Dra. Márcia MelhemSeção de Micologia Instituto Adolfo Lutz

Outros testes de sensibilidade a antifúngicos

Métodos para avaliar a resistência a antifúngicos

Quando avaliar a resistência a antifúngicos

Isolamento de um fungo

Como realizar os testes

Testes

Problemas ainda existentes no método de referência...

Fenômeno trailing ou arraste observado para azóis e 5-fc

Interpretação dos resultados de MIC (g/L)Sensititre YeastOne

Resultado SDD

Comparação de métodos

Indicações do teste de sensibilidade

Espécies

Critérios clínicos para indicação do teste de sensibilidade

Considerações finais

índice

Métodos para avaliar a resistência a antifúngicos

Difusão a partir de discos

Difusão a partir de fitas

Diluição em agar

Diluição em meio líquido

em tubos = macrodiluição

em placas = microdiluição

Infecção ou colonização?

Critérios microbiológicos e clínicos para indicação do teste de sensibilidade a antifúngicos

Quando avaliar a resistência a antifúngicos?

LeveduraFungo Filamentoso (bolor)

Isolamento de um fungo

Microbiota humana transiente ou permanente

(pele, mucosas, TR, TGI, TU)

Microbiota transiente (pele, mucosas, TR)

MICROBIOTA

AGENTEETIOLÓGICO

MEIO AMBIENTE

+ MEIO AMBIENTE

+ MEIO AMBIENTE

Como realizar os testes?Como realizar os testes?

Manutenção Freezer a -20 -

80°cPlaqueamento

Cultura mista é uma causa

comum de erro!

Colônia pura

Suspensãode células do fungo

Solução-padrão=

106 ufc/mL

Comparação para ajuste de turbidez:

espectrofotômetro ou visual

= INÓCULO

Como realizar os testes? 1.Inóculo

Como realizar os testes? 2. Condições

INÓCULO ANTIFÚNGICO (s)X = Sensibilidade

Meio Líquido (caldo)

Meio Sólido (agar)

CONDIÇÕES PARA O TESTE: temperatura, tempo e meio de cultura

Método de Difusão por Discos

Vantagens

Parâmetros definidos para Candida e FZ (M44P)

Fácil de realizar

Similaridade com antibiograma

Desvantagens

Falta padronização para outras drogas

Resultado somente em 3 categorias que não indicam pequenas alterações ou tendência para ®

Não fornece a concentração inibitória mínima (MIC), apenas correlaciona MIC com diâmetro do halo

... técnicas em agar... técnicas em agar

Método de difusão por fitasMétodo de difusão por fitas

Vantagens:

Resultado em CIM = MIC

Facilidade de execução

Disponível no comércio

Desvantagens:

Produto importado (custo)

Trailling

Leitura subjetiva

Inóculo variável

... técnicas em agar... técnicas em agar

Diluição em ágar

Diversas placas, cada uma contendo agar com diferentes concentrações de um AFGInóculo na superfície (fungos de crescimento lento, dermatófitos, agentes de cromomicose)

Observa-se a inibição do fungo na CIM (Vantagem sobre técnica de disco)

Técnicas em agarTécnicas em agar

fungo

Placa com agar e afg64 32 16 8 4 2 1 0,5

(g/mL)

Variante do teste em placa: Teste Rápido para leveduras frente a FZ

Variante do teste em placa: Teste Rápido para leveduras frente a FZ

Agar com FZ (8g/mL)

Colônias pequenas: sensíveis

Colônias grandes: resistentes

Mas,

requer ainda melhor avaliação com cepas R

Em tubos = macrodiluição ou macrométodo

Em placas de microtitulação = microdiluição ou micrométodo

Em tubos = macrodiluição ou macrométodo

Em placas de microtitulação = microdiluição ou micrométodo

Testes em meio líquido

Método de Referência para leveduras

(Candida spp e Cryptococcus neoformans)

Doc. M27-A, 2002- NCCLS

Método de Referência para Fungos Filamentosos

(Aspergillus, Fusarium, Rhizopus e Scedosporium)

Doc. M38-P, 2002- NCCLS

Série de 10 tubos com várias concentrações do antifúngico + inóculo do fungo

Após 24 a 72 h observa-se os tubos em que houve inibição de crescimento

Entre esses tubos, o que contém a menor concentração corresponde ao MIC

Macrométodo

Micrométodo em placa

MICMIC

INÓCULOS

CONCENTRAÇÕES DECRESCENTES DO ANTIFÚNGICO

Controle de

esterilidade do meio

Controle de crescimento dos inóculos

Inóculos cepas ATCC

Automatização = resultados acurados

Meio RPMI + 2% glicose em tampão MOPS = inerte

Placas de microtitulação, 96 orifícios= economia de reagentes

Placas contendo [FZ] de 0,12 até 64g/mL; [IZ] e[ AB] de 0,015 a 8g/mL= armazenadas e congeladas, prontas para uso

Leitura da inibição: visual ou espectrofotométrica com valor da d.o.impressa em fita = rastreabilidade de resultados

Determinação do MIC:

Para azóis = desprezar crescimento residual devido ao trailing MIC é concentração que inibe 50% do crescimento, em relação ao controle positivo (coluna 12)

Para AMB: concentração que inibe 100% do crescimento

Automatização = resultados acurados

Meio RPMI + 2% glicose em tampão MOPS = inerte

Placas de microtitulação, 96 orifícios= economia de reagentes

Placas contendo [FZ] de 0,12 até 64g/mL; [IZ] e[ AB] de 0,015 a 8g/mL= armazenadas e congeladas, prontas para uso

Leitura da inibição: visual ou espectrofotométrica com valor da d.o.impressa em fita = rastreabilidade de resultados

Determinação do MIC:

Para azóis = desprezar crescimento residual devido ao trailing MIC é concentração que inibe 50% do crescimento, em relação ao controle positivo (coluna 12)

Para AMB: concentração que inibe 100% do crescimento

Micrométodo em placa

Micrométodo em placa

Vantagens: acurácia (procedimento e leitura)

Problemas ainda existentes no método de referência...Problemas ainda existentes no método de referência...

16 µg/ml 8 4 2 1 0.5 0.25 0,12 0,06 C+

CIM

64 µg/ml 32 16 8 4 2 1 0,5 0,25 C+

CIM

AB

100%

de inibição

(NCCLS)

90%

(EUCAST)

AB

100%

de inibição

(NCCLS)

90%

(EUCAST)

Azóis

80%

Inibição

(MACRO)

50% de inibição

(MICRO)

Azóis

80%

Inibição

(MACRO)

50% de inibição

(MICRO)

Fenômeno trailing ou arraste observado para azóis e 5-fc

Fenômeno trailing ou arraste observado para azóis e 5-fc

E ainda...E ainda...

Método tem baixa sensibilidade p/ identificar cepas resistentes à anfotericina B - AMB.

Não é viável para laboratório de análises clínicas (complexidade e custo). Algumas espécies de leveduras não crescem bem nas condições de incubação (T , t, meio de cultura?)

Outros métodos denominados NCCLS-like :

Europa: comitê da ESCMID = EUCAST (modificações na microdiluição: adição de glicose ao meio de cultura, suspensão mais concentrada do fungo, leitura antecipada, agitação das placas, etc...).

Interpretação dos resultados de MIC (g/mL)

AfgS SDD R

FZ < 8 16 - 32 > 64

IZ < 0,25 0,25-0,5 > 1

AMB < 2 - > 2

S = sensível; R = resistente; SDD = sensibilidade dependente da dose:

100 mg/dia= 6-7 ug/mL de soro

FZ 400 mg/dia= 20 ug/mL de soro

800 mg/mL=50-60 ug/mL de soro

NCCLS 2002

Sensititre YeastOne

• Indicador Alamar Blue (oxidação-redução)• 2 cepas/placa x IZ, FZ, 5FC• Película selante. Incubação 35°C/24h – 48h

• Indicador Alamar Blue (oxidação-redução)• 2 cepas/placa x IZ, FZ, 5FC• Película selante. Incubação 35°C/24h – 48h

negativo

inibição parcial ( trailing)

positivo

Crescimento:

Resultado SDD

Concentrações séricas de FCZ

Dose diária de FZ (mg/dia) Concentração sanguínea (g/mL)

100 6

400 20-30

800 40-60

Comparação de métodosComparação de métodos

• 5 cepas ATCC

• Correlação boa: • AMB = 85 %• FZ = 74 %

Maiores erros:

• Apenas 1/17 indicou C.krusei FZ®

• Nenhum indicou C.lusitaniae AMB®

• 5 cepas ATCC

• Correlação boa: • AMB = 85 %• FZ = 74 %

Maiores erros:

• Apenas 1/17 indicou C.krusei FZ®

• Nenhum indicou C.lusitaniae AMB®

E-test (3/17)E-test (3/17)

Microdiluição (14/17)Microdiluição (14/17)

[Ramani & ChatuRverdi JCM 2003;41]

17 laboratórios de Nova York, USA

Pfaller et al., 2003

E-test com azul de metilenoE-test com azul de metileno

MicrodiluiçãoMicrodiluiçãoDifusão por discos Difusão por discos

235 cepas de Candida glabrata

FZ = 91-96% VZ = 93-95%

Pfaller et al., 2002

E-test E-test

726 cepas de Candida sp

Caspofungina = alta correlação, exceção C.lusitaniae

MicrodiluiçãoMicrodiluição

Comparação de métodosComparação de métodos

Chryssanthou, E & Cuenca-Estrella JCM 2002;40

E-testE-test MicrodiluiçãoMicrodiluição

102 cepas Candida spp e Saccharomyces cerevisiae

Correlação E test x NCCLS VZ = 100%

Correlação E test x NCCLS Caspofungina = 89%

Comparação de métodosComparação de métodos

Indicações do teste de sensibilidade

Critério microbiológico: depende da identificação da espécie

Após a identificação da espécie....Após a identificação da espécie....

1. Espécie reconhecidamente, resistente ® aos azóis ou anfotericina B

2. Espécie sensível

Espécies: 3 tipos ®Espécies: 3 tipos ®

® INTRÍNSECA: todos os membros são ®

Ex.: fungos filamentosos e levedura Candida krusei

frente ao fluconazol (FZ)

Há indicação do teste de sensibilidade ao FZ ? não

E para outros azóis? sim

® NATURAL: alguns membros são ®

Ex.: Candida glabrata ao FZ

C.lusitaniae, Aspergillus, Rhizopus à anfot.B (AMB)

Espécies ®Espécies ®

Há indicação do teste de sensibilidade ? sim

® ADQUIRIDA: após exposição à droga, alguns membros, ou todos, tornam-se ®

Ex.: C.glabrata,C.albicans,C.parapsilosis, C.tropicalis e outras espécies

a FZ, itraconazol e cetoconazol

Há indicação do teste de sensibilidade ? sim

Espécies ®Espécies ®

Candida glabrata Candida glabrata

Desenvolve ® de modo muito rápido, poucas horas de exposição ao FZ.

Não se recomenda tratar infecções caudadas por C.glabrata com FZ.

Espécies reconhecidamente, sensíveisEspécies reconhecidamente, sensíveis

Avaliação da sensibilidade in vitro não precisa ser feita de

rotina, para a orientação terapêutica.

A identificação da espécie, em regra, é suficiente para

manter ou re-orientar tratamento.

Critérios clínicos para indicação do teste de sensibilidade

Critérios clínicos para indicação do teste de sensibilidade

Paciente com histria de profilaxia com azól.

Caso de falha terapêutica.

Caso com infecção por espécie com perfil de sensibilidade desconhecido ou pouco estudado.

Considerações finais

1. Testes em agar podem ser úteis para triagem de cepas resistentes, desde que, realizadas dentro de um protocolo rígido, com cepas-padrões e monitorados por um laboratório de referência (método NCCLS ou NCCLS-like).

2. Os métodos de referência não são aplicáveis a todas as espécies de fungos.

3. Não existe um método com boa sensibilidade para identificar cepas AMB ®.

4. A aplicação clínica de testes de sensibilidade a antifúngicos é limitada.