MetagenômicaCarla BartelsFrancisco M Ulloa StanojlovicLuis Fábio Batista

BMP 5762 – Bioinformática Aplicada ao Estudo de Doenças Parasitárias

Prof Dr Arthur GruberInstituto de Ciências Biológicas

• O termo Metagenômica foi usado primeiramente em 1998 por Jo Handelsman (Universidade de Wiscosin – EUA)

Dr. Anand Kumar &Dr. R. A. Siddique

METAGENOMAÉ o genoma coletivo da microbiota total, encontrada

em um determinado habitat.

METAGENOMAÉ o genoma coletivo da microbiota total, encontrada em um determinado habitat

METAGENÔMICAÉ a análise genômica das comunidades de

microrganismos de um determinado ambiente por técnicas independentes de cultivo.

Introdução

Dr. Anand Kumar &Dr. R. A. Siddique

Handelsman, 2004

Metatranscritoma

Permite a identificação de genes que estão ou não

sendo expressos

Metaproteômica

Permite uma melhor caracterização funcional

da comunidade microbiana

Metagenômica

Fornece a informação da capacidade metabólica

e funcional da comunidade microbiana

Dr. Anand Kumar &Dr. R. A. Siddique

Metagenômica aplicada

Dr. Anand Kumar &Dr. R. A. Siddique

Metagenômica fornece

Informação genética sobre possíveis novos biocatalizadores ou enzimas

Conexões genômicas entre função e filogenia de organismos “não cultiváveis”

Perfis evolutivos de função e estrutura de comunidades

Novas hipóteses de funções microbiais

Thomas et al, 2012

JCSetubal, 2012

JCSetubal, 2012

JCSetubal, 2012

Desenho do Estudo

Amostragem

Fracionamento da amostra

Extração de DNA

Sequenciamento de DNA

Montagem

Anotação

Análises Estatísticas

Armazenamento de dados

Compartilhamento de dados

Binning

Thomas et al, 2012

Handelsman, 2004

Amostragem• Isolar o DNA

• Depende do tipo de amostras

• Clonar DNA• Inserir dentro de um

vetor (plasmídio, cosmídio, BAC)

• Biblioteca• Screening e

sequenciamento

Daniel, 2005 em Prentice Hall, 2005

Amostragem {desafios}

• Amostras devem representar a população → Quantas amostras são necessárias? Curvas de raridade para estimar fração de espécies sequenciadas. (Abundância x Complexidade).

• Presença de populações dominantes afeta análises → representação maior e maior chance de montar contigs.

• Quanto mais metadados forem coletados mais detalhadas serão as inferências das condições ambientais. Ex.: dados geográficos, bioquímicos, data de coleta, métodos de extração do DNA.

Bruno Malveira Peixoto 2011

Sequenciamento – Shotgun

Commins, Toft, Fares, 2009

Genoma completo

Hierárquico

Prakash and Taylor, 2012

Montagem• Fatores a serem considerados:

• Tamanho das leituras de sequenciamento usadas para criar a base de dados de metagenômica

• São necessárias sequências mais longas para anotação?

• A base de dados está montada para reduzir os requerimentos de processamento de dados?

MIRA: An Automated Genome andAssembler

Montagem baseada em referência:

Montagem “de novo”:

Algoritmos rápidos rodam em laptop em 2h; Regiões divergentes não são cobertas – inserções, deleções ou

polimorfirmos.

Velvet Baseados em gráficos de Bruijn Requer grandes recursos computacionais Requer milhares de gigabytes – dias. Meta-IDBA e MetaVelvet – não clonalidade de populações naturais -

subgráficos de Bruijn - N50 e tam. contig

Thomas, Gilbert e Meyer, 2011

Meta-IDBA MetaVelvet

Montagem

Montagem {limitações}

• Amostragem incompleta – genomas parcialmente amostrados

• Formação de quimeras – sequências de espécies diferentes

• Dificuldade em montar amostras ricas em espécies (solo).

Bruno Malveira Peixoto 2011

Métodos de DiscriminaçãoProcesso de classificação das seqs de DNA em grupos que possam representar um genoma individual ou genomas de organismos fortemente relacionados

• Classificação composicional• Similaridade

Vários algoritmos foram desenvolvidos – empregam dois tipos de informações contidas dentro de uma dada seq DNA

Pontos importantes a considerar:• Tipo de dado de entrada disponível• Existência de training datasets adequados ou genomas de referência• Algumas ferramentas combinam os dois approachs – PhymmBl,

MetaClusterThomas et al, 2012; Liu, 2012

Classificação Composicional• Genomas têm composição de nucleotídeos conservada e isto será

refletido nos fragmentos de sequência dos genomas

• Conteúdo de GC• Uso de códons• Sítios de reconhecimento – 5S ou 16S rRNA

• Bioinfo tools:• Phylopythia• S-GSCM• TACAO

• Não funciona bem com leituras curtas por não conterem informações suficientes

Thomas et al, 2012; Liu, 2012

Conteúdo GC• Karlin & Burge, 1995

• A distribuição de nucleotídeos é relativamente constante dentro do genoma, mas varia entre genomas.

• A razão de possibilidades (odds ratio) de frequência de conteúdo C+G é essencialmente a mesma na maioria dos organismos para todo o DNA versus o DNA codificante e também a mesma para as frações de DNA das diferentes sequências.

• Talvez existam fatores que imponham limites às variações composicionais e estruturais de um genoma e que o conjunto de valores das odds ratios do dinucleotídeo seja uma assinatura genômica.

• Diferenças significativas entre procariotos e eucariotos, entre vírus e seus hospedeiros.

• Pxy = fxy / fx fyKarlin, 1995; Liu, 2012

Karlin, 1995

Karlin, 1995

Uso de códons

Codon Usage Database - http://www.kazusa.or.jp/codon/

Cada genoma tem uma estratégia particular de codificaçãoPercentual de G+C na 3a posição do códon tRNA

Códons redundantes/sinônimos para qq aa não são usados com frequências iguais entre os diversos organismos

Todos os aminoácidos, exceto Met e Trp, são codificados por 2 a 6 códons

Karlin, 1998; Ikemura, 1985

Similaridade• Compara leituras curtas contra sequências

codificadoras de bases de dados públicas de genes usando BlastX e então designa para o seu ancestral comum mais tardio (LCA) de um organismo alvo

• Bioinfo tools• IGG/M• MG-RAST• MEGAN• CARMA• Sort-ITEMS• MetaPhyler

Thomas et al, 2012; Liu, 2012

Classificação {Bioinfo}

• Análise de similaridade: IMG/M, MG-RAST, MEGAN, CARMA, Sort-ITEMS, MetaPhyler

• Análise composicional: Phylopythia, S-GSOM, PCAHIER, TACAO

• Similaridade e composicional: PhymmBL e MetaCluster

Necessidade de sequências de referência* (marcador de RNAr) para fechar o alinhamento para sequenciamentos de leitura curta.

* Base de dados escassas e tendenciosas para apenas três filos Proteobacteria, Firmicutes e Actinobacteria

Thomas, Gilbert e Meyer, 2011Bruno Malveira Peixoto 2011

ANÁLISES DOS DADOS

• Dados de metagenômica cada vez mais abundantes necessitam de banco de dados para cobrir as informações taxonômicas e funcionais

• Plataforma computacional robusta, combinado com programas de pesquisa de similaridade adaptados a esses dados.

Anotação

• Contigs longos ≥ 30.000 pb: RAST ou IMG

• Contigs curtos

Fase 1: identificação dos genes: FragGeneScan (FGS) 1-2% erro, MetaGeneMark (MGM), MetaGeneAnotator (MGA), Metagene e Orphelia

Fase 2: identificação atribuição de função e agrupamento taxonômico

• Usa FGS, Greengenes , RDP e similaridade por RNAr• Usa bases de dados funcionais de ontologia GO

(KEGG, eggNOG, COG/KOG, PFAM e TIGRFAM).

Pipelines

Thomas, Gilbert e Meyer, 2011

Sistema aberto que processa automaticamente as sequências de metagenomas, faz comparações com bases de dados existentes, computa reconstruções filogenéticas e classifica funcionalmente potenciais genes.

• Usa FGS, MGA e taxonomia baseada em 16S RNAr• Usa bases de dados funcionais de ontologia GO (KEGG,

eggNOG, COG e SEED).

Pipelines

Thomas, Gilbert e Meyer, 2011

• Usa FGA e MGA• Oferece esquema de anotação mais flexível

• Requer o uso do mesmo workflow para análise

Pipelines

Thomas, Gilbert e Meyer, 2011

MEGANPipelines

Aplicações

Aplicações

oIdentificar genes funcionais e/ou novas vias metabólicasoEstimar a diversidade microbiana;

permitindo o estudo dos genomas em uma comunidade como um todooCompreender a dinâmica da população de

uma comunidade inteira.

Saúde

Bioenergia

Metabolismo animal

Identificação novos patógenos

Vigilância

Medicina forense

FUNCIONAL

SEQUÊNCIAS

BIOPROSPECÇÃO

BIOPROSPECÇÃO

ESTUDOS ECOLÓGICOSPrimeiros estudos

• Mar de Sargaços– Comunidade

complexa– Genes

desconhecidos– Filotipos novos– Impossibilidade de

sequenciar todos os genomas presentes na amostra

• Global Ocean Sampling (GOS)

Fonte: http://camera.calit2.net/about/gos.shtm

Projetos recentes

• Microorganismos representam mais de 90% da biomassa do oceano, mediam todos os ciclos bioquímicos nos oceanos e são responsáveis por 98% da produção primária no mar.Metagenômica é uma abordagem inovadora de sequenciação para examinar as espécies microbianas de espaço aberto sem a necessidade de isolamento e cultura de laboratório de espécies individuais.

Alves, 2007

Projetos recentes

Projetos recentes

Fluxograma comparativo de projetos genoma tradicionais e metagenômicos

OBRIGADO!