Metabolismo do DNAMetabolismo do DNA

• Replicação do DNA

• fidelidade + velocidade

• Reparo

• múltiplos processos - resolução de injúrias

• Recombinação

• rearranjo da informação genética

Fidelidade da ReplicaFidelidade da Replicaççãoão

• Conceito de “molde”

• Universalidade de processo e mecanismos de catálise para todos os organismos estudados.

• Universalidade de processo e mecanismos de catálise para todos os organismos estudados.

Regras fundamentaisRegras fundamentais

• A replicação do DNA é semiconservativa

• A replicação tem uma origem e procede bidirecionalmente

• A síntese de DNA ocorre na direção 5’-3’ e é semidescontínua

Watson & Crick

Meselsohn e Stahl,1958

.

A replicação do DNA ésemiconservativa

15N

15N + 14N

15N + 14N

14N

Regras fundamentaisRegras fundamentais

• A replicação do DNA é semiconservativa

• A replicação tem uma origem e procede bidirecionalmente

• A síntese de DNA ocorre na direção 5’-3’ e é semidescontínua

OrigemOrigem de de replicareplicaççãoão

Fago λ• Seqüência nucleotídica

variável

• únicas X múltiplas

• múltiplas repetições curtas

• proteínas ligantes

(organização do sítio)

• ⇑ conteúdo AT

Características comuns

Regras fundamentaisRegras fundamentais

• A replicação do DNA é semiconservativa

• A replicação tem uma origem e procede bidirecionalmente

• A síntese de DNA ocorre na direção 5’-3’ e é semidescontínua

SSííntesentese semi semi descontdescontíínuanua: : diredireççãoão 55’’ →→ 33’’

SSííntesentese de DNA: as DNA de DNA: as DNA PolimerasesPolimerases

A. Kornberg 1955: DNA polimeraseI

Requerimentos:

fita molde

iniciador (oligo 3’ OH livre)

DNA DNA PolPol I+ II e III: I+ II e III: pappapééisis definidosdefinidos

DNA Pol I -> 90% da atividade Polimerásica

Adição de nt ~20 x inferior ao movimento da forquilha

Processividade baixa

gene defectivo (DNA Pol I inativa) → linhagem viável (J. Cairns: 1969)

DNA polimerase II: reparo

DNA DNA polimerasepolimerase III: III: replicareplicaççãoão

A A precisãoprecisão do do processoprocesso de de replicareplicaççãoão

• E. coli = 1 erro / 109-1010 nucleotídeos adicionados

• DNA polimerases: 1 erro / 104-105

• Erro in vivo: +++ mecanismos enzimáticos

• Atividade exonucleásica 3’→ 5’ = prova de leitura

• Outros sistemas de reparo

↓

1 erro/104-105

PolimerizaPolimerizaççãoão && DNA DNA PolimerasePolimerase

fita molde

fita nova

DNA DNA polimerasespolimerases I, II, IIII, II, III

GENEESTRUTURAL

POL A POL B POL C

SUBUNIDADES 1 >4 >103’→5’ EXON. SIM SIM SIM

5’→3’ EXON. SIM NÃO NÃO

NT+/SEGUNDO

16-20 ~7 250-1000

PROCESSIVI// 3-200 >10.000 > 500.000

EmpacotamentoEmpacotamento X X precisãoprecisão funcionalfuncional

Principles Of Biochemistry (Second Edition)Albert L. Lehninger, David L. Nelson, Michael M. CoxWorth Publishers

CompactaCompactaççãoão ddo DNA o DNA GenômicoGenômico

Precisão e dinâmica:replicação e transcrição

Principles Of Biochemistry (Second Edition)Albert L. Lehninger, David L. Nelson, Michael M. CoxWorth Publishers

NemNem ssóó de DNA de DNA polimerasepolimerase vive a vive a ssííntesentese de DNA. . .de DNA. . .

• Catálise: + um nucleosídeo (5’-PO) ao 3’OH livre da cadeia

“Toda” DNA polimerase necessita da presença de um iniciador

para catalisar a + de nucleotídeos

• A dupla fita é antiparalela (polaridade química)

• As DNA polimerases não desespiralizam o DNA

MaquinariaMaquinaria: DNA: DNA replicase/replissomoreplicase/replissomo

Separação das Fitas: Helicases

Estresse Topológico: Topoisomerases

Manutenção da “bolha”: SSB

Adição de Iniciadores: Primases

Retirada de Oligo-RNA: Polimerase I

Resolução dos “Nicks”: DNA Ligase

EstEstáágiosgios do do processoprocesso de de replicareplicaççãoão

IniciaIniciaççãoão

Elongação

Terminação

IniciaIniciaççãoão

Estágio que

controla a replicação

IniciaIniciaççãoãoDNA molde superespiralado

OriC

Tetrâmeros de DnaA+ sítios de ligação

Monômeros DnaA = + sítios de ligação

Monômeros de DnaAenrolados sobre OriC

DnaA: 20 a 40 monômeros

Complexo Inicial

Hexâmeros de DnaB e C

Subunidades de DnaC

Complexo Aberto

Região OriC aberta

Ligação de SSB às regiões fita simples

Complexo de pré iniciação

“liberação” da região com DnaA associada

Região OriC aberta

Iniciação e replicação

Sítio Replicador:3 x 13nt – GATCTNTTNTTTT4 x 9nt – TTATCCACA

IniciaIniciaççãoão

Estágio que controlaa replicação

EstEstáágiosgios do do processoprocesso de de replicareplicaççãoão

Iniciação

ElongaElongaççãoão

Terminação

Duas operações similares

Dois mecanismos distintos

fita líder (contínua)

fita lerda ou atrasada (descontínua)

Enzimas necessárias: DNA helicase, DNA topoisomerase,

SSB, primase, etc...

ElongaElongaççãoão

ElongaElongaççãoão

ElongaElongaççãoão: : SSííntesentese dada fitafita atrasadaatrasada

ligase

DNA pol III +

DNA pol I

DNA pol III +

DNA pol I

primase(iniciase)

ElongaElongaççãoão

http://bcs.whfreeman.com/thelifewire/content/chp11/1102003.html

http://www.youtube.com/watch?v=teV62zrm2P0

DNA DNA polimerasepolimerase II

Atividade exonucleásica 5’-3’

Síntese da fita lerda

EstEstáágiosgios do do processoprocesso de de replicareplicaççãoão

Iniciação

Elongação

TerminaTerminaççãoão

Sítios TER (E. coli) + proteína TUS (Helicase impedida)

Separação das moléculas completas: Topoisomerase IV (tipo 2)

Partição das duas moléculas (?) mecanismo pouco conhecido

TerminaTerminaççãoão

CCéélulaslulas EucariEucarióóticasticas

Características gerais da replicação são as mesmas em pró e eucariotos.

Outras Proteínas/fatores, funções ≅ , complexidade ⇑

Mapeamento de diversas origens sugerem:

regiões permissivas para iniciação (bidirecional)

heterogeneidade em tamanho e comportamento

Mamíferos: decisão sobre sítio de iniciação a cada fase S.

Seqüência X Estrutura

EucariotosEucariotos X X ProcariotosProcariotos

Diferença: cromossomos lineares.

Telômeros: estrutura especializada na extremidade dos

cromossomos lineares.

Repetições em Tandem: TxGy

Replicação

Replicação do DNA é semi-conservativa;

Campisi et al. Experimental Gerontology 2001; 36: 1619-1637

Síntese pela telomerase (Transcriptase reversa)

Perda de extremidades a cada divisão celular;

(humanos 50-150pb por divisão)

TelômeroTelômero e telomerasee telomerase

5’

5’

3’

5’

3’

3’

3’

5’

E o cromossomo encurta progressivamente. . .

Falta molde na extremidade 3’ para síntese. . .

http://www.youtube.com/watch?v=AJNoTmWsE0s

Telomerase

Transcriptase reversa

RNA (molde)

proteína

atividade células tumorais e germinativas

http://bioweb.wku.edu/courses/biol22000/13DNAreplication/Telomerase.html

Estrutura

LeBel, C. et al. J Cell Sci 2005;118: 2785-2788

Centrômero

Centrômero

TAS

TAS

T-loop

Humano

Camundongo

Griffith,JD. et al. Cell 1999; 97: 503-514

A replicação da extremidade gera 3’ fita simples – formação de estrutura de laço (T-loop);

TAS – seqüências associadas a telômeros

TelômeroTelômeross

FunçãoTelômeros são essenciais para a integridade do genoma

Protegem as regiões terminais de degradação

Distinguem a extremidade normal de região de dano

Organização funcional dos cromossomos no núcleo

Funciona como relógio molecular (replicações e senescência)

Estrutura: proteínas associadas

Rodier et al/The international Journal of Biochemistry & Cell Biology 2005; 37:977-990

Tankirase- poly ADP-ribosilaseRMN- Complexo RAD50-MRE11-NSB1WRN- DNA helicase e exonuclease

TelômeroTelômeross