Marcadores MolecularesMarcadores Moleculares

• Introdução e Histórico• Descrição de Marcadores• Comparação entre Marcadores

Moleculares • Classificação de Marcadores

Moleculares• Características do Genoma de

Planta• Aplicações

– diversidade genética– mapeamento e seleção assistida

INTRODUÇÃO E HISTÓRICOINTRODUÇÃO E HISTÓRICO

Marcadores MolecularesMarcadores Moleculares

Genética• “arte” e seleção inconsciente

– da invenção da agricultura até séc. XIX

• 1900s - Descoberta dos princípios genéticos

• 1920-50 - Melhoramento genético científico– genética quantitativa e biometria– (fenótipo é previsor ruim do valor genético!)

• 1970-80 - Utilização de marcadores genéticos moleculares

• Sucesso no melhoramento depende da capacidade de distinguir fatores genéticos herdáveis dos ambientais

• Marcadores genéticos são unidades herdáveis simples

marcadorescromossoma

• Polimorfismo de DNA resulta acúmulo de mutações– pontual ou inserção/deleção– macro-rearranjos: translocações,

inversões, deleções

1. Mutações pontuais - SNPsA. ATCTCGTGATTCCTAGTCGTA

TAGAGCACTAAGGGATCAGCAT ex. Sítio EcoRI

B. ATCTCGTGATTATAGTCGTATAGAGCACTAATATCAGCAT

2. Pequenas deleções e/ou inserções - InDelsA. ATCTCGTCTAGTCGTA

TAGAGCAGATCAGCAT

B. ATCTCGT---GTCGTATAGAGCA---CAGCAT

Origem do Polimorfismo Origem do Polimorfismo MolecularMolecular

Histórico de MarcadoresHistórico de Marcadores

1. Karl Sax (1923): propôs método para localização de QTLsligação entre genes de característica qualitativa (cor de semente) e quantitativa (peso de semente);

Problema: ausência de mutações múltiplas em estoque de elite, baixa viabilidade

2. Hunter & Markert (1957) - marcas bioquímicasdesenvolveram isoenzimas em gel de amido

Histórico de MarcadoresHistórico de Marcadores

3. Hubby & Lewotin (1966)demonstraram que 30% de loci de isoenzimas exibiam polimorfismo em populações selvagens de Drosophila;

4. 1970’s - ferramentas molecularesdesenvolvimento de vetores de clonagem; enzimas de restrição; polimerases; ligases; Southern (1977);

Histórico de MarcadoresHistórico de Marcadores

5. RFLP proposto por Botstein et al. (1980)descrito para humanos

6. PCR proposto por Mullis & Faloona (1987)

7. VNTR por Jeffrey (1987)

8. RAPD por Rafalski et al. (1990)

Histórico de MarcadoresHistórico de Marcadores

9. SSR em plantas por Akkaya et al. (1992)

10. AFLP por Zabeau & Vos (1993)

11. CAPS por Konieczny & Ausubel (1993)

12. SCAR por Paran & Michelmore (1993)

13. Cho et al. (1999) - SNPs em Arabidopsis

DESCRIÇÃO DOS MARCADORES MOLECULARES

Marcadores Moleculares

• RFLP• VNTR (minissatélite)• RAPD, AP-PCR, DAF• PCR-específico - SSR, ISSR, CAPS,

SCARs• AFLP• SNPs

Restriction Fragment Length Polymorphism - RFLP

• RFLP examina diferença em tamanho de fragmentos de restrição de DNA específicos

• Polimorfismo deriva de mutação pontual, inserção, deleção

• Utiliza-se DNA celular total• Requer DNA puro de alto peso

molecular

Metodologia de RFLP

1 . Digerir DNA em fragmentos pequenos2. Separação dos fragmentos por gel

eletroforese3. Transferência de fragmentos de DNA

para filtro

Fonte: IPGRI

Metodologia de RFLP

4. Visualização dos fragmentos de DNA– sondas marcadas (32P) ou a frio

5. Análise dos resultados– bandas analisadas para alelos e/ou

presença/ausência– diferenças em padrão de bandas reflete

diferenças genéticas

A escolha de sonda/enzima de restrição é crucial

Fonte: IPGRI

digestão

1

1

52

34

2

5

43

DNA

Digestão de DNA Genômico e Separação em Gel

Separaçãoem gel

Transferência para Membrana de Nylon ou Nitrocelulose

1

2

3

4

5

Hibridização em Nylon ou Nitrocelulose

Construção de biblioteca genômica ou de cDNA

mRNA ouDNA

cDNA

Clone cDNA Biblioteca de cDNA

Eletroforese

Hibridização com sonda marcada Exposição em filme de Raios-

X

Interpretação de resultados

1

2

3

4

5

6

1 2 3 4 5 6

Sítio alvo para sonda

Sítio de restrição

Inserção

Fonte: IPGRI

Sorgo Cana

RFLP em Cana de Açúcar

HibridizaçãHibridização com o com

sonda de sonda de sorgosorgo

P1 P1 P2P2

1:1

3:1

Hibridização Hibridização com sonda com sonda

de Canade Cana

1:1

3:1

6 Kb

AHerança de RFLPs

8 Kb

B

6 Kb

F1

8 Kb

6 Kb 6 Kb

8 Kb

6 Kb

8 Kb 8 Kb

F2

13

8

2

56

Análise de Diversidade e Filogenia por RFLP

13 5 6 2 8

11

9

A B C

4

A B C

RFLP: sondas de locos único

• DNA Nuclear– biblioteca genômica– biblioteca de cDNA

• DNA Citoplasmático– biblioteca de DNA cloroplástico e

mitocondrial

• Sondas de RFLP são:– locos-específica, co-dominante– espécie-específica

RFLP: sondas multi-locus

• Repetições em linha (tandem) - útil– encontrada em vários loci– altamente polimórficas

• Sequência de Minissatélite– VNTR: variable number of tandem

repeats– uso em “DNA fingerprinting”– uso de seqüências repetidas de fago

M13

Interpretação dos resultados

A1A1

A1A2

A2A3

A1A1

A1A2

A2A3

Repetição

Sítio de Restrição

Fonte: IPGRI

Vantagens e Desvantagens de RFLP

• Reprodutível• Marcadores co-dominantes• Simples

• Trabalhoso• Caro• Uso de sondas radioativas*

Fonte: IPGRI

Random Amplification of Polymorphic DNA - RAPD

• Amplifica seqüências anônimas de DNA usando primers arbitrários– 10 bases com >50% G+C

• PCR com um único primer• Método rápido para detecção de

polimorfismos• Marcador dominante• Problemas de reproducibilidade

RAPD

AA

Aa

aa

AA Aa aa

Interpretação de RAPDs• Marcadores RAPD são anônimos• Dados binários (presença x ausência)• RAPD são dominantes (AA = Aa)• Problemas de co-migração

– mesma banda, mesmo fragmento?– uma banda, um fragmento?

• Questionamento para filogenia– banda homólogas?

PCR com primers arbitrários:

acúmulo de siglas!• RAPD

– Random Amplified Polymorphic DNA

• DAF– DNA Amplification Fingerprinting

• AP-PCR– Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction

• MAAP– Multiple Arbitrary Amplicon Profiling (sugerido por

incluir todas as pequenas variações na técnica)

Fonte: IPGRI

Diferenças entre ensaios com primers arbitrários

• RAPD– 10mers, gel de agarose corado com

brometo

• DAF– 5mers, gel de acrilamida e reação marcada

32P

• AP-PCR– 10mers, gel de acrilamida e reação

marcada 32P

RAPD - resumo

• Rápido• Simples• Baixo custo• Sem uso de radio-isótopos

• Marcador dominante• Problemas de reproducibilidade• Problemas de interpretação

Fonte: IPGRI

RAPD - primer OPJ04 - Bananeira

1500 pb

RAPD - Feijoeiro

OPAM13

OPY04

Sítio de Seqüência Dirigida(Sequence-tagged sites)

• Sequence-Tagged Microssatélites (STMS) ou SSR ou Microssatélites

• Microssatélites ancorados– Inter-Simple Sequence Repeat (ISSR)

• Sequence-characterized amplified regions (SCARs)

• Cleaved amplified polymorphic sequence (CAPS) – PCR-RFLP

Fonte: IPGRI

Microssatélites (SSR)

• Sequence-Tagged Microsatélites (STMS)– também conhecido como microssatélite

ou Simple Sequence Repeat (SSR)

• Normalmente locus simples e multi-alélico

• Co-dominante• Altamente reprodutível

Microssatélites

• STMS ou SSRs– Seqüências curtas (1 a 6 bases)

repetidas em tandem – Presentes em procariotos e eucariotos– Presentes em regiões codificantes e não

codificantes– Maioria das repetições são

dinucleotídeos • (AC) n (AG) n (AT)n

• Polimorfismo devido a diferenças no número de repetições– Escorregamento da DNA polimerase durante a

replicação– Crossing-over desigual entre cromátides irmãs

• Codominantes• Normalmente locos simples e multi-alélico

Microssatélites

Microssatélites (SSR)

• altamente informativo - vários alelos por locos

• detecção por PCR• facilmente transferível entre labs• distribuição homogênea no genoma

Microssatélites (SSR)

ACTTCATTAA TGTCTTAGGT GGCAGAATAC TTTGATGCAA CAATTTCAAG GGGTGCTGAC ATTAAGTTGG CTGCCAATTG GATAATGGGT GATATTGCTG CCTATATGAA AAATGAAAAG CTTTCTATTA ATGAGATCAA ACTTATGCCA GAAGAGCTAG TAGAGCTGAT AGCTTCCATT AAAGGTGGGA CTATCAGTGG AAAGATTGGA AAGGAGGTAA GCATTTGCTT CTTTNACTGA

TGCCACTTTC ATGTTCAAAC ATTTGTTAGT AATCCTGTCT ATTTATTTTC ATGGAAGAAT TTTACTAGCT ATTATTCTCC ACTGTGTAGA TGTGATTTTA TAGTTTGTTT GGATATATAA TTATTGTTCG TGTTTTTTTT TTTAATCCAA ACTTTATAAT

CTTTCCAAGT GCTTTTCTCC TCCCTGTCTT TTTCCTCTAC CACACACACA CACACACACA CACACTCATA CAGAAAAAGG AAAAAGGAAA GAAAGAGAAC AGGAGATATA AAAACCTTTT TTCTTTATCA ATTAGATAAT TAGTTATAAA AGTTTTTCTC

CTGCTTCTTA TCCCTCCGCT AAATGCCTGA TTAACTTTCT GCTGGTAAAG ATTTAAAATA ACTTGTTAAT TTTGGACATG

NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN CACACACACACACACACAC NNNNNNNNN NNNNN

NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN GTGTGTGTGTGTGTGTGTG NNNNNNNNNNNNNN

Primer REV

Primer FOR

Repetição CA

Microssatélites (SSR)

Obtenção de seqüências:• a partir de banco de dados de genoma ou

cDNA• hibridação com biblioteca genômica,

identificação de clones e seqüenciamento• construção de biblioteca enriquecida por

afinidade com seqüência da matriz

• Detecção do polimorfismo– Géis de agarose– Géis de acrilamida (detecta diferenças de

até 2pb)• coloração direta: nitrato de prata (barato)• Coloração indireta: marcação radioativa ou

fluorescente

Microssatélites

• Problemas– Custo e trabalho envolvidos no

desenvolvimento dos primers• Construção de bibliotecas genômica• sequenciamento • Triagem dos melhores primers

Possibilidade de se usar seqüências depositadas em banco de dados

EST – SSR funcional x SSR genômico

Microssatélites

Microssatélites (SSR)

ACTTCATTAA TGTCTTAGGT GGCAGAATAC TTTGATGCAA CAATTTCAAG GGGTGCTGAC ATTAAGTTGG CTGCCAATTG GATAATGGGT GATATTGCTG CCTATATGAA AAATGAAAAG CTTTCTATTA ATGAGATCAA ACTTATGCCA GAAGAGCTAG TAGAGCTGAT AGCTTCCATT AAAGGTGGGA CTATCAGTGG AAAGATTGGA AAGGAGGTAA GCATTTGCTT CTTTNACTGA

TGCCACTTTC ATGTTCAAAC ATTTGTTAGT AATCCTGTCT ATTTATTTTC ATGGAAGAAT TTTACTAGCT ATTATTCTCC ACTGTGTAGA TGTGATTTTA TAGTTTGTTT GGATATATAA TTATTGTTCG TGTTTTTTTT TTTAATCCAA ACTTTATAAT

CTTTCCAAGT GCTTTTCTCC TCCCTGTCTT TTTCCTCTAC CACACACACA CACACACACA CACACTCATA CAGAAAAAGG AAAAAGGAAA GAAAGAGAAC AGGAGATATA AAAACCTTTT TTCTTTATCA ATTAGATAAT TAGTTATAAA AGTTTTTCTC

CTGCTTCTTA TCCCTCCGCT AAATGCCTGA TTAACTTTCT GCTGGTAAAG ATTTAAAATA ACTTGTTAAT TTTGGACATG

NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN CACACACACACACACACAC NNNNNNNNN NNNNN

NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN GTGTGTGTGTGTGTGTGTG NNNNNNNNNNNNNN

Primer REV

Primer FOR

Repetição CA

Nicotiana tabacum

DNA genômico total

Seqüência microssatélite

Adaptadores

Sonda biotinilada

Bolinha magnética-estratividina

ssDNA

ssDNA

Coluna

Digestão

Ligação Adaptadore

s

Amplificação

Enriquecimento e Seleção

Amplificação após

enriquecimento

Enriquecimento e Seleção

Coluna Magnéti

ca

Temperatura ambiente / 20 min

ssDNA

Sonda biotinilada

Biotina IIIII(CT)8ou

Biotina IIIII(GT)8

95°C / 15 min

água

Dna TotalDigestãocom RsaI Amplificação

Amplificação apósenriquecimento

Ligação comadaptadores

Nicotiana ripandaN. sylvestrisN. tabacum “Coker 176”N. tabacum “Ky 14 RMI”

Vetor

Clonagem

PCR

Sequenciamento

Desenho de primers

Transferência e Southern blot

Transformação e Seleção

Meio LB + amp + X-gal + IPTG

N. sylvestris

N. tabacum “Coker 176”

Até 24/02/05 Todas as placas foram testadas

Microssatélites (SSR)

Southern blot - clones SSR’s positivos 32P

Amplificação insertos clonados

Microssatélites (SSR)

(TC)15(AG)14

>ZZFIGCO001g_A04_.g_033_Rome.ab1 CHROMAT_FILE: CGATTGGGCCGACGTCCATGCTCCGGNNCGCATGTCGGCCGCGGGAATTCGATTCTCTTGCTTACGCGTGGACTAGCTTACAATAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGTTTTGGCTGATGCCTTATCTCAAAAGAAGAAACGACCCTATATATAGAAAAGAAAAAAACAGAAAGAATCTATGCACAGTAAAGTAGGTCCCATATGTGGGTCCCTTATACAGTGTATTTACTGTGTATACAATATTTCTACTATATAAACAATGTATCTACTGTTGAGTGGGTCGGCGGCCTCACTGTTGATCATATTCCACGTCTCTCTAATTCTTTCATCTGTTGGATGAAATCTTCCGCATTTTCTACAGCTTCGTCAGATAATATCTTCTCCGATTGAATAGGCTGAGAATCTTCTGCAATATCATCGTTGCTTGTTTCACTTCGCATTAAAGTGTCAGATTTTTCATACTGGTTAATAGATTGAAGTAAGTTTCTTTTTACTTCTTCCAAATACTTATTAATCAATTTCTATAAGATAAACATATAAGTTCAGATCCAGGCACATAATTATAACCATGCGTTTTCACACGTATTTGTCAAAATAAGTCTGCATTTCTCACTTCTTTTTCCTGGTTAAGACCCGTTATACCCTCCAATTATACTTGGAACACCTTTTATCGGCGCTATTTATCCTTTTACTAGCATAGATTCTAAAGGATTTACCACAACTTATAAAAATAAAAGAATAGGTTATACCTTTGTTACCGATCCCGTAACTAGGGGATATAATGGCTTTATTAGATATAAATCCAAAATATATT

(AG)30

MicrossatélitesBananeira 3x e 4x

Cir 24.25

Microssatélites

Seta: alelos genoma B

Microssatélites Ancorados ISSR

• Amplificação de segmentos genômicos flanqueados por repetições

• Anelamento locos-específico• Inter-simple sequence repeats (ISSR)

– ancorados na extremidade 3’ ou 5’

• Marcadores dominantes

Microssatélites mais úteis que minissatélites

Microssatélites Ancorados ISSR

NNNNNNNNN CACACACACACACAC NNNNNNNNNNNN CACACACACACACAC NNNNN

NNNNNNNNNGTGTGTGTGTGTGTG NNNNNNNNNNNN GTGTGTGTGTGTGTG NNNNN

(CA) n NN

(CA) n NNNNNNN (CA) n

NNNNN (CA) n

Repetição CA

ISSR5’ ou 3’ancorado

ISSRUBC 811 UBC 816

Nanicão Jangada ControlVariante

Anão N A

SCARs• SCARs - sequence-characterised

amplified regions– proposto por Paran & Michelmore (1993)– marcador locus-único derivado de

fragmentos sequenciados de RAPD, ISSR, AFLP

– maior estabilidade - primers específicos– analisado para presença/ausência– possibilidade de simplificação de análise e

automação

SCARsR

*

S

clonar

ACTTCATTAA TGTCTTAGGT GGCAGAATAC TTTGATGCAA CAATTTCAAG GGGTGCTGAC ATTAAGTTGG CTGCCAATTG GATAATGGGT GATATTGCTG CCTATATGAA AAATGAAAAG CTTTCTATTA ATGAGATCAA ACTTATGCCA GAAGAGCTAG TAGAGCTGAT AGCTTCCATT AAAGGTGGGA CTATCAGTGG AAAGATTGGA AAGGAGGTAA GCATTTGCTT CTTTNACTGA

TGCCACTTTC ATGTTCAAAC ATTTGTTAGT AATCCTGTCT ATTTATTTTC ATGGAAGAAT TTTACTAGCT ATTATTCTCC ACTGTGTAGA TGTGATTTTA TAGTTTGTTT GGATATATAA TTATTGTTCG TGTTTTTTTT TTTAATCCAA ACTTTATAAT

CTTTCCAAGT GCTTTTCTCC TCCCTGTCTT TTTCCTCTAC CACACACACA CACACACACA CACACTCATA CAGAAAAAGG AAAAAGGAAA GAAAGAGAAC AGGAGATATA AAAACCTTTT TTCTTTATCA ATTAGATAAT TAGTTATAAA AGTTTTTCTC

CTGCTTCTTA TCCCTCCGCT AAATGCCTGA TTAACTTTCT GCTGGTAAAG ATTTAAAATA ACTTGTTAAT TTTGGACATG

Primer específico Seqüenciar

SCAR - FeijoeiroROC20460

CAPS ou PCR-RFLP

• CAPS - cleaved amplified polymorphic sequence – marcador locus-específico– produto amplificado por PCR e

analisado por RFLP– seqüência de banco de dados, clones

de cDNA ou genômico– codominante

CAPS

ACTTCATTAA TGTCTTAGGT GGCAGAATAC TTTGATGCAA CAATTTCAAG GGGTGCTGAC ATTAAGTTGG CTGCCAATTG GATAATGGGT GATATTGCTG CCTATATGAA AAATGAAAAG CTTTCTATTA ATGAGATCAA ACTTATGCCA GAAGAGCTAG TAGAGCTGAT AGCTTCCATT AAAGGTGGGA CTATCAGTGG AAAGATTGGA AAGGAGGTAA GCATTTGCTT CTTTNACTGA

TGCCACTTTC ATGTTCAAAC ATTTGTTAGT AATCCTGTCT ATTTATTTTC ATGGAAGAAT TTTACTAGCT ATTATTCTCC ACTGTGTAGA TGTGATTTTA TAGTTTGTTT GGATATATAA TTATTGTTCG TGTTTTTTTT TTTAATCCAA ACTTTATAAT

CTTTCCAAGT GCTTTTCTCC TCCCTGTCTT TTTCCTCTAC CACACACACA CACACACACA CACACTCATA CAGAAAAAGG AAAAAGGAAA GAAAGAGAAC AGGAGATATA AAAACCTTTT TTCTTTATCA ATTAGATAAT TAGTTATAAA AGTTTTTCTC

CTGCTTCTTA TCCCTCCGCT AAATGCCTGA TTAACTTTCT GCTGGTAAAG ATTTAAAATA ACTTGTTAAT TTTGGACATG

A B

Locus Seqüenciado - primers específicos

A B

PCR específico

Digestão com Enzimas Corte

freqüente

A B A B

1

2

locus

Enzimas de RestriçãoAluI HaeIII MboI

CAPS - Feijoeiro

CAPS - Feijoeiro

Amplified Fragment Length Polymorphism - AFLP

• Combinação de RFLP e PCR• Resulta em padrões muito

informativos• Marcador dominante• Método cada vez mais usado

DNA genômico digestão com duas enzimas

adaptadores

EcoRIMseI

pré-amplificação

amplificação seletiva

ligação

MseI

EcoRI

GAATTCCNCTTAAGCN

NTTAANAATT

ATTCCNGCN

NTNAAT

DNA

digestãoEcoRI MseI

ATTCCNGCN

NTN ATTAAligação

TA

ATTCCNTAAGCN

NTTANAAT

pré-amplificaçãoprimer +1

A

C

amplificaçãoprimer +3

ATTCCATAAGCT

GTTACAAT

AAC

AAC

AFLP de cana com 33P

AFLP de feijãogel desnaturante corado com

prata

Marcadores derivados de Retrotransposons

COMPARAÇÃO ENTRE MARCADORES MOLECULARES

Escolha de MarcadoresCaracterística RFLP RAPD SSR AFLP ISSR CAPS Polimorfismo Pontual Pontual # Pontual Pontual Pontual

InDel InDel Rep. InDel InDel InDel Nível dePolimorfismo médio médio alto médio médio baixo

Abundância alta m.alta média m.alta média alta

Dominância CoDom Dom CoDom Dom Dom CoDom

[DNA] 10 g 25 ng 50 ng 500 ng 25 ng 25 ng

Seqüência não não sim não não sim

Marcação sim/não não não sim/não não não Repetibilidade alta baixa alta média baixa alta

CLASSIFICAÇÃO DE MARCADORES MOLECULARES

Classificação por Tipo de Técnica

• Métodos sem uso de PCR• RFLP• VNTR

• Métodos com uso de PCR– PCR com primers arbitrários

• RAPD, AP-PCR, DAF, MAAP;• Polimorfismo de Tamanho de Fragmento Amplificado AFLP;• ISSR

– PCR sítio-específico• CAPS, SCAR• SSRs (microssatélites)• TGGE, SSCP, DGGE

Classificação por Número de Cópias da Seqüência Alvo

• Seqüência de poucas cópias - codificante• RFLP

• Seqüência com cópias repetidas• VNTR• SSRs (microssatélites) • ISSR

• Seqüência com número de cópias indefinido • RAPD, AP-PCR, DAF, MAAP;• AFLP;• CAPS, SCAR