Post on 23-Nov-2018
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
PRISCILLA FERNANDA CAMPOS JUSTINO
Saccharomyces boulardii REVERTE A RESPOSTA
INFLAMATÓRIA E FUNCIONAL PRESENTE NA MUCOSITE
INTESTINAL INDUZIDA POR 5-FLUOROURACIL EM
CAMUNDONGOS
FORTALEZA
2011
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PRISCILLA FERNANDA CAMPOS JUSTINO
Saccharomyces boulardii REVERTE A RESPOSTA
INFLAMATÓRIA E FUNCIONAL PRESENTE NA MUCOSITE
INTESTINAL INDUZIDA POR 5-FLUOROURACIL EM
CAMUNDONGOS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Farmacologia do Departamento de Fisiologia e
Farmacologia da Faculdade de Medicina da Universidade
Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do
título de Mestre em Farmacologia.
Orientador: Prof. Dr. Pedro Marcos Gomes Soares
FORTALEZA
2011
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J97s Justino, Priscilla Fernanda Campos
Saccharomyces boulardii reverte a resposta inflamatória e
funcional presente na mucosite intestinal induzida por 5-
fluorouracil em camundongos./ Priscilla Fernanda Campos
Justino. – Fortaleza, 2011.
89f.; il.
Orientadora: Prof. Dr. Pedro Marcos Gomes Soares. Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Ceará.
Faculdade de Medicina. Departamento de Fisiologia e Farmacologia
1. Doenças inflamatórias intestinais. 2. Antineoplásicos. 3.
Probióticos. I. Soares, Pedro Marcos Gomes (Orient.) II. Título.
CDD: 616.344
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PRISCILLA FERNANDA CAMPOS JUSTINO
Saccharomyces boulardii REVERTE A RESPOSTA INFLAMATÓRIA E
FUNCIONAL PRESENTE NA MUCOSITE INTESTINAL INDUZIDA
POR 5-FLUOROURACIL EM CAMUNDONGOS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Farmacologia da Universidade
Federal do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em
Farmacologia.
Orientador: Prof. Dr. Pedro Marcos Gomes Soares.
Aprovada em: 20/06/2011
BANCA EXAMINADORA
__________________________________________
Prof. Dr. Pedro Marcos Gomes Soares (Orientador)
Universidade Federal do Ceará – UFC
_____________________________________________
Prof. Dr. Ronaldo de Albuquerque Ribeiro
Universidade Federal do Ceará – UFC
___________________________________________
Profa. Dra. Ana Maria Sampaio Assreuy
Universidade Estadual do Ceará - UECE
5
À Deus, primeiramente, que sempre está presente na minha vida;
Aos meus pais, Marcos e Daisy (in memoriam);
Às minhas irmãs, Carinne e Rachel.
6
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, irmãs e amigos pelo apoio e compreensão durante a realização
deste trabalho.
Ao Professor Dr. Marcellus Henrique, por ter acreditado em mim e me acolhido
no laboratório, LAFICA.
Ao Professor Dr. Pedro Marcos Gomes Soares pela orientação científica e
pessoal, pela paciência e dedicação, que foram muito importantes para o meu crescimento
como pesquisadora.
Ao Professor Dr. Ronaldo Ribeiro, agradeço a oportunidade de participar da
equipe de grandes pesquisadores do LAFICA.
Ao Professor Dr. Roberto César, à Prof. Dra. Danielle Macedo por fazerem parte
da minha banca de qualificação.
A todos os outros professores do departamento de Fisiologia e Farmacologia da
UFC, que contribuíram de alguma forma para a minha formação no mestrado.
Aos meus amigos e colegas da pós-graduação do laboratório LAFICA, Roberta
Dalcico, Larisse Lucetti, Ana Paula Macedo, Deisy e Roberto César, os quais se
disponibilizaram a me ensinar e me ajudar nas realizações dos experimentos, e em todo
decorrer do trabalho. Pelas horas de descontração, pelas conversas paralelas e por tornarem
o trabalho mais divertido.
Aos meus grandes amigos Otacílio e Roberta, por sempre me incentivarem a
seguir o caminho certo e por me apoiarem em todos os momentos.
Aos bolsistas, estudantes de iniciação científica do Laboratório LAFICA, André,
Luís Fernando, Luara Manuela, José Victor e Bruno por toda a ajuda nos experimentos,
nas apresentações e por todos os bons momentos passados no laboratório.
7
Aos técnicos, Maria Silvandira França Pinheiro (Vandinha), Carol, Tiara Sena e
Álvaro Franco pela atenção, disponibilidade, organização do laboratório LAFICA, por toda
dedicação, auxílio e as conversas paralelas que tornavam o trabalho mais agradável. À
Socorro pela grande ajuda na confecção das lâminas de histologia. Antonio Haroldo
Pinheiro Ferreira pela colaboração e organização do Biotério.
À secretária da Pós-Graduação, Aura Rhanes e Márcia, pela eficiência e
gentileza.
Ao meu pai Marcos Justino pela dedicação e esforço, por sempre acreditar e
torcer pelo meu sucesso e pelo esforço incondicional pelos meus estudos.
À minha mãe Daisy Fátima (in memoriam) que sempre esteve (e está) ao meu
lado, sempre foi a pessoa que mais me incentivou a realizar os meus sonhos e, que mesmo
não estando mais no mesmo plano físico que nós, não deixou de me influenciar e torcer pelo
meu sucesso. Agradeço por toda a sua dedicação e amor e, por tudo que sempre me ensinou,
por ser responsável pelo que sou hoje.
Às minhas irmãs Rachel Fátima (Kelzinha) e Carinne Justino, por me ajudarem a
realizar esse sonho e me apoiarem nos estudos.
Ao meu avô Antônio Justino que mesmo distante sempre me incentivou e se
realizou com as minhas conquistas.
Aos meus amigos Fabrícia, Lícia, Júlia, Nilton, Juliana Lobo, Erica Leandro,
Aline, Ana Luiza, Pablo, Lore Anny, Lilianne, Cristiane Feijó, Ana Paula Rolim, Célia e
Virna Saraiva que estão presentes no meu dia a dia, me apoiando, me ajudando nas horas
difíceis. Sou muito grata por saber que os tenho como amigos a qualquer hora.
Ao CNPq pelo suporte financeiro.
A todos que direta ou indiretamente colaboraram em alguma etapa da execução
do meu trabalho.
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“Bom mesmo é ir a luta com determinação, abraçar a vida
e viver com paixão, perder com classe e vencer com
ousadia, porque o mundo pertence a quem se atreve e a
VIDA É MUITO para ser insignificante.”
Charlie Chaplin
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RESUMO
Saccharomyces boulardii REVERTE A RESPOSTA INFLAMATÓRIA E
FUNCIONAL PRESENTE NA MUCOSITE INTESTINAL INDUZIDA
POR 5-FLUOROURACIL EM CAMUNDONGOS.
Introdução: A mucosite induzida por antineoplásicos é um fator limitante na terapia
anticâncer. O trato gastrintestinal é vulnerável por causa da alta proliferação e frequência de
renovação celular. Saccharomyces boulardii (SB) é uma levedura probiótica que é utilizado
para proteger a microflora gastrintestinal do desequilíbrio e de distúrbios gastrintestinais
associados. Objetivos: Avaliar o efeito do tratamento com SB na resposta inflamatória e nas
alterações da motilidade digestiva no curso da mucosite intestinal experimental induzida por
5-FU. Métodos: Camundongos machos Swiss (25-30g) foram tratados com 5-FU (450mg/Kg,
i.p.) ou com solução salina (controle). Outros grupos receberam durante 3 ou 6 dias SB
(800mg/Kg, gavagem) até o dia do sacrifício, diariamente. Um grupo pré-tratado recebeu o
SB por 3 dias antes e 3 dias depois da administração do 5-FU (SB 6D) e outro grupo recebeu
SB somente 3 dias após a administração do 5-FU (SB 3D). No 3º dia após o 5-FU ou 5-
FU+SB (3D ou 6D), os animais foram sacrificados, amostras de jejuno e íleo foram retiradas
para avaliar a injúria epitelial por morfometria, escores histológicos, atividade de MPO, níveis
de nitrito e concentração de GSH. Para avaliação de citocinas pelo método de ELISA foi
determinada a concentração de IL-1β e CXCL1. Já na técnica de esvaziamento gástrico os
animais receberam o mesmo tratamento descrito anteriormente. Posteriormente, foram
deixados em jejum de 18 horas. No 7º dia foram administrados 0,3 ml da solução glicosada
(5%) contendo vermelho de fenol (VF) a 0,75 mg/ml em cada animal. Após 20 min, os
animais foram sacrificados e submetidos a uma laparotomia mediana. O intestino delgado foi
exposto e divido em 3 partes iguais: proximal, medial e distal. Com o auxílio de uma proveta
contendo uma solução de NaOH (100ml, 0,1N) o volume do estômago e dos segmentos do
intestino delgado foram determinados. A absorbância da amostra foi lida à 540nm.
Resultados: O tratamento com 5-FU foi capaz de induzir uma lesão intestinal com um
importante comprometimento da barreira epitelial funcional com a presença das seguintes
alterações: encurtamento acentuado das vilosidades intestinais, necrose parcial de criptas,
vacuolização de células, presença de infiltrado de polimorfonucleares, produção de radicais
livres com consumo de GSH, aumento dos níveis de nitrito, aumento na concentração de IL-
1β e CXCL1 e alterações na motilidade digestiva. O tratamento com SB reduziu
significativamente as lesões intestinais, com recuperação da altura dos vilos, recuperação da
profundidade das criptas, diminuição do infiltrado neutrofílico e dos níveis de nitrito, aumento
dos níveis de glutationa e redução da concentração de IL-1β e CXCL1. Contudo, o tratamento
com SB foi capaz de reverter o retarde do esvaziamento gástrico e do transito gastrintestinal.
Conclusão: 5-FU induz mucosite intestinal em camundongos com a participação de IL-1β e
CXCL1, a qual se associa com retarde no esvaziamento gástrico e no transito gastrintestinal.
O tratamento com SB foi capaz de reverter os achados inflamatórios e as alterações na
motilidade digestiva associadas à mucosite por 5- FU em camundongos.
Palavras-chave: doenças inflamatórias intestinais, agentes antineoplásicos, probióticos.
10
ABSTRACT
Saccharomyces boulardii AMELIORATES THE INFLAMMATION AND GASTRIC
DYSMOTILITY PRESENTS IN INTESTINAL MUCOSITIS INDUCED BY 5-
FLUOROURACIL IN MICE.
Introduction: Intestinal mucositis is a frequent side-effect associated to 5-fluorouracil (5-FU)
clinical use and results in inflammatory events. It is characterized by epithelial ulcerations in
the mucosa and clinical manifestations of abdominal pain, nauseas and diarrhea.
Saccharomyces boulardii is a probiotic yeast which has been shown to protect the
gastrointestinal microflora from disequilibrium and from associated gastrointestinal disorders.
Aim: To evaluate the effect of treatment with Saccharomyces boulardii in inflammatory
response and alterations in the gastrintestinal motility in the course of intestinal mucositis
experimental induced by 5-FU. Methods: Swiss male mice (25-30g) were treated with 5-FU
(450mg/Kg, ip) or saline (control). Other groups received 3 or 6 days during SB (800mg/Kg,
gavage) until the day of sacrifice, every day. A group pretreated received the SB for 3 days
before and 3 days after administration of 5-FU (SB 6D) and another group received SB only 3
days after administration of 5-FU (SB 3D). At day 3 after 5-FU, the animals were sacrificed,
samples of jejunum and ileum were collected to assess the injury epithelial morphometry,
histological scores, the activity of MPO, nitrite levels and the concentration of GSH. For
evaluation of cytokine samples of jejunum and ileum were removed and the ELISA was
determined concentrations of IL-1β and CXCL1. In the technique of gastric emptying, the
animals received the same treatment described above. Later, they were left to fast for 18 hours
from d6 to d7. At d7, were administered 0.3 ml of glucose solution (5%) containing phenol
red (VF) to 0.75 mg / ml in each animal. After 20 min, the animals were sacrificed and
underwent a laparotomy. The small intestine was exposed and divided into 3 equal parts:
proximal, medial and distal. With the aid of a beaker containing a solution of NaOH (100ml,
0.1 N) the volume of the stomach and small intestine segments were determined. The sample
absorbance was read in a wavelength of 540 nm. Results: Treatment with 5-FU was able to
induce intestinal injury with a significant impairment of epithelial barrier function in the
presence of the following changes: severe shortening of the villus, crypts of partial necrosis,
vacuolization of cells, infiltration and mono polymorphonuclear free radical production with
consumption of GSH, increased levels of nitrite, increased concentration of IL-1β and CXCL1
and changes in gastrointestinal motility. Treatment with SB significantly reduced intestinal
damage, with recovery of villous height, crypt depth recovery, decreased neutrophil
infiltration and nitrite levels, increased levels of glutathione and reduced concentrations of IL-
1β and CXCL1. However, treatment with SB was able to reverse the delayed gastric emptying
and gastrointestinal transit. Conclusion: 5-FU induces intestinal mucositis in mice involving
IL-1β and CXCL1, which is associated with delayed gastric emptying and gastrointestinal
transit in. Treatment with SB, both 3D and 6D, were able to reverse the inflammatory
changes, and revert the changes in gastrointestinal motility associated with mucositis by 5 -
FU in mice.
Keywords: inflammatory bowel diseases, antineoplastic agents, probiotics
11
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 Fotomicrografia eletrônica do Saccharomyces boulardii...................... 26
FIGURA 2 Esquema do trato intestinal, ilustrando os diferentes mecanismos de
ação do Saccharomyces boulardii (SB).................................................
27
FIGURA 3 Estrutura química do 5-Fluorouracil ..................................................... 29
FIGURA 4 Metabolismo hepático do 5-Fluorouracil .............................................. 30
FIGURA 5 Modelo experimental (parâmetros inflamatórios) ................................. 40
FIGURA 6 Modelo experimental (parâmetros funcionais) ..................................... 45
FIGURA 7 Representação esquemática do centro geométrico de uma refeição
teste ........................................................................................................
46
FIGURA 8 Efeito do tratamento com SB na variação de peso corporal em
camundongos .........................................................................................
50
FIGURA 9 Efeito do tratamento com SB nas alterações histopatológicas no
jejuno induzidas por 5-FU em camundongos ........................................
52
FIGURA 10 Efeito do tratamento com SB nas alterações histopatológicas no íleo
induzidas por 5-FU em camundongos ...................................................
53
FIGURA 11. Efeito do tratamento com SB nas alterações morfométricas induzidas
por 5-FU em camundongos ...................................................................
55
FIGURA 12 Efeito do tratamento com SB no aumento da atividade de MPO nos
segmentos intestinais induzidos por 5-FU em camundongos ...............
56
FIGURA 13 Efeito do tratamento com SB na diminuição da concentração de GSH
nos segmentos intestinais induzidos por 5-FU em camundongos .........
57
12
FIGURA 14 Efeito do tratamento com SB no aumento dos níveis de nitrito nos
segmentos intestinais induzidos por 5-FU em camundongos ...............
58
FIGURA 15 Efeito do tratamento com SB na diminuição dos níveis de IL-1β nos
segmentos intestinais induzidos por 5-FU em camundongos ...............
60
FIGURA 16 Efeito do tratamento com SB na diminuição dos níveis de CXCL1
nos segmentos intestinais induzidos por 5-FU em camundongos .........
61
FIGURA 17 Esvaziamento gástrico de líquidos em camundongos acordados e
tratados com 5-FU ou salina (controle) .................................................
62
FIGURA 18 Efeito do tratamento com SB no retardo do esvaziamento gástrico, na
atividade permanecida no intestino e no trânsito gastrintestinal
induzidos por 5- FU em camundongos..................................................
63
FIGURA 19 Hipótese de Mecanismo de ação do Saccharomyces boulardii ............
73
13
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 Sistema de Escores de Macpherson e Pfeiffer .................................... 41
TABELA 2 SB não altera a leucopenia induzida por 5-FU ................................... 49
TABELA 3 Escores histopatológicos nos segmentos intestinais de
camundongos submetidos à mucosite intestinal induzida por 5-FU e
tratados ou não com Saccharomyces boulardii...................................
51
14
LISTA DE QUADROS
QUADRO 1 Fármacos e diluentes ......................................................................... 37
QUADRO 2 Equipamentos e instrumentos laboratoriais ........................................ 38
15
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
α Alfa
β Beta
γ Gama
µL Microlitro
µM Micrômetro
ºC Graus Celsius
5-FU 5-Fluorouracila
3D Três dias
6D Seis dias
AGCC Ácido graxo de cadeia curta
ANOVA Análise de Variância
ATP Trifosfato de adenosina
ATV Atorvastatina
BN52021 Inibidor do receptor de PAF
BSA Albumina sérica bovina
CADS Síndrome dispéptica associada à quimioterapia do câncer
cAMP Monofosfato de adenosina cíclico
COX-2 Ciclooxigenase 2
CPT-11 Cloridrato de irinotecano
CXCL1 Quimiocina derivada de queratinócitos
CXCR2 Receptor de quimiocina
d Dia
DAB 3,3 diaminobenzidine-peróxido
DHFU Diidrofluorouracila
DNA Ácido desoxirribonucleico
16
DPD Diidropirimidina desidrogenase
DTNB Ácido 5,5-dithiobis-2-nitro-benzóico
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
ELISA Ensaio imunoenzimático
EPM Erro padrão da média
FDA Food and Drug Administration
FdUMP Fluorodioxuridina monofosfato
FdUTP Fluorodioxuridina trifosfato
FUTP Fluorouridina trifosfat
G Grama
GSH Glutationa
HTAB Hexadecitrimetilamônio
H2O Água
H2O2 Peróxido de hidrogênio
H2SO4 Ácido sulfúrico
HIV Vírus da imunodeficiência humana
IFN Interferon
IgA Imunoglobulina A
IL- Interleucina
IkB Proteína inibitória de Kappa beta
ICAM-1 Molécula de adesão intercelular 1
i.p. Intraperitoneal
Kg Quilograma
LPS Lipopolissacarídeo
M Molar
Min. Minutos
17
Mg Miligrama
mL Mililitro
mm3 Milímetro cúbico
MPO Mieloperoxidase
n Número
NaCl Cloreto de sódio
NaOH Hidróxido de sódio
NF-KB Fator nuclear Kappa beta
NO Óxido nítrico
NO2-
Nitrito
NO3-
Nitrato
NOS Óxido nítrico sintase
NOSi Óxido nítrico sintase induzida
NP-SH Grupo sulfidrílico não-protéico
PAF Fator de ativação plaquetária
pH Potencial hidrogeniônico
PLA2 Fosfolipase 2
PMN Polimorfonucleares
PBS Solução tamponada de fosfato
Pg Picograma
PG Prostaglandina
PGE2 Prostaglandina E2
PGI2 Prostaglandina I2
PTX Pentoxifilina
RNA Ácido Ribonucléico
ROS Espécies reativas de oxigênio
18
RPM Rotação por minuto
SB Saccharomyces boulardii
sIgA Imunoglobulina A secretória
s.c. Subcutânea
TCA Ácido tricloroacético
TGF- Fator de crescimento transformador
TF Fator de transcrição
TLD Talidomida
TLRs Receptores toll-like
TNF-α Fator de necrose tumoral α
TRIS Tampão tris-hidroximetilaminometano
TS Timidilato sintase
TXA2 Tromboxano A2
UFC Unidade formadora de colônia
VF Vermelho de fenol
v.o. Via oral
WHO Organização Mundial de Saúde
19
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................
22
1.1. Probióticos e o Saccharomyces boulardii ......................................................
1.2. Mucosite Intestinal e o 5-fluorouracil ..........................................................
1.2.1. Papel das citocinas na mucosite intestinal ..................................................
1.2.2. Aspectos funcionais da mucosite intestinal ...............................................
1.2.3. Mucosite por antineoplásicos e a contribuição do LAFICA ......................
23
28
31
31
32
2 OBJETIVOS .....................................................................................................
2.1. Objetivo Geral ................................................................................................
2.2. Objetivos Específicos .....................................................................................
34
35
35
3 MATERIAIS E MÉTODOS ...........................................................................
3.1. Animais ..........................................................................................................
3.2. Materiais Utilizados ......................................................................................
3.2.1 Fármacos e Diluentes ...................................................................................
3.2.2 Equipamentos e Instrumentos Laboratoriais ................................................
3.3. Protocolo Experimental ................................................................................
3.3.1 Modelo de mucosite intestinal induzida por 5-FU e tratamento com
Saccharomyces boulardii ................................................................................
3.4. Parâmetros avaliados ...................................................................................
3.4.1 Análise do peso corporal .............................................................................
3.4.2 Leucograma .................................................................................................
3.4.3 Análise morfométrica e histopatológica ......................................................
36
37
37
37
38
39
39
40
40
40
41
20
3.4.4 Ensaio para mieloperoxidase (MPO) ..........................................................
3.4.5 Determinação de glutationa (GSH) .............................................................
3.4.6 Dosagem de IL-1β, CXCL1 e IL-10 ...........................................................
3.4.7 Dosagem de nitrito ......................................................................................
3.5. Esvaziamento gástrico e transito gastrintestinal na mucosite intestinal
induzida por 5-FU em camundongos.............................................................
3.6. Efeito do tratamento com SB no retardo do esvaziamento gástrico e
trânsito gastrintestinal observado na mucosite intestinal induzida por 5-
FU em camundongos ......................................................................................
3.7. Análise estatística ............................................................................................
42
42
43
43
43
46
47
4 RESULTADOS .................................................................................................
4.1. Efeito do tratamento com Saccharomyces boulardii sobre a leucopenia
induzida por 5-FU em camundongos ............................................................
4.2. Efeito do tratamento com SB na variação de peso corporal dos animais
tratados com 5-FU ..........................................................................................
4.3. Efeito do tratamento do SB na análise histopatológica da lesão intestinal
causada por 5-FU em camundongos .............................................................
4.4. SB reduz as alterações intestinais morfométricas induzida por 5-FU em
camundongos ...................................................................................................
4.5. Efeito do tratamento com SB no aumento da atividade de MPO nos
segmentos intestinais induzidas por 5-FU em camundongos ......................
4.6. Efeito do tratamento com SB na diminuição da concentração de GSH
nos segmentos intestinais induzidas por 5-FU em
camundongos....................................................................................................
4.7. Efeito do tratamento com SB no aumento das concentrações de nitrito
48
49
49
50
54
56
57
21
nos segmentos intestinais induzidas por 5-FU em camundongos ...............
4.8. SB reverteu o aumento dos níveis de IL-1β e CXCL1 induzidos por 5-FU
nos segmentos intestinais em camundongos .................................................
4.9. Esvaziamento gástrico de líquidos em camundongos acordados e
tratados com 5-FU ou salina ..........................................................................
4.10. SB reverteu o retardo do esvaziamento e do transito gastrintestinal
associado a mucosite intestinal induzida por 5-FU em
camundongos....................................................................................................
58
59
61
62
5 DISCUSSÃO ...................................................................................................
6 CONCLUSÃO ................................................................................................
7 REFERÊNCIAS ..............................................................................................
8 ANEXO ............................................................................................................
65
74
76
89
22
INTRODUÇÃO
23
1 INTRODUÇÃO
O intestino exerce funções importantes para a saúde do organismo, tais como
digestão e absorção de macro e micronutrientes e produção de importantes hormônios
reguladores. Pode funcionar ainda como órgão imune e agir como barreira contra agentes
nocivos. O intestino é formado por três camadas básicas, a camada epitelial, a lâmina própria
e a camada muscular da mucosa (DUNCAN; GRANT, 2003).
O trato gastrointestinal (TGI) dos mamíferos abriga uma comunidade microbiana
que é extremamente densa e diversa, composta por 1014
unidades formadoras de colônias
(UFCs) de microrganismos, número dez vezes maior que o de células do hospedeiro. Estima-
se que o número de espécies bacterianas do trato gastrintestinal gire em torno de 400, embora
estudos mais recentes indiquem que esse número varia de 500-1000 espécies (MARTINS et
al., 2009). Dentre esses microorganismos que hospedam o trato gastrintestinal a maioria são
microorganismos essenciais para o bom funcionamento do organismo, mas por muitas vezes
pode ocorrer a invasão de alguns microorganismos nocivos. O TGI é um microecossistema
cinético que possibilita o desempenho normal das funções fisiológicas do hospedeiro, a menos
que microrganismos prejudiciais e potencialmente patogênicos dominem. (BIELECKA,
BIEDRZYCKA, MAJKOWSKA, 2002).
Normalmente no TGI no estômago e duodeno encontramos < 103
células
bacterianas por grama de conteúdo estomacal e duodenal, predominantemente os
microorganismos mais encontrados são os lactobacilos e estreptococos e, devido às secreções
ácidas, biliares, e pancreáticas ocorre a supressão da maioria dos microrganismos ingeridos
diariamente. No jejuno e íleo o número de bactérias aumenta progressivamente de 104 células
no jejuno a 107
células por grama de conteúdo no íleo e no intestino grosso encontramos um
ambiente densamente povoado por anaeróbios, 1012
células por grama de conteúdo luminal
(SAAD, 2006).
1.1. Probióticos e o Saccharomyces boulardii
A palavra probiótico, pro (a favor) e bio (vida), foi citada pela primeira vez por
Lilley and Stiwell em 1965 caracterizando substâncias secretadas por um microrganismo, as
quais estimulavam o crescimento de outro. Porém, Metchnikoff no início do século passado já
havia notado efeito benéfico em indivíduos que consumiam iogurte contendo lactobacilos
(FULLER, 1992; VANBELLE et al., 1990). A definição de probiótico tem sofrido alterações
24
conforme os avanços alcançados nas pesquisas. Em 1974 Parker reformulou o conceito de
probióticos como sendo organismos e substâncias que contribuem para o equilíbrio
microbiano intestinal. As bactérias probióticas também foram definidas como bactérias
viáveis, em cultura única ou mista, afetando beneficamente o hospedeiro em razão de
promover a melhora das propriedades da microflora indígena (DONOHUE et al., 1998,
HAVENAAR; VELD, 1992).
A definição atualmente aceita internacionalmente para probióticos é que estes são
microrganismos vivos, que, quando administrados em quantidades adequadas conferem
benefícios à saúde do hospedeiro (FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF
UNITED NATIONS; WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2002; SANDERS, 2003).
A influência benéfica dos probióticos sobre a microbiota intestinal humana inclui
efeitos antagônicos, competição e efeitos imunológicos, resultando em um aumento da
resistência contra patógenos. Assim, a utilização de culturas bacterianas probióticas estimula a
multiplicação de bactérias benéficas, em detrimento à proliferação de bactérias
potencialmente prejudiciais, reforçando os mecanismos naturais de defesa do hospedeiro
(PUUPPONEN-PIMIÄ et al., 2002; SAAD, 2006).
Os probióticos têm sido utilizados em várias situações clínicas e condições
cirúrgicas. Há evidências substanciais de que estas substâncias são amplamente benéficas. Os
mecanismos pelos quais os microorganismos podem exercer efeitos benéficos e proteger
contra a colite, por exemplo, incluem efeitos diretos sobre o local e a estimulação da resposta
imune protetora. De fato, alguns estudos clínicos e experimentais têm mostrado que os
probióticos são benéficos no tratamento da diarreia e colite ulcerativa, por exemplo (SOUZA
et al, 2007).
Os benefícios dos probióticos que mais se destacam são o controle e estabilização
da microbiota intestinal após o uso de antibióticos; promoção da resistência gastrintestinal à
colonização por patógenos; diminuição da população de patógenos através da produção de
ácido acético e lático, de bacteriocinas e de outros compostos antimicrobianos; promoção da
digestão de lactose em indivíduos intolerantes à lactose; estimulação do sistema imune; alívio
da constipação; aumento da absorção de minerais e produção de vitaminas. Embora ainda não
comprovados, outros efeitos atribuídos a essas culturas são a diminuição do risco de câncer de
cólon e de doença cardiovascular. São sugeridos também a diminuição das concentrações
plasmáticas de colesterol, efeitos anti-hipertensivos, redução da atividade ulcerativa de
Helicobacter pylori, controle da colite induzida por rotavírus e por Clostridium difficile,
prevenção de infecções urogenitais, além de efeitos inibitórios sobre a mutagenicidade
(SHAH, LANKAPUTHRA, 1997; CHARTERIS et al., 1998; JELEN, LUTZ, 1998;
25
KLAENHAMMER, 2001; KAUR, CHOPRA, SAINI, 2002; TUOHY et al., 2003; SAAD,
2006).
Os conhecimentos sobre os efeitos potenciais dos probióticos no tratamento de
enfermidades intestinais de diferentes origens, embora ampliados e fundamentados em vasta
literatura médica, ainda são pouco difundidos e muitos médicos de diferentes especialidades
não se aprofundaram ou mesmo desconhecem tais aspectos.
A aceitação dos probióticos como uma modalidade terapêutica aumentou
dramaticamente e a frequência de artigos de revisão e de ensaios clínicos randomizados tem
mantido o interesse global nesse inovador método de terapia. Inúmeras cepas probióticas
foram investigadas quanto à eficácia clínica, incluindo várias cepas de bactérias lactobacilos,
bifidobactérias, estreptococos, Clostridium e linhagens dos fungos Saccharomyces boulardii,
S. cerevisiae, e Monascus purpureus (MCFARLAND LV, 2009; CZERUCKA D et al, 2007;
ELMER GW et al, 1996).
Saccharomyces boulardii (SB) foi descoberto por um francês microbiologista,
Henri Boulard em 1920 quando estava na Indochina à procura de novas estirpes de leveduras
que poderiam ser utilizadas em processos de fermentação. Ele observou que durante um surto
de cólera algumas pessoas que não desenvolveram a doença beberam um chá especial, de uma
fruta tropical (lychees, mangosteens). Ele conseguiu isolar o agente responsável, uma
linhagem especial de levedura que nomeou de "Saccharomyces boulardii" (ELMER et al.,
1996; KLEIN et al., 1993).
Atualmente o SB é uma espécie termotolerante do gênero Saccharomyces, a qual
é comumente utilizada em diversos alimentos processados incluindo pães e bebidas
fermentadas. Além disso, é também frequentemente prescrito, sendo utilizado na forma
liofilizada, como agente bioterapêutico (ELMER et al., 1996; KLEIN et al., 1993).
Segundo JESPERSEN (2003), as leveduras do gênero Saccharomyces têm
demonstrado efeito probiótico. Em experimentos clínicos estas mostraram ser efetivas contra
gastroenterites agudas infantis e diarréia seguida de tratamento com antibióticos e apresentar
efeito inibitório sobre Candida albicans, Salmonella typhimurium, Shigella flexneri e
Clostridium difficile, bem como modular o sistema imune estimulando a produção de IgA e o
sistema de fagocitose em camundogos (RODRIGUES et al., 2000).
Desde 1982, ano da primeira publicação, muitos estudos têm sido realizados com
o intuito de esclarecer o mecanismo de ação de probióticos compostos por SB e, assim,
melhor avaliar suas propriedades benéficas para o hospedeiro humano (SURAWICZ et al.,
1989).
26
A levedura de SB (FIGURA 1) é utilizada em muitos países tanto como agente
profilático quanto como agente terapêutico das diarreias e outras variações das doenças
gastrintestinais, como as causadas pela administração de agentes antimicrobianos.
O SB apresenta propriedades que o levam a ser considerado um agente probiótico,
como: (i) sobrevivência no trânsito do trato gastrintestinal (ii) crescimento ótimo a 37ºC tanto
in vivo quanto in vitro e (iii) capacidade de inibir um número considerável de agentes
patogênicos (CZERUCKA et al., 2007).
FIGURA 1 - Micrografia eletrônica do Saccharomyces boulardii (Dr. Sandy Smith, Dept
de Ciência dos Alimentos da Universidade de Guelph, Canadá).
Embora o exato mecanismo através do qual SB atua ainda não esteja
completamente esclarecido, diversos mecanismos possíveis têm sido propostos (FIGURA 2),
que podem ser classificados em três áreas principais: a ação na luz, ação trófica e efeitos
antiinflamatórios (ELMER GW, 2007; BOIRIVANT M, STROBER W, 2007;
POTHOULAKIS C, 2009; NG SC et al, 2009). Esses mecanismos incluem: a inibição da
adesão celular pelos enteropatógenos (GOPAL et al., 2001), a manutenção da integridade da
mucosa intestinal, como as junções de cadeias fechadas íntegras (RODRIGUES et al., 1996),
a neutralização dos fatores de virulência bacterianos (CZERUCKA et al., 2001) e o aumento
da resposta imune na mucosa intestinal (BRANDAO et al., 1998).
27
FIGURA 2 - Diferentes mecanismos de ação do Saccharomyces boulardii (SB) no trato
intestinal (McFarland, 2010).
A dose de ataque de SB é um fator importante no tratamento. Vale ressaltar que
para a efetividade dos diferentes mecanismos de ação do SB, quantidades significativas desse
microrganismo viável devem estar presentes nas doses administradas para a potencialização
dos efeitos benéficos. Considera-se que esse microrganismo poderá agir no ecossistema
somente quando sua população apresentar concentrações iguais ou superiores a 107 células
viáveis/g do conteúdo e a manutenção da atividade metabólica. Portanto, na preparação inicial
comercializada, deve-se contabilizar a concentração de células viáveis que atinja os valores
citados quando no conteúdo intestinal. Dessa forma, estima-se que a concentração de células
viáveis na composição de produtos probióticos deve ser superior a 108 a 10
9 UFC/g,
especialmente devido aos possíveis efeitos gástricos e duodenais (MARTINS et al., 2005).
No Brasil a Agência Nacional de Vigilância Sanitária licenciou uma apresentação
de Saccharomyces boulardii que possibilita a utilização de doses mais elevadas na fase inicial
da gastrenterite (três cápsulas de 250 mg) no primeiro dia, seguidos de uma posologia mais
baixa nos dias subsequentes (duas cápsulas de 200 mg no segundo dia e uma cápsula de 200
mg no terceiro dia). Vale ressaltar que vários trabalhos comprovam a eficácia e segurança de
28
doses aumentadas de SB no tratamento da diarreia aguda de diferentes etiologias (HTWE et
al., 2008, SZAJEWSKA et al., 2007, VILLARRUEL et al., 2007, HAFEEZ et al., 2002).
SB quando administrado por via oral, atinge concentrações de estado estacionário
no prazo de três dias e é eliminado de 3-5 dias após sua suspensão (GRAFF S et al, 2008;
ELMER GW et al, 1999).
SB foi testado quanto a sua eficácia clínica em diversos tipos de doenças crônicas,
incluindo doença de Crohn, síndrome do intestino irritável, giardíase e vírus da
imunodeficiência humana (HIV) relacionadas com a diarréia e mucosite intestinal (SAAD,
2006).
1.2. Mucosite intestinal e o 5-Fluorouracil
A mucosite induzida por antineoplásicos é um fator limitante na terapia
anticâncer. Mucosite é um termo clínico utilizado para caracterizar ulcerações da mucosa de
todo o trato digestivo, e sintomas pertinentes (SONIS, 1993). Esse efeito colateral é bastante
comum nos pacientes portadores de câncer submetidos a tratamento com agentes
quimioterápicos diversos, em especial, os antimetabólitos, como por exemplo, o metotrexato e
5-fluorouracil, mas também com outros agentes como cisplatina, doxorubicina, ifosfamida,
etc. Tem sido descrito incidência de mucosite de aproximadamente 40% associada ao uso de
vários agentes quimioterápicos (CABALLERO et al., 1985; BALIS et al, 1985; ROTH et al.,
1991; BISHOP et al., 1986), além de ser bastante comum em pacientes submetidos à
radioterapia abdominal (ALTMANN, 1974). Vários estudos demonstram a incidência de
mucosite como efeito colateral do 5-FU em aproximadamente 8 a 89% dos casos de câncer
retal (MINSKY et al., 1993; LEVI et al., 1994; ROSSO et al., 1994), 15 a 40% dos
indivíduos com câncer gástrico (LACAVE et al.,1991).
Dentro das abordagens para o tratamento do câncer, a quimioterapia pode ser
utilizada como uma terapia propriamente dita ou como adjuvante de outras formas de
tratamento (DALE, 2008).
Os agentes antineoplásicos são, em sua maioria, antiproliferativos, pois danificam
o DNA e, portanto, desencadeiam o processo de apoptose. Além disso, afetam rapidamente as
células normais em rápida divisão e, por conseguinte, tendem a deprimir a medula óssea, a
comprometer a cicatrização, deprimir o crescimento, causar esterilidade, queda dos cabelos e
teratogenicidade (DALE, 2008).
29
O 5-Fluorouracil, foi selecionado para este estudo, sobretudo pelos efeitos
colaterais causados nas células do trato-gastrintestinal e por ser utilizado no tratamento de
vários tipos de câncer. É uma droga antimetabólica da classe das fluoropirimidinas e que foi
desenvolvida a partir da década de 50, com o objetivo de inibir processos essenciais para as
células como a incorporação de moléculas de DNA e/ou RNA, processo essencial para síntese
e metabolismo de novas células. (RUTMAN, et al., 1954). É um análogo da uracila
adicionado a uma molécula de flúor na posição C-5 (FIGURA 3). No meio intracelular, é
convertido em vários metabólitos: fluorodioxuridina monofosfato (FdUMP),
fluorodioxuridina trifosfato (FdUTP) e fluorouridina trifosfato (FUTP). Esses são metabólitos
ativos que interferem na síntese de RNA e na ação da TS.
FIGURA 3 - Estrutura química do 5-Fluorouracil (LONGLEY; HARKIN; JOHNSTON,
2003).
O mecanismo de citotoxicidade atribuído ao 5-FU está na sua capacidade de
incorporar fluoronucleotídeo na molécula de DNA e/ou RNA bem como pela inibição da
enzima timidilato sintase (TS), essa enzima é importante no processo de fornecimento de
grupos timidilatos para o reparo e síntese de DNA (LONGLEY et al., 2003) (FIGURA 4).
30
FIGURA 4 - Metabolismo hepático do 5-Fluorouracil
5-FU é utilizado para o tratamento de vários tipos de câncer, incluindo o câncer de
mama e o coloretal, sendo de maior impacto nesse último tipo. Seus efeitos adversos variam
consideravelmente de acordo com o tratamento, dose utilizada e via de administração e são
mais evidentes em células com grande índice de mitoses, como tecidos de rápida proliferação.
Na medula óssea resulta em granulocitopenia e trombocitopenia, no trato gastrintestinal
resulta em mucosite oral, mucosite intestinal, faringite, esofagite, gastrite, colite, entre outros
(KOENIG; PATEL, 1970). Alopecia, dermatite, cardiotoxicidade e mais raramente,
neurotoxicidade também são efeitos tóxicos observados na utilização do 5-FU (PIRZADA et
al., 2000).
Porém, a ação desse quimioterápico não se limita somente às células neoplásicas,
com isso, essas drogas podem atuar em células normais tendo como resultado importantes
efeitos colaterais que em determinadas situações podem determinar desde a redução do
esquema terapêutico como a sua total interrupção, assim, podendo trazer grande prejuízo na
eficácia do tratamento oncológico.
31
1.2.1. Papel das citocinas na mucosite intestinal
Os quimioterápicos promovem a liberação de citocinas (TNF-α e IL-1β) do
epitélio e dos tecidos conectivos na primeira fase da inflamação (SONIS, 1998). Citocinas
como o fator de necrose tumoral (TNF-) e interleucina 1β (IL-1β) podem iniciar uma
resposta inflamatória que resulta em aumento da vascularização sub epitelial (PICO et al.,
1998). Uma quimiocina produzida e liberada por macrófagos e células epiteliais, tem sido
implicada na ativação de neutrófilos, monócitos, basófilos e linfócitos T por meio de sua
ligação com o receptor CXCR2, a CXCL1 (TRAVES SL et al., 2004).
1.2.2. Aspectos funcionais da mucosite intestinal
Pacientes sob terapia antineoplásica podem sofrer de outros sintomas, como
dispepsia, disfagia e diarréia que não são controlados por drogas antieméticas (RIEZZO et al.,
2005). O conjunto desses sintomas foi denominado de síndrome dispéptica associada à
quimioterapia do câncer (CADS). Recentemente, pesquisadores sugeriram que a causa dessa
síndrome pode estar associada às anormalidades da motilidade do trato gastrintestinal
(RIEZZO et al., 2001). Essas alterações da motilidade gastrintestinal podem ser provenientes
de eventos inflamatórios. Sendo assim, podemos reforçar a hipótese de que as alterações
funcionais advindas de processos inflamatórios podem estar relacionadas às alterações
estruturais do músculo liso gastrintestinal e/ou alterações neuronais, principalmente do plexo
mioentérico.
Apesar da maioria das pesquisas terem se direcionado à mucosite oral pela
facilidade da observação das lesões e dos resultados dos tratamentos, a mucosite intestinal
destaca-se pelos seus importantes sinais e sintomas tais como náuseas, vômitos, dores
abdominais e diarréia.
Recentemente, demonstrou-se que a mucosite intestinal induzida por 5-FU em
ratos está relacionada a alterações motoras (retardo no esvaziamento gástrico e
hipercontratilidade na musculatura lisa do estômago e duodeno) que ocorrem tanto na fase
inflamatória, como na pós-inflamatória dessa patologia (SOARES et al., 2008).
32
1.2.3. Mucosite por antineoplásicos e a contribuição do LAFICA.
Nosso grupo de pesquisa vem há vários anos dedicando-se ao estudo dos
mecanismos e mediadores envolvidos nos efeitos colaterais da quimioterapia do câncer, como
a mucosite intestinal. Nesse contexto, desde 2004 temos sugerido que o TNF-α teria um
importante papel na fisiopatologia da mucosite oral por 5- FU. Em modelos de mucosite
induzida por 5-FU em Hamster, demonstramos que a pentoxifilina (PTX) e a talidomida
(TLD) foram capazes de inibir a lesão macroscópica e microscópica, bem como o aumento da
atividade de mieloperoxidase (MPO), observada nos animais tratados com 5- FU (LIMA et
al., 2005). De forma inédita, demonstramos o papel relevante do óxido nítrico na gênese da
mucosite oral por 5-FU através da observação de que inibidores seletivos da óxido nítrico
sintase induzível (iNOS / 1400W e aminoguanidina) reduziram a lesão macroscópica e
microscópica, bem como a infiltração de neutrófilos medida pela atividade de MPO na
bochecha de hamster com mucosite oral por 5- FU, além de se demonstrar a expressão da
iNOS por imunohistoquímica e western blot (LEITÃO et al., 2007).
Demonstramos também que a atorvastatina (ATV) reduziu, significativamente, as
lesões macroscópicas e microscópicas induzidas pelo 5-FU na mucosa oral de hamsters. Os
efeitos macroscópicos de proteção foram associados com a redução da produção de TNF-α e
IL-1β, diminuição da infiltração de neutrófilos demonstrado pela análise histopatológica e da
atividade da MPO. Além disso, a ATV reduziu o estresse oxidativo induzido (MEDEIROS et
al., 2010).
Em relação à mucosite intestinal por antineoplásicos, demonstramos que o
tratamento com metotrexato em ratos induz uma importante atrofia de vilos com aumento das
criptas, no duodeno, jejuno e íleo. Observamos ainda, que o metotrexato foi capaz de
aumentar a secreção de sódio e potássio medido pela modelo de perfusão intestinal, bem
como reduziu a área absortiva medida pela razão de excreção do manitol (CARNEIRO-
FILHO et al., 2004). Mais recentemente, observamos que o tratamento com irinotecano
(CPT-11) em camundongos causou uma significativa diarréia nos animais, com diminuição
dos vilos intestinais e perda da arquitetura das criptas. Observamos ainda um aumento na
concentração intestinal de TNF- α, IL-1β e CXCL1. Demonstramos também que a mucosite
intestinal induzida por 5-FU em ratos está associada a alterações na motilidade digestiva que
persistem mesmo com a resolução do processo inflamatório (SOARES et al., 2008).
Demostramos que o TNF-α, IL-1β e CXCL1 são importantes mediadores na patogênese da
mucosite intestinal e que a pentoxifilina (PTX) e a talidomida (TLD) mostraram um efeito
protetor nas estruturas intestinais. No entanto, apenas a PTX reduziu a severidade da diarréia
33
induzida por CPT-11. Este resultado pode ser explicado pelo fato da TLD ser mais seletiva na
inibição do TNF- α (MELO et al.; 2007).
Mais recentemente, SOARES et al.; 2010, demonstrou pela primeira vez o papel
do fator de ativação plaquetária (PAF) na patogênese da mucosite intestinal induzida por 5-
FU usando ratos PAFR / - e com a inibição farmacológica do receptor de PAF, com
BN52021. Nós demonstramos que os ratos PAFR / - foram protegidos contra os danos
causados pelo tratamento com 5-FU na microscopia intestinal.
34
OBJETIVOS
35
2 OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GERAL
Avaliar o efeito do tratamento com Saccharomyces boulardii na resposta inflamatória
e nas alterações funcionais no curso da mucosite intestinal induzida por 5-FU em
camundongos.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Demonstrar que o tratamento com Saccharomyces boulardii reverte as alterações
inflamatórias (alterações histopatológicas, morfometria, atividade de MPO, dosagens
de GSH, nitrito e citocinas IL-1 β, CXCL-1) no curso da mucosite intestinal induzida
por 5-FU em camundongos.
Demonstrar que o tratamento com Saccharomyces boulardii reverte as alterações de
esvaziamento gástrico e trânsito gastrintestinal presentes no curso da mucosite
intestinal induzida por 5-FU.
36
MATERIAIS E MÉTODOS
37
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Animais
Foram utilizados camundongos Swiss adultos, machos pesando entre 25-30g,
provenientes do Biotério Setorial do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da
Universidade Federal do Ceará. Os animais foram acondicionados em caixas de
polipropileno, à temperatura ambiente, com ciclos de claro/escuro de 12 em 12h, recebendo
ração padrão (Purina Chow) e água “ad libitum”. Os animais foram colocados em jejum de
sólidos 18 horas antes da realização dos experimentos.
Os protocolos experimentais utilizados neste trabalho foram realizados de acordo
com as diretrizes aprovadas pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal (CEPA), do
Departamento de Fisiologia e Farmacologia da UFC (Protocolo nº 34/10). Todos os esforços
foram realizados no sentido de reduzir o número de animais, a dor, o sofrimento e o estresse
dos mesmos.
3.2. Materiais Utilizados
3.2.1. Fármacos e diluentes
No quadro 1 estão relacionados os principais fármacos e reagentes utilizados
para a realização dos protocolos.
QUADRO 1 – Fármacos e diluentes usados no experimento
Fármacos/Reagentes Fabricante
5-Fluorouracil (5-FU) Eurofarma
Ácido Tricloroacético 20% (TCA) Vetec
Ácido Sulfúrico PA Reagen
Ácido tricloroacético 50% Vetec
Água destilada Milliq
Brometo de hexadecitrimetilamônico 0,5% (HTAB) Vetec
38
Cloreto de Potássio (KCL) 1,15% Vetec
Dianisidine -
DTNB 0,01M Fluka
EDTA 0,02M Dinâmica
Éter etílico Dinâmina
NADPH -
Nitrato Redutase -
Peróxido de Hidrogênio Merck-Brasil
Saccharomyces boulardii (Floratil ®) Merck , Brasil
Salina (NaCl 0,9%) Fresenius, Brasil
Solução glicosada 5% Synth
Solução de Griess -
Solução de NaOH 0,1N e 0,5N Synth
Tampão fosfato de potássio Synth
Tampão PBS com anti-proteases Synth
Tampão TRIS 0,4M pH 8.9 Vetec
Tribromo etanol 25% Sigma Aldrich
Vermelho de fenol 0,75mg/ml Vetec
3.2.2 Equipamentos e instrumentos laboratoriais
QUADRO 2 – Equipamentos e instrumentos laboratoriais utilizados nos experimentos
Equipamentos/instrumentos laboratoriais Fabricante
Balança analítica Sartarius
Centrífuga 5804R Eppendorf
ELISA ELX 800 Biotex
Espectrofotômetro Spectronic 20 Genesys
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Homogeneizador de tecidos Ultra-turrax T8 Ika
Material cirúrgico -
Micropipetas de 20, 100, 200 e 1000μl Gilson
Microscópio binocular Alphaphot2 VS2 Nikon
Micrótomo Olympus
Placa de 96 poços TPP
Ponteiras para pipetas automáticas Gilson
Seringas B-D Plastipak
3.3. Protocolo experimental
3.3.1. Modelo de mucosite intestinal induzida por 5-FU e tratamento com Saccharomyces
boulardii
Como o esquema mostrado na figura 5, os camundongos foram divididos
aleatoriamente em quatro grupos (n= 6-8, por grupo) e foram tratados durante 3 e 6 dias (d1-
d6) com Saccharomyces boulardii (800 mg/kg). O grupo pré-tratado (6D) recebeu durante 6
dias (d1-d6) Saccharomyces boulardii (800 mg/kg), no d4 todos os animais foram tratados
com uma dose única intraperitoneal de 5-FU (450 mg/kg) e outro grupo, pós-tratado (3D),
recebeu as doses de Saccharomyces boulardii (800mg/Kg) somente nos 3 dias após a
administração do 5-FU (d4-d6) e no 7º dia experimental (d7), todos os animais foram
anestesiados com éter, amostras de sangue periférico foram coletadas diretamente do globo
ocular para a contagem total de leucócitos plasmáticos. Posteriormente, todos os
camundongos foram sacrificados por deslocamento cervical, e fragmentos de jejuno e íleo
foram retirados para análise morfológica e histopatológica. Em seguida, segmentos do
intestino delgado foram retirados e congelados no freezer à -70ºC para posterior dosagem da
atividade da enzima mieloperoxidase (MPO), da concentração de grupos sulfidrílicos (GSH),
dosagem de nitrito e das citocinas IL-1β e CXCL-1. (SOARES et al., 2008).
40
FIGURA 5 – Modelo experimental (parâmetros inflamatórios)
3.4. Parâmetros avaliados
3.4.1. Análise Ponderal
Os animais foram pesados diariamente durante todo o período experimental. Os
valores encontrados foram expressos em variável de peso, em relação ao peso inicial.
3.4.2. Leucograma
O número total de leucócitos plasmáticos foi determinado depois da diluição com
solução de Turk (Acido acético 2%, Violeta Genciana 0,2%). A contagem dos leucócitos
plasmáticos foi realizada com o auxílio da câmara de Newbauer juntamente com o uso de
microscópio ótico (100X). Os resultados foram expressos como número total de leucócitos
contados nos quatro campos da câmara de Newbauer e posteriormente multiplicados pelo
fator de correção da câmara. Por fim, os valores foram expressos como n°células/mm3
(SOARES et al., 2008).
41
3.4.3. Análise morfométrica e histopatológica
Os segmentos obtidos do jejuno e íleo foram fixados em formol a 10%.
Decorridas 24 horas, os fragmentos foram retirados do formol e colocados em álcool 70% e
posteriormente parafinizados. A seguir, foram realizados cortes histológicos de 5 m de
espessura e fixados em hematoxilina e eosina. Posteriormente, com o auxílio de um
microscópio ótico acoplado ao sistema de aquisição de imagens (LEICA), foram medidas as
alturas de 10 vilos e as profundidades de 10 criptas de cada lâmina para cálculo da razão
vilo/cripta. Em seguida, utilizando o sistema de escores de Macpherson e Pfeiffer (1978), um
histopatologista (PMGS) que não conhecia os tratamentos realizados analisou todas as
lâminas (TABELA 2).
TABELA 1 - Sistema de escores de Macpherson e Pfeiffer
Escores Achados Microscópicos
0
Achados histológicos normais.
1
Mucosa: vilos encurtados, perda da arquitetura das criptas, infiltrado de
células inflamatórias, vacuolização e edema.
Muscular: normal.
2
Mucosa: vilos encurtados com células vacuolizadas, necrose das criptas,
intenso infiltrado de células inflamatórias, vacuolização e edema.
Muscular: Normal.
3
Mucosa: vilos encurtados com células vacuolizadas, necrose das criptas,
intenso infiltrado inflamatório, vacuolização e edema.
Muscular: edema, vacuolização e infiltrado neutrofílico.
42
3.4.4. Ensaio para mieloperoxidase (MPO)
Mieloperoxidase (MPO) é uma enzima presente predominantemente nos grânulos
azurófilos dos neutrófilos e tem sido utilizada como um marcador quantitativo da infiltração
de neutrófilos nos processos inflamatórios em vários tecidos, entre eles o trato gastrintestinal.
Resumidamente, 50 a 100 mg dos segmentos intestinais (jejuno e íleo) foram colocados num
tampão fosfato de potássio com 0,5% de brometo de hexadecitrimetilamônio (pH 6,0; 50 mg
de tecido por ml) e posteriormente homogeneizados em um macerador de tecidos (Politron®).
A seguir, o homegenato foi centrifugado a 5000 rpm por 2 minutos. A atividade da MPO por
mg de tecido foi aferida através da técnica descrita utilizando 0,0005% de peróxido de
nitrogênio como substrato para a MPO. A unidade da atividade de MPO foi definida como
aquela capaz de converter 1 mmol de peróxido de nitrogênio em água em 1 minuto
(BRADLEY et al., 1982).
3.4.5. Determinação de Glutationa (GSH)
A concentração de GSH nos segmentos intestinais (jejuno e íleo) foi avaliada
utilizando o ensaio para determinação de grupos sulfidrílicos não protéicos (NP-SH)
(SEDLAK; LINDSAY, 1968). As amostras obtidas dos segmentos intestinais (100mg/ml)
foram homogeneizadas em 0,02 M EDTA. Alíquotas de 400 μl do homogenato foram
misturadas com 320 μl de H2O destilada e 80 μl de ácido tricloroacético a 50% para
precipitação das proteínas. Depois dessa etapa o material foi centrifugado por 15 min em
rotação de 3000 rpm à uma temperatura de 4ºC. Em seguida, novas alíquotas de 400 μl do
sobrenadante foram misturadas com 800 μl de tampão TRIS com concentração de 0,4 M, pH
8.9 e com 20 μl 5,5-dithiobis-2-nitro-benzoic acid (DTNB, Fluka) e agitadas por 3 min. A
absorbância foi então determinada a 412 nm contra um reagente branco (sem o homogenato).
A concentração de GSH foi expressa por μg/mg de tecido a partir de uma curva padrão
(SEDLAK; LINDSAY, 1968) .
43
3.4.6. Dosagem de IL-1β e CXCL-1
A concentração de IL-1β e CXCL-1 foram determinadas nos fragmentos do jejuno
e íleo congelados no freezer à -70ºC. Estes foram homogeneizados em solução tampão de
PBS com anti – proteases, a amostra foi centrifugada por 10 min em 3000 rpm e o
sobrenadante foi imediatamente coletado para dosagem de IL-1β e CXCL-1. A detecção das
concentrações dessas citocinas foi realizada por ELISA espécie - específica, conforme
orientação do fabricante (R&D system). Os resultados foram expressos em pg/ml a partir de
uma curva padrão fornecida pelo fabricante.
3.4.7. Dosagem de Nitrito
A dosagem de nitrito foi determinada nos fragmentos do jejuno e íleo congelados
no freezer à -70ºC e, foi obtida, sendo um indicador da produção de óxido nítrico, através da
determinação do conteúdo total de nitrito/nitrato (NO2- / NO3
-) no intestino através da
concentração total nas amostras, determinada espectrofotometricamente pela reação de Griess.
3.5. Esvaziamento gástrico e trânsito gastrintestinal na mucosite intestinal induzida por
5-FU em camundongos
Inicialmente, camundongos (n= 6-8 por grupo) foram tratados com a dose única
de 450 mg/kg de 5-FU (i.p.) ou salina. Do 6º para o 7º dia experimental, foram mantidos em
jejum de sólidos por 18 horas, mas com livre acesso a água até momentos antes do início do
experimento. Cada animal recebeu, por gavagem, 300 µL da solução glicosada (5%) contendo
vermelho de fenol (0,75 mg/ml), com um intervalo de 5 minutos de um animal para o outro.
Após 10, 20 ou 30 minutos da administração do corante, os animais foram sacrificados por
deslocamento cervical e submetidos a uma laparotomia mediana. Para tanto, foi aberto o
abdômen por uma incisão mediana na parede abdominal desde o apêndice xifóide. A seguir as
junções esôfago- gástrica, gastroduodenal e íleo- cólica foram rapidamente isolados e o
estômago e o intestino delgado foram retirados, estendidos e divididos em quatro segmentos
consecutivos: Estômago, Intestino proximal (40%), medial (30%) e distal (30%). Com o
auxílio de uma proveta contendo uma solução de NaOH (100ml, 0,1N) os volumes de cada
segmentos foram determinados. Depois de medir o volume, os segmentos foram
44
homogeneizados em uma solução de NaOH 0,1N com o auxílio de um misturador por 30 s.
Após 20 minutos da homogeneização foram retirados 1000 µL de cada amostra e levado para
centrifugação por 10 min a 2800 rpm. Foram retirados 500 µL do sobrenadante e a este
adicionado ácido tricloroacético (TCA) (20% peso/volume) e centrifugado novamente por 20
min com a finalidade de obter a precipitação de proteínas. Por fim, uma placa de 96 poços foi
montada com 150 μl da amostra e 200μl de NaOH (0,5 N), a placa foi lida numa leitora de
ELISA sob um comprimento de onda de 540 nm. Uma curva padrão foi obtida em cada
experimento a partir de uma concentração conhecida de vermelho fenol após a adição da
solução de NaOH (0,5 N). O coeficiente linear da curva padrão foi estabelecido e utilizado
para determinação da concentração do corante (C) da solução e em seguida foi calculada a
quantidade de vermelho fenol recuperada em cada segmento (FIGURA 6).
A retenção gástrica do vermelho fenol foi expressa em porcentagem, de acordo
com a seguinte fórmula: Retenção gástrica= Quantidade de vermelho fenol recuperada do
estômago/ Quantidade total de vermelho fenol recuperada em todos os quatro segmentos
(estômago, intestino proximal, intestino medial e intestino distal).
O trânsito gastrintestinal da refeição foi estimado de acordo com o método do
centro geométrico (MILLER et al., 1981). De acordo com este princípio, obtivemos o produto
da retenção fracional de cada segmento (estômago, intestino proximal, intestino medial,
intestino distal) pelo dígito identificador de cada segmento: (1, 2, 3, 4, respectivamente). A
somatória desses valores indica o centro geométrico da refeição com o corante propelida ao
longo do intestino, aos moldes do centro de massa dos objetos (Trânsito gastrintestinal= 1 x
Estômago+ 2 x Proximal+ 3 x Medial + 4 x Distal), (FIGURA 7).
45
FIGURA 6 – Modelo experimental (parâmetros funcionais). Os animais foram tratados
por gavagem com SB (800mg/Kg) ou salina durante seis dias (d1-d6; SB 6D) ou três dias (d4-
d6; SB 3D), no quarto dia (d4) todos os animais receberam dose única, intraperitonial, de 5-
FU (450mg/Kg). Todos os animais ficaram em jejum de 18h. No dia do experimento (d7), os
animais receberam por gavagem 0,3 ml de solução glicosada (5%) contendo vermelho de
fenol a 0,75 mg/ml.
46
FIGURA 7 - Representação esquemática do centro geométrico de uma refeição teste. O
produto da retenção fracional de cada segmento (estômago, intestino proximal, intestino
medial, intestino distal) é obtido pelo dígito identificador de cada segmento: (1, 2, 3, 4,
respectivamente). A somatória desses valores indica o centro geométrico da refeição com o
corante propelida ao longo do intestino, aos moldes do centro de massa dos objetos (Trânsito
gastrintestinal = 1 x Estômago+ 2 x Proximal+ 3 x Medial + 4 x Distal)
3.6. Efeito do tratamento com Saccharomyces boulardii no retarde do esvaziamento
gástrico e trânsito gastrintestinal observado na mucosite intestinal induzida por 5-FU
em camundongos
Os camundongos foram divididos aleatoriamente em quatro grupos (n= 6-8, por
grupo) e foram tratados durante 3 e 6 dias com Saccharomyces boulardii (800 mg/kg). O
grupo pré-tratado (6D) recebeu durante 3 dias Saccharomyces boulardii (800 mg/kg) antes e
após receber a dosagem de 5-FU, totalizando 6 dias de tratamento com o Saccharomyces
boulardii. No 4º dia, todos os animais foram tratados com uma dose única intraperitoneal de
5-FU (450 mg/kg). O grupo pós-tratado (3D) recebeu as doses de Saccharomyces boulardii
(800mg/Kg) somente nos 3 dias após a administração do 5-FU. No 7º dia experimental, o
esvaziamento gástrico e o trânsito intestinal foram avaliados conforme descrito no item
anterior.
47
3.7. Análise estatística.
Os resultados foram expressos como média ± EPM (variáveis com distribuição
normal) ou como mediana ± mínimo e máximo (variáveis sem distribuição normal). A análise
estatística foi feita usando o teste de análise de variância ANOVA seguido do teste de
Bonferroni. Os escores histológicos foram avaliados pelo teste não paramétrico de Kruskal-
Wallis seguido pelo teste de múltiplas comparações de Dunns. Significância estatística foi
observada para valores de p<0,05. Para realização dos testes estatísticos foi utlizado o
software Prism versão 5 da GraphPad Software.
48
RESULTADOS
49
4 RESULTADOS
4.1. Efeito do tratamento com SB sobre a leucopenia induzida por 5-FU em
camundongos
O 5-FU induziu uma significativa leucopenia nos animais quando comparados
com os do grupo controle (salina). Os tratamentos com SB não modificaram
significativamente a leucopenia causada pelo 5-FU (Tabela 2).
TABELA 2 – SB não alteram a leucopenia induzida por 5-FU.
Os
val
ores representam a média ± E.P.M. * p <0,05 quando comparado ao grupo controle (salina).
ANOVA e teste de Bonferroni.
4.2. Efeito do tratamento com SB na variação de peso corporal dos animais tratados com
5-FU
A variação de peso corporal dos camundongos já se mostrou significante no
primeiro dia após a administração do 5-FU, houve perda de massa corporal nos animais
tratados somente com 5-FU (4,24 ± 0,64%) quando comparados ao grupo controle que
ganhou massa corporal (3,62 ± 3,70%) em relação ao peso inicial. Os animais tratados com
SB (3D e 6D) tiveram uma perda de peso significantemente reduzida em relação ao grupo
tratado somente com 5-FU (5-FU + 3D: 2,51 ± 0,46% e 5-FU + 6D: 2,57 ± 0,86%).
Observou-se ganho de peso corporal no grupo controle durante todo o período
experimental, sendo o ganho máximo no último dia do experimento (8.497±0.48%).
Grupos Experimentais (n=8) nº células/mm3
CONTROLE (salina) 5289,00851,80
5-FU + SALINA 1675,00138,90 *
5-FU + SB 3D 2825,00303,30
5-FU + SB 6D 3100,00341,30
50
O grupo 5-FU teve uma perda de peso de 9.75 ± 0.58% no último dia do
experimento em relação ao primeiro dia. E, os animais dos grupos tratados com SB
apresentaram redução do peso corporal significante com relação ao grupo tratado somente
com 5-FU (SB 3D: 2.70 ± 0.64% e SB 6D: 2.64 ± 0,81%) no último dia de experimento em
relação ao primeiro dia (Figura 8).
1 2 3
-15
-10
-5
0
5
10controle
-
sacha 3D
sacha 6D
*
#
#
Pe
so
do
s a
nim
ais
(g
)
FIGURA 8 – Efeito do tratamento com SB na variação de peso corporal nos grupos do
experimento. Os animais foram tratados com SB (800mg/Kg) durante seis dias (d1-d6; SB
6D) ou três dias (d4-d6; SB 3D), no quarto dia (d4) todos os animais receberam dose única,
intraperitonial, de 5-FU (450mg/Kg). Os animais foram pesados diariamente durante todo o
experimento. Os valores foram expressos como média ± E.P.M. *p<0,05 comparado com o
grupo controle (C), # p<0,05 comparados com o grupo 5- FU + salina, pelo teste ANOVA
seguido de Bonferroni.
4.3. Efeito do SB na análise histopatológica da lesão intestinal causada por 5-FU em
camundongos.
Em relação aos escores histopatológicos foi evidenciado que os animais que
receberam somente salina (controle) apresentaram mucosa e camada muscular normais no
jejuno e íleo. O grupo que recebeu 5-FU + salina apresentou nos dois segmentos estudados as
seguintes características: mucosa com vilos encurtados com células vacuolizadas, necrose das
criptas, intenso infiltrado inflamatório, vacuolização e edema, mas camada muscular normal,
o que conferiu um escore muito mais alto que o do grupo controle. Os grupos que receberam
51
5-FU + SB 3D ou 5-FU + SB 6D apresentaram uma significativa melhora nos escores
microscópicos (Tabela 4).
Nas fotomicrografias (100x), observamos que o tratamento com SB 3D ou SB 6D
reverteram o encurtamento dos vilos e aprofundamentos das criptas induzidos por 5-FU, no
jejuno (Figura 9) e íleo (Figura 10). Observa-se ainda, no aumento de 400x, o intenso
infiltrado inflamatório, vacuolização e edema na mucosa e no tecido muscular devido à
administração do 5-FU, que foram revertidos pelo tratamento com o SB, em ambos os
segmentos (Figura 9 e 10).
TABELA 3: Escores histopatológicos nos segmentos intestinais de camundongos
submetidos à mucosite intestinal induzida por 5-FU e tratados ou não com
Saccharomyces boulardii.
ESCORES HISTOPATOLÓGICOS
GRUPOS EXPERIMENTAIS (n=8) ESCORES
JEJUNO ÍLEO
CONTROLE (SALINA) 0 (0-1) 0 (0-1)
5-FU + SALINA 2,5* (1-3) 2,5* (1-3)
5-FU + SB 3D 1# (0-2) 0
# (0-1)
5-FU + SB 6D 1# (1-2) 1 (1-2)
Os valores representam a media ± E.P.M. *p<0,05 quando comparado ao grupo salina e #
p<0,05 quando comparado ao grupo 5- FU + salina. ANOVA e teste de Bonferroni.
52
FIGURA 9 – Efeito do tratamento com SB nas alterações histopatológicas no jejuno
induzidas por 5-FU em camundongos. (A, C, E, G) - Fotomicrografias (100X) do jejuno de
camundongos tratados com salina (A), 5-FU + salina (C), 5-FU + SB 3D (E), ou 5-FU + SB 6D
(G). Observa-se que os tratamentos com SB 3D (E) ou SB 6D (G) reverteram o encurtamento dos
vilos e aprofundamento das criptas induzidos por 5-FU (C, setas). (B, D, F, H) –Fotomicrografias
(400X) do jejuno de camundongos tratados com salina (B), 5-FU + salina (D), 5-FU + SB 3D (F),
ou 5-FU + SB 6D (H). Observa-se que os tratamentos com SB 3D (F) ou SB 6D (H) reverteram o
intenso infiltrado inflamatório, vacuolização e edema na mucosa e na camada muscular induzidos
por 5-FU (D, cabeça de seta).
A B
C D
E F
G
G
H
53
FIGURA 10 – Efeito do tratamento com SB nas alterações histopatológicas no íleo induzidas
por 5-FU em camundongos. (A, C, E, G) - Fotomicrografias (100X) do íleo de camundongos
tratados com salina (A), 5-FU + salina (C), 5-FU + SB 3D (E), ou 5-FU + SB 6D (G). Observa-se
que os tratamentos com SB 3D (E) ou SB 6D (G) reverteram o encurtamento dos vilos e
aprofundamento das criptas induzidos por 5-FU (C, setas). (B, D, F, H) - Fotomicrografias
(400X) do íleo de camundongos tratados com salina (B), 5-FU + salina (D), 5-FU + SB 3D (F), ou
5-FU + SB 6D (H). Observa-se que os tratamentos com SB 3D (F) ou SB 6D (H) reverteram o
intenso infiltrado inflamatório, vacuolização e edema na mucosa e na camada muscular induzidos
por 5-FU (D, cabeça de seta).
G
G
H
G
F
G
E
G
C
G
D
G
A
G
B
G
54
4.4. SB reduziu as alterações intestinais morfométricas induzida por 5-FU em
camundongos
5-FU induziu uma significativa diminuição na altura dos vilos, como observado
na Figura 11A, causou um aumento na profundidade das criptas (Figura 11B) e uma
diminuição na razão vilo/cripta (Figura 11C), tanto no jejuno como no íleo, quando
comparados ao grupo controle (salina). Em relação à altura dos vilos, o tratamento com SB
reverteram, significativamente, o efeito do 5-FU no jejuno e no íleo.
No painel B da figura 11, observamos que o SB 6D e SB 3D reverteram também o
aumento da profundidade das criptas e a diminuição da relação vilo/cripta (Figura 11C)
induzido pelo 5-FU, em ambos os segmentos analisados.
55
C - 3D 6D C - 3D 6D0
100
200
300
400
500
5-FU 5-FU
Jejuno Íleo
*
*
# #
#
#
A l
t u r
a d
o s
V i
l o s
( µ m
)
C - 3D 6D C - 3D 6D0
50
100
150
200
250
5-FU 5-FU
Jejuno Íleo
* *
##
##
P r
o f u
n d
i d
a d
e d
a s
C r
i p t
a s
( µ
m )
C - 3D 6D C - 3D 6D0
1
2
3
4
5-FU 5-FU
Jejuno Íleo
*
*
# ##
#
A l
t u r
a
V i
l o /
P r
o f
u n
d i d
a d
e
C r
i p
t a (
µ m
)
FIGURA 11 – Efeito do tratamento com SB nas alterações morfométricas nos segmentos
intestinais induzidas por 5-FU em camundongos. Os animais foram tratados com SB
(800mg/Kg) durante seis dias (d1-d6; SB 6D) ou três dias (d4-d6; SB 3D), no quarto dia (d4)
todos os animais receberam dose única, intraperitonial, de 5-FU (450mg/Kg). Todos os animais
foram sacrificados no sétimo dia (d7) do experimento. Segmentos do jejuno e íleo foram obtidos
para a medida da altura dos vilos (painel A), profundidade das criptas (painel B) e razão
vilo/cripta (painel C). Os valores foram expressos como media ± E.P.M. *p<0,05 comparado com
o grupo salina (C), # p<0,05 comparados com o grupo 5- FU + salina, pelo teste ANOVA seguido
de Bonferroni.
A
B
C
56
4.5. Efeito do tratamento com SB no aumento da atividade de MPO nos segmentos
intestinais induzidas por 5-FU em camundongos
Nos animais que receberam somente 5-FU, foi encontrado um importante
aumento do infiltrado neutrofílico especificamente nos segmentos do jejuno (5,87±1,06
UMPO/mg) e do íleo (14,09±2,99 UMPO/mg), com valores 2 e 8 vezes maiores (238,6% e
828,5%), respectivamente, quando comparados aos segmentos dos animais controle (100%)
(jejuno:1,73±0,36 UMPO/mg e íleo:1,51±0,17 UMPO/mg).
Os tratamentos com SB reduziram a infiltração neutrofílica no jejuno (SB 3D:
3,08±0,46 UMPO/mg e SB 6D: 3,26±0,50 UMPO/MG), e também no íleo (SB 3D: 3,67±0,85
UMPO/mg e SB 6D: 4,9±0,97 UMPO/MG), quando comparados aos animais que receberam
somente 5-FU.
C - 3D 6D C - 3D 6D0
5
10
15
20
SB (dias de tratamento)
5-FU
SB (dias de tratamento)
5-FU
Jejuno Ileo
*
*
# ##
#
U d
e M
PO
/ m
g t
ec
ido
FIGURA 12 – Efeito do tratamento com SB no aumento da atividade de MPO nos
segmentos intestinais induzidos por 5-FU em camundongos. Os animais foram tratados
com SB (800mg/Kg) durante seis dias (d1-d6; SB 6D) ou três dias (d4-d6; SB 3D), no quarto
dia (d4) todos os animais receberam dose única, intraperitonial, de 5-FU (450mg/Kg). Todos
os animais foram sacrificados no sétimo dia (d7) do experimento. Segmentos do jejuno e íleo
foram obtidos para a realização do ensaio da atividade de MPO. Os valores foram expressos
como média ± E.P.M. *p<0,05 comparado com o grupo salina (C), # p<0,05 comparados com
o grupo 5- FU + salina, pelo teste ANOVA seguido de Bonferroni.
57
4.6. Efeito do tratamento com SB na diminuição da concentração de GSH nos segmentos
intestinais induzido por 5-FU em camundongos
O tratamento com 5-FU induziu uma significativa redução da concentração de
GSH no jejuno (270,9±38,5 µg/g) e no íleo (46,01±6,3 µg/g), quando comparados com o
controle (jejuno: 477,6±25,2 µg/g e, íleo: 186,8±22,8 µg/g).
O tratamento com SB 3D reverteu o consumo de GSH no jejuno em 52,43%
(521,3±48,53 µg/g) e no íleo em 52,94% (144,9±29,83 µg/g). E, para os animais que
receberam tratamento com SB 6D também observou-se redução no consumo de GSH no
jejuno de 31,98% (423,7±43,89 µg/g) e no íleo de 37,44% (116,0±17,62 µg/g) (Figura 13).
C - 3D 6D C - 3D 6D0
200
400
600
GS
H/g
tecid
o
SB (dias de tratamento)
5-FU
SB (dias de tratamento)
5-FU
Jejuno Ileo
*
*
#
#
##
FIGURA 13 - Efeito do tratamento com SB na diminuição da concentração de GSH nos
segmentos intestinais induzidos por 5-FU em camundongos. Os animais foram tratados
com SB (800mg/Kg) ou salina durante seis dias (d1-d6; SB 6D) ou três dias (d4-d6; SB 3D),
no quarto dia (d4) todos os animais receberam dose única, intraperitonial, de 5-FU
(450mg/Kg). Todos os animais foram sacrificados no sétimo dia (d7) do experimento.
Segmentos do jejuno e íleo foram obtidos para aferir a concentração de GSH. Os valores
foram expressos como média ± E.P.M. *p<0,05 comparado com o grupo salina (C), #p<0,05
comparados com o grupo 5- FU + salina, pelo teste ANOVA seguido de Bonferroni.
58
4.7. Efeito do tratamento com SB no aumento das concentrações de NITRITO nos
segmentos intestinais induzidas por 5-FU em camundongos
Na figura 14, observamos que no jejuno e íleo dos animais que receberam
somente 5-FU, houve um aumento significativo das concentrações de nitrito, no jejuno de
86,43±10,93 µM e no íleo de 44,66±5,46 µM, quando comparados ao grupo de animais
controle (jejuno: 37,00±2,39 µM e íleo: 25,08±1,38 µM).
Os tratamentos com SB reduziram as concentrações de nitrito tanto no jejuno (SB
3D: 40,28±9,85 µM e SB 6D: 40,57±9,27 µM), como no íleo (SB 3D: 32,26 ± 5,23 µM e SB
6D: 22,27± 2,90 µM), quando comparados aos animais que receberam somente 5-FU.
C - 3D 6D C - 3D 6D0
50
100
150
SB (dias de tratamento)
5-FU
SB (dias de tratamento)
5-FU
Jejuno Ileo
*
*# #
#
#
Nit
rito
(µ
M)
FIGURA 14 – Efeito do tratamento com SB no aumento dos níveis de nitrito nos
segmentos intestinais induzidos por 5-FU em camundongos. Os animais foram tratados
com SB (800mg/Kg) ou salina durante seis dias (d1-d6; SB 6D) ou três dias (d4-d6; SB 3D),
no quarto dia (d4) todos os animais receberam dose única, intraperitonial, de 5-FU
(450mg/Kg). Todos os animais foram sacrificados no sétimo dia (d7) do experimento.
Segmentos do jejuno e íleo foram obtidos para a determinação dos níveis de nitrito. Os
valores foram expressos como média ± E.P.M. *p<0,05 comparado com o grupo salina (C), #
p<0,05 comparados com o grupo 5- FU + salina, pelo teste ANOVA seguido de Bonferroni.
59
4.8. SB reverteu o aumento dos níveis de IL-1β e CXCL1 nos segmentos intestinais
induzidos por 5-FU em camundongos
Nas figuras 15 e 16, observa-se que o 5-FU, no jejuno e íleo, induziu um aumento
na concentração de IL-1β (jejuno: 3405,0±272,1 pg/ml, referente a 81,79% e, no íleo: 2197,0±
249,3 pg/ml, referente a 107,49%) quando comparados ao grupo controle (100%), o mesmo
aumento ocorreu com a CXCL-1 (jejuno: 1443,0±396,8 pg/ml, referente a 507,24% e, no íleo:
1991± 837,5 pg/ml , referente a 288,76%) quando também comparados ao grupo controle
(100%).
Observou-se ainda que os tratamentos com SB diminuíram significativamente, no
jejuno, as concentrações de IL-1β em relação aos tratados somente com 5-FU, nos animais
tratados com SB 3D essa redução foi de 58,59% (2178±295,3 pg/ml) e nos tratados com SB
6D foi de 75,80% (1873±364,5 pg/ml). Mas, na mucosa do íleo essa redução foi bem maior,
para SB 3D de 128,22% (839,3±79,85 pg/ml) e para SB 6D de 126,13% (861,5±117,5 pg/ml).
Com relação às concentrações de CXCL1, observamos também que nos animais
tratados com SB houve uma diminuição significante nas concentrações tanto no jejuno do SB
3D de 541,15% (198,9±151,5 pg/ml) e no SB 6D de 542,22% (195,7±90,58 pg/ml),
respectivamente para SB 3D e SB 6D. Como no íleo, de 315,23% (376,6±107,1 pg/ml) e
333,31% (284,0±74,02 pg/ml), respectivamente para SB 3D e SB 6D.
60
C - 3D 6D C - 3D 6D0
1000
2000
3000
4000
SB (dias de tratamento)
5-FU
Jejuno
SB (dias de tratamento)
5-FU
Íleo
*
*#
#
# #
IL-1
(p
g/m
l)
FIGURA 15 - Efeito do tratamento com SB na diminuição dos níveis de IL-1β nos
segmentos intestinais induzidos por 5-FU em camundongos. Os animais foram tratados
com SB (800mg/Kg) ou salina durante seis dias (d1-d6; SB 6D) ou três dias (d4-d6; SB 3D),
no quarto dia (d4) todos os animais receberam dose única, intraperitonial, de 5-FU
(450mg/Kg). Todos os animais foram sacrificados no sétimo dia (d7) do experimento.
Segmentos do jejuno e íleo foram obtidos para a determinação dos níveis de IL-1β. Os valores
foram expressos como média ± E.P.M. *p<0,05 comparado com o grupo salina (C), # p<0,05
comparados com o grupo 5- FU + salina, pelo teste ANOVA seguido de Bonferroni.
61
C - 3D 6D C - 3D 6D0
1000
2000
3000
###
**
SB (dias de tratamento) SB (dias de tratamento)
5-FU 5-FU
Jejuno Íleo
#
CX
CL
1 (
pg
/ml)
FIGURA 16 - Efeito do tratamento com SB na diminuição dos níveis de CXCL1 nos
segmentos intestinais induzidos por 5-FU em camundongos. Os animais foram tratados
com SB (800mg/Kg) ou salina durante seis dias (d1-d6; SB 6D) ou três dias (d4-d6; SB 3D),
no quarto dia (d4) todos os animais receberam dose única, intraperitonial, de 5-FU
(450mg/Kg). Todos os animais foram sacrificados no sétimo dia (d7) do experimento.
Segmentos do jejuno e íleo foram obtidos para a determinação dos níveis de CXCL1. Os
valores foram expressos como média ± E.P.M. *p<0,05 comparado com o grupo salina (C), #
p<0,05 comparados com o grupo 5- FU + salina, pelo teste ANOVA seguido de Bonferroni.
4.9. Esvaziamento gástrico de líquidos em camundongos acordados e tratados com 5-FU
ou salina
Na figura 17, observa-se que nos tempos de 10, 20 ou 30 minutos após a refeição,
os animais tratados com 5-FU apresentaram um maior retardo do esvaziamento gástrico,
quando comparado ao controle que recebeu somente salina.
62
0 10 20 300
15
30
45
60
controle
5-fu
Tempo (min)
**
*
R E
T E
N Ç
à O
N
O
E S
T Ô
M A
G O
(%
)
FIGURA 17 - Esvaziamento gástrico de líquidos em camundongos acordados e tratados
com 5-FU ou salina (controle). Os animais foram tratados com 5- FU ou salina. Após 3 dias,
receberam gavagem de 0,3 ml da solução glicosada (5%) contendo vermelho de fenol a 0,75
mg/ml. Os resultados mostram a quantidade de vermelho fenol recuperada no estômago, 10,
20 ou 30min depois da gavagem. Os valores foram expressos como porcentagem da atividade
total no trato gastrointestinal. Os valores foram expressos como média ± E.P.M. * p<0.05
comparado ao grupo controle (salina), pelo teste ANOVA seguido de Bonferroni.
4.10. SB reverte o retardo do esvaziamento e do transito gastrintestinal associado a
mucosite intestinal induzida por 5-FU em camundongos
Na figura 18, observa-se que, no tempo de 20min, o 5-FU induziu um
significativo aumento na retenção gástrica (painel A), quando comparado com o controle
(salina). Estes aumento foi revertido com o tratamento com SB 3D ou SB 6D.
O tratamento com SB melhorou o atraso no esvaziamento gástrico (Figura 18A) e
no trânsito gastrintestinal medido pelo centro de massa (Figura 18C).
No que diz respeito à retenção intestinal, observa-se na figura 18B que houve um
aumento da retenção no segmento medial e uma diminuição no segmento distal nos grupos
tratados com SB, tanto 3D como 6D.
63
Controle - 3D 6D
0
20
40
60
80
*
# #
SB (dias de tratamento)
5-FU
A T
I V
I D
A D
E P
E R
M A
N E
C I
D A
N
O E
S T
Ô M
A G
O (%
)
C - 3D 6D C - 3D 6D C - 3D 6D0
25
50
75
100
*
#
# #
*
*
#
#
5-FU 5-FU 5-FU
Proximal Medial Distal
A T
I V
I D
A D
E P
E R
M A
N E
C I D
A
N O
I N
T E
S T
I N
O (%
)
A
B
64
Controle - 3D 6D1
2
3
4
5
*
#
#
5-FU
C E
N T
R O
G E
O M
É T
R I
C O
D A
R E
F E
I Ç Ã
O
FIGURA 18 - Efeito do tratamento com SB no retardo do esvaziamento gástrico, na
atividade permanecida no intestino e no trânsito gastrintestinal induzidos por 5- FU em
camundongos. Os animais foram tratados com SB (800mg/Kg) ou salina durante seis dias
(d1-d6; SB 6D) ou três dias (d4-d6; SB 3D), no quarto dia (d4) todos os animais receberam
dose única, intraperitoneal, de 5-FU (450mg/Kg). Todos os animais ficaram em jejum de 18h.
No dia do experimento, os animais receberam por gavagem de 0,3 ml a solução glicosada
(5%) contendo vermelho de fenol a 0,75 mg/ml. Os resultados mostram a quantidade de
vermelho fenol recuperada no estômago (painel A) e intestino (painel B), 20 min depois da
gavagem e, o centro geométrico da distribuição da refeição (painel C). Os valores foram
expressos como porcentagem da atividade total no trato gastrintestinal. Os valores foram
expressos como média ± E.P.M. * p<0.05 comparado ao grupo salina, pelo teste ANOVA
seguido de Bonferroni.
C
65
DISCUSSÃO
66
5 DISCUSSÃO
O presente estudo demonstrou que o tratamento com o Saccharomyces boulardii
foi capaz de reverter de forma significante todas as alterações causadas pelo 5-FU, o qual,
resultou na indução de uma lesão intestinal apresentando um importante comprometimento da
barreira epitelial funcional com a presença das seguintes alterações: encurtamento acentuado
das vilosidades intestinais, necrose parcial das criptas, achatamento e vacuolização de
enterócitos, com importante redução da relação vilo/cripta, presença de infiltrado mono e
polimorfonucleares, leucopenia, aumento nas concentrações de óxido nítrico (NO) intestinal,
produção de radicais livres com consumo de GSH intestinal, que poderia ser secundário ao
aumento de espécies reativas de oxigênio (ROS), aumento da produção de citocinas pró-
inflamatórias (IL-1β e CXCL1) no jejuno e íleo e, alterações na motilidade digestiva.
Sonis ST (2004) relata que a mucosite é um processo de complexa fisiopatologia e
classifica sua patogênese em cinco fases: iniciação, resposta primária ao dano, amplificação
de sinais, ulceração e cicatrização. A primeira fase é considerada quando a quimioterapia e/ou
radioterapia têm início e agridem tanto as células epiteliais quanto as do tecido conjuntivo por
meio de dano ao DNA e formação de espécies reativas de oxigênio (ROS), o que diminui a
renovação celular, afetando, em especial, epitélio e vasos sanguíneos. Nesta fase a mucosa
apresenta aspecto normal. Na fase II ocorre a ativação dos fatores nucleares de transcrição da
família Kappa-B (NF-kB), que induz mais de 200 genes, entre eles citocinas pró-inflamatórias
como o TNF-α (fator de necrose tumoral), IL1-β (interleucina 1β) e IL6 (interleucina 6), que
estimulam enzimas pró-apoptóticas, bloqueando os mecanismos de crescimento e
diferenciação celular e dando início às injúrias teciduais. A fase III é consequência da
ativação das citocinas pró-inflamatórias (TNF-α e IL 1-β), que causam dano ao epitélio,
endotélio e fibroblastos. Na fase IV ocorre perda de integridade da mucosa, causando lesões.
Na fase V, denominada de cicatrização, as moléculas mensageiras são lançadas direto da
matriz extracelular ao epitélio contíguo à úlcera, induzindo-o à divisão, migração e
diferenciação, a fim de possibilitar a formação de uma mucosa íntegra.
Os antineoplásicos têm efeito direto na atividade proliferativa das células
epiteliais provocando destruição das células de divisão presentes nas criptas, responsáveis
pela renovação epitelial dos vilos (DUNCAN; GRANT, 2003, KEEFE et al., 2000; 2004).
Ocorre também a liberação de vários mediadores inflamatórios, incluindo citocinas pró-
inflamatórias como IL-1β, IL-6, TNF- (SONIS et al., 2000). As citocinas pró-inflamatórias
podem estimular a produção de outras citocinas, de metabólitos do ácido araquidônico e de
67
proteases por macrófagos, neutrófilos, células do músculo liso, fibroblastos e células epiteliais
(SARTOR, 1994).
A mucosite induzida por antineoplásicos provoca a destruição das células
epiteliais e subsequente indução de resposta inflamatória local (SONIS et al., 2004;
RUBEINSTEIN et al., 2004).
Destacou-se a importante participação dos neutrófilos onde foi observado um
aumento importante da atividade da enzima mieloperoxidase. A liberação da enzima
mieloperoxidase dos grânulos azurófilos catalisa a formação de um poderoso ácido oxidante,
o ácido hipocloroso, o que pode levar a danos no DNA, proteínas e lipídeos. Além disso, a
mieloperoxidase pode agir no endotélio vascular promovendo a liberação de mediadores pró-
inflamatórios e expressão de moléculas de adesão, levando ao aumento da permeabilidade
vascular e aumento da adesão de neutrófilos. Após desgranulação, o neutrófilo também libera
várias substâncias como proteínas antimicrobianas, proteases, componentes da resposta
oxidativa, vários receptores de membrana para moléculas de adesão endotelial,
metaloproteinases de matriz (“Matrix Metalloproteinases” - MMPs) e mediadores solúveis da
inflamação (FAURSCHOU & BORREGAARD, 2003).
Nossos dados estão de acordo com a literatura, que demonstra que a injúria
epitelial associada à utilização de quimioterápicos antineoplásicos, geralmente, ocorre com
infiltração de neutrófilos para a mucosa intestinal que configura a fase inflamatória da
mucosite (SONIS et al., 2004) também descrita por Duncan e Grant (2003) e, o SB reverteu
essa migração de neutrófilos de forma significante. Outros achados da literatura revelam os
neutrófilos como componentes centrais da resposta inflamatória, fato relevante para os
mecanismos de fagocitose, produção de radicais livres e bem como para produção e ativação
de mediadores inflamatórios (REAVES; CHIN; PARKOS, 2005). Trabalhos de Edens et al.
(2002) que usam o modelo ex vivo, mostram que a migração de neutrófilos para as células
epiteliais pode induzir alterações de permeabilidade do epitélio intestinal. Essas alterações da
permeabilidade poderiam estar relacionadas a eventos dispépticos associados à mucosite
intestinal por 5-FU.
De acordo com Sezer et al., (2008) em um estudo de mucosite intestinal induzida
por irinotecano, observou-se que a migração de leucócitos e a inflamação foram
significativamente menores nos animais que receberam o tratamento com SB, melhorando a
mucosite intestinal induzida pelo irinotecano. Estes autores demonstraram também que a
espessura das vilosidades intestinais nos animais tratados com irinotecano é
significativamente menor em relação os animais que receberam irinotecano + SB, mostrando
68
que o SB tem um efeito protetor proeminente sobre a lesão na mucosa intestinal induzida por
irinotecano.
Wu et al (2007), em um estudo sobre a colite induzida por Citrobacter rodentium
(2,5 x 108 UFC, gavagem, dose única) em camundongos tratados com SB (25 mg; 5x10
8
células vivas) duas vezes por dia, por 8 dias, demonstrou que o SB manteve a integridade da
barreira epitelial do cólon e reverteu as sequelas inflamatórias associadas à colite por
Citrobacter rodentium. Nos camundongos infectados, o tratamento SB atenuou
significativamente a perda de peso, melhorou hiperplasia das criptas intestinais, os escores de
danos histológicos e reduziu a atividade de mieloperoxidase.
Para que ocorra a remissão completa das doenças inflamatórias é necessário que
haja a cessação da inflamação e da migração dos enterócitos para reparar o epitélio
danificado. Canonici et al 2011, demonstraram que o SB secreta compostos que aumentam a
migração dos enterócitos, independentemente da proliferação celular. Esta migração avançada
foi associada com a capacidade do SB de favorecer a interação de células-matriz extracelular.
Estes autores concluiram que o SB secreta fatores mitogênicos que aumentam a restituição
celular através da regulação dinâmica da atividade A2B1 integrina.
No decorrer da presente investigação, observou-se ainda, que o SB reduziu
significantemente as concentrações de citocinas pró-inflamatórias, especificamente IL-1β e
CXCL1, aumentadas nos segmentos do jejuno e íleo dos camundongos com a administração
do 5-FU e isso se correlaciona com os outros achados inflamatórios citados. A literatura tem
mostrado que outras drogas utilizadas na quimioterapia do câncer podem levar a uma
mucosite intestinal com a participação de citocinas. Melo (2008) demonstrou que o
irinotecano (CPT-11), importante quimioterápico bastante utilizado na clínica, causa
significante dano à mucosa intestinal, induzindo um aumento significativo na concentração de
TNF-, IL-1β e CXCL1 no intestino de camundongos. Outros trabalhos observaram que a
radioterapia também é capaz de induzir aumento dos níveis de TNF- e IL-1 em modelos
animais de mucosite oral (SONIS et al., 2000). Essas evidências mostram a importância de
citocinas no desenvolvimento da mucosite gastrintestinal induzida pelo tratamento anticâncer.
Assim, o efeito protetor do SB, encontrado no nosso estudo, pode ser explicado por sua
capacidade em inibir o aumento destas citocinas pró-inflamatórias (IL-1β e CXCL1). As
citocinas e as vias de sinalização inflamatória, modificada pelo SB, poderiam também reduzir
a lesão intestinal induzida pelo irinotecano (SEZER et al., 2008).
69
Trabalhos de Lima et al (2005) demonstraram que a administração de talidomida
e pentoxifilina, ambas substâncias agem por inibição de citocinas (TNF-α e IL-1β), protegiam
a mucosa oral de hamster dos efeitos provocados pelo tratamento com o 5-FU.
Fidan et al (2009), demonstraram que o SB pode apresentar redução da resposta
pró-inflamatória, através da diminuição da secreção de citocinas pró-inflamatórias como a IL-
1β nos animais tratados com SB, mas observaram que os níveis de citocinas anti-
inflamatórias, como IL-4 e IL-10, foram maiores nesses animais, demonstrando que o SB
pode apresentar efeito protetor pela redução da resposta pró-inflamatória.
Jawhara e Poulain (2007), demonstraram, que o SB diminui a reação inflamatória
e a colonização do intestino de ratos, na infecção por C. Albicans, em modelo de colite
induzido por sódio dextrana-sulfato (DSS). Nesse estudo os animais foram tratados por
gavagem durante uma semana com SB (107 UFC) e as fezes foram coletadas diariamente
durante duas semanas. Os grupos de camundongos constituído por aqueles que foram
administrados ou C. albicans ou S. boulardii ou ambos foram sacrificados após 14 dias e
amostras do cólon foram retiradas para a classificação histológica e análise de PCR (RT-PCR)
de citocinas inflamatórias e receptores toll-like (TLRs).
Cunha (2010) comparou a influência da irradiação laser de baixa potência (nos
comprimentos de onda 660nm e associação de 660nm e 780nm) somada aos cuidados de
higiene bucal na redução da severidade da mucosite oral induzida pelo uso de antineoplásico
5-Fluoruracil (5-FU) e na alteração de padrão alimentar durante o tratamento. A amostra
totalizou 18 pacientes portadores de neoplasias e que desenvolveram mucosite oral segundo
os sinais e sintomas da Organização Mundial de Saúde (WHO). Ele observou que as citocinas
pró-inflamatórias tem uma função indireta na amplificação da injúria da mucosa iniciada pela
radioterapia e quimioterapia.
A CXCL1 é uma quimiocina que possui muitas funções, incluindo participação na
imunidade, indução de respostas inflamatórias e apoptose (JAIN et al., 2007). É expressa por
macrófagos, neutrófilos e células epiteliais, está envolvida no processo de angiogênese,
inflamação, cicatrização e tumorigênese. Esta quimiocina induz seus efeitos através de
sinalização através do receptor de quimiocina CXCR2 (HH TSAI et al, 2002). CXCL1 é
reconhecida como um poderoso fator quimiotático de neutrófilos (REAVES et al, 2005), logo
o aumento na expressão dessa quimiocina no tratamento com 5-FU, pode justificar o aumento
do infiltrado neutrofílico.
Outra citocina do nosso interesse foi a IL-1. Estudos demonstraram que esta
citocina encontra-se aumentada na mucosa intestinal de pacientes com doenças inflamatórias
intestinais e em tecidos intestinais de animais submetidos à colite experimental
70
(YOUNGMAN et al., 1993). Com isso, acredita-se que IL-1 possa ter importância no
desenvolvimento de doenças inflamatórias intestinais. Yan et al. (2006) demonstraram que a
IL-1 estimula a expressão de genes responsáveis pela produção de fatores inflamatórios
COX-2, MCP-1, MIP-2, iNOS, e RANTES em cultura de células epiteliais. E que
possivelmente, o aumento da expressão desses genes ocorre pela ação de NF-kβ.
Alguns estudos demonstraram que as citocinas regulam e ampliam a resposta
imune, induzem lesão tecidual e mediam complicações, como a diarreia (SARTOR, 1994).
Williams (2001) relatou que citocinas inflamatórias como IL-1β, IL-6, TNF-α, IFN-γ e IL-2
contribuem com a gravidade e manutenção de lesões na mucosa intestinal. De Koning et al,
(2006) demonstraram que a resposta imune da mucosa tem um papel importante durante a
mucosite induzida por metotrexato. TNF-α e IL-10 contribuem para regular o dano da mucosa
através da restrição excessiva da mucosite. Sabe-se também que a IL-1α, IL-1β e TNF-α
estimulam a secreção de outras citocinas, outros metabólitos do ácido araquidônico e
proteases por macrófagos, neutrófilos, células musculares lisas e células epiteliais (SARTOR,
1994).
De acordo com Soares et al (2008) em estudos utilizando animais deficientes para
receptores PAF como também com animais pré-tratados com antagonistas do receptor de
PAF, o BN52021, mostraram que ambos os grupos apresentaram significantemente menos
mucosite intestinal induzida por 5-FU, demonstrando assim a participação do PAF na
mucosite intestinal induzida por 5-FU, não por meio da inibição da migração de neutrófilos ou
por um mecanismo independente desse. O PAF é um mediador inflamatório produzido pelo
intestino durante lesões agudas (SUN; HSUEH, 1988) é um mediador importante na
patogênese da enterocolite necrozante (HSUEH et al, 2003).
Observamos também em nossos estudos que o tratamento com SB reduziu as
concentrações de nitrito que estão aumentadas com a administração do 5-FU, essa redução
das concentrações de nitrito está de acordo com os dados da literatura. DIJKSTRA et al.,
(1998) demonstrou que a produção de níveis elevados de NO está associada a efeitos
inflamatórios. A atividade da iNOS é regulada durante a ativação imune e pode resultar na
síntese de níveis elevados de NO. O efeito inibitório do SB na atividade da iNOS foi exibido
em modelo de indução de diarréia pelo óleo castor (mamona/ricínio) em ratos. O nível de
citrulina (um marcador de produção de NO) estava aumentada no cólon desses ratos,
considerando que a administração de SB foi mostrada por bloquear esta produção. O mesmo
efeito é relatado com o inibidor de iNOS. Estes resultados sugerem que a inibição da iNOS
por SB pode ser benéfico no tratamento da diarréia e inflamação associada a produção
exagerada do NO (GIRARD et al., 2005).
71
Soares et al., (2008) demonstraram que a mucosite intestinal induzida por 5-FU
está associada ao retardo no esvaziamento gástrico / trânsito intestinal de líquidos, e associado
à hipercontratilidade no fundo gástrico e no músculo do duodeno, tanto na fase inflamatória (3
dias) como pós-inflamatória (15 dias), depois do tratamento com 5-FU.
O presente trabalho também teve como objetivo fazer um estudo funcional dos
animais tratados com SB na mucosite intestinal induzida por 5-FU, tendo em vista que os
efeitos colaterais mais frequentes da quimioterapia antineoplásica são os sintomas
gastrintestinais. A mucosite intestinal induzida por 5-FU em camundongos está associada a
significativo retardo no esvaziamento gástrico e no trânsito gastrintestinal. Em nosso estudo,
através da análise do centro de massa da refeição, observamos que o SB reverteu as alterações
na motilidade digestiva no curso da mucosite por 5- FU, melhorando o retarde no trânsito
gastrintestinal, aumentando a retenção no segmento medial e causando uma diminuição no
segmento distal, o que pode ser explicado pela eficácia do SB em inibir a inflamação
associada à mucosite por 5-FU.
Várias evidências indicam que pacientes submetidos à terapia anticâncer podem
sofrer vários sintomas gastrintestinais, tais como, dispepsia, disfagia e diarréia (RIEZZO et
al., 2005). Esse conjunto de sintomas foi denominado síndrome dispéptica associada à
quimioterapia do câncer (CADS). Recentemente, dados da literatura sugerem que as
desordens da motilidade gastrintestinal podem ser uma das causas de CADS (NELSON et al.,
2002, RIEZZO et al., 2005).
De acordo com VERDÚ et al 2004, os probióticos diminuem a
hipercontratilidade de músculo em um modelo animal de síndrome do intestino irritável pós-
infecciosa. Este provavelmente ocorre tanto via modulação imunológica da resposta à
infecção como por um efeito do probiótico (Lactobacillus paracasei) ou através de um
metabólito produzido pelo probiótico na hipercontratilidade muscular pós-infecciosa.
O retardo no esvaziamento gástrico, observado nos camundongos tratados com 5-
FU, pode ser devido a um aumento na complacência gástrica e/ou a um aumento na
resistência antro-duodenal (HABA; SARNA, 1993). Dados da literatura demonstraram que a
inflamação intestinal está associada com anormalidades do controle da motilidade
gastrintestinal em modelos de lesão inflamatória (MARTINOLLE et al., 1995; ANNESE et
al., 1997; MOREELS et al., 2001; AKIHO et al., 2005). Também foi demonstrado que a
hipomotilidade intestinal e o retardo do esvaziamento gástrico podem ser encontrados em um
modelo de íleo paralítico em rato (DE JONGE et al., 2003). Observou-se ainda, que a sepse
inibe a motilidade gastrintestinal podendo ser influenciada pela produção de óxido nítrico (DE
WINTER et al., 2002).
72
Nosso trabalho foi delineado para testar a eficiência do SB na mucosite intestinal
induzida pelo 5-FU e, nos seus danos inflamatórios e funcionais em camundongos. Nos
animais que receberam 5-FU + SB, a lesão da mucosa foi significativamente menor e foi
registrado melhoria na funcionalidade intestinal.
Mais estudos, inclusive estudos clínicos, precisam ser conduzidos para revelar
todos os possíveis mecanismos de ação do SB na lesão da mucosa intestinal induzida pelo 5-
FU.
Saccharomyces boulardii de baixo custo, uso conveniente, droga não interativa, e
desprovida de toxicidade, fornece uma interessante abordagem alternativa de tratamento na
mucosite intestinal induzida por 5-FU.
O SB pode combater o processo inflamatório estabilizando o ambiente microbiano
intestinal, a permeabilidade da barreira intestinal e a degradação de antígenos enterais
alterando sua imunogenicidade. Podem, também, mediar esse processo através do controle do
equilíbrio entre citocinas pró e antiinflamatórias. Uma modificação na microflora intestinal
para aumentar o predomínio de determinadas bactérias não-patogênicas e, assim, alterar o
meio intestinal pode ser considerado como uma alternativa para alcançar efeitos intestinais
profiláticos ou terapêuticos nas doenças inflamatórias intestinais. MURZIN et al (2010),
demonstrou que o extrato de SB produz, além de outras substâncias não identificadas, o ácido
cáprico que é capaz de inibir a formação de hifas, a adesão e a formação de biofilme da
levedura de Candida albicans.
Por fim, concluímos que o Saccharomyces boulardii reverte a mucosite intestinal
causada pelo 5-Fluorouracil, em camundongos, com a participação de IL-1β, CXCL-1, bem
como reverte a mucosite intestinal associada à dismotilidade gastrintestinal. Nossos achados,
em parte, poderiam explicar os sintomas persistentes de CADS nos pacientes sob o tratamento
5-FU, além de contribuir para o entendimento da patogênese da mucosite intestinal e seu
tratamento com SB, auxiliando, na descoberta de novas abordagens terapêuticas com o uso de
Saccharomyces boulardii.
73
Com base nos dados que obtivemos, sugerimos o seguinte modelo hipotético:
FIGURA 19 – Hipótese do Mecanismo de ação do Saccharomyces boulardii
74
CONCLUSÃO
75
6 CONCLUSÃO
Saccharomyces boulardii apresentou atividade antiinflamatória no modelo de lesão
intestinal induzida por 5-FU em camundongos.
Saccharomyces boulardii normalizou o trânsito gastrintestinal no modelo de lesão
intestinal induzida por 5-FU em camundongos.
76
REFERÊNCIAS
77
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ANEXOS
89
ANEXO A - Aprovação pela CEPA do projeto de pesquisa do estudo do tratamento com
Saccharomyces boulardii na mucosite intestinal induzida por 5-FU em camundongos