Purificação de proteínas

ETAPAS PRÉVIAS – DECIDIR:

Fonte de proteína

Método para dosar a atividade biológica

Método para dosar a quantidade total de proteínas

Extrato bruto

Extrato bruto

Centrifugação

Centrifugação

Centrifugação

Purificação de proteínas

solubilidadetamanhocargaafinidade de ligação

Purificação de proteínas

CADA ETAPA DA PURIFICAÇÃO:

TESTAR A ATIVIDADE BIOLÓGICA

DETERMINAR CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS

SOLUBILIDADE

Solubilidade

Força iônica (M)

“Salting in”

“Salting out”

Exemplos de fracionamento “salting out”

Fibrinogênio = 0,8 M de (NH4)2SO4- Albumina = 2,4 M de (NH4)2SO4

“Salting out”

Diálise

Liofilização

Cromatografia= separação de componentes de uma mistura com base nas

diferenças de adsorção à uma matriz insolúvel

Cromatografia em coluna

Cromatografia de GEL FILTRAÇÃO

Cromatografia de GEL FILTRAÇÃO

Cromatografia de GEL FILTRAÇÃO

Cromatografia de GEL FILTRAÇÃO

Gel filtração : Sephadex - Agarose

Gel filtração : colunas

GEL FILTRAÇÃO

GEL FILTRAÇÃO- calibraçãoGlucagon

Citocromo c

Ribonucleasa

Seroalbúmina

IgGTiroglobulina

Volumen

Peso molecular

280

240

200

160

120

80

40

103

104

105

106

GEL FILTRAÇÃO

Purificação de proteínasCromatografia

Equipamentos, soluções e resinas• Coluna de vidro com filtro

• Coletor de frações

• Bomba peristáltica

• Soluções tampão de pH

Espectrofotômetros

GEL FILTRAÇÃO

• Baseia-se no peso molecular das proteínas da amostra

GEL FILTRAÇÃO

TROCA-IÔNICA

O

OH

HOCH2

OHH

H

HOO

O

OH

HOCH2

OHO

H

H

H

H

nCelulosa

O

O

H

H

OHCH2

O

H

O

O

OH

OH

HOCH2

HO

H

H

n

Agarosa

O

OH

CH2

OH

H

HOH

O

OH

OH

H

H

CH2O

H

O

H

H

OH

H

O

n

Dextrano

SUPORTES CROMATOGRÁFICOS

CH2 COO-

Carboximetil (CM)

CH2 CH2 S

O

O

O-

Sulfoetil (SE)

CH2 CH2 CH2 S

O

O

O-

Sulfopropil (SP)

O P

OO-

O-

Fosfo (P)

TROCADOR CATIÔNICO

CH2 CH2 NH+CH2

CH2 CH3

CH3

Dietilaminoetil (DEAE)

CH2 CH2 N+ CH2 CH3CH2CH3

CH2

CH3

Trietilaminoetil (TEAE)

CH2 CH2 N+ CH2CH2CH3

CH2

CH3

CHOH CH3

Dietil 2-hidroxipropil aminoetil (QAE)

TROCADOR ANIÔNICO

+

+++

+++++

---

-

----

--

+

+++

+++++

-

--

--

--

---

- -- -

-

---

-

+

+++

+++++

-

-

--

--

---

-

-

---

-

- -

--

-

Proteínas ligadas

ao trocadoriônico

Baixas [SAL]Desprendem-se

as proteínas menoseletronegativas

Maiores [SAL]Desprendem-se

as proteínas maiseletronegativas

TROCA-IÔNICA

Cromatografia de troca- iônica

Bomba peristáltica

Generadorde gradiente

Columna

Colector defracciones

Resina deintercambioiónico

Baseia-se na AFINIDADE pelo suporte acoplado à resina

AFINIDADE

1 2 3

Cromatografia de afinidade

ELETROFORESE EM GEL DE

POLIACRILAMIDA COM SDS

SDS-PAGE

+

-

ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA COM SDS

SDS-PAGE

Coloração com Coomassie Blue

Coloração por prata