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Biologia In Silico - Centro de Informática - UFPE

Ivan G. Costa Filhoigcf@cin.ufpe.br

Centro de InformáticaUniversidade Federal de Pernambuco

Medição de Expressão GênicaMicroarrays

Tópicos

• Medição de Expressão Gênica– metodos mais usados

• Microarrays– Funcionamento básico– Pipeline experimental– plataformas

• cDNA e Affymetrix

http://www.cin.ufpe.br/~igcf/aeg.html

Métodos de Medição

• SAGE/RNA Seq– Pros: precisão– Contras: custo (tempo)

• RT-PCR, Northen Blot– Pros: alta precisão– Contras: baixa escala, custo

• Microarrays (cDNA e Oligoarrays)– Pros: larga escala, baixo-custo– Contras: ruído

SAGE – Serial Analysis of Gene Expression

• separar celulas

• mRNA → cDNA

• cortar cDNA com enzima

• tagging

• ligar tags

• sequenciar e quantificar

SAGE – Serial Analysis of Gene Expression

• Características:– não é preciso conhecer genes– exato – quantas copias de RNA em

uma celular– requer poucas celulas– custo (financeiro,tempo e pessoal)– Novas tecnologias -

pirosequenciamento

Northern Blotting

• Baseado no uso de enzima de restricições e gels de agarose

• Características:– exato, baixa escala,

custo (tempo)

• Usado na validação de experimentos– RT-PCR, ...

Microarrays Funcionamento Básico

Microarrays

• Características:– alta escala (genomas

completos)– custo baixo (tempo,

financeiro)– presenca de ruído

Microarray

Animação

Microarrays - Etapas Desenho

ExperimentalDesenho

Experimental

1 Qual a hipotese biológica a ser explorada?

2 Que sondas devem estar no array? Qual plataforma?

3 Escanear array; Medir expressão de cada gene;

4 Análise dos dados; Classificação e Agrupamento

Desenho Experimental

Design do microarray

Aquisição e processamento dos dados

Análise (alto nivel) dos dados

Design Experimental (1)

• Qual o objetivo do experimento biológico?– enteder processos celulares

• expressão em relação ao tempo

– diagnóstico de cancer• expressão de diversos pacientes e tipos de

câncer

– desenvolvimento de drogas• expressão de uma celula de acordo com

varias dosagens/tipos de medicamento

Design Experimental (2)

• Medir replicações de condições medidas– replica técnica

•usa mesmo material biológico•reduzir efeitos de ruído

– Replica biologica•usa diversos materiais biológicos

(em mesmas condições)•capturar variabilidade biologica

Design do Microarray (1)

• Definir sondas no microarray– devem ser especifica de um gene <70%

de similaridde (cross-hidridization) – tamanho de 50-70 bases– não devem ter extrutura secundaria– baixo conteudo de CG– deve vir de sequencias do fim do genes

Design do Microarray (2)

• Uso de multiplas sondas por gene– evitar ruidos

• São especificos do organismo e estudo• i.e. incluir apenas genes de interesse de

cancer, imunologia

• Plataformas Comerciais– design já definidos: Affymetrix, Agilent, ...

Aquisição e Processamento de Dados

• Extração dos valores de expressão– identificação do spot– calcular intesidade do

sinal– normalizar valores

entre arrays– detecção de ruidos

Cond A Cond B Cond CGene 1 1,1 0,1 1,5Gene 2 3,1 3,4 2,1Gene 3 2,2 1,9 3... ... ...

Analise Dados (alto nivel)• Extração de

informação – expressão

diferencial– classificação – agrupamento– ...

Microarrays Plataformas

cDNA array Affymetrix ChipAffymetrix Chip Agilent

• Cada plataforma tem suas caracteristicas– costumização, preço, padronização,

tratamento de ruídos ...

cDNA Microarray

• Confecção: uso de um robô para depositar sondas em um vidro

• Requer design do array e equipamentos in house

• Características: barato, requer trabalho inicial, customização

• Proposto por Brow Lab (Stanford)

cDNA Microarray Confecção

• Bancos de clones com as sequencias das sondas

• Sondas tem sequencias de 400-1000 bases

• Uma sonda por gene

• ~12.000 por chip

• Processo de amplificacao pode gerar contaminação

cDNA Microarray Experimento

• Requer sempre 2 amostras (referencia e controle)

• Cada amostra é marcada com verde (Cy3) ou vermelho (Cy5)

• Retorna apenas expressao relativa (Cy5/Cy3)

verde (cy5)

vermelho(cy3)

cDNA Leitura - Exemplo

• Imagen é dividida em 2 canais (verde e vermelho)

• Grid é usado para identificar sondas

• Mediana da intesidade de cada circulo

• Expresão final é dada por– log(cy3/cy5)

AffymetrixMicroarray

• Confecção: uso de um processo de litografia

• Tecnologia Comercial• Plataformas de arrays já definidas:

– Human U133, Mouse 430, ...• Características: barato, não requer

design, padronização

Affymetrix Microarray

Affymetrix Confecção (1)

• Confecção das mascaras é caro

• Escolha das sondas é feita de forma a minimizar o numero de mascaras

• Sondas vizinhas podem se contaminar

• Sondas tem de 20 a 25 bases

• 20 sondas por genes (PF perfect match)

• Para cada uma sonda mismatch (MM)– uma base distinta– vizinho a sonda PM

Affymetrix Experimento

• Marcador radiotivo

• Mede uma amostra por vez

• Razao pode ser obtida a partir do desenho experimental

Affymetrix Leitura

• Grid quadrado é usado para marcar sondas

• Expressao absoluta do gene

PMPMPM

PM1 = 300PM1 = 0

PM2 = 2000PM2 = 100

Affymetrix X cDNA

• Padronização X Customização• Custo Inicial:

– Baixo X Caro

• Custo de Larga Escala:– Medio X Baixo

• Qualidade– ???

Qualidade Affy X cDNA

• Multiple Lab Comparison of Microarray Platforms, Rafael A. Irizarry et al., Department of Biostatistics, Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health

Outras Plataformas

• Agilent– Fabricação por tecnologia Inkjet– Sondas com 60 bases– Permite customização– Expressão controle e referência (2

color)– Qualidade ???

Referencias

• Capitulo 1 e 2 do Causton.• Diógenes Ferreira Filho, INTRODUÇÃO À

TECNOLOGIA DE MICROARRAY

Slides ...

• Parte dos slides foi retirado de aulas de Terry Speed, Christine Steinhof, Mateo Pardo, Tim Beissbarth

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