Post on 09-Nov-2018
UNESP- UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA CÂMPUS DE JABOTICABAL
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
Departamento de Patologia Veterinária
PRÁTICAS LABORATORIAIS EM
IMUNOLOGIA BÁSICA E
APLICADA
HÉLIO JOSÉ MONTASSIER (Professor Adjunto - Disciplina de Imunologia Veterinária )
JABOTICABAL - SP - 2016 -
NORMAS GERAIS PARA AS AULAS PRÁTICAS DE IMUNOLOGIA
1.-Antes de entrar no laboratório, o estudante deverá vestir avental.
2.-Não comer, não fumar e não beber água das torneiras durante a aula.
3.Não trazer animais domésticos (cães e gatos) para dentro do laboratório.
4.-Evitar levar quaisquer dos materiais destinados às aulas práticas à boca.
5.-Antes e depois de realizar as atividades práticas, limpar o local de trabalho,
com papel toalha ou algodão embebido em álcool. Conferir no início e no final da aula o
material recebido para a execução da aula prática (vidraria, plásticos, seringas, agulhas,
estantes, canetas de retro-projetor, material cirúrgico, microscópios, etc.)
6.-Antes de iniciar a experimentação leia com cuidado todos os itens da apostila,
ou roteiro de aula prática, verificando se o material necessário à condução do
experimento está ou não completo. No caso de falta de um ou mais materiais dirigir-se
ao professor ou ao técnico.
7.-Cuidados, muita organização e bom-senso quando for manipular animais de
biotério, nas aulas práticas de imunização. Evitar manipulações exageradas e causar
maior estresse aos animais.
8.-Terminados os trabalhos práticos, verifique se as torneiras de água e gás estão
fechadas, as tomadas das lâmpadas desligadas e, quando forem usados os microscópios,
se eles estão limpos.
9.-Evite transportar os materiais montados e organizados para as aulas práticas
em cada um dos lados das bancadas (normalmente, são 6 grupos de práticas para cada
turma e, excepcionalmente, em aulas práticas demonstrativas, esse número pode ser
menor, o que será comunicado pelo professor).
Aula prática 1
TÉCNICA DE DILUIÇÕES SERIADAS:
Séries com razão constante e diluições sucessivas. Nesta técnica, transferem-se
volumes sucessivamente de um tubo para outro seguinte, ao qual se adicionou
quantidade adequada de diluente.
Exemplo 1. Diluições sucessivas com razão constante igual a 2 (figura 01)
1) Distribuir numa série de tubos com l ml de diluente.
2) Ao tubo l adicionar l ml do material.
3) Transferir l ml do tubo l para o tubo 2.
Figura 01
4) Transferir l ml do tubo 2 para o tubo 3.
5) Prosseguir da mesma maneira até o último tubo da série.
As diluições obtidas serão: l:2; l:4; l:8; l:l6; l:32;l:64
Exemplo 2. Diluições sucessivas com razão constante igual a l0 (figura 02)
1) Distribuir 9ml de diluente numa série de tubos.
2) Ao tubo 1 adicionar 1 ml do material não diluído.
3) Transferir 1 ml do tubo 1 para o tubo 2.
4) Transferir 1 ml do tubo 2 para o tubo 3.
5) Prosseguir da mesma maneira até o último tubo da série.
1/2
2 3 4 5
1ml 1ml 1ml 1ml
1/4 1/8 1/16 1/32 1/64
6 1
1ml
Material 1ml
1ml de
salina em
todos
As diluições obtidas serão: 1:10; 1:100; 1:1000; 1:10.000; e 1:100.000.
Figura 02
Problemas:
1. Como você faz para diluir um soro a 1/50;1/100;1/200;1/400 e 1/800?
2. Como você procede para diluir um vírus de 10-3
a 10-8
?
Perguntas:
1. Qual o procedimento geral para se preparar uma suspensão antigênica
bacteriana a 5%?
2. Como se faz para preparar uma solução antigênica de gamaglobulina bovina a
0,1%, num volume final de 5ml?
3. Qual das preparações antigênicas acima (exercícios 1 e 2) será usada para a
obtenção de soros:
a) Precipitantes b) Aglutinantes
4. Qual(is) a(s) principal(is) finalidade(s) de se fazer uma escala de diluições
seriadas?
5. O que são:
a) Solução anti-coagulante de Alsever
b) Solução salina d) Soro
c) Plasma e) Solução salina tamponanda
1/10
2 3 4 5 1ml 1ml 1ml 1ml
1/100 1/1.000 1/10.000 1/100.000
1
1ml
Material
Aula prática 2
PURIFICAÇÃO PARCIAL DOS ANTICORPOS PRESENTES NO SORO
NORMAL ATRAVÉS DA PRECIPITAÇÃO DA FRAÇÃO
GAMA-GLOBULINA COM SULFATO DE AMÔNIO.
1. INTRODUÇÃO - GENERALIDADES
Para estudar a estrutura dos Acs é necessário purificá-los previamente. Tal
purificação é de grande interesse prático, pois diminui consideravelmente as reações
produzidas pelos soros quando eles são utilizados com finalidades profilática ou
terapêutica.
Os métodos usados para purificação dos Acs se filiam a duas modalidades:
métodos não específicos e específicos. Os primeiros se baseiam em técnicas de
fracionamento físico ou físico-químico e não permitem separar as gamaglobulinas
normais dos Acs. Os métodos específicos, por outro lado, baseiam-se na dissociação ou
eluição dos imunocomplexos e permitem obter os Acs em alto grau de pureza, livres de
imunoglobulinas (Igs) inespecíficas. São os métodos de escolha para estudos
experimentais, porém, não podem ser aplicados aos soros terapêuticos em virtude de
baixo rendimento inerente ao processo de purificação.
O método de precipitação com sais neutros ("Salting-out") é de uso corrente e
utiliza, sobretudo, o sulfato de amônio e o sulfato de sódio.
De modo geral, quando se deseja precipitar todas as globulinas de um soro
sanguíneo, adiciona-se sulfato de amônio a 50% de saturação ou sulfato de sódio a 22%
de saturação (a 37ºC) permanecendo solúvel apenas a fração albumina. Outra maneira é
precipitar as frações Gama e Beta globulina que contêm praticamente a maior parte das
proteínas com função de Acs com sulfato de amônio a 40% de saturação ou com sulfato
de sódio a l9% de saturação (a 37ºC).
No nosso caso, será utilizado o método de precipitação das frações gama e beta
globulina com sulfato de amônio a 40% de saturação.
2. MATERIAL
- 5ml de soro sanguíneo
- 5ml solução salina tamponada com fosfatos (PBS)
- solução de sulfato de amônio a l00% de saturação
- becker de 50ml
- pipeta de lml, 2ml, 5ml, l0ml
- tubos cônicos plásticos de centrífugas
- bastões de vidro pequenos e grandes
- provetas de 25, 50ml e 1000ml
- saco de diálise, cordonê
- becker de 2 litros
- pipeta pasteur e tetina
- erlenmeyer de 125 e 250 ml
Figura 03
3. MÉTODOLOGIA
3.1. Juntar 5ml de soro com 5ml de P.B.S.
3.2. Calcular o volume de sulfato de amônio a l00% de saturação que deverá ser
acrescentado a mistura de soro mais P.B.S. no volume final de l0ml; volume de sulfato
de amônio a l00% de saturação onde:
V - volume final de soro + PBS
C - A saturação do sulfato de amônio desejado (40%)
V x C
X =
l00-C
10ml de
solução
3.3. Sob agitação cuidadosa, acrescentar gota a gota o volume calculado do
sulfato de amônio a l00% de saturação, para dar uma saturação final de 40%.
Figura 04
3.4. Continuar agitando por mais 30 minutos.
3.5. Transferir o volume para os tubos de centrífuga e levar a centrífuga a
3000rpm por l5 minutos.
Figura 05
3.6. Descartar o sobrenadante e lavar o sedimento com solução de sulfato de
amônio a 42% de saturação, isto é deve-se centrifugar e descartar o sobrenadante,
ressuspender com cuidado o sedimento na solução de sulfato de amônio a 42% de
saturação.
Obs.: Cálculo da solução do sulfato de amônio a 42% de saturação:
X = V x C X = Vol. de sulfato de amônio a 100% de saturação
100 - C
X = 30 x 42 V = Vol. desejado da solução (30 mL)
100 – 42
C = Saturação final do sulfato de amônio (42% de saturação)
Soro + PBS
Proteínas solúveis
Proteína
O
H H
Proteína /
Globulinas
Camada de Solvatação
+ Sulfato de Amônio
Precipitação das Globulinas
Remoção da Camada de Solvatação
X = 21,72 mL de sulfato de amônio a 100% de saturação + 30 mL de água
destilada
Figura 06
3.7. Após a última lavagem, descartar o sobrenadante e ressuspender o
precipitado em 1 mL de PBS com cuidado e com o uso de pipeta Pasteur.
3.8. O sedimento ressuspenso deve ser colocado dentro do saco de diálise, esse
deve ser fechado e se coloca para dialisar contra salina. Deixa-se dialisar por 2 dias a
4ºC, com duas trocas de líquido de diálise ao dia.
4. Retira-se a fração precipitada do saco de diálise e guarda-se em congelador a -
20ºC para ser testada por imunodifusão.
PERGUNTAS
1) O que são imunoglobulinas e quais as suas principais propriedades físico-
químicas e biológicas?
2) Qual o objetivo de se purificar anticorpos?
3) Como atua o sulfato de amônio sobre moléculas de imunoglobulinas e por que
é importante se conhecer o grau de saturação sulfato de amônio para fazer a separação
das imunoglobulinas?
4) O que é diálise, e por que esse processo é empregado nesse caso?
Aula prática 3
IMUNOHEMÓLISE - Experiência de Erlich Morgenroth Modificada
I. OBJETIVOS
Demonstrar os elementos que participam da reação de imunohemólise de
hemácias de carneiro: (figura 07)
(Ag) Antígeno - Hemácias de carneiro (E)
(Ac) Anticorpos - Hemolisina de coelho anti-E
(C) Complemento - Soro normal de cobaia
Figura 07
II. MATERIAL
l) Estante para tubo de hemólise (l2x75mm)
2) 3 tubos de ensaio l2x75mm
3) 4 pipetas de lml com graduação centesimal
4) Suspensão de hemácias de carneiro a 5%
5) Hemolisina (já diluída)
6) Complemento (soro normal de cobaia) já titulado
7) Solução fisiológica
C Ac
Ag
III. TÉCNICA
l) Numerar os tubos l, 2 e 3
2) Pipetar 0,lml de suspensões de hemácias nos 3 tubos
3) Pipetar 0,lml de hemolisina nos tubos l e 2
4) Pipetar 0,5ml de complemento nos tubos l e 3
5) Pipetar solução fisiológica: (figura 08)
- 0,8ml no tubo l
- l,3ml no tubo 2
- 0,9ml no tubo 3
6) Incubar em B.M. a 37ºC por 30 minutos
1 2 3
Figura 08
IV - RESULTADOS E INTERPRETAÇÃO
Uma vez realizada a leitura da experiência procedente, prosseguir do seguinte
modo:
7) Centrifugar os tubos 2 e 3
8) Abandonar o sobrenadante do tubo 2
Solução Tampão
Complemento
Hemolisina
Hemácia
s
0,5ml
0,8ml
0,1ml
0,1ml
1,3ml
0,1ml
0,1ml
0,5ml
0,9ml
0,1ml
9) Decantar o sobrenadante do tubo 3 sobre as hemácias do tubo 2 e agitar este
tubo para ressuspender as hemácias
10) Sobre o sedimento do tubo 3, colocar hemolisina (0,lml) e solução salina
(l,3ml). Agitar para ressuspender as hemácias
11) Incubar os tubos 2 e 3 em B.M. a 37ºC por 30 minutos
Figura 09 Tubo 1 Figura 10 Tubo 2
Figura 11 Tubo 3
V. RESULTADOS FINAIS E INTERPRETAÇÃO
2 3
Tubo 2 Tubo 3
Figura 12
PERGUNTAS
1) Quais os elementos que participam de uma reação de imunohemólise e qual o
papel de cada um deles nessa reação?
2) O que é Sistema Complemento?
3) Em que circunstâncias o Sistema Complemento é ativado na ausência de
anticorpos?
Aula prática 4
REAÇÃO DE SOROAGLUTINAÇÃO
As reações de aglutinação são reações de floculação celular em que o antígeno é
constituído por suspensão homogênea de células. Estas células podem ser bactérias,
hemácias etc, que normalmente são vistas no microscópio, mas quando aglutinadas, elas
formam flocos ou flóculos que são aglomerados visíveis a olho nu. Um dos requisitos
essenciais para se proceder a reação de aglutinação é que se possua uma suspensão
celular estável. É óbvio, também, que tal reação se verifica somente com antígenos que
estão situados na superfície celular.
Características dos antígenos e anticorpos envolvidos na reação de
soroaglutinação:
Antígenos aglutinantes – de natureza particulada (insolúveis), como
células procariotas e eucariotas.
Devem ser, no mínimo, bivalentes.
Características dos anticorpos envolvidos na reação de soroaglutinação:
Depende da classe isotípica – Ig M tem maior atividade aglutinante,
enquanto que a Ig G tem menor atividade.
Anticorpos devem ser, no mínimo, bivalentes quanto à capacidade de se
ligar aos antígenos específicos.
Explicação do fenômeno da aglutinação:
Duas explicações são mais correntemente aventadas:
1) Revestimento da superfície do antígeno pelo anticorpo o que transformaria a
suspensão celular de hidrófila em hidrófoba e daí a aglutinação. (figura 13)
Figura 13
Antígenos
particulados
hidrófilos
Perda da camada
de solvatação
Hidrófobo Agregação - Aglutinação
2) Teoria "das malhas" da qual os aglomerados seriam constituídos de células ligadas
entre si pelos anticorpos. (figura 14)
Excesso de Anticorpos Excesso de Antígenos
Zona de Equivalência
Figura 14
Técnicas das reações de aglutinação:
As reações de aglutinação podem ser executadas sobre lâminas de microscopia
ou placas de vidro, em tubos de ensaio e em microplacas. Elas podem ser:
1) Reações qualitativas.
2) Reações quantitativas.
Na aula prática, os alunos terão uma demonstração sobre reação de aglutinação
quantitativa feita em placas (micrométodo) usando soros anti-hemácias de carneiro e
suspensão antigênica de hemácias de carneiro.
Material necessário:
1) Microplacas plásticas para hemaglutinação.
2) Soros de camundongos (imunização feita em aula prática pelos grupos 2, 6, 3
e 7).
3) Suspensão de hemácias de carneiro a 1%.
4) Solução salina (0,l5M).
5) Micropipetadores de 25 ul
Técnica da Reação:
1) Adicionar um volume de 25ul de diluente (PBS) em todas as cavidades das
fileiras A e B da microplaca (0,025ml).
2) Colocar na primeira cavidade da fileira A1 e B1 25ul (0,025ml) do soro
positivo de camundongos
3) Com uma micropipeta de 25ul , começar a homogeneizar a primeira cavidade
da fileira A, contendo o soro e, sem tocar na superfície ou na borda da placa, transferir
25ul para a segunda cavidade da fileira A2. Novamente homogeneizar bem e, com os
mesmos cuidados, transferir 25ul para a terceira cavidade e assim sucessivamente até a
11ª cavidade (A11), pois para a última não será transferida nenhum volume da diluiçao
dos soros e esta cavidade servirá como controle da suspensão antigênica de hemácias.
No final, portanto, queremos as seguintes diluições dos soros: l/2, l/4, l/8, l/l6, l/32, l/64,
l/l28, l/256, l/5l2, l/l024, l/2048.
4) Repetir a mesma operação para a fileira B
5) Colocar em todas as cavidades das duas fileiras 25ul (0,025ml) da suspensão
de hemácias de carneiro.
6) Agitar com cuidado a placa e incubar por 60 minutos à temperatura ambiente.
7) Fazer a leitura da reação e, comparando os resultados dos soros e fazer a
interpretação dos resultados.
Figura 15
PERGUNTAS
1) Quais os mecanismos da reação de soroaglutinação?
2) Que tipos de antígenos são revelados pela reação de soroaglutinação?
3) Qual(is) a(s) utilidade(s) da reação de soroaglutinação?
4) Como se procede para titular um soro aglutinante?
1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 1/2048
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
Controle
Aula prática 5
MÉTODO INDIRETO DE ELISA PARA DETECÇÃO E TITULAÇÃO
DE ANTICORPOS DE COBAIA ANTI-GAMAGLOBULINA BOVINA
Trata-se de um método extensivamente usado para detecção e/ou titulação de
anticorpos específicos presentes em soros sangüíneos. A especificidade desse ensaio
imunoenzimático é direcionada pelo antígeno presente na fase sólida (superfície da
microplaca), o qual pode ser uma preparação altamente purificada, ou então preparações
semi-purificadas, ou até mesmo brutas. Após adição e incubação do antígeno (Ag), as
cavidades da microplaca serão lavadas para eliminar o excesso e os antígenos não
ligados à superfície dessas mesmas cavidades. Os soros contendo os anticorpos contra
esse Ag podem ser então adicionados, diluindo-os em tampão apropriado que impeça a
ligação não específica dos anticorpos a sítios livres presentes na superfície da
microplaca, os quais não foram ocupados pelas molécula de Ag. Os soros podem ser
adicionados com diluição única, ou com diluição seriada. Após incubação das diluições
séricas, as cavidades devem ser novamente lavadas para se eliminar o excesso de
anticorpos não ligados.
Os anticorpos combinados ao Ag são então detectados após incubação com o
conjugado imunoenzimático anti-imunoglobulinas ou anti-Ig G da espécie cujos
anticorpos se pretende titular. O conjugado deve ser diluído no mesmo tampão em que
foram diluídos os soros. Após incubação e lavagem das cavidades da microplaca, é
adicionada às cavidades uma solução de substrato imunoenzimático (água oxigenada) e
cromógeno (orto-fenilenodiamina), incubando-se a reação para desenvolvimento de cor
e, ao final, depois de bloqueada a reação enzimática, devem ser lidas as densidades
ópticas (DOs),em leitor de microplacas no comprimento de onda de 490nm.
O esquema básico do método indireto do Elisa é o seguinte:
Ag + Ac (?) + conjugado I.E. + S leitura de Dos
Ag – preparação antigênica solúvel de gamaglobulina bovina
Ac – soros-teste de cobaia
Conjugado I. E. – conjugado de Ig G de coelho anti-Ig G de cobaia com
peroxidase
S – substrato
Observar esquema abaixo:
Antígeno Soro Antiglobulina Substrato Reação
Marcada com enzimático de cor
enzima
Lavagem Lavagem Lavagem
Figura 16
Material
Preparação antigênica solúvel de gamaglobulina bovina
Soros-teste de cobaias imunizadas anteriormente com antígeno citado +
adjuvantes distintos (ACF – Adjuvante Completo de Freund; AIF – Adjuvante
Incompleto de Freund; Al(OH)3 – Hidróxido de alumínio)
Conjugado de Ig G de coelho anti-Ig G de cobaia com peroxidase
(enzima)
Peróxido de hidrogênio (H2O2 – água oxigenada) a 3% (substrato)
Orto-Fenileno-Diamina – OPD (cromógeno)
Microplacas para Elisa
Antígeno
Anticorpo
Substrato Enzimático
Antiglobulina marcada com
enzima
Bloqueador
Tampão Carbonato-Bicarbonato pH 9,6 a 0,05M
Tampão PBS pH 7,4
Tampão PBST pH 7,4 + 10% de LPD (Leite em Pó Desnatado)
Solução de HCl concentrado 2N
Procedimento
1. Adicionar volumes de 50L da solução antigênica em sua diluição ideal
de uso (1g/mL) preparada em Tampão Carbonato-Bicarbonato (1:12500). Incubar a
reação over-night, em geladeira. Ao final, lavar as cavidades da microplaca 4 – 5 vezes
com PBS.
2. Bloquear as cavidades da microplaca através da adição de LPD a 10%
em TCB, incubar a reação por 45 minutos a 37ºC. Ao final, lavar a microplaca como no
item anterior.
3. Adicionar as diluições das amostras de soros-teste preparadas em tampão
PBST + LPD. Incubar a reação por 60 minutos a 37ºC. Ao final, lavar novamente,
conforme já descrito.
4. Adicionar o conjugado em sua diluição ideal de uso (1:2000) preparada
em tampão PBST + LPD. Incubar por mais 60 minutos a 37ºC. Ao final, lavar
novamente.
5. Adicionar a solução de substrato (H2O2) + OPD. Incubar, sob proteção da
luz, por 15 minutos e, então, bloquear a reação com HCl.
6. Fazer a leitura das DOs. Determinar a DO média dos controles para
obtenção dos títulos de Acs presentes nos soros.
1/100
1/200 1/400 1/800 1/1600 1/3200 1/6400 1/25600 1/100240 1/12800 1/51200
8 1
2 3 4 5 6 7 9 10 11 12
A
B
D
E
F
C
G
H
ACF
AIF
AlOH
Sem
Adjuvante