.372 log IC50 (μg/ml) + 2.024 para IC50 em μg/ml;

Vantagens

Protocolos básicos são amplamente conhecidos, permitem o entendimento do mecanismo de

diferentes efeitos e existem modelos celulares para quase todos os tecidos;

Necessitam de pequena quantidade de amostra;

Alto número de replicatas e possibilidade de automatização;

Novas tecnologia: captura de imagens e “omicas”;

Poucos problemas éticos:

Células primarias (humanas ou não): é necessário autorização de Comitê de Ética;

Células tronco embrionárias.

Métodos in vitro - Cultura de Células

Venkataramanan et al., Life Sciences 78: 2105, 2006; Hartung & Daston. Toxicological Sciences 111: 233, 2009; Agarwal et al., Current Opinion in Biotechnology 25: 39–44, 2014.

Limitações

Condições artificiais de cultivo:

Crescimento em monocamadas ou em suspensão;

Condições de cultura não homeostáticas;

Monocultura (uma única linhagem celular);

Ausência de capacidade de biotransformação;

Maioria das linhagens celulares tem origem em tecidos tumorais;

Autenticidade das linhagens celulares.

Métodos in vitro - Cultura de Células

Venkataramanan et al., Life Sciences 78: 2105, 2006; Hartung & Daston. Toxicological Sciences 111: 233, 2009; Agarwal et al., Current Opinion in Biotechnology 25: 39–44, 2014.

Métodos in vivo

Desenvolvimento de Medicamentos Oncológicos - Aspectos

Gerais dos Estudos Não-Clínicos in vitro e in vivo de Eficiência

e Segurança