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Biologia In Silico - Centro de Informática - UFPE

Ivan G. Costa Filhoigcf@cin.ufpe.br

Centro de InformáticaUniversidade Federal de Pernambuco

Pré-processamento e Normalização de Microarrays

Tópicos

• Microarrays e Ruídos• Aquisição dos dados de microarray

– análise da imagem– medição da expressão

• Pré-processamento e normalização– normalização dos dados

• inter e intra arrays

– filtros

Aquisição e Processamento de Dados

• Extração dos valores de expressão– identificação do spot– calcular intensidade

do sinal– normalizar valores

entre arrays– detecção de ruídos

Cond A Cond B Cond C

Gene 1 -1,1 0,1 1,5Gene 2 3,1 3,4 2,1

Gene 3 -2,2 -1,9 -3

... ... ...

Fontes de Variabilidade (1)

• Sistemáticos– quantidade total de RNA– transcriptase reversa– etiquetagem (label)– processo de escaneamento da imagem

• Efeitos similares em muitos dados– Técnicas de normalização

• Estocásticos– defeito em sondas– deficiência do processo de detecção de

spots – cross-hibridização ou hibridização não

específica

• Efeitos específico de cada sonda– requerer modelos ruído

Conceitos Basicos

Víes Ausencia de Víes

Ruido P

ouco Ruido

Processamento de Imagem

• Arquivo GAL identifica o posicionamento das sondas– especifico da plataforma

• Processamento– Posicionamento dos grids

• Processamento– Posicionamento dos grids– Identificação dos spots– Valor do background

Identificação Spots

• Identificar bordas

• Custoso, boa detecção do sinal

• Centralizar círculos

• Simples, baixa qualidade no sinal

Valor do Spot

Valor do Spot Saturação • Calibragem do scanner pode levar

muitos pixels a ter valores máximos– 16bits – 65,535

• Mediana resolve com poucos pontos saturados

• Usar NA no caso de vários valores

verde (cy5)

vermelho(cy3)

cDNA Leitura - Exemplo

• Imagem é dividida em 2 canais (verde e vermelho)

• Mediana da intensidade de cada circulo

• Expressão final é dada por

– cy3mediana/cy5mediana

Detecção de Background

• Problemas:– falha na lavagem do

array, luminosidade, hibridização não específica

• Uso de intensidade local como sinal de background

verde (cy5)

vermelho(cy3)

cDNA Leitura - Exemplo

• Imagem é dividida em 2 canais (verde e vermelho)

• Inclusão de background na medida

• Expressão final é dada por– (cy3sinal-cy3background)/

(cy5sinal -cy5background)

Leitura Affymetrix Exemplo

• Grid quadrado é usado para marcar sondas

• Expressão absoluta do gene

PMPMPM

PM1 = 300

PM1 = 0

PM2 = 2000

PM2 = 100

Leitura Affymetrix Exemplo

• Expressão absoluta do gene

• Formula original pode gerar valores negativos

PMPMPM

PM1 = 300

PM1 = 0

PM2 = 2000

PM2 = 100

Avg.diff=∑j∈A

w j PM j−MM j

∣A∣∑j∈A

w j=1 if PM j−MM j00 if PM j−MM j0

Qualidade de Leitura • u

• Fontes de ruído– Defeito de fabricação, distribuição, erro no

processo de identificação do spot, bolha de ar, poeira, cabelo, buracos negros

• Qualidade do spot:– Luminosidade: razão do sinal/background – Uniformidade: variação da intensidade do

pixel– Morfologia: área, perímetro, forma circular– Tamanho do spot: numero de pixels

Qualidade de Leitura • u

• Ações:– Definir valores como NA (missing values)

•i.e. (cy3sinal-cy3background) < c– normalização locais para reduzir problemas

como poeira– usar indicadores de qualidade em estágios

posteriores da análise.

Normalização

Preliminares

Normalização

microarrays

Normalização

• Problemas– Intensidade dos canais, calibragem do

scanner, ...

• Princípios básicos– a maioria dos genes medidos mantem

mesma expressão– a quantidade total de RNA

apresentado é igual

Normalização

• Localização– Corrigir viés

espacial• Escala

– igualar variabilidade

• Os microarrays devem ter mesma escala e localização

Normalização Escalonamento

• Rescalonamento

Mediana é usada por ser mais robusto

• Todos arrays tem a mesma localização

enorm=enorm−medianaarray

Normalização Escalonamento (2)• Como medir o fator de escalonamento?

– todos os genes– genes house-keeping – controles spike-in

• Correção do Background– global - Usar 5% percentile– Local - ???

Controle de Qualidade

• Swirl data

log(red)/log(green)

Controle de Qualidade

Escalonamento Local

Aplicar escalonamento para cada sub-grid

Escalonamento Local

EscalonamentoProblemas Scatter Plot MA Plot

Normalização global → não leva efeitos de intensidade em consideração

Normalização Loess

• Existe um viés dependente da intensidade

Viés = f(x)• emed= f(x) + ereal

• Encontra f e calcular emed-f

• Calcular f com regressão local

Normalização LoessExemplo

Normalizacao Metodo de Quantil• Todos os histogramas devem ser

identicos

Normalizacao Metodo de Quantil

NormalizacaoEstabilizacao de Variancia• Usa transformacao arcsin ao invez

do log• Usa metodos de maxima

verossimilhanca para calcular valores de escalonamento e normalizacao

• Ussume um erro aditivo e multiplicativo

NormalizacaoEstabilizacao de Variancia

Normalizacoes

• A principio todas as normalizacoes retornam bom resultados– Escalonamento local– Loess– Quantil– Estabilizacao de variancia

Filtros

• Problema no desing da sonda

Filtros

• Alguns genes nao hidridizam com suas sondas

• Problemas de confeccao da sonda• Solucoes

– Usar sondas multiplas– Filtrar genes com baixa expressao

• Ex. Em affymetrix genes com emed > 200

Conclusoes

• Pre-processamento – Obtenco dos dados– Requer varios niveis de checagem de

qualidade• Sonda, array, gene

– Exercicio importante na analise de dados!

Software

• Bioconductor– Implementa maioria dos metodos:

vsn, limma, affy, …

• Affymetrix, Agilent– tem software proprio implementando

metodos.

Agradecimentos

Slides foram retirados de apresentacoes de Christine Steinhof e Tim Beissbarth

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