Fabiane Maria Lima SousaMestranda PPGZ-UFC

Orient.: Prof.: Arlindo Moura

A digestão é necessária para que todas as partes da proteína fiquem uniformemente expostas à dissociação e ionização, e para aumentar a eficiência desses processos.

As bandas/spots protéicos correspondentes à proteína de interesse serão: 1. Excisadas 2. Descoradas 3. Submetidas à digestão enzimática

Imagem gerada pelo PDQuest: Master gel

Proteases normalmente utilizadas:o Quimotripsinao Pepsinao Carboxipeptidaseso Aminopeptidaseso Tripsina ou uma combinação delas

CapacidadePrevisibilidadeDisponibilidade

Cuidados no procedimento Manter o gel umedecido com água destilada para evitar o ressecamento. Deve-se usar reagentes de boa qualidade e procedência conhecida. Durante os procedimentos de corte e digestão, é importante o uso de luvas, jaleco de mangas compridas, e, se possível, touca e máscara, para evitar contaminações, a principal é a queratina humana.

Etapas do procedimentoExcisão ou corte dos spots

o Spot no gel, é cortado no centro e dividido em pedaços menores.

o Existem os métodos manuais (tesoura, bisturi ou gilete), e existe um método computadorizado (spot picker).

Excisão manual com bisturi

Método computadorizado (Spot picker)

Lavagem do gel

o Solução de acetonitrila/bicarbonato de amônioo Desidratado o gel com acetonitrilao Remover a acetonitrila e secar completamente

os géis no Speed Vac.

Digestão com tripsinao Solução de tripsina diluída será distribuída de

forma a cobrir os pedaços de gel.o Extração dos peptídeos (por meio de

lavagens)com ácido fórmico 5% ou TFA 5%/ acetonitrila 50%.

o Concentrar as amostras .

Gel separation – 1D or 2D

ExciseSpot

Trypsin Digest

Protein Peptides

Obrigada

fmlsousa@gmail.com