SÍNTESE DE PEPTÍDEOS EM FASE SÓLIDA (SPFS)

Química Fmoc/tBu

Aline B. Guimarães e Daniel LogradoLaboratório de Bioquímica e Química de Proteínas

junho/2012

SPFS E MERRIFIELD

Ligação de aminoácidos à um suporte sólido adição de

novos resíduos de aminoácidos por reações de

acoplamento síntese do peptídeo desejado ;

1963 = síntese de um tetrapeptídeo, usando um suporte

sólido poroso (trabalho polêmico – metodologia

questionada – produção de impurezas?)

1964 = síntese e purificação de um nonapeptídeo em

cinco dias revolucionou as estratégias de síntese de

peptídeos da época !!

Por sua concepção, o cientista foi agraciado com o Nobel

de Química em 1984!

ROBERT BRUCE MERRIFIELD (1921-2006)

CASO PRÁTICOSíntese de Análogo do peptídeo Pentadactylin

16 resíduos – Gly, Leu, Lys, Ala, Asn,Val e Ser

http://amphibiaweb.org/cgi/amphib_query?where-genus=Leptodactylus&where-species=pentadactylus

Gly-Leu-Leu-Asp-Thr-Leu-Lys-Gly-Ala-Ala-Lys-Asn-Val-Val-Gly-Ser-Leu-Ala-Ser-Lys-Val-Met-Glu-Lys-Leu-NH2

SINTETIZADOR DE PEPTÍDEOSPSSM-8 - SHIMADZU

Compatível com a estratégia Fmoc;

O peptídeo é sintetizado com a porção C-terminal amidada.

VASO DE REAÇÃO

NovaPEG Rink Amide resin

CARACTERÍSTICAS DA RESINA

Partículas quimicamente inertes a todos os solventes e

reagentes usados durante todo o processo de síntese;

Não deve interagir com a cadeia peptídica;

Facilidade de modificação química = o primeiro

aminoácido (da sequência) deve conseguir se ligar

eficazmente ao suporte;

Capacidade de “inchar” = aumento da área tornar

os pontos de reação acessíveis aos solventes e

reagentes .

“LINKER” - ESPAÇADOR

Na síntese Fmoc/tBu, as condições de clivagem não são suficientemente agressivas para quebrar a ligação entre os aminoácidos e a resina importância do linker.

Ligação entre o peptídeo e o linker:estável a tratamentos repetitivos -

remoção do grupo protetor temporário e acoplamento dos aminoácidos;

deve permitir, ao final da síntese a clivagem da ligação peptídeo-resina sem danificar o produto final.

FORMAÇÃO DA LIGAÇÃO PEPTÍDICA

Competição pode gerar produtos indesejáveis!

Leu

Leu

GlyGly

ACOPLAMENTO

No sentido de promover a reação entre o aminoácido a ser adicionado à sequência peptídica e o último resíduo da cadeia (já desprotegido), é necessário ativar previamente o grupo carboxílico livre do aminoácido a incorporar.

O uso de agentes de acoplamento possibilita o aumento da rapidez de reação (mesmo entre aminoácidos estericamente impedidos) e a supressão ou minimização de reações laterais.

ACOPLAMENTO

Racemização no carbono alfa (carboxila) a formação de subproduto (diasterisômero) pode ser evitada com a adição de grupos de proteção!!

NMM Em DMFDMF

GRUPOS DE PROTEÇÃO - TIPOS

TEMPORÁRIO = para aqueles que formam a ligação peptídica (Fmoc);

PERMANENTE = para grupos funcionais dentro de cada cadeia lateral (estes devem ser muito estáveis para suportarem a remoção dos GPT).

CADEIA LATERAL = H, ALQUILA, ARILA

Sem grupo de proteção !

CADEIA LATERAL = OH OtBU

CADEIA LATERAL = COOH COOtBU

CADEIA LATERAL = CONH2Trt

CADEIA LATERAL = SH DEPENDE...

CADEIA LATERAL = GRUPOS BÁSICOS E IMIDAZOL

SAÍDA DO GRUPO Fmoc DO N-TERMINAL

PIPERIDINA

9 CICLOS DEPOIS...

7 CICLOS DEPOIS...

EXTRAÇÃO DOS PEPTÍDEOS

EXTRAÇÃO DOS PEPTÍDEOS• Durante o processo são

geradas espécies catiônicas altamente reativas que podem, a menos que impedidas, reagir e modificar resíduos que contêm grupos funcionais nucleofílicos (Trp, Met, Tyr e Cys).

• Uso de reagentes nucleofílicos (scavengers) para capturar os cátions e impedir tais reações.

Reagentes: anisol, o p-cresol, o etan-1,2-ditiol, o sulfureto de dimetilo e trialquilsilanos.

CLIVAGEM DOS GRUPOS PERMANENTES

Remoção do grupo de proteção do resíduo Asn em condições ácidas radical tritila confere a mudança na cor da solução!

Coleta

PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DOS PEPTÍDEOS SINTÉTICOS

Avaliação : cromatografia líquida;

Espectrometria de massas = confirmação da sequência;

RMN = identificação estrutural e investigação do comportamento conformacional.

INDICA SE A SÍNTESE/PURIFICAÇÃO FOI BEM SUCEDIDA GRAU DE CONFIABILIDADE DO

MATERIAL SINTÉTICO.

CROMATOGRAMA

CONSIDERAÇÕES FINAIS

Vantagens Desvantagens Suporte polimérico insolúvel Fácil remoção de material de

partida ou subprodutos não ligados à resina – lavagem a cada etapa

Pode-se utilizar excesso de reagentes aumento do rendimento

Purificação rápida e parcial a cada etapa

Possibilidade de automatização = combinação de velocidade e praticidade

Reações incompletas e modificações químicas das cadeias lateraiscontaminantes

Possibilidade de agregação: associação intercadeias peptídicas

Racemização provocada pela necessidade de ativar a carboxila alfa dos aminoácidos em meio básico para a formação da ligação peptídica

Não suporta síntese de longas sequências.

RENDIMENTO

Não é 100%, mas

tentamos aumentar a

quantidade de peptídeo

sintetizado com o uso

de um excesso de

reagentes – isso não é

problema, pois o

excesso é lavado a

cada etapa!

REFERÊNCIAS

Machado, A., et al. SÍNTESES QUÍMICA E ENZIMÁTICA DE PEPTÍDEOS: PRINCÍPIOS BÁSICOS E APLICAÇÕES .Quim. Nova, Vol. 27, No. 5, 781-789, 2004.

ESTUDO DA SÍNTESE CONVERGENTE DE PEPTÍDEOS EM FASE SÓLIDA: ABORDAGEM CLÁSSICA E USO DE TEMPERATURA ALTA. - César Manuel Remuzgo Ruiz.: Dissertação de Mestrado USP, São Paulo, 2003.

APPLIED Biosystems – Technical Bulletin Cleavage, Deprotection, and Isolation of Peptides after Fmoc Synthesis

The Chemical Synthesis of Peptides http://nzic.org.nz/ChemProcesses/biotech/12E.pdf

A NEW CONCEPTION OF POLYMERIC SUPPORTS FOR THE SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS: RIGIDITY AND POROSITY AS DETERMINANT FACTORS FOR THE SUCCESS IN INDUSTRIAL APPLICATIONS – Sara Cantone. Tese de Doutorado: Università degli studi di Triest, Itália, 2008.

Advanced Automated Peptide Protein Technologies – Coupling Reagents Thttp://www.aapptec.com/broch/Coupling%20Reagents.pdf

SÍNTESE DE PÉPTIDOS ENVOLVIDOS EM MECANISMOS DE ACÇÃO ANTIBIÓTICA - Sílvia Maria da Silva Pereira Faria. Dissertação de Mestrado: Faculdade de Ciências, Universidade do Porto, 2003

Organic Chemistry -  Clayden, Jonathan; Warren, Stuart; Wothers, Peter; Clayden, Jonathan ; Greeves, Nick. Editora: Oxford Univ Press Usa

Organic synthesis in drug discovery - http://userwww.sfsu.edu/~cberkman/640_org_synth_drug_discov_1.pdf

Muito obrigada!!!