Enzimas (Parte II)Bioquímica para Enfermagem

Prof. Dr. Didier SalmonMSc. Daniel Lima

Cinética Enzimática• Estudo da velocidade da reação e dos fatores que a influenciam• Pode ser medido por:

– Quantidade de produto formado por unidade de tempo– Quantidade de substrato consumido por unidade de tempo

V = -ΔS/Δt = ΔP/Δt

Cinética Enzimática

Cinética Enzimática

2[S][S]

3[S]4[S]5[S]

tempo

[pro

duto

]

[S]Ve

loci

dade

da

reaç

ão

V0 e Vmáx

• V0 sobe linearmente a medida que se aumenta a concentração de substrato, e então começa a se nivelar e se aproximar de um ponto máximo onde a velocidade não aumenta, mesmo em concentrações maiores de substrato.

Velocidade da reação é proporcional a S Substrato satura todas

as moléculas de enzima

V0 e Vmáx

• Após curto tempo - estabilidade dinâmica com relação a [E] e [ES] é alcançado

E + ES E + PK1

K -1

K2

K -2

Hipótese: etapa limitante

Substrato Único

S

Substrato Único• Estado estacionário - [ES] constante

– Ou seja: formação do complexo = sua degradação• V0 é determinado pela quebra de ES formando o produto

– V0 = k2[ES]

• [ES] difícil de determinar. Alternativa! [Et]=[E] + [ES]

• As velocidades de formação e quebra de ES são determinadas pelas etapas governadas pelas constantes k1 (formação) e k-1 + k2 (quebra em reagentes e produtos)– V de Formação de ES = K1 [E] [S]– V de degradação de ES = K –1[ES] + K2 [ES]

Substrato Único• Uma vez que a degradação de ES é igual a sua formação, temos:

– k1 ([Et]-[ES]) [S] = k–1[ES] + k2 [ES], ou seja:– k1[S][Et] - k1[S][ES] = (k–1+ k2) [ES]

– Dessa forma: [ES] = [Et][S] [S] + (k-1 + k2)/k1

• Se V0=k2[ES]– V0 = k2. [Et] [S]

[S] + Km

[Et]=[E] + [ES]

Km

Equação de Michaelis-Menten• Na Vmax, [ES] = [Et], assim:

– Vmax = k2[Et]– Substituindo na equação anterior

V0 = k2. [Et] [S] [S] + Km

temos,

V0 = Vmax [S] [S] + Km

Propriedade Importante• Quando V0 = Vmax, temos: 2

Vmax = Vmax [S] , 2 [S] + Km

Km + [S] = 2 [S],Km = 2 [S] – [S]Km = [S]

• Ou seja, o Km é igual a concentração do substrato quando a velocidade inicial é metade da velocidade máxima

Km = [S]

Km

• Característico de cada enzima.• Reflete a afinidade da enzima pelo seu substrato.

Equação de Lineweaver-Burk

V e [Enzima]

• A velocidade da reação é proporcional à concentração da enzima

• Facilita a determinação da concentração de uma enzima

• Dosagens (transaminases, LDH, amilase, fosfatase alcalina) v0

[E]

Mais de um substrato...• Ex: ATP + d-glicose → ADP + d-glicose-6-fosfato

Mais de um substrato...• Reações em que há 2 substratos envolvem a transferência de átomos ou

grupos funcionais de um substrato para o outro:Sequencial (formação do complexo ternário)

Pingue-pongue ou duplo deslocamento

Inibidores• A atividade das enzimas pode ser diminuída ou parada por várias

substâncias chamadas de inibidores.

• Existem inibidores naturais, fazendo parte dos constituintes da célula, e outros estranhos ao organismo que podem provocar alterações do metabolismo celular.

• Aqueles encontrados nas células são fundamentais para a fisiologia pois

permitem às células um controle preciso da velocidade de algumas reações chave, permitindo uma resposta integrada à mudança das condições fisiológicas.

• Inhibição específica de certas enzimas permita as aplicações farmacológicas – Ex: sulfonamidas: usadas para combater as infecções bacterianas

Sulfonamidas• Inibidores competitivos da diidropteroato sintetase (dhps), enzima

importante envolvida no metabolismo dos folatos (síntese de DNA e RNA) de muitos organismos menos o homem.

• Os folatos nos serem humanos são fornecidos pela dieta.

• Toxicidade seletiva para bactérias.

• Utilizados para tratar:– Pneumonia a pneumocystis (Pneumocystis jirovici, P. carinii) IO em pacientes HIV + – Infecção do trato urinário– Shigelose (Desinteria)– Algumas infecções por protozoários (Plasmodium falciparum)

Inibidores• Largo campo de aplicação para o combate de insetos

• Ex: enzimas digestivas de insetos como as α-amilases catalisam a hidrólise de ligações glicosídicas α-1,4 do amido, glicogênio e outros carboidratos. Essas enzimas são muito importantes para os insetos, especialmente para aqueles que se desenvolvem em grãos ricos em amido. (No feijão foram identificados 4 desses inibidores)

• Desenvolvimento de plantas mais resistentes ao ataque das pragas contribuindo para a redução do uso de inseticidas químicos.

Inibidores• Importância:

– Agentes farmacêuticos– Ferramentas no estudo de mecanismo de funcionamento das enzimas– Ferramenta nos estudos das vias metabólicas

Inibidores

Reversíveis

Irreversíveis Inib. Competitiva (freqüente)

Inib. Acompetitiva (quando o inibidor liga-se ao complexo ES , mas não a enzima livre)

Inib. Mista

Inib. Não-competitiva (caso particular de inib. Mista)

Inibidor Irreversível• 1-Reagentes específicos para grupo (R) • 2- Análogos de substrato • 3- Inibidor suicida

1

2

Inibidores Reversíveis

Semelhança estrutural entre S e I

Não há semelhança estrutural entre S e I

Não há semelhança estrutural entre S e I

• Inibidor competitivo – Estrutura

semelhante à do substrato

– Liga-se ao Sítio Ativo da enzima

– Aumento da [substrato] diminui a inibição

– A Vmax NÃO se altera

– Km da enzima AUMENTA na presença do inibidor

• Inibidor não competitivo – Não tem estrutura

semelhante à do substrato

– Não se liga ao Sítio Ativo da enzima

– Aumento da [substrato] não diminui a inibição

– A Vmax diminui na presença do inibidor altera

– Km da enzima não se altera

Inibição CompetitivaSubstrato (mM) V0 (sem inibidor)

mmol.L-1.min-1 V0 (com inibidor)

mmol.L-1.min-1 0.2 5 3 0.4 7.5 5 0.8 10.0 7.5 1.0 10.7 8.3 2.0 12.5 10.7 4.0 13.6 12.5 6.0 13.5 13.5

0 1 2 3 4 5 6 70

5

10

15

Sem inibidor

Com inibidor

Substrato (mM)

V 0(m

ol.L

-1.m

in-1

)

Inibição Competitiva Inibição Não-Competitiva

Inibição Incompetitiva• O inibidor se liga somente no complexo ES, em sítio próprio

Analgésicos – Inibidores de Prostaglandinas

• Ligação covalente– Inibidor irreversível (suicida) - Aspirina

• Interações sem ligação covalente – Inibidor competitivo e reversível – Ponstan

Regulação de perfusão renalAgregação plaquetáriaProtetora de mucosa gástrica

Inflamação

Sítio Ativo da COX

Inibidor competitivo e reversível da COX-1/2 Interação iônica

Dipirona sódica

Inibidor competitivo e reversível da COX-2

Meloxicam

Inibidores de Proteases do HIV• Gag e Pol são clivados pela protease do HIV em 9 pontos específicos para

produzir proteínas funcionais. – O precursor Gag vai originar proteínas estruturais– O precursor Pol vai originar enzimas como transcriptase reversa,

integrase e proteases.

Amprenavir

Ciclo de replicação do HIV

Sistema multienzimático sequencial

Enzimas Alostéricas

Enzimas Alostéricas• Analogia com proteínas alostéricas: Hemoglobina• Moduladores alostéricos (≠ de inibidores não-competitivos ou mistos!!)• Mudanças conformacionais entre forma ativa e inativa e parâmetros

cinéticos diferentes (≠ do Michaelis-Menten)

• Homotrópicas ou heterotrópicas

Enzimas Alostéricas• Reguladas por moduladores

alostéricos → envolvendo ou não o sítio ativo

• Várias subunidades • Inibição por retroalimentação

• Exemplo: Aspartato transcarbamilase• 12 cadeias polipeptídicas

• Azul: catalítica• Vermelho/Amarela:

regulatórias

Aspartato TranscarbamilaseSíntese de pirimidinas

Modulador Alostérico• Pode ser tanto um inibidor quanto um ativador.

Michaelis-Menten

Enzimas AlostéricasEnzima Homotrópica

Efeito moduladores

Efeito moduladores

Exemplos de Enzimas RegulatóriasPFK-1

Modificação Covalente Reversível

Exemplos de Enzimas RegulatóriasGlicogênio Fosforilase

Ativação Proteolítica

Fatores que afetam a Velocidade Enzimática

pH

Temperatura

Concentração de substratos

Concentração de cofatores

Presença de Inibidores e/ou ativadores

Modificações químicas: fosforilações, adenilações, etc

Concentração de enzima