Ligação, permuta, mapas genéticos Prof. Dra. Adriana DantasUERGS Bento Gonçalves

Segregação independente

Descoberta da Ligação

• William Bateson e R.C. Punnett estudaram herança de dois genes:

• Um afetando a cor da flor• (P – púrpura; p – vermelho)

• Um afetando a forma dos grãos de pólen• (L – longo; l – redondo)

• Propuseram que a proximidade física entre alelos dominantes e entre alelos recessivos impedem a distribuição independente na F1.

Bateson e Punnet ~1906

PPLL (purpura, longo) X ppll (vermelha, redondo)

PpLl

Fenótipos de ervilhas observados na F2

Fenótipo (genótipo) Observado Proporção esperada9:3:3:1

Purpura longo (Purpura longo (P_L_P_L_) 4.831 ) 4.831 3.9113.911Purpura, redondo (P_ll) 390 1.303Vermelho, longa (ppL_) 393 1.303Vermelho, redonda (Vermelho, redonda (ppllppll) ) 1.3381.338 435 435 6.952 6.952

Bateson e Punnet ~1906

Cruzamento teste

Cis Trans

Oque esta ocorrendo?

• Os fenótipos desviam da proporção esperada de 9:3:3:1

• Não parece ser explicado pela proporção mendeliana

• Duas classes fenotípicas são maiores que o esperado: purpura longo e vermelha redondo.

• Presença de mais gametas PL e pl do que seria produzido na distribuição independente

Teoria Cromossômica da Herança• Thomas Hunt Morgan em 1910, trouxe a primeira evidência

para essa teoria. • Foi obtida a partir de estudos em uma mosca da fruta, a

Drosophila melanogaster. • Adequado para estudos genéticos.

• pequeno tamanho• baixo número de cromossomo• fácil criação em pequenos espaços de laboratório• cultura de manutenção econômica• grande número de descendentes por geração• grande número de gerações em pouco espaço de tempo• possibilidade de se obter fêmeas virgens logo após a eclosão

para efetuar cruzamentos precisos.

Ligação e padrão de segregação

Morgan ~1911

Experimento de Morgan• Morgan cruzou moscas de linhagens puras com olhos vermelhos

(gene dominante) e de olhos brancos.

• Entretanto nem toda a progênie era de olho vermelho.

• Quando cruzava machos de olho vermelho da geração F1 com suas irmãs fêmeas de olho vermelho produzia somente ¼ de somente ¼ de

• machos de olho branco mas nenhuma fêmea de olho branco. machos de olho branco mas nenhuma fêmea de olho branco.

• Explicação desse resultado - a cor de olho nessa mosca deveria ser ligada ao sexo.

• Então existiriam cromossomos sexuais que carregariam genes como os da coloração de olhos.

Proporções desviadas

Conclusões de Morgan

• Valores observados se desviam muito da proporção mendeliana prevista 1:1:1:1 – INDICA LIGAÇÃO GÊNICA.INDICA LIGAÇÃO GÊNICA.

• Morgan chamou a combinação não-parental de genes ligados de recombinantes;

• Ele esperava 50% de fenótipos recombinantes se a segregação ocorresse independentemente;

• Morgan observou 900/2.441 (36,9%) de fenótipos recombinantes. Então, concluiu que os dois genes devem estar ligados.

• Observando essa características apresentava o mesmo padrão de segregação em Drosophila: asas pequenas (Miniature), cor de corpo amarela (Yelow)

• Morgan trouxe, portanto, como evidência da Teoria Cromossômica da Herança, os padrões de Teoria Cromossômica da Herança, os padrões de segregação dos genes ligados aos cromossomos segregação dos genes ligados aos cromossomos sexuais em sexuais em Drosophila. Drosophila.

Autossomos ligados

P

pr+pr+ vg+vg+ prpr vgvg

Gametas pr+ vg+ pr vg

F1

pr+pr vg+vg

X

As duas maiores classes são as combinações pr+vg+ e prvg, originalmente introduzidas pelas linhagens parentais homozigotas.

Herança dos gametasHerança dos gametasNa herança dos genes ligados, a freqüência dos gametas de

um heterozigoto depende da taxa de crossing-over ou taxa de recombinação que ocorre entre os cromossomos homólogos.

Os Gametas Parentais são formados mesmo que não haja recombinação e aparecem em maior quantidade.

Os Gametas Recombinantes são formados apenas se houver permuta e aparecem em menor quantidade.

A Taxa de Crossing é expressa em porcentagem e corresponde a freqüência de gametas recombinantes formados na gametogênese.

Cruzamento teste

• Um dos genitores (o testador) contribui com gametas que só possuem alelos recessivos

• Os fenótipos da prole revelam a contribuição gamética do outro, o genitor duplamente heterozigoto

• Analisador se concentra na meiose de um genitor e esquece o outro

• Analise da prole F1 autofecundada, apresenta dois conjuntos de meiose a ser considerada: um genitor masculino e genitor feminino

Autossomos ligados

XP

pr+pr vg+vg pr+pr vgvg prpr vg+vg prpr vgvg

F1

1339

Parental

151

Recombinante

154

Recombinante

1195

Parental

Cruzamento teste revela a aproximação de uma proporção 1:1 entre os dois tipos parentais e também entre os dois tipos não parentais

F1 usado em cruzamento teste• pr+pr+ vgvg X prpr vg+vg+

• F1 pr+pr vg+vg X prpr vgvg

• F2 pr+vg+ 157prvg 146pr+vg 965prvg+ 1.067

Desvio da proporção mendeliana de 1:1:1:1Classes maiores são as que tem um alelo

dominante

Herança simples de dois pares de alelos situados no mesmo par cromossomico

• Duas situações:• Alelos dominantes se repelem – REPULSÃO

• Um dominante e um recessivo em cada cromossomo

• Alelos dominantes estão grudados – LIGAÇÃO• Num cromossomo estão ligados os alelos

dominantes dos dois genes ou dos recessivos

pr+ vg

pr+ vg

pr+ vg+

pr vg

Posição dos genesPosição dos genesNa vinculação gênica a posição dos genes no

heterozigoto (AaBb) pode ser Cis ou Trans.

Estas posições também podem ser utilizadas para se definir quem são os gametas parentais e os recombinantes.

A B

a b

Posição CIS

A b

a B

Posição TRANS

Genes Ligados - LinkageGenes Ligados - LinkageQuando dois ou mais genes,

responsáveis por diferentes características, estão localizados em um mesmo cromossomo, a herança é chamada de Vinculação Gênica.

Nestes casos a quantidade de gametas e portanto a freqüência da descendência apresentarão diferenças em relação ao diibridismo.

Crossing-Over ou permuta é a troca de partes entre cromossomos homólogos durante a meiose e é um dos principais fatores para a variabilidade genética.

Entendendo a recombinação

• As disposições originais de alelos nos dois cromossomos são chamados combinações parentais

• As duas novas combinações são chamadas de produtos do crossing ou recombinantes

Crossing-over

• A ligação entre os genes pode ser incompleta, pois durante a prófase I da meiose, quando os cromossomos homólogos estão pareados, ocorrem trocas de partes entre as cromátides irmãs, num processo chamado crossing-over ou permutação.

• Essas trocas resultam na formação de gametas recombinantes, que são cromossomos com novas combinações de alelos.

Recombinação intercromossômica

• Distribuição mendeliana independente causa recombinação intercromossômica

• As duas classes recombinantes constituem 50% da prole, isto é 25% de cada tipo recombinante na prole.

• Os dois genes estão em pares separados de cromossomos

Ligação gênica

• Se não houvesse recombinação nesses genes, a proporção de

gametas formados por um duplo heterozigoto seria 50% AB e

50% ab.

• No processo de segregação independente, um indivíduo AaBb

produz 4 tipos de gametas, na proporção de 25% cada.

• Quando ocorre um caso de ligação gênica, o indivíduo AaBb

produz apenas gametas AB e ab, na proporção de 50% cada.

Recombinação intracromossômica

• O crossing-over produz recombinação intracromossomica

• Duas cromátides não-irmas podem fazer crossing

• Não há crossing entre dois genes específicos em todas as meioses, mas qdo há, metade dos produtos desta meiose são recombinantes

• A meiose sem crossing entre os genes em estudo só produz genótipos parentais.

• Sinal de recombinação intracromossômica é menos de 50% - genes ligados

• Com 50% - não ligados – genes em cromossomos separados

Ligação gênica

• Quando há recombinação, observa-se na descendência uma pequena proporção de recombinantes, por exemplo:

40% – AB (parental)40% – ab (parental)10% – Ab (recombinante)10% – aB (recombinante)

• Quanto mais afastado um gene estiver do outro, maior será a taxa de recombinação.

Formação de GametasCromátides irmãs

Primeira divisão meiótica

Segunda divisão meiótica

Quatro gametas haplóides

Tetrades

Cromossomos Homólogos

Cromátides irmãs

A B

A Ba b

a b

A B

A b

a B

a b

A B A b a B a b

A B

A ba B

a b

Quiasma: estrutura de recombinação entre cromátides não-irmãs

Crossing Over e Recombinação

Permuta simples

Permutas duplas envolvendo 2 cromátides

Permutas duplas envolvendo 3 cromátides

Permutas duplas envolvendo 4 cromátides

Crossing over

Mapas de ligação•Morgan observava que a proporção de prole recombinante variava, dependente de quais genes ligados estavam sendo estudados•Variações na frequência de crossing-over refletem a distancia real que separa os genes do cromossomos•A porcentagem de recombinantes genéticos produzidos num cruzamento teste reflete a relação de ligação entre os genes.•Stutervant desenvolveu um método para descrever a diferença de separação espacial dos genes, onde as variações de recombinantes determinaria as sequencias na dimensão linear de um cromossomo

Postulado de Sturtevant

• Quanto maior a distancia entre os genes ligados, maior a probabilidade de as cromátides não-irmãs se cruzarem na região entre os genes e, e portanto, maior a proporção de recombinantes que seriam produzidos

• Assim obtendo a frequência de recombinantes, obtemos uma medida de distancia do mapa genético de ligação entre os genes

Unidade de mapa (u.m.)• A partir da frequência de recombinação é possível construir o

mapa gênico de um cromossomo. • Definição – é a distancia entre os genes para a qual um

produto de meiose em 100 é recombinante.• Uma frequência de recombinação (FR) de 0,01 (ou 1%) é

definida como 1 u.m. • Uma unidade de mapa é chamada centimorgan (cM)• As unidades são medidas em unidades de recombinação (UR),

morgan ou centimorgan • uma UR corresponde a 1% da taxa de recombinação

Distância de mapaA B

5 u.m.

A C

3 u.m.

A C B

5 u.m.

C A B

8 u.m.

Mapa baseado na recombinação A-B

Mapa baseado na recombinação A-C

Mapas com genes combinados

possiveis

Locus gênico (loci)

• Local onde o gene esta situado no cromossomo

• Locus do gene cor de olho e locus do gene para comprimento de asa estao separados em 11 u.m.

pr 11.0 vg

Analise em três caracteresO macho é triplo homozigoto recessivo abc/abcA femea é tripla heterozigota dominante ABC/ABC Geraram 1000 descendentes

Frequência de recombinantesA – B 367/1000 = 36,7% = 36,7 CmB – c 107/1000 = 10,7% = 10, 7 cMA – C 450/1000 = 45,0% = 45,0 cMPodemos construir um mapa genético a partir destes dados

Teste de dois pontos

415

92

88

405

820Parentais

Recombinantes 180

Total 1.000

Freqüência de recombinação =

_____180

1.000

vg b18 u.m.

Teste dos três pontos

sc ec cv9,1 10,5

Mapas gênico em Drosofila• Em drosófilas, encontraram as seguintes taxas de

recombinação e mapearam os genes p, v e r:

GenesTaxa de

recombinação Distância

p – v 17% 17 UR

p – r 9% 9 UR

r – v 8% 8 UR

Problema

• Em Drosophila melanogaster, asa selvagem (normal)

é dominante sobre asa miniatura; olho selvagem

(marrom-avermelhado) é dominante sobre olho

vermelho. Fêmeas selvagens puras foram cruzadas

com machos de asa miniatura e olhos vermelhos. As

fêmeas da geração F1 foram cruzadas com machos

recessivos, produzindo a seguinte descendência:

Problema

48,5 % asa selvagem / olho selvagem 48,5 % asa miniatura / olho vermelho 1,5 % asa selvagem / olho vermelho 1,5 % asa miniatura / olho selvagem

Pergunta-se:

a) Qual é a evidência de que se trata de um caso de ligação gênica?b)Qual é a distância relativa entre os loci considerados?

Solução

a) Como se trata de um cruzamento-teste, o

fenótipo da descendência é determinado pelo

genótipo dos gametas produzidos pelo

indivíduo com características dominantes.

Assim, os tipos de óvulos que geraram cada

uma das classes de descendentes são:

Solução

Percebe-se que não se trata de segregação

independente porque os gametas femininos não

ocorrem na proporção de 1:1:1:1 (25 % de cada tipo)

Fenótipos da descendência

Genótipo dos óvulos

Porcentagem

selvagem / selvagem MV 48,5 %miniatura / vermelho mv 48,5 %selvagem / vermelho Mv 1,5 %miniatura / selvagem mV 1,5 %

Solução

Trata-se, portanto, de um caso de ligação gênica

incompleta, pois se formaram quatro classes

fenotípicas, duas em maior frequência (classes

parentes) e duas em menor frequência (classes

recombinantes)

Solução

b) Estimamos a distância relativa entre os dois loci

gênicos a partir da frequência de permutação

entre eles.

A frequência de permutação é igual à soma das

frequências das classes recombinantes, ou seja,

3 % (1,5 % + 1,5 %). Assim, a distância entre

esses dois loci é de 3 UR ou 3 centimorgans.

Mapeamento gênico em eucariotos• Genes sobre cromossomos não homólogos segregam

independentemente.• Genes sobre o mesmo cromossomo (sintênicos) estão fisicamente

ligados (grupo de ligação) e podem ser herdados juntos.Objetivo:• Analisar a freqüência de recombinação alélica em cruzamentos;• Novas combinações de alelos parentais são produzidos por

recombinação (“crossing-over” durante a meiose I);• Cruzamentos-teste são usados para determinar quais genes estão

ligados e criar um mapa de ligação (mapa genético de cada cromossomo).

Mapeamento GenéticoMapeamento GenéticoMapa genético ou cromossômico é a representação da

posição dos genes no cromossomo.Está diretamente relacionada a taxa de crossing.Unidades de Recombinação (U.R.) ou Morganídeos (M)

são as unidades usadas para determinar a posição dos genes no cromossomo e correspondem a taxa de crossing.

Exemplo: Em um cromossomo há a seguinte frequência de recombinação entre os genes A,B,C e D:

A-B 45% A-C 20% C-B 25%B-D 5% C-D 20% A-D 40%

Qual a posição dos genes no Qual a posição dos genes no cromossomo? cromossomo?

A C D B

45M

40M

20M 20M 5M

Grupo de Ligação

Populações de Mapeamento

Aplicação dos mapas geneticosGuia para o sequenciamento de genomas, pois mostra a posição de genes e dos e marcadores genéticos

Tipos de mapas: Mapa Genético de ligação e Mapa Físico

Identificar genes relacionados a doenças herdadas

Analisar uma série de marcadores polimórficos em famílias com o gene de interesse.

Como se faz?• Cromossomos individuais em muitas espécies animais tendem a

ter cerca de 100 cM de comprimento (100 x 106 pb)

• Assim, ocorre um “crossing over” por cromossomo por geração.

• Marcadores localizados em cromossomos diferentes têm 50% de chance de “co-segregarem”, estando a 50 cM de distância.

• 50 cM é o limite mínimo para se caracterizar dois marcadores como pertencentes ao grupo de ligação (“linkage group”) – ou ao mesmo cromossomo.

Marcadores que co-segregam• Ainda assim, é possível, dois marcadores que se recombinem

em 50% das vezes podem estar no mesmo grupo de ligação, desde que estejam relacionados a um terceiro marcador que mostre menos de 50% de recombinação com cada um dois primeiros marcadores

DNA

Primers são separados em pouca distância, fragmento É AMPLIFICADO

100 - 1,500 bases

RAPDDominante

RAPD RAPD ((Random Amplified Polymorphic DNA)Random Amplified Polymorphic DNA)

A

A B

B

A1A1 A1A2 A2A2

Marcadores Marcadores “dominantes”“dominantes”

Ind. L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8

01020304050607080910

0100100010

1001101101

0011011010

1011000101

1110111001

0101100100

1000000000

1111110111

01 02 03 04 05 06 07 08 09 10

L2L1

L3

L5

L6

L4

L7

L8

Marcadores Marcadores “dominantes”“dominantes”

QUAIS AS POLIMÓRFICAS?QUAIS AS (CO)SEGREGANTES?

Análise em gel de RAPDAnálise em gel de RAPD

TransposonsSequências de

inserçãoSatélites

Microssatélites

Minissatélites

Genoma

Repetições em tandem

Repetições dispersas

Onde estão localizados no genoma os Onde estão localizados no genoma os marcadores?marcadores?

IntronsFragmentos

de genes

RAPDs

AFLPs

outros

Genes e sequências

relacionadas

DNA extragênico

DNA repetitivoDNA codificante

DNA não codificante

DNA repetitivo

MicrosatélitesMicrosatélites• SSR – Simple Sequence RepeatsSSR – Simple Sequence Repeats

• Pequenas sequências (“sequence motif”) com 1 a 4 nucleotídeos repetidos em tandem - Amplificados via PCR

• Classe de marcadores moleculares mais polimórficos

SinonímiasSinonímias

SSR (Simple Sequence Repeats);SSR (Simple Sequence Repeats);

STMS (Sequence Tagged Microsatellites);STMS (Sequence Tagged Microsatellites);

SSLP (Single Sequence Length Polymorphisms);SSLP (Single Sequence Length Polymorphisms);

Onde são encontrados ???

Mamíferos: (CA)n ( 50.000 a 100.000 vezes no genoma)

Plantas: (AT)n

Mitocôndrias

Cloroplastos

M

homozigotoheterozigoto

M

homozigotoheterozigoto

Marcador co-dominante

Marcador multialélico

A1A1 A1A2 A2A2

Marcadores “co-dominantes”Marcadores “co-dominantes”

Ind. L1

01020304050607080910

1/33/42/33/31/31/11/31/43/31/2

1

2

3

4

01 02 03 04 05 06 07 08 09 10

Marcadores “co-dominantes”Marcadores “co-dominantes”

Sequenciamento de regiões microssatélitesSequenciamento de regiões microssatélites

Mapeamento genético de ligaçãoMapeamento genético de ligação• Identificar marcadores genéticos ligados aos genes Identificar marcadores genéticos ligados aos genes de interesse, nos respectivos cromossomos;de interesse, nos respectivos cromossomos;

•Disponibilizados para as principais espécies de Disponibilizados para as principais espécies de importância agronômica;importância agronômica;

•QTLs e/ou QRLs rastreados e etiquetados, QTLs e/ou QRLs rastreados e etiquetados,

visando uma melhoria na eficiência da seleção.visando uma melhoria na eficiência da seleção.

Xu & Korban, 2000Xu & Korban, 2000

Gene Vf (Sarna)

AFLP

CARACTERIZAÇÃO BIOLÓGICACARACTERIZAÇÃO BIOLÓGICAFenotipagem (Fenotipagem (Locos de resistênciaLocos de resistência))

A) Melrose x Gala – 86 plantasB) M13/91 x Gala - 129 plantas C) M13/91 x M46/94 -185 plantas

M9 x Marubakaido - 85 FM9 x Marubakaido - 85 F1 1 ((QTLs - loci quantitativosQTLs - loci quantitativos))

A BA B

pulgão espinhosPerfilhos uniformes

tipo spur Perfilhos uniformes

S C M

Progênie F1 (Santa Rosa x Chatard)

Marcas segregantes

840 marcadores:

475 AFLPs

235 RAPDs

129 SSRs

Caracterização molecular Caracterização molecular

Identificação de marcas candidatasIdentificação de marcas candidatas

Desenvolvimento de um SCAR Desenvolvimento de um SCAR

((Sequence characterized amplified RAPDSequence characterized amplified RAPD))

1) identificação de um iniciador que confere polimorfismo a dois bulks de DNA com fenótipos contrastantes,

2) o isolamento e a clonagem do fragmento amplificado em um vetor (plasmideo),

3) sequenciamento do fragmento isolado,

4) desenho dos iniciadores de tamanho maior que os decâmeros,

5) teste final em plantas.

Validação das Marcas – Desenvolvimentos de Validação das Marcas – Desenvolvimentos de marcadores específicos (marcadores específicos (Clonagem por mapeamentoClonagem por mapeamento))

Seleção assistida por marcadoresSeleção assistida por marcadores (SAM) (SAM)

Atributos

Isoenzimas

Proteínas de sementes

RFLPs

RAPDs

Microssatélites

AFLPs

Nível de Polimorfismo

baixo alto baixo-alto baixo-alto muito alto muito alto

Estabilidade ambiental

moderada alta alta alta alta alta

Número de locos moderado (<50) baixo (<10) alto alto alto alto Expressão genética co-dominate co-dominante co-dominante dominante co-dominante dominante Número de alelos por loco

2-5 multialélico multialélico 2 multialélico 2

Distribuição no genoma

regiões de cópia única

regiões de cópia única

várias ao acaso ao acaso ao acaso

Acessibilidade tecnológica

muito alta muito alta média muito alta muito baixa média

Aplicabilidade no melhoramento

rápido, baixo custo

rápido, baixo custo

lento, custo médio

rápido, baixo custo

lento, custo alto rápido, custo baixo

Identificação de genótipos

baixa baixa alta muito alta muito alta muito alta

Avaliação de germoplasma

média baixa alta alta alta muito alta

Mapeamento genético

baixa muito baixa alta alta muito alta alta

Mapeamento de regiões específicas

baixa inadequado média muito alta média muito alta

Mapeamento comparativo

baixa inadequado muito alta baixa alta baixa

Genética de Autógamas

baixa baixa média alta muito alta muito alta

Genética de Alógamas

média baixa média alta muito alta muito alta

Análise Filogenética média baixa muito alta média alta média Adaptado de Gepts (1993) e Ferreira & Grattapaglia (1995).

Mapas físicosÉ a distância entre posições de seqüências definidas de DNA expressa de kilo bases.•O mapa físico final é a seqüência completa.•Montagem de mapas físicos:

• Alinhamento de clones isolados aleatórios com base em perfis de fragmentos de restrição.

• Abordagem baseada em hibridizações: uma sonda comum é usada para identificar quais numa série de clones são provavelmente contíguos.

• Sequenciamento de diferentes fragmentos de DNA e organização dos fragmentos pela análise de superposições (contigs)

• Contigs podem ser estendidos pelo sequenciamento da extremidade de clones específicos, levando à identificação de “sequenced-tagged sites” – STSs.

•

5’..GTPyPuAC..3’3’..CAPuPyTG..5’

5’..AAGCTT..3’3’..TTCGAA..5’

Mapa de restrição: duas moléculas de DNA com o mesmo mapa de restrição devem ser iguais.

Os diferentes fragmentos de DNA são sequenciados e a partir dos mesmos vão sendo contruídas as seqüências contínuas

CONTIGS

Mapa físico

Genoteca deBAC/YAC

Mapa

Mapa genético humanoO primeiro mapa genético humano de alta resolução

foi publicado em 1994.Em 2.000, mais de 1milhão de SNPs identificados.

Um marcador polimórfico a cada ~2.000 pb.Marcadores genéticos são geralmente considerados

como atributos do DNA:uma seqüência específica identificada em um dado locus

(sequence tags)repetições simples (microssatélites)polimorfismo de restrição

http://www.ncbi.nlm.nih.gov

Mapas detalhados de cromossomos

Arroz

Humanos

Marcador molecular

Populações segregantes

Mapeamento de QRL/ QTL

Polimorfismo

SeleSeleçção assistidaão assistida

Marcador molecular

Populações segregantes

Mapeamento de QRL/ QTL

Polimorfismo

SeleSeleçção assistidaão assistida

Melhoramento molecular(molecular breeding)

Bibliotecas cDNA

Expressão gênica - RNAm

Bibliotecas cDNA

Expressão gênica - RNAm

Proteôma

Banco de dados