Post on 10-Jan-2017
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Isabela Casagrande Jeremias
Investigao das alteraes imunolgicas em camundongos submetidos ao modelo
animal de sepse por ligao e perfurao cecal (CLP) com alteraes cerebrais
Tese apresentada Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo para obteno do ttulo de Doutora em Cincias Programa de Cincias Mdicas rea de Concentrao: Processos Inflamatrios e Alrgicos Orientador: Prof. Dr. Francisco Garcia Soriano
So Paulo
2015
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Dados Internacionais de Catalogao na Publicao (CIP)
Preparada pela Biblioteca da
Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo
reproduo autorizada pelo autor
Jeremias, Isabela Casagrande Investigao das alteraes imunolgicas em camundongos submetidos ao modelo animal de sepse por ligao e perfurao cecal (CLP) com alteraes cerebrais / Isabela Casagrande Jeremias. -- So Paulo, 2015.
Tese(doutorado)--Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo. Programa de Cincias Mdicas. rea de Concentrao: Processos Inflamatrios e
Alrgicos.
Orientador: Francisco Garcia Soriano. Descritores: 1.Sepse 2.Inflamao 3.Encefalopatia associada a sepse
4.Linfcitos 5.Acetilcolina
USP/FM/DBD-270/15
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Aos meus pais, Jaka e Rosinha,
e ao meu noivo, Sandro,
pelo incentivo, amor e dedicao.
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AGRADECIMENTOS
Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo e ao programa de
Emergencias Clnicas, por fornecerem as condies para a realizao deste trabalho, e
aos professores e funcionrios dessa instituio, por todo o suporte necessrio.
FAPESP, Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So Paulo, pelo apoio
financeiro para a realizao desse projeto.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Francisco Soriano, Chico, pela amizade, ajuda,
compreenso, sabedoria e exemplo de profissionalismo. Muitssimo obrigada pela
oportunidade e pelo aprendizado oriundo de um pesquisador admiravelmente
completo!
Um agradecimento especial a Thas e Suely por todo apoio e constante ajuda
para a realizao deste trabalho. E a todas as pessoas que participaram de alguma
forma deste trabalho.
Aos funcionrios e amigos do LIM 51: Kelli, Denise, Hermes, Gerlado, Ftima.
Aos meus amigos e colegas de laboratrio Anne, Joleen, Wermerson, Vivian,
Ricardo, Rosangla, ndre, Mariana, por deixarem os trabalhos no laboratrio muito
mais divertidos.
De maneira muito especial Vanessa pela ajuda, companheirismo, momentos
alegres e pela grande amizade formada.
Aos meus mais antigos e preciosos amigos, por se importarem, por lembrarem de
mim e por tudo que aprendi durante o tempo em que estivemos perto. Sinto saudades.
Ao meu noivo, Sandro, que ficou ao meu lado, dando apoio e fora que preciso.
Obrigada pela alegria, companheirismo, ateno, principalmente, por todo amor
dedicado.
5
minha famlia, pelo amparo, pelo carinho e dedicao.
Aos meus pais, exemplos de dedicao, pelo amor, educao, presena constante,
confiana e pelo incentivo em cada nova etapa da minha vida.
Deus, especialmente pela vida.
6
Uma mente que se abre a uma nova idia
jamais voltar a seu tamanho original
Albert Einsten
7
Esta tese est de acordo com as seguintes normas, em vigor no momento desta
publicao:
Universidade de So Paulo. Faculdade de Medicina. Diviso de Biblioteca e
Documentao. Guia de apresentao de dissertaes, teses e monografias. Elaborado
por Anneliese Carneiro da Cunha, Maria Julia de A. L. Freddi, Maria F. Crestana,
Marinalva de Souza Arago, Suely Campos Cardoso, Valria Vilhena. 3a ed. So Paulo:
Diviso de Biblioteca e Documentao; 2011.
Referncias: adaptado de International Committee of Medical Journals Editors
(Vancouver).
Abreviaturas dos ttulos dos peridicos de acordo com List of Journals Indexed in Index
Medicus.
1
SUMRIO
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE TABELAS
LISTA DE ABREVIATURAS
RESUMO
ABSTRACT
1. Introduo ..................................................................................................................... 9
2. Objetivos ..................................................................................................................... 10
2.1 Geral ...................................................................................................................... 10
2.2 Especficos ............................................................................................................ 10
3. Reviso da Literatura .................................................................................................. 12
3.1 Sepse ..................................................................................................................... 12
3.1.1 Definio ........................................................................................................ 12
3.1.2 Epidemiologia ................................................................................................ 13
3.1.3 Fisiopatologia ................................................................................................. 14
3.1.4 Resposta imunolgica .................................................................................... 16
3.1.5 Imunodepresso .............................................................................................. 18
3.1.6 Encefalopatia sptica ...................................................................................... 20
3.1.6.1 Teste comportamental SHIRPA ............................................................. 22
3.1.6.2 S100 ...................................................................................................... 22
3.1.7 Ligao e perfurao cecal ............................................................................. 24
3.2 Interaes entre sistema nervoso central e sistema imunolgico ......................... 25
3.3 Acetilcolina ........................................................................................................... 28
3.3.1 Donepezila ...................................................................................................... 29
3.3.2 VAChT ........................................................................................................... 30
4. Materiais e Mtodos ................................................................................................... 32
4.1 Animais ................................................................................................................. 32
4.2 Experimentos ........................................................................................................ 33
4.2.1 Experimento Agudo ....................................................................................... 33
4.2.2 Experimento Crnico ..................................................................................... 34
2
4.2.3 Efeito da acetilcolina na evoluo tardia da sepse ......................................... 34
4.3 Ligao e perfurao cecal.................................................................................... 35
4.4 SHIRPA ................................................................................................................ 36
4.5 ELISA ................................................................................................................... 37
4.6 Histologia e Tunel ................................................................................................. 38
4.7 Isolamento de Linfcitos....................................................................................... 39
4.8 Caracterizao dos linfcitos ................................................................................ 40
4.9 Morte celular e ciclo celular ................................................................................. 40
4.10 Anlise estatstica ............................................................................................... 41
5. Resultados ................................................................................................................... 43
5.1 Experimento Agudo .............................................................................................. 43
5.1.1 Anlise da sobrevida nas diferentes gravidades do CLP................................ 43
5.1.2 Alteraes neurolgicas nas diferentes gravidades do CLP........................... 44
5.1.3 Perfil das clulas no bao de diferentes gravidades do CLP .......................... 47
5.1.4 Perfil inflamatrio nas diferentes gravidades do CLP ................................... 50
5.2 Experimento Crnico ............................................................................................ 51
5.2.1 Alteraes neurolgicas em sobreviventes do CLP ....................................... 51
5.2.2 Perfil das clulas do bao em sobreviventes do CLP ..................................... 55
5.2.3 Perfil inflamatrio em sobreviventes do CLP ................................................ 61
5.3 Efeito da acetilcolina na evoluo tardia da sepse ................................................ 62
5.3.1 Anlise da sobrevida nos animais com donepezila e VAChT KD ................. 62
5.3.2 Alteraes neurolgicas nos animais com donepezila e VAChT KD ............ 63
5.3.3 Perfil das clulas do bao nos animais com donepezila e VAChT KD ......... 67
5.3.4 Perfil inflamatrio nos animais com donepezila e VAChT KD..................... 73
6. Discusso .................................................................................................................... 75
6.1 Experimento Agudo .............................................................................................. 75
6.2 Experimento Crnico ............................................................................................ 79
6.3 Efeito da acetilcolina na evoluo tardia da sepse ................................................ 85
7. Concluso ................................................................................................................... 90
7. Referncias ................................................................................................................. 92
3
LISTA DE FIGURAS
Figura 01. Curva de sobrevida nas diferentes gravidades de CLP ................................. 43
Figura 02. SHIRPA 6 horas aps o CLP em diferentes gravidades. .............................. 45
Figura 03. Os nveis plasmticos de S100 6 horas aps o CLP ................................... 46
Figura 04. Nveis de citocinas no hipocampo 6 horas aps o CLP ................................ 46
Figura 05. Peso do bao 6 horas aps o CLP ................................................................. 47
Figura 06. Caracterizao de linfcitos no bao 6 horas aps o CLP ............................ 48
Figura 07. Correlao entre os linfcitos e o S100 6 horas aps o CLP ...................... 49
Figura 08. Nveis de citocinas no bao 6 horas aps o CLP .......................................... 50
Figura 09. Nveis de citocinas no plasma 6 horas aps o CLP ....................................... 51
Figura 10. Teste comportamental SHIRPA 6 horas aps o CLP ................................... 52
Figura 11. Teste comportamental SHIRPA 15 dias aps o CLP .................................... 53
Figura 12. Os nveis plasmticos de S100 15 dias aps o CLP .................................... 54
Figura 13. Peso do bao 15 dias aps o CLP ................................................................. 55
Figura 14. Corte histolgico do bao, 15 dias aps o CLP ............................................ 56
Figura 15. Caracterizao de linfcitos no bao 15 dias aps o CLP ............................ 57
Figura 16. Correlao entre os linfcitos e o S100 15 dias aps o CLP ...................... 58
Figura 17. Morte celular no bao 15 dias aps o CLP ................................................... 59
Figura 18. Correlao entre a morte celular e o S100 15 dias aps o CLP .................. 59
Figura 19. Ciclo celular no bao 15 dias aps o CLP .................................................... 60
Figura 20. Curva de sobrevida aps CLP no experimento com donepezila ................... 62
Figura 21. Curva de sobrevida aps CLP no experimento VAChT KD ........................ 63
Figura 22. Teste comportamental SHIRPA 6 horas aps o CLP com donepezila ......... 64
Figura 23. Teste comportamental SHIRPA 6 horas aps o CLP no VAChT KD .......... 65
Figura 24. Peso do bao 15 dias aps o CLP com donepezila ....................................... 67
Figura 25. Peso do bao 15 dias aps o CLP no VAChT KD ........................................ 67
Figura 26. Caracterizao de linfcitos no bao 15 dias aps o CLP com donepezila .. 69
Figura 27. Caracterizao de linfcitos no bao 15 dias aps o CLP no VAChT KD ... 70
Figura 28. Morte celular no bao 15 dias aps o CLP com donepezila ......................... 71
Figura 29. Morte celular no bao 15 dias aps o CLP no VAChT KD .......................... 71
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LISTA DE TABELAS
Tabela 01. Citocinas no hipocampo 15 dias aps CLP. ................................................. 54
Tabela 02. Citocinas no bao 15 dias aps CLP. ........................................................... 60
Tabela 03. Citocinas no plasma 15 dias aps CLP. ........................................................ 61
Tabela 04. Citocinas no hipocampo 15 dias aps CLP com donepezila. ....................... 66
Tabela 05. Citocinas no hipocampo 15 dias aps CLP no VAChT KD. ........................ 66
Tabela 06. Citocinas no bao 15 dias aps CLP com donepezila. ................................. 72
Tabela 07. Citocinas no bao 15 dias aps CLP no VAChT KD. .................................. 73
Tabela 08. Citocinas no plasma 15 dias aps CLP com donepezila............................... 74
Tabela 09. Citocinas no plasma 15 dias aps CLP no VAChT KD. .............................. 74
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LISTA DE ABREVIATURAS
ACh acetilcolina
AChE enzima acetilcolinesterase
BHE barreira hematoenceflica
CARS sndrome da resposta compensatria sistmica
ChAT enzima colina acetiltransferase
CHT1 transportador de colina de alta afinidade
CLP ligao e perfurao cecal
CO2 dixido de carbono
DAMP padro molecular associado ao dano
DNA cido desoxirribonucleico
ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
EPM erro padro da mdia
HE hematoxilia eosina
HMGB1 protena de alta mobilidade box 1
IL interleucina
IRAK quinase associada ao receptor de IL-1
IRF3 fator 3 de regulao do interferon
LBP protena ligante de lipopolissacardeo
LPS Lipopolissacardeo
MCP protena quimiottica de moncito
MD-2 protena de diferenciao mielide-2
MIP protena inflamatria de macrfago
6
mRNA RNA mensageiro
MyD88 protena citoslica ativada pelo toll
NF-kB fator de transcrio nuclear -kB
PAMP padro molecular associado ao patgeno
PI iodeto de propdeo
RNA cido ribonucleico
SHIRPA SmithKline/Harwell/ImperialCollege/RoyalHospital/Phenotype Assessment
SIRS sndrome da resposta inflamatria sistmica
SNC sistema nervoso central
SPF livres de patgenos especficos
Th1 clulas T com padro de resposta pr-inflamatria
Th2 clulas T com padro de resposta anti-inflamatria
TIRAP protena adaptadora contendo Toll-IL-1R
TLR receptor do tipo toll
TNF- fator de necrose tumoral alfa
TOLL denominao da protena de reconhecimento de LPS
TRAF protena adaptadora associada ao receptor de TNF
TRAM molcula adaptadora relacionada a TRIF
TRIF protena adaptadora contendo o domnio TIR indutora de interferon
TUNEL Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling
UTI unidade de terapia intensiva
VAChT transportador vesicular de acetilcolina
VAChT KD animais knockdown para VAChT
WT wild-type
7nAChR receptores -7 nicotnicos de acetilcolina
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RESUMO Jeremias, IC: Investigao das alteraes imunolgicas em camundongos submetidos ao modelo animal de sepse por ligao e perfurao cecal (CLP) com alteraes cerebrais [tese]. So Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de So Paulo; 2015. A sepse caracterizada por um desequilbrio entre a resposta pr- e anti-inflamatria s infeces. Um dos principais componentes da resposta do hospedeiro no choque sptico so as interaes recprocas entre o sistema imune e o sistema nervoso central, desta forma o objetivo deste estudo foi investigar o desenvolvimento de alteraes neurolgicas e sua associao com alteraes imunolgicas em fases iniciais e tardias aps a sepse por ligao e perfurao cecal (CLP). Dividimos em trs experimentos: agudo, crnico e efeito da ACh na evoluo tardia da sepse. No experimento agudo utilizamos camundongos Balb/c, induzimos sepse por CLP em diferentes gravidades (leve, moderado e grave), 6 horas aps o CLP foi realizado teste comportamental SHIRPA e logo aps os animais foram sacrificados. No experimento crnico os camundongos Balb/c foram submetidos ao CLP leve, o SHIRPA foi realizado 6 horas e 15 dias aps o CLP e os animais foram sacrificados 15 dias aps o CLP. No experimento dos efeitos da ACh utilizamos camundongos Balb/c que receberam a droga donepezila (5 mg/kg/dia, oralmente) sete dias antes do CLP leve at o dia do sacrifcio e os camundongos homozigotos mutantes VAChT KD tambm submetidos ao CLP leve. O teste comportamental SHIRPA foi realizado 6 horas aps o CLP e os animais sacrficos 15 dias aps o CLP. O plasma, o bao e o hipocampo foram removidos em todos os experimentos. Os nveis do S100 foram medidos no plasma. Os baos foram pesados, e por citometria de fluxo foi caracterizado os linfcitos (linfcitos T citotxicos, linfcitos T auxiliares, linfcitos B, clulas T reguladoras e clulas Th17) e morte celular (Apoptose inicial, necrose e apoptose tardia). Os nveis de citocinas no bao, hipocampo e plasma foram determinados por ELISA. Nossos resultados mostram que no experimento agudo, 6 horas aps o CLP a encefalopatia diferente dependendo da gravidade da sepse, e o perfil de linfcitos no bao no alterado por nenhuma gravidade da sepse. No entanto, a ativao de clulas do bao foi indicada no nosso estudo por variaes na quantidade de citocinas no bao. No experimento crnico observamos que 15 dias aps o CLP os animais apresentam encefalopatia sptica, e esta est correlacionada com a diferenciao e morte celular de linfcitos do bao, o que leva a um alto perfil imunossupressor. No experimento da ACh mostramos que a estimulao da transmisso colinrgica, utilizando donepezila, diminui a inflamao, por aumentar linfcitos, morte linfocitria e diminuir citocinas pr-inflamatria. E, ao contrrio, a diminuio da transmisso colinrgica, experimento VAChT KD, observou-se uma diminuio de linfcitos, sem morte celular e aumento da inflamao. Desta forma, conclumos que a alterao neurolgica nos animais com sepse est associada com as alteraes imunolgicas tardias e que a ACh tem um importante papel no perfil imunolgico 15 dias aps o CLP. Descritores: sepse; inflamao; encefalopatia associada sepse; linfcitos; acetilcolina
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ABSTRACT Jeremias, IC: Investigation of changes immunological in mice submitted to model animal of sepsis by cecal ligature and puncture (CLP) with brain injure [thesis]. So Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de So Paulo; 2015. Sepsis is characterized by an imbalance between pro- and anti-inflammatory responses to infection. One of the main components of the host response in septic shock are the reciprocal interactions between the immune system and the central nervous system, so the aim of this study was to investigate the development of neurological disorders and their association with immunological changes in early and late stages after sepsis by cecal ligation and puncture (CLP). We divided in three experiments: acute, chronic and chronic ACh. In acute experiment we use Balb/c mice, induce sepsis by CLP in different severities (mild, moderate and severe), 6 hours after CLP was conducted behavioral test SHIRPA and after the animals were sacrificed. In the chronic experiment Balb/c mice were subjected to CLP mild, the SHIRPA was performed 6 hours and 15 days after CLP, and animals were sacrificed 15 days after CLP. In chronic ACh experiment use Balb/c mice that received the drug Donepezil (5 mg/kg/day, orally) seven days before the CLP mild until the day of sacrifice and use too mice homozygous mutants KD VAChT also submitted to CLP mild. The SHIRPA behavioral test was performed 6 hours after CLP and the animals were sacrificed 15 days after CLP. The plasma, spleen and hippocampus were removed in all experiments. The levels of S100 were measured in plasma. The spleens were weighed, and flow cytometry was characterized lymphocytes (cytotoxic T lymphocytes, helper T lymphocytes, B lymphocytes, regulatory T cells and Th17 cells) and cell death (apoptosis initial, necrosis and DNA fragmentation). Cytokine levels in the spleen, hippocampus and plasma were determined by ELISA. Our results show that in the acute experiment, 6 hours after CLP encephalopathy is different depending on the severity of sepsis, since the profile of the spleen lymphocytes is not changed by any severity of sepsis. However, the spleen cell activation was shown in this study by variations in the quantity of cytokines in the spleen. In the chronic experiment we observed that 15 days after CLP animals have septic encephalopathy, and this correlates with cell differentiation and the death of spleen lymphocytes, which leads to a high immunosuppressive profile. Since in the chronic ACh experiment have shown that stimulation of cholinergic transmission, using donepezil, reduces inflammation by increasing lymphocytes, lymphocyte death and decreasing proinflammatory cytokine. And, conversely, the reduction in cholinergic transmission, KD VAChT experiment, we observed a decrease of lymphocytes, and increase cell death without inflammation. Thus, we conclude that the neurological deficits in animals with sepsis is associated with immunological late changes and ACh plays an important role in the immune profile 15 days after CLP. Descriptors: sepsis; inflammation; sepsis-associated encephalopathy; lymphocytes; acetylcholine
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1. Introduo
Sepse a principal causa de morte de pacientes em unidades de terapia intensiva e
causada pela ativao imune inadequada devido a bactrias e componentes bacterianos
liberados. Assim, a sepse caracterizada por um desequilbrio entre a resposta pr- e
anti-inflamatria s infeces. Quando a cascata da sepse acionada, uma resposta
sistmica desregulada ocorre, podendo progredir para insuficincia de mltiplos rgos
que inclui a encefalopatia sptica. A encefalopatia sptica uma complicao comum,
mas pouco compreendida, afetando 8-70% de pacientes spticos. Ela pode ser definida
como um distrbio cerebral resultante de sinalizao celular e metablica mediada por
componentes inflamatrios.
Os avanos recentes na compreenso da biologia de toxicidade de citocinas
levaram descoberta da "via anti-inflamatria colinrgica", que envolve a comunicao
bidirecional entre o crebro e o sistema imunolgico. A ativao desta via, quer por
estimulao eltrica do nervo vago ou atravs de abordagens farmacolgicas, foi
mostrado para melhorar significativamente patologias induzidas por modelos de
doenas mediadas por citocinas, incluindo a endotoxemia e sepse. Esta via
funcionalmente ligado ao bao atravs do ramo celaca comum do nervo vago e a
estimulao do nervo vago atenua a inflamao sistmica e protetor contra a sepse.
Sabendo que as interaes recprocas entre o sistema imune e o sistema nervoso
central so consideradas um dos principais componentes da resposta do hospedeiro no
choque sptico, a hiptese principal deste estudo que as alteraes cerebrais
decorrentes da sepse induziro disfuno do sistema imunolgico.
10
2. Objetivos
2.1 Geral
Investigar o desenvolvimento de alteraes neurolgicas e sua associao com
alteraes imunolgicas em fases iniciais e tardias aps a sepse por ligao e perfurao
cecal (CLP).
2.2 Especficos
Avaliar as alteraes neurolgicas em fases iniciais e tardias aps a sepse.
Estratgia: Pela anlise do teste comportamental SHIRPA, os nveis plasmticos
de S100 e as citocinas no hipocampo, caracterizamos as alteraes neurolgicas.
Avaliar a alterao do perfil das clulas do bao em fases iniciais e tardias aps a
sepse:
Tamanho e peso do bao;
O perfil das populaes de linfcitos: T CD4, CD8, Treg, T17 e linfcitos B;
O perfil de citocinas no bao;
Estratgia: Atravs de anlise por citometria de fluxo caracterizamos e
quantificamos as diversas linhagens de linfcitos. E por ELISA quantificamos as
diversas citocinas no bao.
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Avaliar se a alterao no perfil das clulas imunolgicas do bao decorre de:
Apoptose;
Necrose;
Estratgia: Atravs de anlise por citometria de fluxo utilizamos marcadores que
nos indicaram a presena de apoptose ou necrose celular.
Avaliar o perfil inflamatrio sistmico em fases iniciais e tardias aps a sepse.
Estratgia: Atravs de anlise por Milliplex verificamos o perfil de diversas
citocinas no plasma.
Avaliar o efeito da acetilcolina no desenvolvimento de alteraes imunolgicas e sua
associao com danos cerebrais em fase tardia aps a sepse.
Estratgia: Atravs da utilizao de um inibidor da acetilcolinesterase e animais
homozigotos mutantes VAChT KD verificamos as alteraes imunolgicas atravs do
teste comportamental SHIRPA e perfil imunolgico atravs do perfil das clulas do
bao e as citocinas.
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3. Reviso da Literatura
3.1 Sepse
3.1.1 Definio
Na reunio de consenso da American College of Chest Physicians e da Society of
Critical Care Medicine, em 1991, a sepse foi definida como a sndrome da resposta
inflamatria sistmica (SIRS) associada a um quadro infeccioso (Bone et al., 1992).
A sepse caracterizada pelo desenvolvimento de alteraes clnicas,
hematolgicas, bioqumicas e imunolgicas associadas infeco, e quando complicada
pela disfuno orgnica denominada sepse grave. O choque sptico se refere a um
estado de falncia circulatria aguda com hipotenso arterial apesar da reposio
volmica, fazendo-se necessrio a terapia vasopressora para manuteno de uma
presso arterial a valores aceitveis (Vincent e Korhut, 2008; Barbeiro et al., 2011;
Lorigados et al., 2011; Melo et al., 2011).
Na sepse, a desregulao dos mecanismos imunolgicos pode resultar em uma
perda de controle da inflamao. A fase precoce da sepse caracterizada pela excessiva
ativao, no hospedeiro, da produo de mediadores inflamatrios aps o sistema de
reconhecimento de patgenos ser ativado. A excessiva produo de radicais livres e
enzimas causam danos teciduais em grande escala, leva a uma desregulao de vrios
sistemas do corpo. Atualmente, h evidncias de que a sepse uma condio que afeta
no s o sistema imunolgico, mas tambm outros sistemas biolgicos (Rittirsch et al.,
2008).
13
Por isso, a sepse uma enfermidade extremamente complexa, pelo desequilbrio
entre a resposta pr e anti-inflamatria induzindo ao longo do tempo uma falncia
mltipla de rgos, sendo uma causa importante de morbidade e mortalidade em todo o
mundo (Hotchkiss e Karl, 2003; Vandijck et al., 2006).
3.1.2 Epidemiologia
Nos Estados Unidos, dados de mortalidade indicam que a sepse est entre as 10
causas mais comuns de morte (Kung et al., 2008) indicando que ocorrem
aproximadamente 751.000 casos de sepse por ano (Remick, 2007) e se relata que o
choque sptico a causa de 6-15% das internaes em unidades de terapia intensiva
(UTI) (Antonelli et al., 2007). A taxa de mortalidade anual de 32,2% para sepse grave
e 54,1% para choque sptico (Vincent e Abraham, 2006), sendo que os ndices
aumentam continuamente nos pacientes de maior idade (Martin et al., 2003), isso ocorre
devido tendncia epidemiolgica nessa faixa etria onde h um aumento de pacientes
cronicamente doentes (O'brien et al., 2007).
No Brasil, atravs de estudos do Brazilian Sepsis Epidemiologic Study (BASES)
analisou por 8 meses os dados fornecidos por 5 hospitais dos estados de So Paulo e
Santa Catarina e mostrou que cerca de 25% dos pacientes internados nas UTIs
apresentaram diagnsticos de sepse grave e choque sptico, com uma mortalidade de
34,7% para sepse, 47,3% para sepse grave e 52,2% para choque sptico (Silva et al.,
2004). Outro estudo analisou em diferentes UTIs que a mortalidade por sepse foi de
16,7%, para sepse grave, 34,4% e para choque sptico, 65,3% (Sales e Andrade, 2006).
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A taxa de mortalidade em outro estudo foi de 21,4% para sepse, 30,9% para sepse grave
e 47,7% para choque sptico (Fernandes, 2008).
O Instituto Latino Americano de Sepse em sua campanha sobrevivendo a sepse
(Surviving Sepsis Campaign) apresentou em dezembro de 2014, no seu relatrio
trimestral, dados gerais de mortalidade de pacientes spticos no Brasil e no mundo. No
Brasil, a mortalidade de pacientes com sepse grave de 31,6% e no mundo 23,9%. No
entanto, pacientes com choque sptico no Brasil a mortalidade chega a 64,2% enquanto
no mundo de 37,4% (ILAS, 2014). Os dados mundiais so referentes a 2010 (Levy et
al., 2010).
Sepse e choque sptico representam a causa mais importante de morte em UTIs de
adultos, superando as doenas cardiovasculares (Nguyen et al., 2006). A grande
incidncia, associada gravidade da sepse seria por si s o suficiente para justificar o
aprofundamento no conhecimento de sua fisiopatologia e a tentativa de novas
possibilidades teraputicas.
3.1.3 Fisiopatologia
A maior causa de infeco na sepse por bactrias Gram positivas e Gram
negativas, mas a resposta inflamatria do hospedeiro tambm pode ser desencadeada
por fungos e vrus (Nduka e Parrillo, 2009). Sessenta por cento dos casos ocorre pela
invaso de bactrias Gram negativas e quarenta por cento so decorrentes de bactrias
Gram positivas (Angus et al., 2001a; Alberti et al., 2003; Hanna, 2003).
15
O lipopolissacardeo (LPS) e as exotoxinas so liberados normalmente durante a
replicao da bactria e/ou como consequncia de sua morte, devido lise da parede
celular. Diversos receptores foram encontrados nos ltimos anos, capazes de reconhecer
essas molculas e ativar assim, a resposta imune inata (Triantafilou e Triantafilou,
2002). Eles so reconhecidos por receptores encontrados em clulas do sistema imune
inato como neutrfilos polimorfonucleares, macrfagos e clulas dendrticas. Um dos
maiores avanos no entendimento do reconhecimento microbiano pelo sistema imune
inato tem sido a identificao de receptores do tipo Toll (TLRs), que agem como
sensores de alvos moleculares associados a patgenos, reconhecendo e disparando a
resposta do hospedeiro (Janeway e Medzhitov, 2002; Creagh e O'Neill, 2006; Opitz et
al., 2009).
A ativao dos macrfagos pelo LPS se d atravs da ligao protena ligante de
LPS (LBP) e interage com o CD-14 (protena da superfcie externa da membrana celular
de moncitos que facilita a ativao celular induzida pelo LPS). (Zhang e Morrison,
1993; Benjamini et al., 2002). O CD-14 em conjunto com a protena de diferenciao
mielide-2 (MD-2) uma pequena molcula sem regio transmembrana, participam da
apresentao de LPS para o receptor similar ao Toll e em 1998, Poltorak e
colaboradores, mostraram que a sinalizao pelo LPS transmitida pelo receptor Toll-
like-4 (TLR-4) o primeiro membro da famlia a ser caracterizado em mamferos
(Poltorak et al., 1998).
TLR-4 capaz de ativar vias de sinalizao distintas que envolvem diferentes
cofatores e molculas adaptadoras intermediando diversas respostas imunes. Uma das
vias de sinalizao a via de sinalizao TLR dependente de MyD88 (protena
citoslica ativada pelo toll) que ativada pela ligao direta do domnio TIR
citoplasmtico com a protena adaptadora contendo o domnio TIR (TIRAP), que
16
recruta a molcula adaptadora MyD88 e de quinases associadas ao receptor de IL-1
(IRAK). Aps autofosforilao das IRAK, a protena adaptadora associada ao receptor
de TNF (TRAF6) interage com complexos de protenas, ativando o complexo IkB-
quinase (IKK) e por fim, ativando o fator de transcrio nuclear kappa B (NF-kB)
(Kawai e Akira, 2006).
A outra via de sinalizao, a via de sinalizao independente de MyD88
envolve a protena adaptadora contendo domnio TIR indutora de interferon (TRIF)
ou a molcula adaptadora relacionada a TRIF (TRAM), que levam fosforilao do
fator 3 de regulao do interferon (IRF3), induzindo produo de interferon e molculas
co-estimulatrias (Medzhitov, 2001; Kawai e Akira, 2006; ONeill e Bowie, 2007).
Uma vez que os patgenos so identificados pelas clulas dendrticas cuja
funo apresentar antgeno aos linfcitos disparada a resposta imune adaptativa,
com consequente liberao de citocinas, resultando em uma sequncia de eventos
bioqumicos e clnicos (Hanna, 2003; Weighardt e Holzmann, 2007; Matsuda et al.,
2012).
3.1.4 Resposta imunolgica
A resposta imunolgica realizada pela sucesso dos mecanismos inatos e
adaptativos, ou seja, nas fases iniciais da infeco h um predomnio das respostas
inatas e nas fases mais tardias os linfcitos passam a gerar respostas imunolgicas
adaptativas (Kourilsky e Truffa-Bachi, 2001).
17
As clulas do sistema imune inato, as quais incluem moncitos, macrfagos e
neutrfilos compe a primeira linha de resposta infeco e leso (Wang e Deng,
2008). A imunidade inata resultante de um sistema inespecfico de defesa imunolgico
encontrado em organismos multicelulares. Durante a infeco, a imunidade inata faz o
reconhecimento de padres moleculares associados ao patgeno (PAMPs), tais como
LPS, peptideoglicano, RNA (cido ribonucleico) de fita dupla; ou padres moleculares
associados ao dano (DAMPs), tais como protena do choque trmico, cido rico,
anexinas, e HMGB1, usando receptores de reconhecimento como os TLR-2, TLR-4 e
TLR-9 (Brightbill et al., 1999; Wang et al., 1999; Li et al., 2003).
A sinalizao TLR pode induzir a produo de citocinas pr-inflamatrias e
aumento da expresso de molculas coestimuladoras, as quais so ativadas no apenas
pela imunidade inata, como tambm pela imunidade adquirida (Kaisho e Akira, 2002).
As clulas da imunidade inata infiltram nos tecidos infectados e liberam diversas
citocinas, como Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF-), interleucina-1 (IL-1), IL-6, IL-
12 e quimiocinas como IL-8, protena inflamatria de macrfagos (MIP-1s e MIP-2) e
protena quimiottica de moncitos (MCP-1) (Baggiolini e Loetscher, 2000; Luster et
al., 2005; Wang e Deng, 2008). Em resposta a infeco ou dano causado pelos
microrganismos, o sistema imune inato responde imediatamente ao estmulo,
removendo os patgenos invasores e, aps sua eliminao, ocorre uma regresso do
quadro inflamatrio retornando a homeostase imunolgica. Os patgenos ou
mediadores pr-inflamatrios endgenos podem extravasar para a corrente sangunea,
ocasionando a sepse (Wang e Deng, 2008).
A principal diferena entre a resposta imunolgica inata e adaptativa que a
resposta adaptativa altamente especfica e desenvolve memria contra o germe
agressor. A expanso clonal dos linfcitos em resposta a um agente infeccioso
18
absolutamente necessria para gerao de uma resposta imunolgica eficiente. O
desenvolvimento de clones diferenciados em clulas efetoras leva de 3 a 5 dias. Os
linfcitos memorizam a estrutura do agente agressor e passam a responder mais
rpida e eficientemente no caso de haver uma reinfeco pelo mesmo patgeno
(Kourilsky e Truffa-Bachi, 2001).
Desta forma, a imunidade adquirida mediada por linfcitos T e B, tem alta
especificidade para microrganismos atravs da combinao dos receptores com
molculas dos patgenos. Alm disso, capaz de ativar fatores de transcrio e de
promover secreo de citocinas pr-inflamatrias junto s clulas T, alm de aumentar a
sntese de citocinas anti-inflamatrias (IL-4, IL-10, IL-13), modular a expresso de
receptores de citocinas e liberar receptores solveis e antagonistas, bem como atuar
sobre o sistema imune inato (Sikora et al., 2001; Faix, 2013). Contudo, este perodo de
tempo para desenvolver a resposta adaptativa bastante longo, e suficiente para que as
bactrias produzam graves danos ou a morte do hospedeiro, desta forma necessrio
um mecanismo de ao rpida, ou melhor, de ao imediata. Os mecanismos efetores da
imunidade inata so ativados imediatamente aps a invaso e tem papel importante na
defesa do hospedeiro, durante os estgios iniciais da infeco (Sikora et al., 2001).
3.1.5 Imunodepresso
A literatura tem discutido se a sepse caracterizada por curto perodo da SIRS e
seguido por um sustentado perodo de imunossupresso e resposta anti-inflamatria.
Roger Bone, em 1997, deu o nome de CARS (sindrome da resposta compensatria
19
sistmica) a essa resposta anti-inflamatria, a qual ele interpretou como uma tentativa
do organismo de contra-regular a SIRS, podendo, em determinados casos, se tornar
prevalente e ocasionar fenmenos de imunodepresso nos pacientes que apresentam
esse quadro, como por exemplo, respostas de hipersensibilidade alteradas e maiores
riscos de infeces secundrias e por germes oportunistas (Bone et al., 1997; Oberholzer
et al., 2002; Moine e Abraham, 2004)
A CARS caracterizada por defeito na apresentao de antgeno, paralisia de
macrfagos, anergia de clulas T, supresso de proliferao de clulas T, diminuio da
proliferao de clulas Th1 e aumento de apoptose das clulas B e T (da Silva e
Velasco, 2007).
A contribuio da apoptose na gnese da SIRS e da CARS tem sido muito
debatida. De modo geral, a apoptose das clulas efetoras do sistema imune, como
linfcitos e clulas dendrticas, um evento importante para a evoluo do quadro
sptico e tem sido muito estudada (Wolfrd et al., 2000; Kumar et al., 2001; Wu et al.,
2001). A eliminao de um grande nmero de clulas do sistema imune compromete a
defesa efetiva do hospedeiro. A apoptose na sepse foi alvo de estudos, demonstrando
que a preveno dos eventos apoptticos aumenta a sobrevida de maneira relevante em
modelos animais de sepse, uma vez que o aumento de apoptose, predominantemente em
rgos linfides, tem sido correlacionado ao surgimento da sndrome de disfuno de
mltiplos rgos (Rudinsky et al., 2000; Ver Elst et al., 2000; Tavernier et al., 2001;
Stromme et al., 2001; Saadeddin et al., 2002).
20
3.1.6 Encefalopatia sptica
Com a potencializao da inflamao causada pela ativao sistmica de
receptores TLR-4, caracterstico da falncia mltipla de rgos em modelo animal de
sepse, o crebro pode ser um dos primeiros rgos a serem afetados associados alta
morbidade e mortalidade. Este rgo imunologicamente ativo e influenciado por
reaes inflamatrias sistmicas e respostas, tais como as que resultem de doenas
sistmicas e sepse (Elenkov et al., 2005; Iacobone et al., 2009).
A fisiopatologia da disfuno do sistema nervoso central (SNC) decorrente da
sepse tem sido pouco estudada apesar da sua importncia na evoluo clnica dos
pacientes. A encefalopatia sptica considerada uma disfuno cerebral devido sepse
podendo ocorrer em 8-70% dos pacientes spticos, dependendo dos critrios clnicos
empregados (Sprung et al., 1990; Young et al., 1990), sendo a encefalopatia mais
comum nas UTIs (Bleck et al., 1993). O conceito de encefalopatia sptica como uma
entidade que no possa ser explicada pela disfuno, hipotenso, ou pela hipxia
heptica ou renal, relativamente nova, porm est claro que a sepse e suas reaes
podem ser associadas a um largo espectro de danos e disfunes cerebrais
(Papadopoulos et al., 2000).
Diversos fatores de risco tm sido descritos para a ocorrncia de encefalopatia
sptica e podem ser categorizados como: a) condio pr-existente do paciente (como p.
ex. idade, histria de depresso, doena heptica, doena renal); b) condio aguda do
paciente (como p.ex. overdose de drogas, febre) e c) fatores iatrognicos ou ambientais
(como p.ex. uso de sedativos, alimentao enteral, cateter venoso central) (Ebersoldt et
al., 2007). Em casos fatais, tm-se demonstrado proliferao de astrcitos e microglia
21
no crtex, infartos cerebrais, prpura cerebral, mltiplas hemorragias pequenas na
substncia branca e disseminao de microabsessos (Jackson et al., 1985). Nos
sobreviventes se tem demonstrado reduo do fluxo sanguneo cerebral, disfuno da
barreira hematoenceflica (BHE) e alterao de neurotransmissores (Bowton et al.,
1989; Descamps et al., 2003).
Alm destas manifestaes neurolgicas agudas observadas em pacientes
criticamente enfermos, demonstra-se que sobreviventes da terapia intensiva, incluindo
pacientes spticos, apresentam disfunes cognitivas de longo prazo (Angus et al.,
2001a; Hough e Curtis, 2005; Winters et al., 2010). O dano cognitivo em longo prazo
vem sendo relatado como uma sequela de sepse (Gunther et al., 2012; Semmler et al.,
2013). Estudos mostraram que a prevalncia de dano cognitivo moderado a grave
10,6% maior em pacientes sobreviventes de sepse grave (Iwashyna et al., 2010).
Semmler e colaboradores (2007) demonstraram em animais sobreviventes de sepse
perda neuronal no hipocampo e sub-regies do crtex pr-frontal e inervao
colinrgica reduzida de reas corticais, resultando em relevantes consequncias
funcionais, tais como, a perda de memria, uma alterao semelhante ao observado em
pacientes com doena de Alzheimer. Assim como para a encefalopatia, os mecanismos
associados a estas alteraes no so bem entendidos, mas podem incluir inflamao,
estresse oxidativo e disfuno energtica cerebral (Messaris et al., 2004).
22
3.1.6.1 Teste comportamental SHIRPA
O protocolo semi-quantitativo SHIRPA (SmithKline/ Harwell/ ImperialCollege/
RoyalHospital/ Phenotype Assessment) representa ferramenta desenvolvida no final da
dcada de 90 por importantes centros de pesquisa britnicos associados a uma
companhia farmacutica e inclui 40 diferentes testes em 3 classes amplas (estgios) de
rastreamento de funes neurolgicas bsicas, com diferentes graus de complexidade e
especializao. Apesar de bastante rica e ampla na abordagem das diferentes
modalidades do exame neurolgico, o protocolo SHIRPA ferramenta qualitativa e
baseada em gradaes por escores, o que torna o significado real de cada teste aplicado
examinador-dependente e passvel apenas de comparao com outros animais para
validao (Rogers et al., 1997; Rogers et al., 2001; Hatcher et al., 2001; Masuya et al.,
2005; Pinto et al., 2013).
Estudos utilizando o modelo experimental de sepse por ligao e perfurao cecal
(CLP) vem utilizando o teste comportamental SHIRPA para a avaliao do estado
neurolgico destes animais (Comim et al., 2011a; Chavan et al., 2012).
3.1.6.2 S100
A busca de marcadores perifricos gerais e especficos de leso cerebral tem
aumentado ao longo dos ltimos 10 anos. Um destes marcadores o S100, que uma
23
protena de ligao de clcio, expressa predominantemente por astrcitos no crebro dos
vertebrados (Donato, 2001).
A famlia das protenas S100 modula uma variedade de funes intracelulares,
incluindo homeostase do clcio, organizao citoesqueltica, progresso do ciclo
celular, crescimento e diferenciao celular (Donato, 2001; Heizmann et al., 2002).
Apesar de suas funes intracelulares, a liberao das S100s acontecem a partir de
diferentes tipos celulares durante processos inflamatrios, podendo ser utilizadas como
marcadores de atividade na doena (Frosch et al., 2000; Foell e Roth, 2004), sendo a
S100 associada a inflamao no SNC (Foell et al., 2007). Estes eventos celulares so
importantes na progresso da neurodegenerao (Tan et al., 2009). A resposta inata da
glia ao dano, patgeno ou estimulo de ativao de maneira geral conduziria a desfeschos
benficos, como a fagocitose ou produo de fatores de reparao ou proteo. No
entanto, quando a ao da microglia mantida gera superproduo de mediadores pr-
inflamatrios alterando a homeostase, o que resulta em progresso da doena
exacerbando a influncia de fatores que interferem na disfuno neuronal e na
progresso da neuropatologia (Lue et al., 2001; van Eldik et al., 2007; Fang et al.,
2010).
Nveis elevados de S100 refletem com preciso a presena de condies
neuropatolgicas incluindo leses traumticas na cabea (Biberthaler et al., 2006; Blyth
et al., 2009; Ruan et al., 2009), transtornos psiquitricos (Rothermundt et al., 2004;
Andreazza et al., 2007), insultos vasculares cerebrais (Missler et al., 1997) e doenas
neurodegenerativas (Griffin et al., 1989; Peskind et al., 2001; Netto et al., 2006),
enquanto que os nveis normais excluem de forma confivel a maioria das patologia do
SNC (Ingebrigtsen et al., 1999; Biberthaler et al., 2001; Biberthaler et al. 2006). O
24
aumento da S100 tem associao direta com a alta mortalidade e um preditor
independente de sobrevida na terapia intensiva (Iacobone et al., 2009).
3.1.7 Ligao e perfurao cecal
Estudos de sepse em humanos so difceis devido severidade da doena, a
necessidade de intervenes teraputicas imediatas e a heterogeneidade dos pacientes.
Vrios modelos experimentais tm sido desenvolvidos para os estudos dos aspectos
fisiopatolgicos e das consequncias sistmicas da sepse, assim como para a
investigao de agentes potencialmente teraputicos e seus mecanismos de ao. Para
esta proposta, deve-se utilizar um modelo animal que reproduza a vasodilatao,
hipotenso, aumento no dbito cardaco, resposta ao tratamento e mortalidade vistos em
pacientes spticos. Utiliza-se para tal finalidade o modelo de sepse abdominal, sepse
cutnea, sepse induzida pela administrao de LPS ou TNF. Porm os modelos que
induzem peritonite so mais amplamente utilizados. A peritonite pode ser induzida por
inoculao direta de bactrias ou contedo fecal na cavidade peritoneal e, entretanto o
modelo mais aceito na literatura, e que parece simular mais adequadamente o quadro
clnico de sepse chamado de CLP (Deitch, 2005; Hubbard et al., 2005; Rocha et al.,
2006; Rittirsch et al., 2007).
A CLP baseia-se na ligao do ceco logo abaixo da vlvula leo cecal, perfurao
do ceco com tamanho padronizado e liberao do contedo fecal para a cavidade
peritoneal, conforme classicamente descrito por Wichterman e colaboradores
(Wichterman et al., 1980). Desta maneira alm da peritonite se induz isquemia
25
mesentrica simulando as grandes sndromes clnicas de sepse abdominal (p. ex.
apendicite, isquemia mesentrica) (Hollenberg et al., 2001).
Representa vantagens como relativa simplicidade, reprodutibilidade e
possibilidade de controlar o grau de contaminao bacteriana na cavidade peritoneal, e
consequentemente, a mortalidade, pela mudana do tamanho da agulha e/ou nmero de
perfuraes realizadas no ceco. Em contrapartida, variabilidades na mortalidade podem
ser encontradas, mesmo quando protocolos iguais so usados, devido a fatores aos
quais, na maioria das vezes, no so considerados como, por exemplo, diferenas no
tamanho da inciso na pele e msculo, no comprimento ligado do ceco e volume de
contedo fecal extravasado para a cavidade peritoneal (Deitch, 2005; Hubbard et al.,
2005; Rocha et al., 2006; Rittirsch et al., 2007). Por isso, a padronizao do
procedimento de induo de sepse polimicrobiana por CLP tem relevante importncia
na consistncia e reprodutibilidade dos resultados.
3.2 Interaes entre sistema nervoso central e sistema imunolgico
A ideia da existncia de interaes entre os sistemas nervoso e imune
extremamente antiga. Aristteles, afirmava que a psique (alma) e o corpo reagiam
complementarmente um com o outro; para ele, uma mudana no estado da psique
produzia uma mudana na estrutura do corpo e, inversamente, uma mudana na
estrutura do corpo produzia uma mudana na estrutura da psique (Conti, 2000;
Besedovsky e Del Rey, 2007).
26
Blalock (1984) props que o sistema imune, alm da sua funo na defesa do
organismo, teria uma funo de rgo sensorial que serviria para detectar estmulos que
no poderiam ser ouvidos, vistos, cheirados, degustados ou sentidos. Ele sugeriu que o
sistema imune poderia funcionar como um Sexto Sentido capaz de detectar e levar o
organismo a responder a substncias estranhas tais como patgenos, tumores, alrgenos.
Por ter grande sensibilidade e especificidade sabe-se hoje que esse rgo sensorial
mobiliza o corpo a responder prontamente a esses desafios; esta capacidade sensorial
tem seu fundamento nas bases moleculares propostas para a anlise das interaes entre
os sistemas imune e neuroendcrino uma vez que os leuccitos individualmente no
esto diretamente conectados ao SNC (Blalock, 2005).
Estudos realizados pelo grupo de Tracey e colaboradores contriburam
enormemente para o conhecimento nessa rea (Rangwala et al., 1997; Tracey, 2002;
Wang et al., 2004; Pavlov et al., 2006; Tracey, 2007; Sloan et al., 2007; Rosas-Ballina e
Tracey, 2009; Tracey, 2009; Huston e Tracey, 2011). Descreveram inicialmente que a
ativao do nervo vago (eltrica ou com uso de agonistas colinrgicos) reduz a resposta
inflamatria em modelos experimentais de sepse; em trabalhos subsequentes, esse grupo
cunhou a teoria do Reflexo Inflamatrio. Como todo arco reflexo mediado pelo
sistema nervoso, composto por uma via de informao aferente, reas de integrao no
SNC e uma efetora eferente. De forma breve, verificou-se que mediadores inflamatrios
(citocinas) produzidos em tecidos perifricos notificam o SNC da presena de
inflamao no organismo, por ao direta em reas centrais ou por estimulao de
aferncias do nervo vago; nas reas centrais ocorre a integrao dos sinais e
desencadeamento da resposta inflamatria global, incluindo a ativao da via eferente
do parassimptico, mediado em especial, pelo nervo vago; o nervo vago, cujo
neurotransmissor acetilcolina (ACh) (via colinrgica), inerva vrios componentes ou
27
rgos do sistema imunolgico (sistema retculo endotelial), como linfonodos, fgado e
bao; a ativao do vago leva a reduo da produo de citocinas pelo bao de forma
significativa, e como consequncia uma reduo intensa da resposta inflamatria (em
modelos de inflamao sptica e assptica). No reflexo inflamatrio, o vago o
elemento mais importante no brao eferente.
No entanto, pouco se sabe sobre a regulao do crebro por vias eferentes do vago
baseada nos nervosos colinrgicos anti-inflamatrios. Os componentes anatmicos desta
via incluem os neurnios pr-ganglionares originrios do ncleo motor dorsal dos
neurnios vago e ps-ganglionares localizados nos gnglios do plexo mesentrico
celaco superior, que projeta para o bao atravs do nervo esplnico (Rosas-Ballina et
al., 2008).
Estudos em animais indicam que o neurotransmissor liberado pelo nervo vago, a
ACh, capaz de inibir a produo de citocinas pelos macrfagos localizados no bao,
ligando-se aos receptores do tipo nicotnico, mais especificamente, receptores -7
nicotnicos de ACh (7nAChR) (Pavlov et al., 2009; Olofsson et al., 2012).
Ainda que ambos os receptores para ACh, nicotnicos e muscarnicos, sejam
encontrados nos macrfagos, somente os 7nAChR exercem funo relevante na via
anti-inflamatria colinrgica (Wang et al., 2003; Pavlov et al., 2006; Bencherif et al.,
2011). Pesquisas com camundongos knockout para o 7nAChR mostraram claramente,
in vivo, o importante papel dessa subunidade na via anti-inflamatria colinrgica: esses
animais so mais sensveis a estmulos inflamatrios porque liberam maiores
quantidades de TNF-, IL-1, IL-6 no sangue quando comparados com animais
selvagens; no se observa significativa reduo da produo de citocinas no bao e no
fgado (TNF-, IL-1, IL-6, IL-8, e HMGB1) por meio da estimulao eltrica do nervo
vago; macrfagos peritoniais isolados desses animais no respondem ACh nem
28
nicotina, e quando estimulados, continuam a produzir TNF- mesmo na presena desses
ligantes (Wang et al., 2004; Rosas-Ballina et al., 2008).
3.3 Acetilcolina
A ACh o neurotransmissor das junes neuromusculares, sistema nervoso
autnomo e alguns neurnios do SNC. No sistema nervoso autnomo, o transmissor
das fibras pr e ps-ganglionares parassimpticas e fibras pr-ganglionares simpticas,
controlando inmeras funes mantenedoras da homeostase como a contrao da
musculatura gstrica, ritmo cardaco e secreo de alguns hormnios. No SNC, a ACh
parece estar envolvida em processos cognitivos como ateno, memria, aprendizado e
viglia (Gold, 2003; Pepeu e Giovaninni, 2004; Sarter et al., 2005).
A biossntese da ACh ocorre no citosol do terminal dos neurnios colinrgicos
onde a colina acetilada pela enzima colina acetiltransferase (ChAT) utilizando acetil-
CoA como doador de grupo acetil (Scagnelli et al., 1991; Ribeiro et al., 2006).
Liberao eficiente de ACh a partir de terminaes nervosas depende da sua
armazenagem em vesculas sinpticas, uma etapa dependente da atividade de um
transportador vesicular de acetilcolina (VAChT). O VAChT uma glicoprotena de
vesculas sinpticas que apresenta 12 domnios transmembrana e possui homologia com
os transportadores vesiculares de monoaminas (Parsons et al., 1993; Erickson et al,
1994; Roghani et al., 1994; Reimer et al., 1998).
Aps ser liberada no terminal sinptico, a ACh interage com seus receptores e
rapidamente degradada pela acetilcolinesterase (AChE), a colina novamente recaptada
29
para o terminal pr-sinptico pelo transportador de colina de alta afinidade (CHT1). A
inativao da acetilcolina realizada pela ao da AChE. Esta enzima catalisa a
converso da molcula de acetilcolina em acetato e colina (Yamamura e Snyder, 1973;
Collier e Ilson, 1977; Rand, 2007; Ribeiro et al., 2006).
A fim de estudar o papel da acetilcolina no desenvolvimento de alteraes
neurolgicas e imunolgicas em fase tardia aps a sepse, foram utilizadas duas
estratgias: aumentar ou diminuir os nveis de ACh, utilizando respectivamente:
donepezila e animais knockdown para o VAChT (VAChT KD).
3.3.1 Donepezila
Donepezila quimicamente conhecido como cloridrato de ()-2,3-diidro-5,6-
dimetoxi-2-[[1-(fenilmetil)-4-piperidinil]metil]-1H-inden-1-ona, sua frmula molecular
C24H29NO3 HCl, e seu peso molecular 415,96. Foi a segunda medicao aprovada
nos Estados Unidos para o tratamento de Alzheimer (Rogers et al., 1996).
Seus efeitos clnicos so resultantes da inibio da AChE, o que leva ao aumento
da concentrao extracelular de acetilcolina no crtex cerebral e hipocampo (Giacobini,
1993; Francis et al., 1999; Wilkinson, 1999). um inibidor reversvel de longa durao,
conhecido para melhorar a memria e a funo cognitiva (Hansen et al., 2008). Estudos
demonstraram que o uso crnico da donepezila modula positivamente receptores
colinrgicos nicotnicos, e tem capacidade neuroprotetora (Takada-Takatori et al.,
2008).
30
Os eventos adversos mais comuns da donepezila, bem como o de outros inibidores da
colinesterase, so nuseas, vmitos, diarreia e tontura, todos os quais so os sintomas
ligados hiperestimulao colinrgica (Rogers et al., 1998a; Burns et al., 1999). Estes
efeitos so dose-relacionados e depender em grande parte das concentraes plasmticas
(Imbimbo, 2001). Quando a donepezila administrada por via oral, ela bem absorvida e
atinge a concentrao mxima no plasma em 3-4 horas (Jann et al., 2002).
A donepezila vem sido utilizada em diversos ensaios clnicos, demonstrando
melhorar a funo cognitiva em pacientes para uma ampla gama de gravidade Alzheimer,
de muito leve, moderada a grave, mostrando tambm um possvel efeito anti-inflamatrio
(Rogers et al., 1996; Rogers et al., 1998b; Seltzer et al., 2004; Reale et al., 2005; Winblad
et al., 2006; Tsuno, 2009).
Diversos estudos em animais utilizaram donepezila para hiperestimular a
transmisso colinrgica e apresentaram uma melhora na neurognese hipocampal e na
funo cognitiva em roedores, mostrando seu efeito anti-inflamatrio (Kaneko et al.,
2006; Kotani et al., 2008; Narimatsu et al., 2009; Inanaga et al., 2010; Bruel-Jungerman
et al., 2011; Itou et al., 2011; Yu et al., 2015).
3.3.2 VAChT
Em 2006, Prado e colaboradores caracterizaram um camundongo geneticamente
modificado com diminuio (knockdown) na expresso do gene que codifica a protena
VAChT. O gene da protena VAChT fica no primeiro ntron do gene da protena ChAT.
importante ressaltar, entretanto, que a queda na transcrio de mRNA (RNA
31
mensageiro) foi especfica para a VAChT, no havendo alterao na expresso nos
nveis de mRNA para a ChAT.
A anlise do crtex cerebral, estriado, medula espinhal e hipocampo revelou que
animais VAChT KD homozigoto possuem uma diminuio de 65-70% na expresso da
VAChT, em relao aos animais VAChT wild type (WT). A reduo na expresso da
VAChT teve consequncia direta sobre a quantidade de ACh liberada no sistema
nervoso central (Prado et al., 2006; Lima et al., 2010; Pinheiro et al., 2015).
Diversos estudos vm utilizando os animais VAChT KD como uma forma de
diminuir a ACh liberada na fenda e consequentemente diminuir a transmisso
colinrgica (Guidine et al., 2008; Lima et al., 2010; Capettini et al., 2011; Schmid et al.,
2011; Roy et al., 2012; Rodrigues et al.,2013; Pinheiro et al., 2015).
32
4. Materiais e Mtodos
4.1 Animais
Foram utilizados camundongos Balb/c machos e camundongos homozigotos
mutantes VAChT KD e seus WTs, com 8 semanas, pesando 20-25 g, livres de
patgenos especficos (SPF) provenientes do Biotrio Central da Faculdade de
Medicina da Universidade de So Paulo. Mutantes VAChT KD utilizados neste estudo
foram geradas por ratos heterozigotos intercruzados. Estes camundongos mostraram
uma reduo de aproximadamente 65% nos nveis de VAChT no sistema nervoso e
tambm em outros rgos (Pinheiro et al., 2015), que est correlacionado com a reduo
dos nveis de ACh (Prado et al., 2006; Lima et al., 2010).
Os camundongos foram mantidos em gaiolas, em local com temperatura e ciclo de
luz controlado, recebendo gua e comida ad libitum, e permaneceram durante o
experimento no Biotrio de Manuteno do LIM 51 Disciplina de Emergncias
clnicas, sobre responsabilidade do bilogo Antnio dos Santos Filho.
Todos os procedimentos foram realizados de acordo com o Guia para o Cuidado e
Uso de Animais de Laboratrio publicado pelo US National Institutes of Health. Nosso
projeto recebeu aprovao do Comit de tica em Pesquisa da Faculdade de Medicina
da Universidade de So Paulo. Protocolo de Pesquisa no 289/12.
33
4.2 Experimentos
Este estudo foi divido em trs: Experimento Agudo, Experimento Crnico e
Efeito da acetilcolina na evoluo tardia da sepse.
4.2.1 Experimento Agudo
A fim de verificar o efeito da gravidade da sepse na interao entre SNC e sistema
imunolgico os camundongos Balb/c foram submetidos ao procedimento cirrgico para
induzir a sepse em diferentes gravidades (grave, moderado e leve), 6 horas aps foi
realizado o teste comportamental SHIRPA e logo aps os animais foram sacrificados
por inalao de dixido de carbono (CO2). O sangue foi colhido por puno cardaca, e
transferidos para tubos contendo EDTA, centrifugados e o plasma foi separado, para
dosagem de S100 e de citocinas. O crebro foi removido, hipocampo foi isolado e
congelado para posterior anlise de citocinas. Os baos foram colhidos em condies
asspticas, pesados, divididos em dois pedaos, um no qual foi congelado para posterior
anlise de citocinas e o outro, pesado e mantido em gelo at o isolamento dos linfcitos.
34
4.2.2 Experimento Crnico
Para conhecer o efeito crnico, os camundongos Balb/c foram submetidos ao
procedimento cirrgico para induzir a sepse (leve). O teste comportamental SHIRPA foi
realizado 6 horas e 15 dias aps o CLP. Aps os 15 dias os camundongos foram
sacrificados por inalao de CO2. O sangue foi colhido por puno cardaca, e
transferidos para tubos contendo EDTA, centrifugados e o plasma foi separado para
dosagem de S100 e citocinas. O crebro foi removido, hipocampo foi isolado e
congelado para posterior anlise de citocinas. Os baos foram colhidos em condies
asspticas, pesados, divididos em dois pedaos, um no qual foi congelado para posterior
anlise de citocinas e o outro, pesado e mantido em gelo at o isolamento dos linfcitos.
Outros animais foram sacrificados para obteno do bao para anlise histolgica
demonstrativa.
4.2.3 Efeito da acetilcolina na evoluo tardia da sepse
Com intuito de verificar o efeito da ACh no processo inflamatrio em fase tardia
da sepse utilizamos donepezila, um inibidor da acetilcolinesterase, e animais
homozigotos mutantes VAChT KD, que possuem uma diminuio da expresso da
VAChT.
Desta forma, camundongos Balb/c receberam a droga donepezila (5 mg/kg/dia,
oralmente) sete dias antes do procedimento cirrgico (CLP leve) at o dia do sacrifcio.
35
Alm disso, camundongos homozigotos mutantes VAChT KD foram submetidos ao
CLP leve. O teste comportamental SHIRPA foi realizado 6 horas aps o CLP. Aps os
15 dias os camundongos foram sacrificados por inalao de CO2. O sangue foi colhido
por puno cardaca, e transferidos para tubos contendo EDTA, centrifugados e o
plasma foi separado para dosagem de citocinas. O crebro foi removido, hipocampo foi
isolado e congelado para posterior anlise de citocinas. Os baos foram colhidos em
condies asspticas, pesados, divididos em dois pedaos, um no qual foi congelado
para posterior anlise de citocinas e o outro, pesado e mantido em gelo at o isolamento
dos linfcitos.
4.3 Ligao e perfurao cecal
Os animais foram anestesiados com uma mistura de cetamina (80 mg/kg) e
xilasina (10 mg/kg), intraperitoneal (i.p.). CLP foi induzida como descrito previamente
(Soriano et al., 2002). Sob condies asspticas, uma laparotomia mediana de 2 cm foi
realizada para permitir a exposio do ceco. 50% do ceco foi ligado e subsequentemente
perfurado por uma nica puno com uma agulha de calibre 21 na rea menos
vascularizada (CLP leve), ou 100% do ceco foi ligado e subsequentemente perfurado
trs vezes (CLP moderado) ou cinco vezes (CLP grave), todos com uma agulha calibre
21 na rea menos vascularizada. Em seguida, o ceco foi gentilmente comprimido at a
extruso de contedo fecal a partir dos locais de perfurao. O ceco foi devolvido para a
cavidade peritoneal e a laparotomia foi fechada com fio de seda 4,0. Os camundongos
sham-operados foram submetidos a todos os procedimentos cirrgicos, mas o ceco no
36
foi nem ligado, nem perfurado. Os animais foram devolvidos para suas gaiolas com
livre acesso a gua e comida. Os animais foram monitorados trs vezes por dia, e as
taxas de sobrevida foram determinadas para 360 horas (15 dias).
4.4 SHIRPA
Os animais foram submetidos ao teste comportamental SHIRPA, que foi
concebido como uma bateria de mltiplos testes usados para estudos longitudinais com
diretrizes e materiais padronizados (Rogers et al., 1997), afim de avaliar a presena de
alteraes cerebrais. O quadro primrio de SHIRPA consiste em uma srie de
observaes, reflexos e funes bsicas sensrio-motoras que fornece um perfil
funcional e comportamental pela observao avaliativa do desempenho individual.
O protocolo de SHIRPA foi usado para avaliar mudanas comportamentais
durante o curso da sepse. Para o propsito de anlise, os parmetros individuais
avaliados pelo SHIRPA foram agrupados em cinco categorias funcionais (estado
neuropsiquitrico, comportamento motor, funo autonmica, tnus e fora muscular;
reflexo e funo sensorial) de acordo com Lackner e colaboradores (2006),
determinando uma contagem global e cinco domnios de contagem. O reflexo e domnio
sensorial envolvem o posicionamento visual, reflexo auricular, reflexo corneal, presso
no dedo da pata, e reflexo de endireitamento. O estado neuripsiquitrico envolve
atividade espontnea, excitao de transferncia, escape ao toque, passividade
posicional, medo, irritabilidade, mordida e vocalizao. O comportamento motor
envolve atividade locomotora, posio corporal, tremores, maneira de andar, elevao
37
plvica, elevao da cauda, ondulao do tronco, manobra do arame, agarramento dos
membros, e geotaxia negativa. Funo autonmica envolve ritmo respiratrio,
fechamento da plpebra, irritao cutnea, cor da pele, ritmo cardaco, lacrimejao e
salivao. Envolve tnus muscular e fora, tnus corporal, tnus dos rgos, e tnus
abdominal.
4.5 ELISA
Utilizamos o teste imunoenzimtico ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent
Assay) para a determinao quantitativa de S100 em plasma de camundongos,
SEA567Mu (Cloud-Clone Corp). O plasma foi diludo 1:2 com PBS 0,01M.
Para a determinao nveis de citocinas 100mg dos tecidos congelados, bao e
hipocampo, foram pulverizado em nitrognio lquido. As amostras foram
homogeneizadas em Triton-X100 a 150 mM de NaCl, 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 1% de
NP40, oxibato de sdio a 1%, 0,1% de SDS e inibidores de enzima proteoltica
(40ug/mL de fluoreto de fenil-metil-sulfonilo 1 mM, Sigma, St , Louis, MO). Depois da
separao de debris atravs da centrifugao durante 40 minutos a 10000 rpm, os
sobrenadantes foram recolhidos e a concentrao de protena foi determinada pelo
mtodo de Bradford (BioRad, Hercules, CA). As amostras foram mantidas a -80 at
serem analisadas.
A concentrao da interleucina-6 (IL-6), interleucina-1 (IL-1), fator de necrose
tumoral (TNF-) e interleucina-10 (IL-10), do bao e hipocampo do experimento
agudo foram realizadas com kit da R&D Systems (Minneapolis, MN, USA).
38
A concentrao das IL-1, IL-1, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12p40, IL-12p70, MIP-1,
MIP-1 e TNF-, no bao, no hipocampo e no plasma, foi determinada pela tecnologia
MilliPlex (# MCYTOMAG-70K, Merck KGaA, Darmstadt, Germany). Os ensaios
foram realizados de acordo com as instrues do fabricante. As amostras foram
analizadas no sistema MagPix, e os dados foram coletados pelo software Luminex
xPONENT.
4.6 Histologia e Tunel
Os cortes histolgicos foram utilizados para fins demonstrativos. Utilizamos
camundongos balb/c submetidos ao CLP leve. Os animais foram sacrificados 15 dias
aps o CLP, o bao foi coletado e perfundido com formol 10%. Os baos foram ento
processados e, a partir destes, produziu-se cortes histolgicos de 5m. As lminas
contendo os cortes histolgicos foram fixadas com lcool (absoluto, 95 e 70), lavadas
com gua corrente e incubadas com hematoxilina de Harris por um minuto para
colorao de ncleos (hematoxilia-eosina HE). Aps lavagem com gua corrente, as
lamnulas foram submetidas a banho com diferenciador (HCl 1%), banho de gua
corrente, e banho de gua amoniacal (hidrxido de amnia 1%), antes de nova lavagem
com gua corrente. Em seguida, as lamnulas foram submetidas segunda desidratao
com lcool 95 e incubadas com uma soluo de eosina + floxina (composio em
mL/L: eosina 1% 111,73; floxina 1% 11,17; lcool 95 871,51; cido actico glacial
5,59) por 35 segundos. A seguir, as lamnulas sofreram novas desidrataes com lcool
(trs vezes com lcool 95e quatro com absoluto) para, finalmente, passarem por
39
lavagem com xilol (trs vezes) e montagem em lmina com resina sinttica para
fixao.
Para a avaliao das clulas em apoptose, utilizou-se o mtodo de TUNEL
(Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling), conforme o protocolo
do kit: In Situ Cell Death Detection Kit, POD (Ref. 11684817910, Version 13, Roche).
As imagens dos cortes histolgicos e do ensaio de TUNEL foram adquiridas por
cmera Nikon acoplada ao microscpio ptico Leica (Q500, iW, Cambridge, UK).
4.7 Isolamento de Linfcitos
A parte do baso destinada para o isolamento de linfcitos foi pesada e colocada
entre duas lminas autoclavadas fosca que foram gentilmente pressionadas em direes
opostas para dissociar o tecido. Quando o tecido do rgo comeou a dissociar, as
lminas foram mergulhadas em 8 mL de PBS numa placa de Petri at que apenas o
tecido conjuntivo se manteve. A suspenso de clulas foi transferida assepticamente
para um tubo de centrfuga de 15 mL estril. As suspenses de clulas do bao foram
centrifugadas a 400g durante 10 min e em seguida ressuspensas em PBS. Os eritrcitos
foram removidos a partir de suspenses de clulas de bao por uma breve exposio (5-
10 min) de 1 mL de Tris NH4Cl em gelo e as clulas foram em seguida centrifugadas a
400g durante 10 min e ressuspensas em 3 mL de PBS.
40
4.8 Caracterizao dos linfcitos
Foram caracterizados cinco tipos de linfcitos: Linfcitos T citotxicos (CD3+,
CD4-, CD8+); Linfcitos T auxiliares (CD3+, CD4+, CD8-); Linfcitos B (CD3+,
CD19+); Clulas T reguladoras (CD3+, CD4+, CD25+) e Clulas Th17 (CD3+, IL17+).
Os linfcitos T auxiliares e linfcitos T citotxicos (1106 clulas por mL) foram
incubados durante 30 min a 4C com anti-CD3 (conjugado com FITC), anti-CD4
(conjugada com PE) e anti-CD8 (conjugada com PE/Cy5) anticorpos diludos em PBS
contendo 2% de soro fetal bovino inativado. Outros linfcitos foram incubadas durante
30 min a 4C com os anticorpos anti-CD3 (conjugado com FITC), anti-CD4 (conjugada
com PE), anti-CD19 (conjugado com PE/Cy7), anti-CD25 (conjugado com APC/Cy7) e
anti-IL-17A (conjugado com APC), diludos em tampo de permeabilizao. Todas as
anlises foram realizadas em um citmetro de fluxo EasyCyte 8HT (Guava, Hayward,
CA) com um mnimo de 5000 eventos. As anlises foram executadas em Software
Express Pro Guava.
4.9 Morte celular e ciclo celular
Aps a isolao de linfcitos, as clulas foram lavadas com PBS gelado e
ressuspensas em tampo de ligao a 4C. A concentrao das clulas foi ajustada para
1x106 clulas/mL. Foi adicionado a 1,5mL desta suspenso, 100L de Alexa Fluor 647-
conjugado recombinante com Anexina V (BioLegend). As clulas foram incubadas por
41
15 minutos a temperatura ambiente no escuro. Imediatamente aps o perodo de
incubao, foi adicionado 5 L de iodeto de propdeo (PI) e as clulas foram analisadas
por citometria de fluxo.
Para a anlise de fragmentao do DNA, 1x106 clulas foram ressuspensas em
0,2mL de tampo de Lise (0,1% de citrato de sdio e 0,1% Triton X-100) contendo
50mg/mL de PI. As clulas foram incubadas no escuro, a 4C por 24 horas, e usadas
para a anlise de fragmentao do DNA.
No ciclo celular, 1x106 clulas foram fixadas em 1 mL de etanol 70% por 2 horas.
Aps este perodo, foram centrifugadas, lavadas em PBS e ressuspensas em 500L de
tampo contendo 0,1% citrato de sdio, 0,1% Triton X-100, 50g/mL de PI e 0,3mg/ml
de RNase. As clulas foram incubadas por 30 minutos 37 C e posteriormente foram
analisadas por citometria de fluxo.
4.10 Anlise estatstica
Os dados so apresentados como mdia erro padro da mdia (EPM). As
anlises foram realizadas utilizando InStat Statistical Software (GraphPad, La Jolla, CA,
EUA). Para anlise da curva de sobrevida foi utilizado o teste de Log rank. Para anlise
estatstica de comparao de mdias do teste comportamental SHIRPA, no experimento
agudo e utilizando animais VAChT KD foi utilizado o teste Kruskal-Wallis com post
hoc Dunns e nos experimentos crnico e com donepezila utilizou-se Mann Whitney. As
comparaes entre os grupos experimentais, nos experimentos agudo e VAChT KD,
foram realizadas utilizando o teste ANOVA com post hoc Tukey, nos experimentos
42
crnico e com donepezila utilizou-se o teste t. Por fim, para as correlaes utilizou-se o
teste de Person. Em todos os testes foram considerados como diferena significativa os
grupos que obtiverem p
43
5. Resultados
5.1 Experimento Agudo
5.1.1 Anlise da sobrevida nas diferentes gravidades do CLP
Os resultados da curva de sobrevida das diferentes gravidades de CLP esto
apresentados na Figura 01. Uma taxa de sobrevida de 100% do grupo sham foi
observada. O grupo CLP leve apresentou uma taxa de sobrevida de 90%, o grupo CLP
moderado 40% e no grupo CLP grave apenas 20% de sobrevida, no final dos cinco dias
at o 15 dia. A taxa de sobrevida foi significativa entre os grupos CLP moderado e
CLP grave em relao ao grupo sham. Alm disso, o grupo CLP grave foi diferente do
grupo CLP leve.
Figura 01. Curva de sobrevida nas diferentes gravidades de CLP. Os animais foram observados por 15 dias, e a mortalidade foi registrada a cada 8h. Teste Log-rank, n=10, * p 0,05 quando comparado com o grupo sham e # quando comparado ao CLP leve.
44
5.1.2 Alteraes neurolgicas nas diferentes gravidades do CLP
Para avaliao das alteraes neurolgicas foram realizados o teste
comportamental SHIRPA, a anlise do biomarcador srico, S100, e a dosagem de
algumas citocinas no hipocampo.
Figura 02 ilustra o desempenho dos camundongos Balb/c 6h aps a induo da
sepse nas cinco categorias funcionais distintas: reflexo e funo sensorial (A), estado
neuropsiquitrico (B), comportamento motor (C), funo autnoma (D) e tnus e fora
muscular (E). A soma das pontuaes de todas as categorias funcionais mostrada no
'Total' (F). Houve uma diminuio no reflexo e funo sensorial, estado
neuropsiquitrico e comportamento motor entre os grupos CLP moderado e CLP grave
em relao ao grupo sham. Estes mesmos grupos tambm mostraram um aumento na
funo autnoma. No entanto, no mostramos diferenas significativas entre os grupos
de acordo com o tnus e fora muscular. Finalmente, apresentamos uma diminuio na
soma das pontuaes de todas as categorias funcionais nos grupos CLP moderado e
CLP grave em relao ao grupo sham.
45
Figura 02. Teste comportamental SHIRPA 6 horas aps o CLP em diferentes gravidades. Aps 6h do CLP foi analisado o comportamento atravs do protocolo SHIRPA. Foi divido em cinco categorias funcionais distintas: reflexo e funo sensorial (A), estado neuropsiquitrico (B), comportamento motor (C), funo autnoma (D) e tnus e fora muscular (E). A soma dos escores de todas as categorias est representada como Total (F). Os dados esto apresentados com mdia EPM, 10 animais por grupo. Kruskal-Wallis test e post hoc Dunns, *p0,05 quando comparado com sham.
A Figura 03 mostra que os nveis plasmticos de S100 foram significativamente
aumentados nos grupos CLP moderado e CLP grave em relao ao grupo sham e ao
grupo CLP leve.
46
Figura 03. Os nveis plasmticos de S100 6 horas aps o CLP. Aps 6 horas do CLP os animais foram sacrificados, o plasma foi removido e os nveis de S100 foram medidos por ELISA. Os dados so apresentados como mdia EPM, dez camundongos por grupo. ANOVA e post hoc Tukey, *p0,05 quando comparado com o grupo sham e #p0,05 quando comparado ao grupo CLP leve.
Quantificamos as citocinas: IL-6, IL-1, TNF- e IL-10 no hipocampo. Estas
citocinas fornecem um perfil inflamatrio aps a CLP nos tecidos. Porm no hipocampo
(Figura 04) no observamos nenhuma diferena estatstica em nenhuma das citocinas
quantificadas.
Figura 04. Nveis de citocinas no hipocampo 6 horas aps o CLP. Aps 6 horas do CLP os animais foram sacrificados, o crebro foi removido, o hipocampo isolado e os nveis de IL-6 (A), IL-1 (B), TNF- (C) e IL-10 (D) foram medidos por ELISA. Os dados so apresentados como mdia EPM, dez animais por grupo. ANOVA e post hoc Tukey.
47
5.1.3 Perfil das clulas no bao de diferentes gravidades do CLP
Os baos dos camundongos foram removidos 6 horas aps o CLP, os pesos foram
registrados na Figura 05 (A), no apresentando diferena significativa entre os grupos.
A Figura 05 (B) mostra a relao entre o peso do bao/ peso do corpo, que tambm no
foi observado nenhuma diferena significativa. Os baos dos camundongos foram
processados e o nmero de clulas foi quantificado por citometria de fluxo, mostrado na
Figura 05 (C), onde no podemos verificar diferena estatstica entre os grupos.
Figura 05. Peso do bao 6 horas aps o CLP. Aps 6 horas do CLP os animais foram sacrificados, o bao foi coletado, pesado e por citometria de fluxo o nmero de clulas foi quantificado. (A) peso do bao (B) relao do peso do bao/peso do corpo (C) nmero de clulas no bao. Os dados so apresentados como mdia EPM, dez animais por grupo. ANOVA e post hoc Tukey.
Os linfcitos foram diferenciados e as contagens no bao dos animais esto
apresentadas na Figura 06: linfcito T citotxico (A); linfcitos T auxiliares (B);
linfcitos B (C); clulas T reguladoras (D) e clulas Th17 (E). No houve diferena
significativa em qualquer grupo em qualquer tipo de linfcito.
Na Figura 07, observamos que a correlao entre os linfcitos com o biomarcador
de encefalopatia sptica o S100 foi uma correlao significativa e positiva em linfcito
T citotxico e linfcito T auxiliar.
48
Figura 06. Caracterizao de linfcitos no bao 6 horas aps o CLP. Aps 6 horas do CLP os animais foram sacrificados, o bao foi removido e caracterizado cinco tipos de linfcitos por citometria de fluxo: linfcito T citotxico (A); linfcitos T auxiliares (B); linfcitos B (C); clulas T reguladoras (D) e clulas Th17 (E). Os dados so apresentados como mdia EPM, dez animais por grupo. ANOVA e post hoc Tukey.
49
Figura 07. Correlao entre os linfcitos e o S100 6 horas aps o CLP. Linfcito T citotxico (A); linfcitos T auxiliares (B); linfcitos B (C); clulas T reguladoras (D), clulas Th17 (E). Pearson, *p0,05.
Podemos observar nas citocinas quantificadas no bao (Figura 08) um aumento
significativo na quantidade de IL-6 aps a sepse no grupo CLP grave em relao ao
grupo sham e CLP leve. O nvel de IL-1 aumentou significativamente no grupo CLP
moderado e CLP grave quando comparados ao grupo sham e CLP leve. Os nveis de
TNF- no diferenciaram. No entanto, o nvel de IL-10, foi aumentado
50
significativamente no CLP moderado em relao ao sham e no CLP grave em
comparao com sham e CLP leve.
Figura 08. Nveis de citocinas no bao 6 horas aps o CLP. Aps 6 horas do CLP os animais foram sacrificados, o bao foi removido e os nveis de IL-6 (A), IL-1 (B), TNF- (C) e IL-10 (D) foram medidos por ELISA. Os dados so apresentados como mdia EPM, dez animais por grupo. ANOVA e post hoc Tukey, *p 0,05 quando comparado com o grupo sham e #p 0,05 quando comparado com o grupo CLP leve.
5.1.4 Perfil inflamatrio nas diferentes gravidades do CLP
O perfil inflamatrio nas diferentes gravidades do CLP foi observado atravs da
quantificao de algumas citocinas no plasma (Figura 09). Relatamos um aumento no
grupo CLP grave em relao ao sham, CLP leve e moderado em IL-1, IL-6, IL-10, IL-
12p40, MIP-1 e TNF-. Um aumento no grupo CLP grave em relao ao sham e CLP
leve foi observado em IL-4 e MIP-1. O grupo CLP moderado foi aumentado em
relao ao sham e CLP leve em IL-6 e em relao apenas ao sham em MIP-1 e MIP-
1.
51
Figura 09. Nveis de citocinas no plasma 6 horas aps o CLP. Aps 6 horas do CLP os animais foram sacrificados, o plasma isolado e os nveis de IL-1 (A), IL-1 (B), IL-4 (C), IL-6 (D), IL-10 (E), IL-12p40 (F), IL-12p70 (G), MIP-1 (H), MIP-1 (I) e TNF- (J), foram dosados por tecnologia MilliPlex. Os dados so apresentados como mdia EPM, cinco animais por grupo. ANOVA e post hoc Tukey, *p0,05 quando comparado com o grupo sham, #p0,05 quando comparado com o grupo CLP leve e p0,05 quando comparado com o grupo CLP moderado.
5.2 Experimento Crnico
5.2.1 Alteraes neurolgicas em sobreviventes do CLP
Em relao ao teste comportamental SHIRPA, seis horas aps a induo da sepse,
observamos na Figura 10 uma diminuio entre os grupos CLP leve em relao ao
grupo sham no reflexo e funo sensorial, estado neuropsiquitrico, comportamento
52
motor e o score total. Um aumento na funo autnoma, tambm foi observado. No
entanto, a categoria tnus e fora muscular no houve diferena estatstica.
A Figura 11 ilustra o teste comportamental SHIRPA 15 dias aps a induo da
sepse. Observamos que houve apenas uma diminuio significativa no reflexo e funo
sensorial no grupo CLP leve em relao ao grupo sham.
Figura 10. Teste comportamental SHIRPA 6 horas aps o CLP. Aps 6h do CLP foi analisado o comportamento atravs do protocolo SHIRPA. Foi divido em cinco categorias funcionais distintas: reflexo e funo sensorial (A), estado neuropsiquitrico (B), comportamento motor (C), funo autnoma (D) e tnus e fora muscular (E). A soma dos escores de todas as categorias est representada como Total (F). Os dados esto apresentados com mdia EPM, 10 animais por grupo. Mann Whitney, *p0,05.
53
Figura 11. Teste comportamental SHIRPA 15 dias aps o CLP. Aps 15 dias do CLP foi analisado o comportamento atravs do protocolo SHIRPA. Foi divido em cinco categorias funcionais distintas: reflexo e funo sensorial (A), estado neuropsiquitrico (B), comportamento motor (C), funo autnoma (D) e tnus e fora muscular (E). A soma dos escores de todas as categorias est representada como Total (F). Os dados esto apresentados com mdia EPM, 10 animais por grupo. Mann Whitney, *p0,05.
Os nveis plasmticos de S100 15 dias aps o CLP podem ser observados na
Figura 12. Mostramos que o grupo CLP encontra-se aumentado quando comparado com
o sham.
54
Figura 12. Os nveis plasmticos de S100 15 dias aps o CLP. Aps 15 dias do CLP os animais foram sacrificados, o plasma foi removido e os nveis de S100 foram medidos por ELISA. Os dados so apresentados como mdia EPM, dez camundongos por grupo. Teste t, *p 0,05.
Ns quantificamos as citocinas IL-1, IL-1, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12p40, IL-
12p70, MIP-1, MIP-1 e TNF- no hipocampo (Tabela 01) e observamos que o grupo
CLP foi significativamente aumentado somente em IL-6 quando comparado com o
grupo sham.
Tabela 01. Citocinas no hipocampo 15 dias aps CLP.
Nota: Os dados so apresentados com mdia EPM, cinco animais por grupo. Teste t, *p0,05.
55
5.2.2 Perfil das clulas do bao em sobreviventes do CLP
Ns observamos um aumento do peso do bao dos camundongos CLP leve 15
dias aps o CLP (Figura 13 A). A relao entre o peso do bao/ peso do corpo tambm
foi aumentada significativamente (Figura 13B) assim como o nmero de clulas que foi
quantificada por citometria de fluxo (Figura 13C). A Figura 13D ilustra o tamanho do
bao obtido.
Figura 13. Peso do bao 15 dias aps o CLP. Aps 15 dias do CLP os animais foram sacrificados, o bao foi coletado, pesado e por citometria de fluxo o nmero de clulas foi quantificado. (A) peso do bao, (B) relao do peso do bao/peso do corpo, (C) nmero de clulas no bao e (D) imagem do bao. Os dados so apresentados como mdia EPM, dez animais por grupo. Teste t, *p 0,05.
Na Figura 14 est representado o corte histolgico do bao dos camundongos 15
dias aps a induo da sepse por CLP. Observamos na imagem (A) um bao de um
camundongo CLP com a polpa branca bastante aumentada, muitos linfcitos presentes,
quando comparado com o bao do camundongo sham (B). Na imagem (C) mostramos a
56
presena de megacaricitos no bao do CLP, diferentemente do sham, imagem (D). Nas
imagens (E) CLP e (F) sham, observamos a marcao por Tunel, mostrando que a
apoptose esta mais evidente nos animais CLP.
Figura 14. Corte histolgico do bao, 15 dias aps o CLP. Corte histolgico corado ao HE: (A) CLP aumento 200x, (B) sham aumento 200x, (C) CLP aumento 400x, (D) sham aumento 400x. Marcao de apoptose ao mtodo de TUNEL: (E) CLP aumento 400x, (F) sham aumento 400x. As numeraes representam: 1- Polpa branca; 2- Polpa vermelha; 3- Megacaricitos; 4- clulas em apoptose.
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A caracterizao dos linfcitos no bao de camundongos 15 dias aps o CLP est
apresentada na Figura 15. Observamos um aumento significativo em linfcito T
citotxico, linfcitos T auxiliares, linfcitos B e clulas T reguladoras nos grupos CLP
leve comparados ao sham. No houve diferena significativa em clulas Th17.
A correlao dos linfcitos com o biomarcador de encefalopatia sptica, o S100,
pode ser observado na Figura 16. Mostramos uma correlao significativa e positiva em
linfcito t citotxico e linfcito T auxiliar. Uma correlao significativa e negativa em
Th17 tambm pode ser observada.
Figura 15. Caracterizao de linfcitos no bao 15 dias aps o CLP. Aps 15 dias do CLP os animais foram sacrificados, o bao foi removido e caracterizado cinco tipos de linfcitos por citometria de fluxo: linfcito T citotxico (A); linfcitos T auxiliares (B); linfcitos B (C); clulas T reguladoras