Marcadores para Características

Físicas em Genética Forense

Professor: Dr. Rinaldo PereiraAlunas: Ana Cláudia Oliveira; Larissa Santos; Luciana Vieira; Mikaely Gonçalves

Brasília, Junho de 2011

Genética Forense Atual Contextualização

A Identificação humana por DNA é uma ferramenta poderosa para:o Casos de paternidade;o Identificação de pessoas desaparecidas;o Investigação criminal.

Perfil de DNA:o Regiões do DNA analisadas:

• Maior variação individual;• Facilidade de estudo.

o Banco de Dados de perfis genéticos.

Genética Forense Atual Contextualização

o Marcadores polimórficos de DNA• SNPs;• Conjuntos específicos de SNPs - determinação de

características físicas.

Marcadores genéticos específicoso Importância na investigação criminal.

AncestralidadeCaracterísticas Físicas

Estudo de Galton e Candolle: o Descrição da natureza fenotípica da cor dos

olhos, em estudos de herança nas famílias;o Predição de características físicas na

investigação da ancestralidade geográfica.

http://3.bp.blogspot.com/_VjhZVizBKfI/TL5m1mCc2FI/AAAAAAAAAEw/NcuY4cbTqMs/s1600/cor+dos+olhos.jpg

AncestralidadeCaracterísticas Físicas

Hipóteses sobre a evolução da pigmentação da pele em humanos, segundo Esteban J. Parra:o Exposição a raios UV;o Níveis de melanina e latitude.

Variação da pigmentação da pele em humanos STURM, 2009

AncestralidadeCaracterísticas Físicas

Estudo brasileiro, da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG):o Pele escura não indica com segurança que a pessoa

teve a maioria de seus genes herdada de ascendentes africanos;

o Indivíduo de pele branca, não é possível afirmar que a maioria dos seus genes são herdados de ascendentes europeus;

o Brasil – Cor determinada por avaliação física é um fraco fator de predição de ancestralidade genômica africana ou européia – Miscigenação.

Os Operários, 1933

Distribuição da Pigmentação da Pele em Populações

Humanas

www.interscience.wiley.com.

Distribuição da Pigmentação da Pele em Populações

Humanas

Pigmentação Humana

Diversidade na pigmentação humana:

Fatores Ambientais e Culturaiso Exposição a radiação UV.

Pigmentos Exógenoso Carotenóides – amarelo.

Pigmentos Endógenoso Oxihemoglobina - vermelhoo Desoxihemoglobina – azul.

Genes o Determinam o número, tamanho e distribuição de

Melanossomas;o Proporção de eumelanina preta/marrom;o Pigmento feomelanina amarelo/vermelho.

Melanogênese O processo de melanogênese ocorre dentro dos

Melanócitoso Localizados em diversos locais: olhos (epitélio pigmentar

retiniano, íris e coróide), ouvidos (estrias vasculares), SNC (leptomeninges), matriz dos pêlos, mucosas, e pele.

Melanossomas o Estruturas intracitoplasmáticas específicas dos melanócitos

que sintetizam e armazenam melanina. Quando repletos, direcionam a melanina para o interior dos ceratinócitos.

http://www.scielo.br/pdf/abd/v84n6/v84n06a08.pdf

Melanogênese

Gillian Tully .Genotype versus phenotype: Human pigmentation. Forensic Science International: Genetics 1 (2007) 105–110.

Melanogênese

A diferença fenotípica entre populações mais pigmentadas e menos pigmentadas não reside no número de melanócitos, mas na da atividade de

síntese de melanina pelos melanossomas!

http://cliquedicas.blogspot.com/2009_05_01_archive.html

Características Fenotípicas

Importância em Genética forense:

o Auxílio na resolução de casos criminais:• Prevê características visíveis do suspeito partir de uma

amostra de DNA presente na cena do crime;• Restringe o número de suspeitos criminosos.

o Detecção de genes envolvidos na determinação do sexo, e na pigmentação da pele, cabelo, olho:• Pesquisas de SNPs através da associação genômica (GWA)

e Mapeamento HapMap.

o Complexidade na determinação de genes envolvidos na altura dos indivíduos.

Marcadores de Características

Fenotípicas

Gene do Receptor de Melanocortina 1 - MC1R Membro da família de receptores acoplados a

proteína G;

Papel fundamental na mudança de eumelanina e síntese feomelanina nos melanócitos;

Essencial para pigmentação da pele e do cabelo;

Também tem sido associado com a cor dos olhos;

Valor preditivo limitado.

Gene do Receptor de Melanocortina 1 - MC1R Ligação do hormônio melanócito-estimulante

(a-MSH) com MC1R resulta:o Na ativação da guanilato ciclase, aumento dos níveis

de AMPc e da atividade de tirosinase;o Promove a produção de eumelanina dentro dos

melanócitos.

Quando o antagonista de sinalização da proteína (ASIP) liga-se a MC1R:o Há uma diminuição da atividade da tirosinase e tem

produção de feomelanina.

Gene do Receptor de Melanocortina 1 - MC1R

Na Europa, na Ásia Oriental e Sudeste da Ásia, o MC1R é altamente polimórfico;

Mutações que têm uma forte associação com o cabelo vermelho/fenótipo de pele clara:o Asp84Glu, Arg151Cys Arg160Trp, e Asp294His;

Associação fraca:o Val60Leu, Val92Met e Arg163Gln.

Mutações do Gene MC1R

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19083738

Gene Oculocutâneo Tipo II – OCA2

Codifica a proteína P-humana;

Mutações nesse gene são responsáveis pelo albinismo;

Também associada com variação de pigmentação normal do olho e do cabelo;

Polimorfismo Arg305Trp – pigmentação entre diferentes populações;o Alelo 305Trp é o mais comum em Caucasianos;o Alelo 305Arg é o mais comum em indivíduos da raça

negra.

SLC24A5

Localizado no cromossomo 15 no braço longo (21.1);

Precursor do melanossoma;

Efeito clareador da pigmentação - substituição de alanina por treonina no aminoácido 111;

Relacionado a cor pálida da pele dos europeus;

Associado a cor do cabelo.

Gene da Tirosinase - TYR

Codifica enzima chave na melanogênese;

Dependente de íons cobre para catalisar a biossíntese da melanina;

Responsável pelo tipo mais comum de albinismo;

Associado com a pigmentação normal da pele e da íris do olho.

Genes Polimórficos Envolvidos na Pigmentação em Humanos

Human Molecular Genetics, 2009, Vol. 18, Review Issue 1 R9–R17 doi:10.1093/hmg/ddp003

PCR Multiplex Permite amplificar simultaneamente múltiplos

locos:o Amplificação de várias sequencias específicas do DNA

ao mesmo tempo;o Amplifica mais de 10 regiões distintas do DNA;o Utilização de vários primers.

Realizada após a extração de DNA.

A PCR multiplex é a metodologia de escolha para análise dos marcadores de características físicas a partir do DNA:o SNPs.

PCR Multiplex

São usados primers específicos para cada seqüência que se deseja ampliar:

o Cor do cabelo (Kitlg, OCA2, MC1R, TYRP1, SLC45A2, HERC2, ASIP);

o Cor dos olhos (OCA2, HERC2, e TYR);

o Pigmentação da pele (MC1R,TYR, SLC24A2);

o Comprados ou confeccionados.

PCR Multiplex

Tratamento Enzimático

Extensão dos Produtos

Eletroforese Capilar

Eletroforese Capilar

http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0100-40422003000100013

Eletroforese Capilar

Caroline Bouakaze, 2009

Caroline Bouakaze, 2009

Retinome

17 de agosto de 2004, a DNAPrint ™ anuncia o lançamento do RETINOME ™ para o mercado forense;

Prever a cor da íris do olho humano a partir do DNA;

Usado para predizer uma característica complexa a partir do DNA;

Usado por investigadores forenses.

Retinome

O teste RETINOME ™, junto com outros testes constituem um grande avanço na ciência;

Inferência precisa da cor da íris através de SNPs específicos.

IrisPlex

Sistema de genotipagem multiplex para a cor dos olhos;

Prever a cor dos olhos azul e marrom em humanos:o Precisão >90%.

Requer uma pequena quantidade de DNA, cerca 31 pg;

Amplificação de fragmento de apenas 80-128 pb;

Não requer informação sobre a ancestralidade-biogegráfica;

Recomendada para a tipagem de DNA degradado;

Maior sensibilidade do que os outros métodos disponíveis atualmente.

IrisPlex Obtenção de amostra de DNA:

o Diversos materiais podem ser usados;

Extração de DNA pelo kit Mini QIAamp DNA (Qiagen);

6 SNPs:o HERC2 - (rs12913832);o OCA2 - (rs1800407);o SLC24A4 - (rs12896399);o SLC45A2 ( MATP) - (rs16891982);o TYR - (rs1393350);o IRF4 - (rs12203592);

 Amplificação dos mesmos pelo PCR multiplex.

IrisPlex

Purificação do produto obtido, para remover primers e dNTPs sem personalidade jurídica;

Realização de Ensaio SBE multiplex com uma mistura de reação SNAPshot (Applied Biosystems);

Quantificação usando o DNA humano kit Quantifiler (Applied Biosystems);

Eletroforese capilar;

Comparação com padrões conhecidos.

SNaPshot

http://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/mcb_support/documents/generaldocuments/cms_042107.pdf

SNaPshot

Minisequenciamento;

Extensão de primer alelo-específico;

Dideoxinucleotídeos marcados com corante fluorescente;

Três passos:o Amplificação;o Extensão;o Análise.

Questões ÉticasOpinião Científica x

Opinião da Sociedade

Quais sãos as informações obtidas pelos marcadores de DNA? Elas são tratadas com sigilo?

Princípios

Privacidade

Autonomia

Igualdade

Liberdade

Etapas na Identificação de Suspeitos

Amostra na cena de crime

Extração do DNA Amplificação dos STRs por PCR Eletroforese Capilar

Comparação com perfis em Bancos de

Dados

Não obtenção de perfil compatível com

o suspeito

Investigação por meio de

características fenotípicas

Marcadores de características

fenotípicas

PCR Multiplex (SNAPSHOT),

Retinome, IrisPlex

Identificação de possíveis suspeitos

Amplificação de STRs dos suspeitos para obtenção de perfil

genético

Comparação do perfil dos suspeitos com o perfil da amostra da

cena de crime

Identificação do suspeito

Compatibilidade do perfil do suspeito com o perfil da

amostraIdentificação do

Suspeito

Referências Bibliográficas

BOND J.W. Value of DNA evidence in detecting crime. J Forensic Sci 52, 128-136, 2007.

DECORTE, Ronny. Genetic identification in the 21st century—Current status and future developments. Forensic Science International 201 (2010) 160–164.

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JAGER, Alessandra V., TAVARES, Marina F. M. Determinação simultânea de cátions por eletroforese capilar: fundamentos e aplicações. Instituto de Química, Universidade de São Paulo, Vol. 24, n3, May/June 2001.

KAYSER, Manfred, SCHNEIDER, Peter M. DNA-based prediction of human externally visible characteristics in forensics: Motivations, scientific challenges, and ethical considerations. Forensic Science International: Genetics 3 (2009) 154–161.

Referências Bibliográficas

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MIOT, Luciane, et al. Fisiopatologia do melasma. An Bras Dermatol. 2009;84(6):623-35.

PARRA EJ. Human pigmentation variation: evolution, genetic basis, and implications for public health. Am J Phys Anthropol Suppl 45: 85–105, 2007.

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PULKER, Hannah, et al. Finding genes that underlie physical traits of forensic interest using genetic tools. Forensic Science International: Genetics 1 (2007) 100–104.

Referências Bibliográficas

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STURM, Richard A. Molecular genetics of human pigmentation diversity Human Molecular Genetics, 2009, Vol. 18, Review Issue 1 doi:10.1093/hmg/ddp003, 2008.

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WALSH, Susan, LINDENBERGH, Alexander Zuniga, SIJEN, Sofia B. Titia, KNIJFF, Peter de, KAYSER, Manfred, BALLANTYNE , Kaye N. Developmental validation of the IrisPlex system: Determination of blue and brown iris colour for forensic intelligence. Forensic Science International: Genetics, Vol. 648, No. of Pages 8. 2010.