Post on 23-Jun-2015
Vitrificação e Reprodução Vitrificação e Reprodução Assistida: Assistida: uma revolução ?uma revolução ?Vitrificação e Reprodução Vitrificação e Reprodução Assistida: Assistida: uma revolução ?uma revolução ?
Carlos Gilberto Almodin Carlos Gilberto Almodin
• Sobrevida embriões camundongo -Sobrevida embriões camundongo - Whittinghan Whittinghan
19721972• Congelamento embrião humano - Congelamento embrião humano - lentolento Trouson & Mohr 1983 embriões Trouson & Mohr 1983 embriões 4/8 cels4/8 cels
Congelamento Histórico
Estágio de transferência
Sobrevida/descongelament
o (%)
Gravidez clínica/transferência
(%)
Implantação/no. transferidos
(%)
Embriões pró-núcleo
1101/1441 (76,4) 99/235 (42,1) 170/997 (17,10)
Embriões divididos
1646/2093 (78,6) 153 /409 (37,4) 231/1516 (15,2)
Blastocistos 196/254 (77,2) 52/81 (64,2) 67/174 (38,5)
Resultados de 1995 – 2002 Veeck LL RBMOnLine 6:367-74
Congelamento lento – embriões humanosHistórico
Criopreservação de oócitosHistórico- Importância
• Casos de comprometimento da reserva ovariana – tratamento para doenças malignas, falha ovariana prematura
• Problemas éticos relacionados à criopreservação de embriões em FIV-ET
• Síndrome de hiperestimulação ovariana
• Banco de oócitos - doação
• Aumento no sucesso dos resultados de FIV-ET – nova tentativa
Criopreservação de oócitos:Criopreservação de oócitos:Histórico - DificuldadesHistórico - DificuldadesCriopreservação de oócitos:Criopreservação de oócitos:Histórico - DificuldadesHistórico - Dificuldades
OócitosOócitos
• Características membrana plasmáticaCaracterísticas membrana plasmática
• Presença de grânulos corticaisPresença de grânulos corticais
• Fusos na metáfase IIFusos na metáfase IIChen et al.,2003Chen et al.,2003
VitrificaçãoVitrificaçãoHistórico - DificuldadesHistórico - DificuldadesVitrificaçãoVitrificaçãoHistórico - DificuldadesHistórico - Dificuldades
Criopreservação de OócitosCriopreservação de Oócitos
• Baixo coeficiente de permeabilidadeBaixo coeficiente de permeabilidade
• Alta concentração de lipídeos Alta concentração de lipídeos cristais gelocristais gelo
• Alta sensibilidade ao congelamentoAlta sensibilidade ao congelamentoParks & Ruffing, 1992Parks & Ruffing, 1992
VitrificaçãoVitrificaçãoHistórico - DificuldadesHistórico - DificuldadesVitrificaçãoVitrificaçãoHistórico - DificuldadesHistórico - Dificuldades
Oócitos - EmbriõesOócitos - Embriões
• Menor superfície/volume dificulta desidrataçãoMenor superfície/volume dificulta desidrataçãoFabbri et al.,2000Fabbri et al.,2000
• Fecundação - Fecundação - Ca livre citoplasma - PermeávelCa livre citoplasma - PermeávelGook et al., 1993Gook et al., 1993
• Melhor transito crioprotetor e água Melhor transito crioprotetor e água
• Diminuição da formação cristais de geloDiminuição da formação cristais de geloGook et al., 1993Gook et al., 1993
VitrificaçãoVitrificaçãoHistórico - DificuldadesHistórico - DificuldadesVitrificaçãoVitrificaçãoHistórico - DificuldadesHistórico - Dificuldades
Oócitos – Metáfase IIOócitos – Metáfase II
• Fusos – microtúbulos – dímeros tubulina alfa e Fusos – microtúbulos – dímeros tubulina alfa e betabeta
Zhou et al., 2002Zhou et al., 2002
• Cromossomos aos pares em forma de barrilCromossomos aos pares em forma de barrilMaro et al., 1986Maro et al., 1986
• Crioprotetor – alteração dos fusos - Crioprotetor – alteração dos fusos - viabilidadeviabilidade
Chen et al., 2000Chen et al., 2000
• Vesicula germinal – menor condutividade Vesicula germinal – menor condutividade hídricahídrica
Agca et al., 1997Agca et al., 1997
VitrificaçãoVitrificaçãoHistórico - NecessidadeHistórico - NecessidadeVitrificaçãoVitrificaçãoHistórico - NecessidadeHistórico - Necessidade
Criopreservação de oócitos Criopreservação de oócitos
• Grande velocidade de resfriamento e Grande velocidade de resfriamento e reaquecimentoreaquecimento
• Reduzido tempo de exposiçãoReduzido tempo de exposição
• Pequeno volume de crioprotetorPequeno volume de crioprotetor
VitrificaçãoVitrificaçãoSucessoSucessoVitrificaçãoVitrificaçãoSucessoSucesso
• Capacidade de permeação CP• Concentração dos CPs• Tempo de exposição aos CPs• Volume da solução
• Impede formação cristais de gelo• Não provoca lesão osmótica ou toxica
Rall & Fahy, 1985
Vitrificação - Vitrificação - DefiniçãoDefiniçãoVitrificação - Vitrificação - DefiniçãoDefinição
““Vitrificação é a solidificação de uma solução em Vitrificação é a solidificação de uma solução em baixa temperatura sem a formação de cristais de baixa temperatura sem a formação de cristais de
gelo”gelo”Vatja G, 2000Vatja G, 2000
VitrificaçãoVitrificaçãoDefinição – Como ocorre Definição – Como ocorre VitrificaçãoVitrificaçãoDefinição – Como ocorre Definição – Como ocorre
O fenômeno é obtido com o aumentoextremo da viscosidade, associando
grande velocidade de resfriamento e o uso de soluções crioprotetoras que impeçam a
formação de cristais de gelo.
Congelamento VitrificaçãoLento
Cristais de gelo ++++ / ++ -Resfriamento ++++ - / +Toxicidade ++ ++++Efeitos osmóticos ++ ++++Problemas Mecânicos +++ +
Equipamento ++++ - / ++Habilidade ++ ++Velocidade ++ ++++
Contaminação + + / ++++
Avanço da criopreservação nos últimos 30 anos
`70`70 ‘80 ‘90 ‘80 ‘90 ‘00 ‘00
Potencial
lentolento
Décadas
vitvit
Porque algumas pessoas preferem congelamento lento
1. Educação conservadora
2. Congelamento lento leva a bons resultados com criopreservação de embriões
3. Congelamento lento traz resultados satisfatórios na criopreservação de oócitos
3. Vitrificação não tem uma única técnica padronizada
4. Empresas não estão interessadas
•Primeiro trabalho por Rall e Fahy (1985)Primeiro trabalho por Rall e Fahy (1985)• Procedimentos simples e eficientesProcedimentos simples e eficientes• Alta (CPAs) permeação celularAlta (CPAs) permeação celular• - Solidificação sem formação de gelo- Solidificação sem formação de gelo• Sólido contém distribuição iônica normal de estado Sólido contém distribuição iônica normal de estado líquido líquido • - viscoso, super-resfriamento líquido “glass-like”- viscoso, super-resfriamento líquido “glass-like”• Nenhum equipamento $ especial é requeridoNenhum equipamento $ especial é requerido• Todo o custo é baixoTodo o custo é baixo
Vitrificação - Congelamento rápido/ultra-rápidoVitrificação - Congelamento rápido/ultra-rápido
•Vitrificaçaõ: Embriões Vitrificaçaõ: Embriões HumanosHumanos
Autor Ano CPAs/ equipamento Estágio Resultados
Mukaida et al. 1998 EG, ficoll, sacarose/straw
D2-3 (4-8 c) Nascimento 1
Lane et al. 1999 EG, DMSO, ficoll, sacarose/cryolop
D6 spares Sobrevida pós descongel.
Choi et al. 2000 EG, sacarose/ EM grid D5-6 Nascimento 7
Yokota et al. 2000 EG, DMSO/straw D5 Gravidez
Yokota et al. 2001 EG, DMSO/straw D5 Nascimento
Mukaida et al 2001 EG, ficoll, sacarose/ cryoloop
D5 Nascimento
El-Danasouri et al. 2001 EG, sacarose/OPS D3 (6-8 c) Nascimento
Selman et al. 2002 EG, sacarose/OPS D1 zigoto Gravidez
Liebermann et al. 2002 EG, sacarose/ flexipet D1 zigoto Dev. Blast.
Vanderzwalmen et al. 2002 EG, ficoll, sacarose/straw
D 4-5, w/artificial redução da blastocele
Gravidez
Vitrificação: Oócitos HumanosVitrificação: Oócitos HumanosAutor Ano CPAs/
instrumentoEstágio Resultados
Pensis et al. 1989 DMSO, PROH, sacarose/straw
MII Sobrevida pós-descongelamento
Hunter et al. 1995 DMSO, PROH, EG/straw
MII Fert., desenvolvimento
Hong et al. 1999 EG, sacarose/ EM grid
GV/MII Sobrevida, formação de blastocisto
Kuleshova et al. 1999 EG, sacarose / OPS
MII Nascimento (1)
Chung et al. 2000 EG, sacarose/ grid
GV/ MI Blast., cromossomos normais
Yoon et al 2000 EG, sacarose/ EM grid
MII Nascimento (3)
Wu et al. 2001 EG, sacarose/ EM grid
GV Gravidez bioquímica
Chen et al. 2001 EG, sacarose/ straw
MII Sobrevida, fertilização, clivagem
Yoon et al. 2002 EG, sacarose/ EM grid
MII Sobrevida, fertilização, clivagem, PR (21%) IR (6,4%), nascimento 7
Esforços para melhorar a vitrificação
• 1985 -1997 decréscimo da toxicidade de crioprotetores
• 1996 – aumento das taxas de congelamento e resfriamento
• 1999 – busca de equipamentos apropriados
VitrificaçãoVitrificaçãoSucessoSucessoVitrificaçãoVitrificaçãoSucessoSucesso
O aumento da velocidade de resfriamento reduziu os danos produzidos pelas gotas lipídicas
intracelulares, principalmente as contidas nas membranas e no citoesqueleto, por atravessar mais rapidamente as faixas críticas (+15°C a –
5°C) de temperatura
Dobrinski, 1996;Martino, 1996b; Isachenko, 1998; Zeron, 1999
•Desidratação em 2 passos antes da vitrificaçãoDesidratação em 2 passos antes da vitrificação• Solução de equilíbrio (15-20% CPA): 2-20 min.Solução de equilíbrio (15-20% CPA): 2-20 min.• Solução de vitrificação (30-40% CPAs + sacarose): 20-90 Solução de vitrificação (30-40% CPAs + sacarose): 20-90 seg.seg.• Equipamentos para o congelamento ultra-rápido:Equipamentos para o congelamento ultra-rápido:
Cryostraw, EM grid, Cryoloop, OPS, Hemistraw, Cryotop Cryostraw, EM grid, Cryoloop, OPS, Hemistraw, Cryotop (mínimo volume no congelamento), Cryotip (straw puxado (mínimo volume no congelamento), Cryotip (straw puxado e fechado), Vitri-Ingáe fechado), Vitri-Ingá• Mergulhados diretamente no nitrogênio líquidoMergulhados diretamente no nitrogênio líquido• Diluição de CpAs e reidratação em 3 passos com Diluição de CpAs e reidratação em 3 passos com decréscimo da concentração de sacarose.decréscimo da concentração de sacarose.•Solução de descongelamento (1.0 M de sacarose)Solução de descongelamento (1.0 M de sacarose)•Solução de diluição (0,5 M de sacarose)Solução de diluição (0,5 M de sacarose)•Solução de lavagem (não sacaroseSolução de lavagem (não sacarose) )
Métodos de vitrificaçãoMétodos de vitrificação
VitrificaçãoVitrificação
vitrificação está baseada no contato direto da solução crioprotetora com o nitrogênio líquido
VitrificaçãoVitrificação
vitrificação está baseada no contato direto da solução crioprotetora com o nitrogênio líquido
•A taxa de resfriamento calculada:14.000 a 24.000°C/minuto - Martino, 1996b; Arav, 1997
20.000°C/minuto por Vajta et al., 1997 (OPS), Mezzalira et al., 1999 (vidro), Lane et al., 1999 (cryoloop), Matsumoto et al., 2001(nylon mesh)
Straw Grid&loop OPS SOPS Cryotop Straw Grid&loop OPS SOPS Cryotop Vitri-ingáVitri-ingá
2000020000
Taxa de Taxa de resfriamentoresfriamento
°C/min°C/min20002000
Velocidade de resfriamento
Método de vitrificação
Volume de solução (ul)
Taxa de congelamento
(C/min)
Taxa de aquecimento
(C/min)
Straw 25.0 4460 1300
OPS 1.5 16340 13900
Cryotop/ Vitri-ingá
<0.1 22800 42100
Kuwayama M, RMBOnline 11:300-8,2005
Método No. de oócitos No (%) comMorfologia
normal
No (%)clivados
Desenvolvimento
a blastocisto
Straw 152 144 (94.7) 60 (39.5) 8 (5.3)
OPS 149 143 (96.0) 71 (47.7) 11 (7.4)
Cryotop 153 148 (96.7) 91 (59.5) 35 (22.9)
Controle fresco
152 - 118 (77.6) 68 (44.7)
Desenvolvimento de oócitos bovinos depois da vitrificação
Kuwayama M, RMBOnline 11:300-8,2005
Vitri-ingá 100 86 (86.0) 32 (37,0)
JBRA 12:20-3,2008
Gestação 2009
Procedimento Gravideztotal
Gravidez clínica
Gravidez química
Aborto
Descongelamento de embriões
50,0% 50,0% 0,0% 0,0%
Descongelamento de oócitos
39,3% 10,7% 10,7% 17,9%
FIV 56,6% 45,3% 3,8% 7,5%
ICSI 56,3% 40,6% 9,4% 6,3%
ICSI + PESA 100,0% 100,0% 0,0% 0,0%
Gestação 2009 < 35 anos
Procedimento Gravideztotal
Gravidez clínica
Gravidez química
Aborto
Descongelamento de embriões
75,0% 75,0% 0,0% 0,0%
Descongelamento de oócitos
35,3% 11,8% 0,0% 23,5%
FIV 56,2% 53,1% 0,0% 3,1%
ICSI 59,1% 50,0% 9,1% 0,0%
ICSI + PESA 100,0% 100,0% 0,0% 0,0%
Gestação 2010
Procedimento Gravideztotal
Gravidez clínica
Gravidez química
Aborto
Descongelamento de embriões
20,0% 20,0% 0,0% 0,0%
Descongelamento de oócitos
58,4% 41,7% 16,7% 0,0%
FIV 55,6% 55,6% 0,0% 0,0%
ICSI 42,9% 33,3% 4,8% 4,8%
ICSI + PESA 28,6% 28,6% 0,0% 0,0%
Gestação 2010 < 35 anos
Procedimento Gravideztotal
Gravidez clínica
Gravidez química
Aborto
Descongelamento de embriões
25,0% 25,0% 0,0% 0,0%
Descongelamento de oócitos
60,0% 40,0% 20,0% 0,0%
FIV 50,0% 50,0% 0,0% 0,0%
ICSI 40,0% 30,0% 0,0% 10,0%
ICSI + PESA 40,0% 40,0% 0,0% 0,0%
Preparo endometrial• Embrião
Ciclo espontaneo + sup.Lutea. Prg+Est+Bus
• Oocitos
Neovlar 15 ou mais dias
Lupron 0.15 ml nos 5 ultimos dias do neovlar
Estrofen 2 mg/3d + 4 mg/3d + 6mg/d
Prl 100 mg + Bus no 4° d / Est 6 mg (Endométrio > 7 mm / A)
Aquecimento dia seguinte
Transferencia dia 3 pós aquecimento/ICSI
LANÇAMENTO
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Sem duvida Sem duvida
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