Leveduras e

Produção de

Biomassa

Prof Bernardo Dias

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

EQB353 - MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL

Levedura origem etimológica na palavra “levare”

(crescer ou fazer crescer) primeiras leveduras

descobertas a processos de fermentação

Existem aproximadamente 350 espécies diferentes

de leveduras, separadas em cerca de 39 gêneros.

São largamente encontradas na natureza solo,

superfícies de órgãos dos vegetais, principalmente

em flores e frutos, trato intestinal de animais, líquidos

açucarados e grande série de outros locais

INTRODUÇÃO

Habitat

As leveduras são fungos que se apresentam

predominantemente, sob forma unicelular.

Uma levedura típica células ovais, que se multiplicam

assexuadamente (brotamento ou gemulação) Não

formam corpos de frutificação.

Como células simples, as leveduras crescem e se

reproduzem mais rapidamente do que os bolores.

Leveduras eficientes na realização de alterações

químicas, por causa da sua maior relação área/volume.

A maioria das leveduras não vive no solo adaptação

a ambientes com alto teor de açúcares (néctar das

flores e a superfície de frutas).

As leveduras também diferem das algas, pois não

efetuam a fotossíntese, e igualmente não são

protozoários porque possuem uma parede celular

rígida de quitina.

São facilmente diferenciadas das bactérias em virtude

das suas dimensões maiores e de suas propriedades

morfológicas

Leveduras

Bolores

Penicillium

Aspergillus

Saccharomyces

Trichoderma

Morfologia

Pleomorfismo:

Macroscopicamente:

Trigonopsis variablisSaccharomyces cerevisiae

Saccharomyces

Rhodotrula

Redondas Trigonopsis

Candida

Saccharomyces

Ovais Hansenula

Saccharomyces

Trigonopsis

Cilíndricas Hansenula

Saccharomyces

Kloëckera

Triangulares Trigonopsis

Apiculares Kloëckera

Ogivas Bretanomyces Trigonopsis variablis

Bretanomyces dekkera

Candida albicansSaccharomyces

cerevisiae

Kloëckera

Saccharomyces

cerevisiae

Hansenula

Dimorfismo nos fungos

O que é dimorfismo?

- Alguns fungos apresentam tanto a forma leveduriforme como a forma

filamentosa, sendo considerados dimórficos

Alguns fungos filamentosos em certas condições nutricionais (ambiente

rico em açúcar) podem crescer na forma leveduriforme.

Micologia médica crescimento micelial (22° e 28°C) e leveduriforme

(35°C e 37°C) reversibilidade da morfologia.

Dimorfismo fúngico Histoplasma capsulatum, Blastomyces

dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Sporothrix schenckii.

Dimorfismo nos fungos

Paracoccidioides brasiliensis

Taxonomia – Filo Ascomycota

Subfilo Saccharomycotina

Classe Saccharomycetes

Subfilo Taphrinomycotina

Classe Schizosaccharomycetes

Schizosaccharomyces é um gênero de leveduras de fissão.

É o único gênero na família Schizosaccharomycetaceae, a única família da ordem

Schizosaccharomycetales, que é a única ordem na classe Schizosaccharomycetes

do filo Ascomycota.

A espécie mais bem estudada é S. Pombe.

Tal como a distantemente aparentada Saccharomyces cerevisiae, S. pombe é um

organismo modelo importante no estudo da biologia das células eucariotas.

Taxonomia – Filo Basidiomycota

Leveduras Basidiomicéticas (Bensingtonia, Rhodotorula, Bullera, Cryptococcus,

Rhodotorula e Sporobolomyces – Sporidiobolous) são normalmente encontradas

em substratos que possuam componentes mais complexos.

Leveduras Ascomicéticas (Candida, Saccharomyces, Debaryomyces,

Schizosaccharomyces) são frequentemente encontradas em substratos ou fontes

ricas em açúcares simples (frutos)

Subfilo Agaricomycotina

Classes Tremellomycetes (fungos dimórficos)

Dacrymycetes

Actinomycota x Basidiomycota

Aplicações

LEVEDURA – MODELO DE ESTUDO DA CÉLULA

EUCARIÓTICA

Parede Celular

Ligação Glicosídica

A parede celular das leveduras é composta principalmente por polissacarídeos de

glucose e manose, algumas proteínas e quitina.

Parede Celular

Quitina

Membrana Plasmática

A) Grânulos metacromáticos, constituídos de

polimetafosfato inorgânicos.

B) Reserva de Glicogênio hidratos de carbono

encontrado em células adultas.

C) Grânulos lipóides em quantidade variável com a

espécie de levedura, a idade da célula e o substrato.

D) Mitocôndrias se apresentam com aspecto

filamentoso, constituídos de lipoproteínas com

pequena quantidade de ácido ribonucleico, e contendo

enzimas respiratórias

E) O núcleo é bem definido, pelo menos em células em

vias de reprodução; pequeno, esférico ou reniforme,

de localização variável, associado a vacúolo nuclear.

O Citoplasma

O Núcleo

Mitocôndria

Retículo Endoplasmático;

Ribossomos

Complexo de Golgi; Vacúolo; Lisossomas

Nutrição e Fisiologia das Leveduras

Nutrição é heterotrófica absorção de nutrientes, digestão extracelular

Sob condições anaeróbicas, a via clássica, usada pela maioria das

leveduras, é a de Embden-Meyerhof (via glicolítica clássica), que

resulta na formação de piruvato.

As substâncias orgânicas, de preferência, são carboidratos simples

como D-glicose e sais minerais como sulfatos e fosfatos.

Oligoelementos (ferro, zinco, manganês, cobre, molibdênio e cálcio)

são exigidos em pequenas quantidades.

Temperatura de crescimento abrange uma larga faixa, havendo

espécies psicrófilas, mesófilas e termófilas. Não toleram pH alcalino

Oxidativo: C6H12O6 CO2 + H2O + 36 ATP

Fermentativo: C6H12O6 2 C2H5OH + 2 CO2 + 2 ATP

MetabolismoO2

Reprodução

Reprodução

Candida albicans

Blastoconídio - uma única estrutura

desenvolve-se por brotamento ou

gemulação, com separação posterior

entre este e a célula mãe

Clamidoconídio - as células terminais

ou intercaladas de uma hifa aumentam

de tamanho e desenvolvem paredes

espessas. Têm função de resistência

BROTAMENTO

FISSÃO

DIVISÃO BINÁRIA

ReproduçãoAureobasidium pullulans

Leveduras pretas (melanizadas) – formação de

clamidoconídios

Debaryomyces etchellsii

Outros nomes: Kloeckera faecalis, Pichia etchellsii,

Pichia faecalis, Torulaspora etchellsii, Zygopichia

etchellsii

Formação de Pseudo-hifas

Sporobolomyces roseus

Leveduras vermelhas da

classe Urediniomycetes

Reprodução – brotamento (pseudo-hifas)

Sporobolomyces phyllomatis

a-d CBS 7198.

a. yeast cells on YMoA;

b. pseudohyphae on Dalmau plate (YMoA);

c. germinating yeast cell on PDA;

d. ballistoconidia on CMA.

Reprodução

Reprodução Ascomicetos

Aplicações

- Fermento de pão

- Bebidas

- Etanol Combustível

-Proteína (“Single cell protein”)

Ração animal complemento

nutricional

- Medicamento

Aplicações

-Enzimas

Invertase Lactase

Lipase

- Pró-vitamina A

- Biosurfactantes

Aplicações

Produção de Biomassa

Cn(H2O)n + O2 + NH3 + P, S, K, Na, Mg, Ca, Fe

Substrato Oxigênio Amônia Sais Minerais

(CHNO)n + CO2 + H2O + ∆H

Biomassa Dióxido de Água Calor de reação

carbono

São convertidos por multiplicação

celular biosíntese em:

Objetivo = obter massa microbiana para uso industrial

CRESCIMENTO MICROBIANO

Tempo geração

- variável para os diferentes organismos

- dependente de fatores genéticos e nutricionais e ambientais

• Crescimento em Culturas Contínuas

- Quimiostato

- controle da densidade populacional e a taxa de crescimento

- taxa de diluição e concentração do nutriente limitante (fatores)

- manutenção das células em fase exponencial

- técnica muito utilizada em processos industriais

- crescimento em equilíbrio dinâmico

Crescimento Microbiano

Crescimento Microbiano

• Quimiostato

- Taxa de Diluição Taxa de Crescimento

- densidade controlada pela quantidade do nutriente limitante

Métodos Diretos

• Determinação do número de

células

Contagem ao microscópio;

Contagem de colônias formadas;

Número mais provável

Contagem eletrônica (Contador

Coulter, Citometria de fluxo)

Quantificação Celular

• Determinação da biomassa

microbiana Peso Seco;

Turbidimetria;

Volume de Centrifugado;

Viscosidade

Métodos Indiretos

• Constituintes celulares

Concentração total de N ou C;

ATP;

DNA, RNA;

Conteúdo protéico;

• Dosagem de elementos do

meio de cultura

Substrato;

Consumo de O2;

Produção de CO2;

• Contagem de Células Viáveis

(contagem em placa e diluição seriada)

- coleta de alíquotas de uma cultura microbiana ou amostra ambiental

- utilização do método da diluição seriada

- inóculo em meio sólido (spread plate ou pour plate)

- contagem das colônias formadas (30 e 300 colônias)

- diminuição do erro triplicatas ou quintuplicatas (validação estatística)

Medidas do Crescimento Microbiano

Medidas do Crescimento Microbiano

• Diluição Seriada + Spread Plate

Métodos Diretos

Contagens de colônias

formadas;

• Determinação do número de células

Medidas do Crescimento Microbiano

Medidas do Crescimento Microbiano

• Número Mais Provável (NMP)

- amplamente utilizado em laboratórios de microbiologia

- utilização de volumes decimais de uma dada amostra (10, 1 e 0.1 ml)

- réplicas correspondentes a 5 tubos, observando ou não crescimento

- contagem de tubos positivos – cálculo pela Tabela do NMP

- exemplos: contagem de microrganismos com dada atividade metabólica

atividade nitrificante ou atividade celulolítica

contagem de coliformes fecais e totais em água

Bactérias diazotróficas

Medidas do Crescimento Microbiano

- 95% de confiabilidade estatística da população conter realmente o número de

microrganismos relacionado na tabela.

• Número Mais Provável (NMP)

Medidas do Crescimento Microbiano

• Contagem Total de Células (microscópio)

- Contagem direta no microscópio utilizando câmaras de contagem (amostra fixada

e corada ou a fresco – 10ml da suspensão de células)

- Não diferencia célula viva de célula morta (uso de corante vital)

- Microscopia de contraste de fase para lâminas não coradas (<106 células/ml)

Câmara de Petroff-Hausser

Medidas do Crescimento Microbiano

• Contagem direta das células, usando uma câmara de contagem (ex.

Neubauer)

Vantagens:

◦ É o processo mais direto, econômico e rápido de contagem de

microrganismos

◦ Dá também informação sobre o tamanho e morfologia dos

microrganismos

Desvantagens:

◦ A população deve ser bastante grande para que a contagem seja o mais

real possível devido aos pequenos volumes que se utilizam para contar

◦ É impossível distinguir as células vivas das células mortas

• Turbidimetria

- Quantificação em espectrofotômetro ou colorímetro (660 nm)

- Rápida confecção de uma curva

padrão

- baixa sensibilidade

- células viáveis X células mortas

(sem distinção)

Medidas do Crescimento Microbiano

• Massa de Células (peso seco)

- estimativa através do peso seco

- baixa sensibilidade

- replicata – diminuição da margem de erro

- filtração da cultura líquida, secagem e

pesagem (100-160ºC / 16 horas)

Medidas do Crescimento Microbiano

Métodos Indiretos

• Constituintes celulares

Concentração total de N ou C;

ATP;

DNA;

Conteúdo protéico;

Composto% em peso seco

Bactérias Leveduras Fungos

C 46-52 46-52 45-55

H 10 10 10

O 20 20 20

N 10-14 6-8,5 4-7

S 0,2-1 0,01-0,03 0,1-0,5

P 2-3 0,8-2,6 0,4-4,5

Mg 0,1-0,5 0,1-0,5 0,1-0,3

K, Ca 0,1-0,5 0,1-0,5 0,1-0,5

Na, Fe 0,01-0,1 0,01-0,1 0,01-0,1

Outros traços traços traços

Composição elementar

Métodos Indiretos

• Constituintes celulares

Concentração total de N ou C;

ATP;

DNA, RNA;

Conteúdo protéico;

Métodos Indiretos

• Dosagem de elementos do meio de cultura

Consumo de O2;

Produção de CO2;

• Vantagens:

Tempo de geração curto

Bactérias: 30 min a 2 h

Leveduras: 1 a 3 h

Algas: 2 a 6 h

Fungos filamentosos: 4 a 12 h

Elevado teor de vitaminas

Alto conteúdo protéico

Variedade de fonte de carbono utilizada

Facilidade em realizar alterações genéticas

Instalações

Independe de fatores climáticos

Produção de Biomassa Microbiana

Produção de Biomassa

• Leveduras de panificação

São empregadas linhagens selecionadas de S.

cerevisiae em função:

Características fisiológicas estáveis

Fermentação vigorosa do açúcar na massa

Crescimento rápido

Manutenção de boa qualidade sem

autólise

Alto rendimento no fermentador

Produção de Biomassa

• Leveduras:

Melaço é a principal matéria-prima para a produção de

leveduras tais como S. cerevisiae e C. utilis

É um subproduto da produção do açúcar de cana e

beterraba

O melaço apresenta K, Mg, P, Zn, Fe, Cu, além de vitaminas

(biotina, ác. pantotenico, inositol, tiamina) e aminoácidos

(asparagina, ác. aspártico, alanina, ácido glutâmico e glicina)

Produção de Biomassa

• Leveduras de panificação

Preparo do mosto:

Melaço é diluído ([açúcar]i = 0,5 a 1,5 %p/v)

Acidulado (pH 4,5 a 5,0)

Aquecido

Clarificado por filtração ou sedimentação

Esterilizado (vapor sob pressão)

Fortificado (sais de amônio, uréia sais de fósforo ou ác.

fosfórico, vitaminas) e retirada de SO3 (aeração em

temperatura alta)

• Etapas do processo:

Cultivo do microrganismo

Esterilização

Aeração

Equipamento

Forma de Condução

Recuperação da Biomassa

Centrifugação (Leveduras e Bactérias)

Filtros rotatórios (Fungos Filamentosos)

Secagem

Quebra da parede celular (para SCP)

Produção de Biomassa Microbiana

Produção de Biomassa

• Leveduras de

panificaçãoAltas taxas de aeração e

Sistema em batelada

alimentada com baixo teor

de açúcares favorece

respiração e crescimento

No fim da fermentação, não

se adiciona mais açúcar,

mas continua a aeração por

30–60 min, produção de

trealose.

Atua protegendo a levedura

contra congelamento e

desidratação

Produção de Biomassa

Resolução CNNPA n. 38

Fermento biológico produto obtido de culturas puras de leveduras

(Saccharomyces cereviseae) por procedimento tecnológico adequado e

empregado para dar sabor próprio e aumentar o volume e a porosidade dos

produtos forneados” (ANVISA, 1977).

Classificação:

a) fermento fresco, também denominado: "fermento prensado", "fermento verde"

e "levedura prensada"; obtido depois da concentração, lavagem e

estabilização

b) fermento seco, também denominado: "fermento desidratado" e "levedura

seca“ ocorre a adição dos componentes abaixo, a concentração por

filtração, extrusão suave, e secagem em leito fluidizado a temperatura

ambiente

os fermentos biológicos poderão ser adicionados das seguintes substâncias,

próprias para uso alimentar: - farinhas, amidos e féculas, no máximo 5% p/p; -

óleos e gorduras comestíveis; - sulfato de cálcio; - carbonato de cálcio; - sorbitol;

- Monolaurato de Sorbitana e outras aprovadas pela CNNPA.

Produção de Biomassa

Resolução CNNPA n. 38

Fermento fresco prensado pasta cremosa como manteiga, com textura lisa

e moldável, lembra massa de vidraceiro ou argila úmida. Pode ser adquirido em

lojas de especialidades alimentícias e mercearias de produtos naturais. 70%

umidade, se for mantido em geladeira (4 a 8ºC) se mantém por 15 dias

Para usar esse tipo de fermento esfarelá-lo diretamente na água ou no leite antes

de adicionar qualquer outro ingrediente, em temperaturas entre 20 e 32ºC.

Produção de BiomassaResolução CNNPA n. 38

Fermento seco ativo ou fermento biológico seco a partir da secagem do

fermento fresco por ar quente. É quebrado em pequenas partículas ou grânulos do

tamanho de um alpiste. Pode ser adquirido em mercearias, supermercados e

algumas lojas de conveniências, apresenta umidade entre 7 e 9%, pode ser

conservado a temperatura de 25ºC em embalagem fechada, e estando sob

refrigeração dura de 3 a 4 meses

Uso: O fermento seco ativo deve ser reidratado em água morna (37 a 43ºC) por 10 a

15 minutos. Uma particularidade do fermento seco ativo é deixar a massa um pouco

menos elástica do que quando feita com fermento fresco, sendo preferível no

preparo de massa de pizzas

Produção de BiomassaResolução CNNPA n. 38

Fermento biológico seco instantâneo as

leveduras são desidratadas, permanecem em estado

de dormência. Apresenta-se sob a forma de grânulos

muito pequenos, quase como areia fina, de coloração

creme claro, menores e mais lisos do que o fermento

seco ativo. Desenvolvido para dar ao padeiro agilidade

da reidratação rápida, permitindo que seja misturado

diretamente a farinha e mantendo o ótimo

desempenho do fermento fresco, vem sendo bastante

usado. Umidade de 5%, e em embalagem fechada

pode ser conservado a temperatura ambiente por até

dois anos, e sob refrigeração entre 3 e 4 meses

A reidratação não é necessária devido ao pequeno

tamanho dos grânulos. Pode ser adicionado à farinha,

porém a temperatura ótima da massa recomendada

no preparo deve ser elevada em cerca de 2 a 3ºC para

melhor desempenho.

Produção de Biomassa

Produção de Biomassa

• Levedura alimentar

S. cerevisiae e C. utilis são propagadas em diferentes

substratos e comercializadas como fonte de proteínas e

vitaminas do complexo B para suplementação humana ou

rações animais

As leveduras resultantes dos processos exclusivamente

destinados a sua propagação são denominados leveduras 1as,

enquanto que as obtidas como subprodutos de outra indústria

são denominadas leveduras 2as (recuperadas de cervejarias e

destilarias)

Componentes

Proteína > 45%

Gordura – 2%

Fibras – 2%

Cinzas – 7-8%

Ca – 0,1 -0,5%

P – 1,5%

Tiamina – 6 a 100 mg/kg

Riboflavina – 10 a 50 mg/kg

Produção de Biomassa

• Levedura Alimentar

Obtenção de levedura

secundária

Produção de Biomassa

• Levedura

Alimentar

Obtenção de

leveduras secas

em uma destilaria