Saccharomyces boulardii REVERTE A RESPOSTA … · motilidade digestiva associadas à mucosite por...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

FACULDADE DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA

CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA

PRISCILLA FERNANDA CAMPOS JUSTINO

Saccharomyces boulardii REVERTE A RESPOSTA

INFLAMATÓRIA E FUNCIONAL PRESENTE NA MUCOSITE

INTESTINAL INDUZIDA POR 5-FLUOROURACIL EM

CAMUNDONGOS

FORTALEZA

2011

2


Saccharomyces boulardii REVERTE A RESPOSTA

INFLAMATÓRIA E FUNCIONAL PRESENTE NA MUCOSITE

INTESTINAL INDUZIDA POR 5-FLUOROURACIL EM

CAMUNDONGOS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em

Farmacologia do Departamento de Fisiologia e

Farmacologia da Faculdade de Medicina da Universidade

Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do

título de Mestre em Farmacologia.

Orientador: Prof. Dr. Pedro Marcos Gomes Soares

FORTALEZA

2011

3

J97s Justino, Priscilla Fernanda Campos

Saccharomyces boulardii reverte a resposta inflamatória e

funcional presente na mucosite intestinal induzida por 5-

fluorouracil em camundongos./ Priscilla Fernanda Campos

Justino. – Fortaleza, 2011.

89f.; il.

Orientadora: Prof. Dr. Pedro Marcos Gomes Soares. Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Ceará.

Faculdade de Medicina. Departamento de Fisiologia e Farmacologia

1. Doenças inflamatórias intestinais. 2. Antineoplásicos. 3.

Probióticos. I. Soares, Pedro Marcos Gomes (Orient.) II. Título.

CDD: 616.344

4


Saccharomyces boulardii REVERTE A RESPOSTA INFLAMATÓRIA E

FUNCIONAL PRESENTE NA MUCOSITE INTESTINAL INDUZIDA

POR 5-FLUOROURACIL EM CAMUNDONGOS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Farmacologia da Universidade

Federal do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em

Farmacologia.

Orientador: Prof. Dr. Pedro Marcos Gomes Soares.

Aprovada em: 20/06/2011

BANCA EXAMINADORA

__________________________________________

Prof. Dr. Pedro Marcos Gomes Soares (Orientador)

Universidade Federal do Ceará – UFC

_____________________________________________

Prof. Dr. Ronaldo de Albuquerque Ribeiro

Universidade Federal do Ceará – UFC

___________________________________________

Profa. Dra. Ana Maria Sampaio Assreuy

Universidade Estadual do Ceará - UECE

5

À Deus, primeiramente, que sempre está presente na minha vida;

Aos meus pais, Marcos e Daisy (in memoriam);

Às minhas irmãs, Carinne e Rachel.

6

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais, irmãs e amigos pelo apoio e compreensão durante a realização

deste trabalho.

Ao Professor Dr. Marcellus Henrique, por ter acreditado em mim e me acolhido

no laboratório, LAFICA.

Ao Professor Dr. Pedro Marcos Gomes Soares pela orientação científica e

pessoal, pela paciência e dedicação, que foram muito importantes para o meu crescimento

como pesquisadora.

Ao Professor Dr. Ronaldo Ribeiro, agradeço a oportunidade de participar da

equipe de grandes pesquisadores do LAFICA.

Ao Professor Dr. Roberto César, à Prof. Dra. Danielle Macedo por fazerem parte

da minha banca de qualificação.

A todos os outros professores do departamento de Fisiologia e Farmacologia da

UFC, que contribuíram de alguma forma para a minha formação no mestrado.

Aos meus amigos e colegas da pós-graduação do laboratório LAFICA, Roberta

Dalcico, Larisse Lucetti, Ana Paula Macedo, Deisy e Roberto César, os quais se

disponibilizaram a me ensinar e me ajudar nas realizações dos experimentos, e em todo

decorrer do trabalho. Pelas horas de descontração, pelas conversas paralelas e por tornarem

o trabalho mais divertido.

Aos meus grandes amigos Otacílio e Roberta, por sempre me incentivarem a

seguir o caminho certo e por me apoiarem em todos os momentos.

Aos bolsistas, estudantes de iniciação científica do Laboratório LAFICA, André,

Luís Fernando, Luara Manuela, José Victor e Bruno por toda a ajuda nos experimentos,

nas apresentações e por todos os bons momentos passados no laboratório.

7

Aos técnicos, Maria Silvandira França Pinheiro (Vandinha), Carol, Tiara Sena e

Álvaro Franco pela atenção, disponibilidade, organização do laboratório LAFICA, por toda

dedicação, auxílio e as conversas paralelas que tornavam o trabalho mais agradável. À

Socorro pela grande ajuda na confecção das lâminas de histologia. Antonio Haroldo

Pinheiro Ferreira pela colaboração e organização do Biotério.

À secretária da Pós-Graduação, Aura Rhanes e Márcia, pela eficiência e

gentileza.

Ao meu pai Marcos Justino pela dedicação e esforço, por sempre acreditar e

torcer pelo meu sucesso e pelo esforço incondicional pelos meus estudos.

À minha mãe Daisy Fátima (in memoriam) que sempre esteve (e está) ao meu

lado, sempre foi a pessoa que mais me incentivou a realizar os meus sonhos e, que mesmo

não estando mais no mesmo plano físico que nós, não deixou de me influenciar e torcer pelo

meu sucesso. Agradeço por toda a sua dedicação e amor e, por tudo que sempre me ensinou,

por ser responsável pelo que sou hoje.

Às minhas irmãs Rachel Fátima (Kelzinha) e Carinne Justino, por me ajudarem a

realizar esse sonho e me apoiarem nos estudos.

Ao meu avô Antônio Justino que mesmo distante sempre me incentivou e se

realizou com as minhas conquistas.

Aos meus amigos Fabrícia, Lícia, Júlia, Nilton, Juliana Lobo, Erica Leandro,

Aline, Ana Luiza, Pablo, Lore Anny, Lilianne, Cristiane Feijó, Ana Paula Rolim, Célia e

Virna Saraiva que estão presentes no meu dia a dia, me apoiando, me ajudando nas horas

difíceis. Sou muito grata por saber que os tenho como amigos a qualquer hora.

Ao CNPq pelo suporte financeiro.

A todos que direta ou indiretamente colaboraram em alguma etapa da execução

do meu trabalho.

8

“Bom mesmo é ir a luta com determinação, abraçar a vida

e viver com paixão, perder com classe e vencer com

ousadia, porque o mundo pertence a quem se atreve e a

VIDA É MUITO para ser insignificante.”

Charlie Chaplin

9

RESUMO

Saccharomyces boulardii REVERTE A RESPOSTA INFLAMATÓRIA E

FUNCIONAL PRESENTE NA MUCOSITE INTESTINAL INDUZIDA

POR 5-FLUOROURACIL EM CAMUNDONGOS.

Introdução: A mucosite induzida por antineoplásicos é um fator limitante na terapia

anticâncer. O trato gastrintestinal é vulnerável por causa da alta proliferação e frequência de

renovação celular. Saccharomyces boulardii (SB) é uma levedura probiótica que é utilizado

para proteger a microflora gastrintestinal do desequilíbrio e de distúrbios gastrintestinais

associados. Objetivos: Avaliar o efeito do tratamento com SB na resposta inflamatória e nas

alterações da motilidade digestiva no curso da mucosite intestinal experimental induzida por

5-FU. Métodos: Camundongos machos Swiss (25-30g) foram tratados com 5-FU (450mg/Kg,

i.p.) ou com solução salina (controle). Outros grupos receberam durante 3 ou 6 dias SB

(800mg/Kg, gavagem) até o dia do sacrifício, diariamente. Um grupo pré-tratado recebeu o

SB por 3 dias antes e 3 dias depois da administração do 5-FU (SB 6D) e outro grupo recebeu

SB somente 3 dias após a administração do 5-FU (SB 3D). No 3º dia após o 5-FU ou 5-

FU+SB (3D ou 6D), os animais foram sacrificados, amostras de jejuno e íleo foram retiradas

para avaliar a injúria epitelial por morfometria, escores histológicos, atividade de MPO, níveis

de nitrito e concentração de GSH. Para avaliação de citocinas pelo método de ELISA foi

determinada a concentração de IL-1β e CXCL1. Já na técnica de esvaziamento gástrico os

animais receberam o mesmo tratamento descrito anteriormente. Posteriormente, foram

deixados em jejum de 18 horas. No 7º dia foram administrados 0,3 ml da solução glicosada

(5%) contendo vermelho de fenol (VF) a 0,75 mg/ml em cada animal. Após 20 min, os

animais foram sacrificados e submetidos a uma laparotomia mediana. O intestino delgado foi

exposto e divido em 3 partes iguais: proximal, medial e distal. Com o auxílio de uma proveta

contendo uma solução de NaOH (100ml, 0,1N) o volume do estômago e dos segmentos do

intestino delgado foram determinados. A absorbância da amostra foi lida à 540nm.

Resultados: O tratamento com 5-FU foi capaz de induzir uma lesão intestinal com um

importante comprometimento da barreira epitelial funcional com a presença das seguintes

alterações: encurtamento acentuado das vilosidades intestinais, necrose parcial de criptas,

vacuolização de células, presença de infiltrado de polimorfonucleares, produção de radicais

livres com consumo de GSH, aumento dos níveis de nitrito, aumento na concentração de IL-

1β e CXCL1 e alterações na motilidade digestiva. O tratamento com SB reduziu

significativamente as lesões intestinais, com recuperação da altura dos vilos, recuperação da

profundidade das criptas, diminuição do infiltrado neutrofílico e dos níveis de nitrito, aumento

dos níveis de glutationa e redução da concentração de IL-1β e CXCL1. Contudo, o tratamento

com SB foi capaz de reverter o retarde do esvaziamento gástrico e do transito gastrintestinal.

Conclusão: 5-FU induz mucosite intestinal em camundongos com a participação de IL-1β e

CXCL1, a qual se associa com retarde no esvaziamento gástrico e no transito gastrintestinal.

O tratamento com SB foi capaz de reverter os achados inflamatórios e as alterações na

motilidade digestiva associadas à mucosite por 5- FU em camundongos.

Palavras-chave: doenças inflamatórias intestinais, agentes antineoplásicos, probióticos.

10

ABSTRACT

Saccharomyces boulardii AMELIORATES THE INFLAMMATION AND GASTRIC

DYSMOTILITY PRESENTS IN INTESTINAL MUCOSITIS INDUCED BY 5-

FLUOROURACIL IN MICE.

Introduction: Intestinal mucositis is a frequent side-effect associated to 5-fluorouracil (5-FU)

clinical use and results in inflammatory events. It is characterized by epithelial ulcerations in

the mucosa and clinical manifestations of abdominal pain, nauseas and diarrhea.

Saccharomyces boulardii is a probiotic yeast which has been shown to protect the

gastrointestinal microflora from disequilibrium and from associated gastrointestinal disorders.

Aim: To evaluate the effect of treatment with Saccharomyces boulardii in inflammatory

response and alterations in the gastrintestinal motility in the course of intestinal mucositis

experimental induced by 5-FU. Methods: Swiss male mice (25-30g) were treated with 5-FU

(450mg/Kg, ip) or saline (control). Other groups received 3 or 6 days during SB (800mg/Kg,

gavage) until the day of sacrifice, every day. A group pretreated received the SB for 3 days

before and 3 days after administration of 5-FU (SB 6D) and another group received SB only 3

days after administration of 5-FU (SB 3D). At day 3 after 5-FU, the animals were sacrificed,

samples of jejunum and ileum were collected to assess the injury epithelial morphometry,

histological scores, the activity of MPO, nitrite levels and the concentration of GSH. For

evaluation of cytokine samples of jejunum and ileum were removed and the ELISA was

determined concentrations of IL-1β and CXCL1. In the technique of gastric emptying, the

animals received the same treatment described above. Later, they were left to fast for 18 hours

from d6 to d7. At d7, were administered 0.3 ml of glucose solution (5%) containing phenol

red (VF) to 0.75 mg / ml in each animal. After 20 min, the animals were sacrificed and

underwent a laparotomy. The small intestine was exposed and divided into 3 equal parts:

proximal, medial and distal. With the aid of a beaker containing a solution of NaOH (100ml,

0.1 N) the volume of the stomach and small intestine segments were determined. The sample

absorbance was read in a wavelength of 540 nm. Results: Treatment with 5-FU was able to

induce intestinal injury with a significant impairment of epithelial barrier function in the

presence of the following changes: severe shortening of the villus, crypts of partial necrosis,

vacuolization of cells, infiltration and mono polymorphonuclear free radical production with

consumption of GSH, increased levels of nitrite, increased concentration of IL-1β and CXCL1

and changes in gastrointestinal motility. Treatment with SB significantly reduced intestinal

damage, with recovery of villous height, crypt depth recovery, decreased neutrophil

infiltration and nitrite levels, increased levels of glutathione and reduced concentrations of IL-

1β and CXCL1. However, treatment with SB was able to reverse the delayed gastric emptying

and gastrointestinal transit. Conclusion: 5-FU induces intestinal mucositis in mice involving

IL-1β and CXCL1, which is associated with delayed gastric emptying and gastrointestinal

transit in. Treatment with SB, both 3D and 6D, were able to reverse the inflammatory

changes, and revert the changes in gastrointestinal motility associated with mucositis by 5 -

FU in mice.

Keywords: inflammatory bowel diseases, antineoplastic agents, probiotics

11

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 Fotomicrografia eletrônica do Saccharomyces boulardii...................... 26

FIGURA 2 Esquema do trato intestinal, ilustrando os diferentes mecanismos de

ação do Saccharomyces boulardii (SB).................................................

27

FIGURA 3 Estrutura química do 5-Fluorouracil ..................................................... 29

FIGURA 4 Metabolismo hepático do 5-Fluorouracil .............................................. 30

FIGURA 5 Modelo experimental (parâmetros inflamatórios) ................................. 40

FIGURA 6 Modelo experimental (parâmetros funcionais) ..................................... 45

FIGURA 7 Representação esquemática do centro geométrico de uma refeição

teste ........................................................................................................

46

FIGURA 8 Efeito do tratamento com SB na variação de peso corporal em

camundongos .........................................................................................

50

FIGURA 9 Efeito do tratamento com SB nas alterações histopatológicas no

jejuno induzidas por 5-FU em camundongos ........................................

52

FIGURA 10 Efeito do tratamento com SB nas alterações histopatológicas no íleo

induzidas por 5-FU em camundongos ...................................................

53

FIGURA 11. Efeito do tratamento com SB nas alterações morfométricas induzidas

por 5-FU em camundongos ...................................................................

55

FIGURA 12 Efeito do tratamento com SB no aumento da atividade de MPO nos

segmentos intestinais induzidos por 5-FU em camundongos ...............

56

FIGURA 13 Efeito do tratamento com SB na diminuição da concentração de GSH

nos segmentos intestinais induzidos por 5-FU em camundongos .........

57

12

FIGURA 14 Efeito do tratamento com SB no aumento dos níveis de nitrito nos


58

FIGURA 15 Efeito do tratamento com SB na diminuição dos níveis de IL-1β nos


60

FIGURA 16 Efeito do tratamento com SB na diminuição dos níveis de CXCL1

nos segmentos intestinais induzidos por 5-FU em camundongos .........

61

FIGURA 17 Esvaziamento gástrico de líquidos em camundongos acordados e

tratados com 5-FU ou salina (controle) .................................................

62

FIGURA 18 Efeito do tratamento com SB no retardo do esvaziamento gástrico, na

atividade permanecida no intestino e no trânsito gastrintestinal

induzidos por 5- FU em camundongos..................................................

63

FIGURA 19 Hipótese de Mecanismo de ação do Saccharomyces boulardii ............

73

13

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 Sistema de Escores de Macpherson e Pfeiffer .................................... 41

TABELA 2 SB não altera a leucopenia induzida por 5-FU ................................... 49

TABELA 3 Escores histopatológicos nos segmentos intestinais de

camundongos submetidos à mucosite intestinal induzida por 5-FU e

tratados ou não com Saccharomyces boulardii...................................

51

14

LISTA DE QUADROS

QUADRO 1 Fármacos e diluentes ......................................................................... 37

QUADRO 2 Equipamentos e instrumentos laboratoriais ........................................ 38

15

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

α Alfa

β Beta

γ Gama

µL Microlitro

µM Micrômetro

ºC Graus Celsius

5-FU 5-Fluorouracila

3D Três dias

6D Seis dias

AGCC Ácido graxo de cadeia curta

ANOVA Análise de Variância

ATP Trifosfato de adenosina

ATV Atorvastatina

BN52021 Inibidor do receptor de PAF

BSA Albumina sérica bovina

CADS Síndrome dispéptica associada à quimioterapia do câncer

cAMP Monofosfato de adenosina cíclico

COX-2 Ciclooxigenase 2

CPT-11 Cloridrato de irinotecano

CXCL1 Quimiocina derivada de queratinócitos

CXCR2 Receptor de quimiocina

d Dia

DAB 3,3 diaminobenzidine-peróxido

DHFU Diidrofluorouracila

DNA Ácido desoxirribonucleico

16

DPD Diidropirimidina desidrogenase

DTNB Ácido 5,5-dithiobis-2-nitro-benzóico

EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético

ELISA Ensaio imunoenzimático

EPM Erro padrão da média

FDA Food and Drug Administration

FdUMP Fluorodioxuridina monofosfato

FdUTP Fluorodioxuridina trifosfato

FUTP Fluorouridina trifosfat

G Grama

GSH Glutationa

HTAB Hexadecitrimetilamônio

H2O Água

H2O2 Peróxido de hidrogênio

H2SO4 Ácido sulfúrico

HIV Vírus da imunodeficiência humana

IFN Interferon

IgA Imunoglobulina A

IL- Interleucina

IkB Proteína inibitória de Kappa beta

ICAM-1 Molécula de adesão intercelular 1

i.p. Intraperitoneal

Kg Quilograma

LPS Lipopolissacarídeo

M Molar

Min. Minutos

17

Mg Miligrama

mL Mililitro

mm3 Milímetro cúbico

MPO Mieloperoxidase

n Número

NaCl Cloreto de sódio

NaOH Hidróxido de sódio

NF-KB Fator nuclear Kappa beta

NO Óxido nítrico

NO2-

Nitrito

NO3-

Nitrato

NOS Óxido nítrico sintase

NOSi Óxido nítrico sintase induzida

NP-SH Grupo sulfidrílico não-protéico

PAF Fator de ativação plaquetária

pH Potencial hidrogeniônico

PLA2 Fosfolipase 2

PMN Polimorfonucleares

PBS Solução tamponada de fosfato

Pg Picograma

PG Prostaglandina

PGE2 Prostaglandina E2

PGI2 Prostaglandina I2

PTX Pentoxifilina

RNA Ácido Ribonucléico

ROS Espécies reativas de oxigênio

18

RPM Rotação por minuto

SB Saccharomyces boulardii

sIgA Imunoglobulina A secretória

s.c. Subcutânea

TCA Ácido tricloroacético

TGF- Fator de crescimento transformador

TF Fator de transcrição

TLD Talidomida

TLRs Receptores toll-like

TNF-α Fator de necrose tumoral α

TRIS Tampão tris-hidroximetilaminometano

TS Timidilato sintase

TXA2 Tromboxano A2

UFC Unidade formadora de colônia

VF Vermelho de fenol

v.o. Via oral

WHO Organização Mundial de Saúde

19

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ................................................................................................

22

1.1. Probióticos e o Saccharomyces boulardii ......................................................

1.2. Mucosite Intestinal e o 5-fluorouracil ..........................................................

1.2.1. Papel das citocinas na mucosite intestinal ..................................................

1.2.2. Aspectos funcionais da mucosite intestinal ...............................................

1.2.3. Mucosite por antineoplásicos e a contribuição do LAFICA ......................

23

28

31

31

32

2 OBJETIVOS .....................................................................................................

2.1. Objetivo Geral ................................................................................................

2.2. Objetivos Específicos .....................................................................................

34

35

35

3 MATERIAIS E MÉTODOS ...........................................................................

3.1. Animais ..........................................................................................................

3.2. Materiais Utilizados ......................................................................................

3.2.1 Fármacos e Diluentes ...................................................................................

3.2.2 Equipamentos e Instrumentos Laboratoriais ................................................

3.3. Protocolo Experimental ................................................................................

3.3.1 Modelo de mucosite intestinal induzida por 5-FU e tratamento com

Saccharomyces boulardii ................................................................................

3.4. Parâmetros avaliados ...................................................................................

3.4.1 Análise do peso corporal .............................................................................

3.4.2 Leucograma .................................................................................................

3.4.3 Análise morfométrica e histopatológica ......................................................

36

37

37

37

38

39

39

40

40

40

41

20

3.4.4 Ensaio para mieloperoxidase (MPO) ..........................................................

3.4.5 Determinação de glutationa (GSH) .............................................................

3.4.6 Dosagem de IL-1β, CXCL1 e IL-10 ...........................................................

3.4.7 Dosagem de nitrito ......................................................................................

3.5. Esvaziamento gástrico e transito gastrintestinal na mucosite intestinal

induzida por 5-FU em camundongos.............................................................

3.6. Efeito do tratamento com SB no retardo do esvaziamento gástrico e

trânsito gastrintestinal observado na mucosite intestinal induzida por 5-

FU em camundongos ......................................................................................

3.7. Análise estatística ............................................................................................

42

42

43

43

43

46

47

4 RESULTADOS .................................................................................................

4.1. Efeito do tratamento com Saccharomyces boulardii sobre a leucopenia

induzida por 5-FU em camundongos ............................................................

4.2. Efeito do tratamento com SB na variação de peso corporal dos animais

tratados com 5-FU ..........................................................................................

4.3. Efeito do tratamento do SB na análise histopatológica da lesão intestinal

causada por 5-FU em camundongos .............................................................

4.4. SB reduz as alterações intestinais morfométricas induzida por 5-FU em

camundongos ...................................................................................................

4.5. Efeito do tratamento com SB no aumento da atividade de MPO nos

segmentos intestinais induzidas por 5-FU em camundongos ......................

4.6. Efeito do tratamento com SB na diminuição da concentração de GSH

nos segmentos intestinais induzidas por 5-FU em

camundongos....................................................................................................

4.7. Efeito do tratamento com SB no aumento das concentrações de nitrito

48

49

49

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56

57

21

nos segmentos intestinais induzidas por 5-FU em camundongos ...............

4.8. SB reverteu o aumento dos níveis de IL-1β e CXCL1 induzidos por 5-FU

nos segmentos intestinais em camundongos .................................................

4.9. Esvaziamento gástrico de líquidos em camundongos acordados e

tratados com 5-FU ou salina ..........................................................................

4.10. SB reverteu o retardo do esvaziamento e do transito gastrintestinal

associado a mucosite intestinal induzida por 5-FU em

camundongos....................................................................................................

58

59

61

62

5 DISCUSSÃO ...................................................................................................

6 CONCLUSÃO ................................................................................................

7 REFERÊNCIAS ..............................................................................................

8 ANEXO ............................................................................................................

65

74

76

89

22

INTRODUÇÃO

23

1 INTRODUÇÃO

O intestino exerce funções importantes para a saúde do organismo, tais como

digestão e absorção de macro e micronutrientes e produção de importantes hormônios

reguladores. Pode funcionar ainda como órgão imune e agir como barreira contra agentes

nocivos. O intestino é formado por três camadas básicas, a camada epitelial, a lâmina própria

e a camada muscular da mucosa (DUNCAN; GRANT, 2003).

O trato gastrointestinal (TGI) dos mamíferos abriga uma comunidade microbiana

que é extremamente densa e diversa, composta por 1014

unidades formadoras de colônias

(UFCs) de microrganismos, número dez vezes maior que o de células do hospedeiro. Estima-

se que o número de espécies bacterianas do trato gastrintestinal gire em torno de 400, embora

estudos mais recentes indiquem que esse número varia de 500-1000 espécies (MARTINS et

al., 2009). Dentre esses microorganismos que hospedam o trato gastrintestinal a maioria são

microorganismos essenciais para o bom funcionamento do organismo, mas por muitas vezes

pode ocorrer a invasão de alguns microorganismos nocivos. O TGI é um microecossistema

cinético que possibilita o desempenho normal das funções fisiológicas do hospedeiro, a menos

que microrganismos prejudiciais e potencialmente patogênicos dominem. (BIELECKA,

BIEDRZYCKA, MAJKOWSKA, 2002).

Normalmente no TGI no estômago e duodeno encontramos < 103

células

bacterianas por grama de conteúdo estomacal e duodenal, predominantemente os

microorganismos mais encontrados são os lactobacilos e estreptococos e, devido às secreções

ácidas, biliares, e pancreáticas ocorre a supressão da maioria dos microrganismos ingeridos

diariamente. No jejuno e íleo o número de bactérias aumenta progressivamente de 104 células

no jejuno a 107

células por grama de conteúdo no íleo e no intestino grosso encontramos um

ambiente densamente povoado por anaeróbios, 1012

células por grama de conteúdo luminal

(SAAD, 2006).

1.1. Probióticos e o Saccharomyces boulardii

A palavra probiótico, pro (a favor) e bio (vida), foi citada pela primeira vez por

Lilley and Stiwell em 1965 caracterizando substâncias secretadas por um microrganismo, as

quais estimulavam o crescimento de outro. Porém, Metchnikoff no início do século passado já

havia notado efeito benéfico em indivíduos que consumiam iogurte contendo lactobacilos

(FULLER, 1992; VANBELLE et al., 1990). A definição de probiótico tem sofrido alterações

24

conforme os avanços alcançados nas pesquisas. Em 1974 Parker reformulou o conceito de

probióticos como sendo organismos e substâncias que contribuem para o equilíbrio

microbiano intestinal. As bactérias probióticas também foram definidas como bactérias

viáveis, em cultura única ou mista, afetando beneficamente o hospedeiro em razão de

promover a melhora das propriedades da microflora indígena (DONOHUE et al., 1998,

HAVENAAR; VELD, 1992).

A definição atualmente aceita internacionalmente para probióticos é que estes são

microrganismos vivos, que, quando administrados em quantidades adequadas conferem

benefícios à saúde do hospedeiro (FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF

UNITED NATIONS; WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2002; SANDERS, 2003).

A influência benéfica dos probióticos sobre a microbiota intestinal humana inclui

efeitos antagônicos, competição e efeitos imunológicos, resultando em um aumento da

resistência contra patógenos. Assim, a utilização de culturas bacterianas probióticas estimula a

multiplicação de bactérias benéficas, em detrimento à proliferação de bactérias

potencialmente prejudiciais, reforçando os mecanismos naturais de defesa do hospedeiro

(PUUPPONEN-PIMIÄ et al., 2002; SAAD, 2006).

Os probióticos têm sido utilizados em várias situações clínicas e condições

cirúrgicas. Há evidências substanciais de que estas substâncias são amplamente benéficas. Os

mecanismos pelos quais os microorganismos podem exercer efeitos benéficos e proteger

contra a colite, por exemplo, incluem efeitos diretos sobre o local e a estimulação da resposta

imune protetora. De fato, alguns estudos clínicos e experimentais têm mostrado que os

probióticos são benéficos no tratamento da diarreia e colite ulcerativa, por exemplo (SOUZA

et al, 2007).

Os benefícios dos probióticos que mais se destacam são o controle e estabilização

da microbiota intestinal após o uso de antibióticos; promoção da resistência gastrintestinal à

colonização por patógenos; diminuição da população de patógenos através da produção de

ácido acético e lático, de bacteriocinas e de outros compostos antimicrobianos; promoção da

digestão de lactose em indivíduos intolerantes à lactose; estimulação do sistema imune; alívio

da constipação; aumento da absorção de minerais e produção de vitaminas. Embora ainda não

comprovados, outros efeitos atribuídos a essas culturas são a diminuição do risco de câncer de

cólon e de doença cardiovascular. São sugeridos também a diminuição das concentrações

plasmáticas de colesterol, efeitos anti-hipertensivos, redução da atividade ulcerativa de

Helicobacter pylori, controle da colite induzida por rotavírus e por Clostridium difficile,

prevenção de infecções urogenitais, além de efeitos inibitórios sobre a mutagenicidade

(SHAH, LANKAPUTHRA, 1997; CHARTERIS et al., 1998; JELEN, LUTZ, 1998;

25

KLAENHAMMER, 2001; KAUR, CHOPRA, SAINI, 2002; TUOHY et al., 2003; SAAD,

2006).

Os conhecimentos sobre os efeitos potenciais dos probióticos no tratamento de

enfermidades intestinais de diferentes origens, embora ampliados e fundamentados em vasta

literatura médica, ainda são pouco difundidos e muitos médicos de diferentes especialidades

não se aprofundaram ou mesmo desconhecem tais aspectos.

A aceitação dos probióticos como uma modalidade terapêutica aumentou

dramaticamente e a frequência de artigos de revisão e de ensaios clínicos randomizados tem

mantido o interesse global nesse inovador método de terapia. Inúmeras cepas probióticas

foram investigadas quanto à eficácia clínica, incluindo várias cepas de bactérias lactobacilos,

bifidobactérias, estreptococos, Clostridium e linhagens dos fungos Saccharomyces boulardii,

S. cerevisiae, e Monascus purpureus (MCFARLAND LV, 2009; CZERUCKA D et al, 2007;

ELMER GW et al, 1996).

Saccharomyces boulardii (SB) foi descoberto por um francês microbiologista,

Henri Boulard em 1920 quando estava na Indochina à procura de novas estirpes de leveduras

que poderiam ser utilizadas em processos de fermentação. Ele observou que durante um surto

de cólera algumas pessoas que não desenvolveram a doença beberam um chá especial, de uma

fruta tropical (lychees, mangosteens). Ele conseguiu isolar o agente responsável, uma

linhagem especial de levedura que nomeou de "Saccharomyces boulardii" (ELMER et al.,

1996; KLEIN et al., 1993).

Atualmente o SB é uma espécie termotolerante do gênero Saccharomyces, a qual

é comumente utilizada em diversos alimentos processados incluindo pães e bebidas

fermentadas. Além disso, é também frequentemente prescrito, sendo utilizado na forma

liofilizada, como agente bioterapêutico (ELMER et al., 1996; KLEIN et al., 1993).

Segundo JESPERSEN (2003), as leveduras do gênero Saccharomyces têm

demonstrado efeito probiótico. Em experimentos clínicos estas mostraram ser efetivas contra

gastroenterites agudas infantis e diarréia seguida de tratamento com antibióticos e apresentar

efeito inibitório sobre Candida albicans, Salmonella typhimurium, Shigella flexneri e

Clostridium difficile, bem como modular o sistema imune estimulando a produção de IgA e o

sistema de fagocitose em camundogos (RODRIGUES et al., 2000).

Desde 1982, ano da primeira publicação, muitos estudos têm sido realizados com

o intuito de esclarecer o mecanismo de ação de probióticos compostos por SB e, assim,

melhor avaliar suas propriedades benéficas para o hospedeiro humano (SURAWICZ et al.,

1989).

26

A levedura de SB (FIGURA 1) é utilizada em muitos países tanto como agente

profilático quanto como agente terapêutico das diarreias e outras variações das doenças

gastrintestinais, como as causadas pela administração de agentes antimicrobianos.

O SB apresenta propriedades que o levam a ser considerado um agente probiótico,

como: (i) sobrevivência no trânsito do trato gastrintestinal (ii) crescimento ótimo a 37ºC tanto

in vivo quanto in vitro e (iii) capacidade de inibir um número considerável de agentes

patogênicos (CZERUCKA et al., 2007).

FIGURA 1 - Micrografia eletrônica do Saccharomyces boulardii (Dr. Sandy Smith, Dept

de Ciência dos Alimentos da Universidade de Guelph, Canadá).

Embora o exato mecanismo através do qual SB atua ainda não esteja

completamente esclarecido, diversos mecanismos possíveis têm sido propostos (FIGURA 2),

que podem ser classificados em três áreas principais: a ação na luz, ação trófica e efeitos

antiinflamatórios (ELMER GW, 2007; BOIRIVANT M, STROBER W, 2007;

POTHOULAKIS C, 2009; NG SC et al, 2009). Esses mecanismos incluem: a inibição da

adesão celular pelos enteropatógenos (GOPAL et al., 2001), a manutenção da integridade da

mucosa intestinal, como as junções de cadeias fechadas íntegras (RODRIGUES et al., 1996),

a neutralização dos fatores de virulência bacterianos (CZERUCKA et al., 2001) e o aumento

da resposta imune na mucosa intestinal (BRANDAO et al., 1998).

27

FIGURA 2 - Diferentes mecanismos de ação do Saccharomyces boulardii (SB) no trato

intestinal (McFarland, 2010).

A dose de ataque de SB é um fator importante no tratamento. Vale ressaltar que

para a efetividade dos diferentes mecanismos de ação do SB, quantidades significativas desse

microrganismo viável devem estar presentes nas doses administradas para a potencialização

dos efeitos benéficos. Considera-se que esse microrganismo poderá agir no ecossistema

somente quando sua população apresentar concentrações iguais ou superiores a 107 células

viáveis/g do conteúdo e a manutenção da atividade metabólica. Portanto, na preparação inicial

comercializada, deve-se contabilizar a concentração de células viáveis que atinja os valores

citados quando no conteúdo intestinal. Dessa forma, estima-se que a concentração de células

viáveis na composição de produtos probióticos deve ser superior a 108 a 10

9 UFC/g,

especialmente devido aos possíveis efeitos gástricos e duodenais (MARTINS et al., 2005).

No Brasil a Agência Nacional de Vigilância Sanitária licenciou uma apresentação

de Saccharomyces boulardii que possibilita a utilização de doses mais elevadas na fase inicial

da gastrenterite (três cápsulas de 250 mg) no primeiro dia, seguidos de uma posologia mais

baixa nos dias subsequentes (duas cápsulas de 200 mg no segundo dia e uma cápsula de 200

mg no terceiro dia). Vale ressaltar que vários trabalhos comprovam a eficácia e segurança de

28

doses aumentadas de SB no tratamento da diarreia aguda de diferentes etiologias (HTWE et

al., 2008, SZAJEWSKA et al., 2007, VILLARRUEL et al., 2007, HAFEEZ et al., 2002).

SB quando administrado por via oral, atinge concentrações de estado estacionário

no prazo de três dias e é eliminado de 3-5 dias após sua suspensão (GRAFF S et al, 2008;

ELMER GW et al, 1999).

SB foi testado quanto a sua eficácia clínica em diversos tipos de doenças crônicas,

incluindo doença de Crohn, síndrome do intestino irritável, giardíase e vírus da

imunodeficiência humana (HIV) relacionadas com a diarréia e mucosite intestinal (SAAD,

2006).

1.2. Mucosite intestinal e o 5-Fluorouracil

A mucosite induzida por antineoplásicos é um fator limitante na terapia

anticâncer. Mucosite é um termo clínico utilizado para caracterizar ulcerações da mucosa de

todo o trato digestivo, e sintomas pertinentes (SONIS, 1993). Esse efeito colateral é bastante

comum nos pacientes portadores de câncer submetidos a tratamento com agentes

quimioterápicos diversos, em especial, os antimetabólitos, como por exemplo, o metotrexato e

5-fluorouracil, mas também com outros agentes como cisplatina, doxorubicina, ifosfamida,

etc. Tem sido descrito incidência de mucosite de aproximadamente 40% associada ao uso de

vários agentes quimioterápicos (CABALLERO et al., 1985; BALIS et al, 1985; ROTH et al.,

1991; BISHOP et al., 1986), além de ser bastante comum em pacientes submetidos à

radioterapia abdominal (ALTMANN, 1974). Vários estudos demonstram a incidência de

mucosite como efeito colateral do 5-FU em aproximadamente 8 a 89% dos casos de câncer

retal (MINSKY et al., 1993; LEVI et al., 1994; ROSSO et al., 1994), 15 a 40% dos

indivíduos com câncer gástrico (LACAVE et al.,1991).

Dentro das abordagens para o tratamento do câncer, a quimioterapia pode ser

utilizada como uma terapia propriamente dita ou como adjuvante de outras formas de

tratamento (DALE, 2008).

Os agentes antineoplásicos são, em sua maioria, antiproliferativos, pois danificam

o DNA e, portanto, desencadeiam o processo de apoptose. Além disso, afetam rapidamente as

células normais em rápida divisão e, por conseguinte, tendem a deprimir a medula óssea, a

comprometer a cicatrização, deprimir o crescimento, causar esterilidade, queda dos cabelos e

teratogenicidade (DALE, 2008).

29

O 5-Fluorouracil, foi selecionado para este estudo, sobretudo pelos efeitos

colaterais causados nas células do trato-gastrintestinal e por ser utilizado no tratamento de

vários tipos de câncer. É uma droga antimetabólica da classe das fluoropirimidinas e que foi

desenvolvida a partir da década de 50, com o objetivo de inibir processos essenciais para as

células como a incorporação de moléculas de DNA e/ou RNA, processo essencial para síntese

e metabolismo de novas células. (RUTMAN, et al., 1954). É um análogo da uracila

adicionado a uma molécula de flúor na posição C-5 (FIGURA 3). No meio intracelular, é

convertido em vários metabólitos: fluorodioxuridina monofosfato (FdUMP),

fluorodioxuridina trifosfato (FdUTP) e fluorouridina trifosfato (FUTP). Esses são metabólitos

ativos que interferem na síntese de RNA e na ação da TS.

FIGURA 3 - Estrutura química do 5-Fluorouracil (LONGLEY; HARKIN; JOHNSTON,

2003).

O mecanismo de citotoxicidade atribuído ao 5-FU está na sua capacidade de

incorporar fluoronucleotídeo na molécula de DNA e/ou RNA bem como pela inibição da

enzima timidilato sintase (TS), essa enzima é importante no processo de fornecimento de

grupos timidilatos para o reparo e síntese de DNA (LONGLEY et al., 2003) (FIGURA 4).

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=12724731&ordinalpos=18&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVDocSum



30

FIGURA 4 - Metabolismo hepático do 5-Fluorouracil

5-FU é utilizado para o tratamento de vários tipos de câncer, incluindo o câncer de

mama e o coloretal, sendo de maior impacto nesse último tipo. Seus efeitos adversos variam

consideravelmente de acordo com o tratamento, dose utilizada e via de administração e são

mais evidentes em células com grande índice de mitoses, como tecidos de rápida proliferação.

Na medula óssea resulta em granulocitopenia e trombocitopenia, no trato gastrintestinal

resulta em mucosite oral, mucosite intestinal, faringite, esofagite, gastrite, colite, entre outros

(KOENIG; PATEL, 1970). Alopecia, dermatite, cardiotoxicidade e mais raramente,

neurotoxicidade também são efeitos tóxicos observados na utilização do 5-FU (PIRZADA et

al., 2000).

Porém, a ação desse quimioterápico não se limita somente às células neoplásicas,

com isso, essas drogas podem atuar em células normais tendo como resultado importantes

efeitos colaterais que em determinadas situações podem determinar desde a redução do

esquema terapêutico como a sua total interrupção, assim, podendo trazer grande prejuízo na

eficácia do tratamento oncológico.

31

1.2.1. Papel das citocinas na mucosite intestinal

Os quimioterápicos promovem a liberação de citocinas (TNF-α e IL-1β) do

epitélio e dos tecidos conectivos na primeira fase da inflamação (SONIS, 1998). Citocinas

como o fator de necrose tumoral (TNF-) e interleucina 1β (IL-1β) podem iniciar uma

resposta inflamatória que resulta em aumento da vascularização sub epitelial (PICO et al.,

1998). Uma quimiocina produzida e liberada por macrófagos e células epiteliais, tem sido

implicada na ativação de neutrófilos, monócitos, basófilos e linfócitos T por meio de sua

ligação com o receptor CXCR2, a CXCL1 (TRAVES SL et al., 2004).

1.2.2. Aspectos funcionais da mucosite intestinal

Pacientes sob terapia antineoplásica podem sofrer de outros sintomas, como

dispepsia, disfagia e diarréia que não são controlados por drogas antieméticas (RIEZZO et al.,

2005). O conjunto desses sintomas foi denominado de síndrome dispéptica associada à

quimioterapia do câncer (CADS). Recentemente, pesquisadores sugeriram que a causa dessa

síndrome pode estar associada às anormalidades da motilidade do trato gastrintestinal

(RIEZZO et al., 2001). Essas alterações da motilidade gastrintestinal podem ser provenientes

de eventos inflamatórios. Sendo assim, podemos reforçar a hipótese de que as alterações

funcionais advindas de processos inflamatórios podem estar relacionadas às alterações

estruturais do músculo liso gastrintestinal e/ou alterações neuronais, principalmente do plexo

mioentérico.

Apesar da maioria das pesquisas terem se direcionado à mucosite oral pela

facilidade da observação das lesões e dos resultados dos tratamentos, a mucosite intestinal

destaca-se pelos seus importantes sinais e sintomas tais como náuseas, vômitos, dores

abdominais e diarréia.

Recentemente, demonstrou-se que a mucosite intestinal induzida por 5-FU em

ratos está relacionada a alterações motoras (retardo no esvaziamento gástrico e

hipercontratilidade na musculatura lisa do estômago e duodeno) que ocorrem tanto na fase

inflamatória, como na pós-inflamatória dessa patologia (SOARES et al., 2008).

32

1.2.3. Mucosite por antineoplásicos e a contribuição do LAFICA.

Nosso grupo de pesquisa vem há vários anos dedicando-se ao estudo dos

mecanismos e mediadores envolvidos nos efeitos colaterais da quimioterapia do câncer, como

a mucosite intestinal. Nesse contexto, desde 2004 temos sugerido que o TNF-α teria um

importante papel na fisiopatologia da mucosite oral por 5- FU. Em modelos de mucosite

induzida por 5-FU em Hamster, demonstramos que a pentoxifilina (PTX) e a talidomida

(TLD) foram capazes de inibir a lesão macroscópica e microscópica, bem como o aumento da

atividade de mieloperoxidase (MPO), observada nos animais tratados com 5- FU (LIMA et

al., 2005). De forma inédita, demonstramos o papel relevante do óxido nítrico na gênese da

mucosite oral por 5-FU através da observação de que inibidores seletivos da óxido nítrico

sintase induzível (iNOS / 1400W e aminoguanidina) reduziram a lesão macroscópica e

microscópica, bem como a infiltração de neutrófilos medida pela atividade de MPO na

bochecha de hamster com mucosite oral por 5- FU, além de se demonstrar a expressão da

iNOS por imunohistoquímica e western blot (LEITÃO et al., 2007).

Demonstramos também que a atorvastatina (ATV) reduziu, significativamente, as

lesões macroscópicas e microscópicas induzidas pelo 5-FU na mucosa oral de hamsters. Os

efeitos macroscópicos de proteção foram associados com a redução da produção de TNF-α e

IL-1β, diminuição da infiltração de neutrófilos demonstrado pela análise histopatológica e da

atividade da MPO. Além disso, a ATV reduziu o estresse oxidativo induzido (MEDEIROS et

al., 2010).

Em relação à mucosite intestinal por antineoplásicos, demonstramos que o

tratamento com metotrexato em ratos induz uma importante atrofia de vilos com aumento das

criptas, no duodeno, jejuno e íleo. Observamos ainda, que o metotrexato foi capaz de

aumentar a secreção de sódio e potássio medido pela modelo de perfusão intestinal, bem

como reduziu a área absortiva medida pela razão de excreção do manitol (CARNEIRO-

FILHO et al., 2004). Mais recentemente, observamos que o tratamento com irinotecano

(CPT-11) em camundongos causou uma significativa diarréia nos animais, com diminuição

dos vilos intestinais e perda da arquitetura das criptas. Observamos ainda um aumento na

concentração intestinal de TNF- α, IL-1β e CXCL1. Demonstramos também que a mucosite

intestinal induzida por 5-FU em ratos está associada a alterações na motilidade digestiva que

persistem mesmo com a resolução do processo inflamatório (SOARES et al., 2008).

Demostramos que o TNF-α, IL-1β e CXCL1 são importantes mediadores na patogênese da

mucosite intestinal e que a pentoxifilina (PTX) e a talidomida (TLD) mostraram um efeito

protetor nas estruturas intestinais. No entanto, apenas a PTX reduziu a severidade da diarréia

33

induzida por CPT-11. Este resultado pode ser explicado pelo fato da TLD ser mais seletiva na

inibição do TNF- α (MELO et al.; 2007).

Mais recentemente, SOARES et al.; 2010, demonstrou pela primeira vez o papel

do fator de ativação plaquetária (PAF) na patogênese da mucosite intestinal induzida por 5-

FU usando ratos PAFR / - e com a inibição farmacológica do receptor de PAF, com

BN52021. Nós demonstramos que os ratos PAFR / - foram protegidos contra os danos

causados pelo tratamento com 5-FU na microscopia intestinal.

34

OBJETIVOS

35

2 OBJETIVOS

2.1. OBJETIVO GERAL

Avaliar o efeito do tratamento com Saccharomyces boulardii na resposta inflamatória

e nas alterações funcionais no curso da mucosite intestinal induzida por 5-FU em

camundongos.

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Demonstrar que o tratamento com Saccharomyces boulardii reverte as alterações

inflamatórias (alterações histopatológicas, morfometria, atividade de MPO, dosagens

de GSH, nitrito e citocinas IL-1 β, CXCL-1) no curso da mucosite intestinal induzida

por 5-FU em camundongos.

Demonstrar que o tratamento com Saccharomyces boulardii reverte as alterações de

esvaziamento gástrico e trânsito gastrintestinal presentes no curso da mucosite

intestinal induzida por 5-FU.

36

MATERIAIS E MÉTODOS

37

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Animais

Foram utilizados camundongos Swiss adultos, machos pesando entre 25-30g,

provenientes do Biotério Setorial do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da

Universidade Federal do Ceará. Os animais foram acondicionados em caixas de

polipropileno, à temperatura ambiente, com ciclos de claro/escuro de 12 em 12h, recebendo

ração padrão (Purina Chow) e água “ad libitum”. Os animais foram colocados em jejum de

sólidos 18 horas antes da realização dos experimentos.

Os protocolos experimentais utilizados neste trabalho foram realizados de acordo

com as diretrizes aprovadas pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal (CEPA), do

Departamento de Fisiologia e Farmacologia da UFC (Protocolo nº 34/10). Todos os esforços

foram realizados no sentido de reduzir o número de animais, a dor, o sofrimento e o estresse

dos mesmos.

3.2. Materiais Utilizados

3.2.1. Fármacos e diluentes

No quadro 1 estão relacionados os principais fármacos e reagentes utilizados

para a realização dos protocolos.

QUADRO 1 – Fármacos e diluentes usados no experimento

Fármacos/Reagentes Fabricante

5-Fluorouracil (5-FU) Eurofarma

Ácido Tricloroacético 20% (TCA) Vetec

Ácido Sulfúrico PA Reagen

Ácido tricloroacético 50% Vetec

Água destilada Milliq

Brometo de hexadecitrimetilamônico 0,5% (HTAB) Vetec

38

Cloreto de Potássio (KCL) 1,15% Vetec

Dianisidine -

DTNB 0,01M Fluka

EDTA 0,02M Dinâmica

Éter etílico Dinâmina

NADPH -

Nitrato Redutase -

Peróxido de Hidrogênio Merck-Brasil

Saccharomyces boulardii (Floratil ®) Merck , Brasil

Salina (NaCl 0,9%) Fresenius, Brasil

Solução glicosada 5% Synth

Solução de Griess -

Solução de NaOH 0,1N e 0,5N Synth

Tampão fosfato de potássio Synth

Tampão PBS com anti-proteases Synth

Tampão TRIS 0,4M pH 8.9 Vetec

Tribromo etanol 25% Sigma Aldrich

Vermelho de fenol 0,75mg/ml Vetec

3.2.2 Equipamentos e instrumentos laboratoriais

QUADRO 2 – Equipamentos e instrumentos laboratoriais utilizados nos experimentos

Equipamentos/instrumentos laboratoriais Fabricante

Balança analítica Sartarius

Centrífuga 5804R Eppendorf

ELISA ELX 800 Biotex

Espectrofotômetro Spectronic 20 Genesys

39

Homogeneizador de tecidos Ultra-turrax T8 Ika

Material cirúrgico -

Micropipetas de 20, 100, 200 e 1000μl Gilson

Microscópio binocular Alphaphot2 VS2 Nikon

Micrótomo Olympus

Placa de 96 poços TPP

Ponteiras para pipetas automáticas Gilson

Seringas B-D Plastipak

3.3. Protocolo experimental

3.3.1. Modelo de mucosite intestinal induzida por 5-FU e tratamento com Saccharomyces

boulardii

Como o esquema mostrado na figura 5, os camundongos foram divididos

aleatoriamente em quatro grupos (n= 6-8, por grupo) e foram tratados durante 3 e 6 dias (d1-

d6) com Saccharomyces boulardii (800 mg/kg). O grupo pré-tratado (6D) recebeu durante 6

dias (d1-d6) Saccharomyces boulardii (800 mg/kg), no d4 todos os animais foram tratados

com uma dose única intraperitoneal de 5-FU (450 mg/kg) e outro grupo, pós-tratado (3D),

recebeu as doses de Saccharomyces boulardii (800mg/Kg) somente nos 3 dias após a

administração do 5-FU (d4-d6) e no 7º dia experimental (d7), todos os animais foram

anestesiados com éter, amostras de sangue periférico foram coletadas diretamente do globo

ocular para a contagem total de leucócitos plasmáticos. Posteriormente, todos os

camundongos foram sacrificados por deslocamento cervical, e fragmentos de jejuno e íleo

foram retirados para análise morfológica e histopatológica. Em seguida, segmentos do

intestino delgado foram retirados e congelados no freezer à -70ºC para posterior dosagem da

atividade da enzima mieloperoxidase (MPO), da concentração de grupos sulfidrílicos (GSH),

dosagem de nitrito e das citocinas IL-1β e CXCL-1. (SOARES et al., 2008).

40

FIGURA 5 – Modelo experimental (parâmetros inflamatórios)

3.4. Parâmetros avaliados

3.4.1. Análise Ponderal

Os animais foram pesados diariamente durante todo o período experimental. Os

valores encontrados foram expressos em variável de peso, em relação ao peso inicial.

3.4.2. Leucograma

O número total de leucócitos plasmáticos foi determinado depois da diluição com

solução de Turk (Acido acético 2%, Violeta Genciana 0,2%). A contagem dos leucócitos

plasmáticos foi realizada com o auxílio da câmara de Newbauer juntamente com o uso de

microscópio ótico (100X). Os resultados foram expressos como número total de leucócitos

contados nos quatro campos da câmara de Newbauer e posteriormente multiplicados pelo

fator de correção da câmara. Por fim, os valores foram expressos como n°células/mm3

(SOARES et al., 2008).

41

3.4.3. Análise morfométrica e histopatológica

Os segmentos obtidos do jejuno e íleo foram fixados em formol a 10%.

Decorridas 24 horas, os fragmentos foram retirados do formol e colocados em álcool 70% e

posteriormente parafinizados. A seguir, foram realizados cortes histológicos de 5 m de

espessura e fixados em hematoxilina e eosina. Posteriormente, com o auxílio de um

microscópio ótico acoplado ao sistema de aquisição de imagens (LEICA), foram medidas as

alturas de 10 vilos e as profundidades de 10 criptas de cada lâmina para cálculo da razão

vilo/cripta. Em seguida, utilizando o sistema de escores de Macpherson e Pfeiffer (1978), um

histopatologista (PMGS) que não conhecia os tratamentos realizados analisou todas as

lâminas (TABELA 2).

TABELA 1 - Sistema de escores de Macpherson e Pfeiffer

Escores Achados Microscópicos

0

Achados histológicos normais.

1

Mucosa: vilos encurtados, perda da arquitetura das criptas, infiltrado de

células inflamatórias, vacuolização e edema.

Muscular: normal.

2

Mucosa: vilos encurtados com células vacuolizadas, necrose das criptas,

intenso infiltrado de células inflamatórias, vacuolização e edema.

Muscular: Normal.

3

Mucosa: vilos encurtados com células vacuolizadas, necrose das criptas,

intenso infiltrado inflamatório, vacuolização e edema.

Muscular: edema, vacuolização e infiltrado neutrofílico.

42

3.4.4. Ensaio para mieloperoxidase (MPO)

Mieloperoxidase (MPO) é uma enzima presente predominantemente nos grânulos

azurófilos dos neutrófilos e tem sido utilizada como um marcador quantitativo da infiltração

de neutrófilos nos processos inflamatórios em vários tecidos, entre eles o trato gastrintestinal.

Resumidamente, 50 a 100 mg dos segmentos intestinais (jejuno e íleo) foram colocados num

tampão fosfato de potássio com 0,5% de brometo de hexadecitrimetilamônio (pH 6,0; 50 mg

de tecido por ml) e posteriormente homogeneizados em um macerador de tecidos (Politron®).

A seguir, o homegenato foi centrifugado a 5000 rpm por 2 minutos. A atividade da MPO por

mg de tecido foi aferida através da técnica descrita utilizando 0,0005% de peróxido de

nitrogênio como substrato para a MPO. A unidade da atividade de MPO foi definida como

aquela capaz de converter 1 mmol de peróxido de nitrogênio em água em 1 minuto

(BRADLEY et al., 1982).

3.4.5. Determinação de Glutationa (GSH)

A concentração de GSH nos segmentos intestinais (jejuno e íleo) foi avaliada

utilizando o ensaio para determinação de grupos sulfidrílicos não protéicos (NP-SH)

(SEDLAK; LINDSAY, 1968). As amostras obtidas dos segmentos intestinais (100mg/ml)

foram homogeneizadas em 0,02 M EDTA. Alíquotas de 400 μl do homogenato foram

misturadas com 320 μl de H2O destilada e 80 μl de ácido tricloroacético a 50% para

precipitação das proteínas. Depois dessa etapa o material foi centrifugado por 15 min em

rotação de 3000 rpm à uma temperatura de 4ºC. Em seguida, novas alíquotas de 400 μl do

sobrenadante foram misturadas com 800 μl de tampão TRIS com concentração de 0,4 M, pH

8.9 e com 20 μl 5,5-dithiobis-2-nitro-benzoic acid (DTNB, Fluka) e agitadas por 3 min. A

absorbância foi então determinada a 412 nm contra um reagente branco (sem o homogenato).

A concentração de GSH foi expressa por μg/mg de tecido a partir de uma curva padrão

(SEDLAK; LINDSAY, 1968) .

43

3.4.6. Dosagem de IL-1β e CXCL-1

A concentração de IL-1β e CXCL-1 foram determinadas nos fragmentos do jejuno

e íleo congelados no freezer à -70ºC. Estes foram homogeneizados em solução tampão de

PBS com anti – proteases, a amostra foi centrifugada por 10 min em 3000 rpm e o

sobrenadante foi imediatamente coletado para dosagem de IL-1β e CXCL-1. A detecção das

concentrações dessas citocinas foi realizada por ELISA espécie - específica, conforme

orientação do fabricante (R&D system). Os resultados foram expressos em pg/ml a partir de

uma curva padrão fornecida pelo fabricante.

3.4.7. Dosagem de Nitrito

A dosagem de nitrito foi determinada nos fragmentos do jejuno e íleo congelados

no freezer à -70ºC e, foi obtida, sendo um indicador da produção de óxido nítrico, através da

determinação do conteúdo total de nitrito/nitrato (NO2- / NO3

-) no intestino através da

concentração total nas amostras, determinada espectrofotometricamente pela reação de Griess.

3.5. Esvaziamento gástrico e trânsito gastrintestinal na mucosite intestinal induzida por

5-FU em camundongos

Inicialmente, camundongos (n= 6-8 por grupo) foram tratados com a dose única

de 450 mg/kg de 5-FU (i.p.) ou salina. Do 6º para o 7º dia experimental, foram mantidos em

jejum de sólidos por 18 horas, mas com livre acesso a água até momentos antes do início do

experimento. Cada animal recebeu, por gavagem, 300 µL da solução glicosada (5%) contendo

vermelho de fenol (0,75 mg/ml), com um intervalo de 5 minutos de um animal para o outro.

Após 10, 20 ou 30 minutos da administração do corante, os animais foram sacrificados por

deslocamento cervical e submetidos a uma laparotomia mediana. Para tanto, foi aberto o

abdômen por uma incisão mediana na parede abdominal desde o apêndice xifóide. A seguir as

junções esôfago- gástrica, gastroduodenal e íleo- cólica foram rapidamente isolados e o

estômago e o intestino delgado foram retirados, estendidos e divididos em quatro segmentos

consecutivos: Estômago, Intestino proximal (40%), medial (30%) e distal (30%). Com o

auxílio de uma proveta contendo uma solução de NaOH (100ml, 0,1N) os volumes de cada

segmentos foram determinados. Depois de medir o volume, os segmentos foram

44

homogeneizados em uma solução de NaOH 0,1N com o auxílio de um misturador por 30 s.

Após 20 minutos da homogeneização foram retirados 1000 µL de cada amostra e levado para

centrifugação por 10 min a 2800 rpm. Foram retirados 500 µL do sobrenadante e a este

adicionado ácido tricloroacético (TCA) (20% peso/volume) e centrifugado novamente por 20

min com a finalidade de obter a precipitação de proteínas. Por fim, uma placa de 96 poços foi

montada com 150 μl da amostra e 200μl de NaOH (0,5 N), a placa foi lida numa leitora de

ELISA sob um comprimento de onda de 540 nm. Uma curva padrão foi obtida em cada

experimento a partir de uma concentração conhecida de vermelho fenol após a adição da

solução de NaOH (0,5 N). O coeficiente linear da curva padrão foi estabelecido e utilizado

para determinação da concentração do corante (C) da solução e em seguida foi calculada a

quantidade de vermelho fenol recuperada em cada segmento (FIGURA 6).

A retenção gástrica do vermelho fenol foi expressa em porcentagem, de acordo

com a seguinte fórmula: Retenção gástrica= Quantidade de vermelho fenol recuperada do

estômago/ Quantidade total de vermelho fenol recuperada em todos os quatro segmentos

(estômago, intestino proximal, intestino medial e intestino distal).

O trânsito gastrintestinal da refeição foi estimado de acordo com o método do

centro geométrico (MILLER et al., 1981). De acordo com este princípio, obtivemos o produto

da retenção fracional de cada segmento (estômago, intestino proximal, intestino medial,

intestino distal) pelo dígito identificador de cada segmento: (1, 2, 3, 4, respectivamente). A

somatória desses valores indica o centro geométrico da refeição com o corante propelida ao

longo do intestino, aos moldes do centro de massa dos objetos (Trânsito gastrintestinal= 1 x

Estômago+ 2 x Proximal+ 3 x Medial + 4 x Distal), (FIGURA 7).

45

FIGURA 6 – Modelo experimental (parâmetros funcionais). Os animais foram tratados

por gavagem com SB (800mg/Kg) ou salina durante seis dias (d1-d6; SB 6D) ou três dias (d4-

d6; SB 3D), no quarto dia (d4) todos os animais receberam dose única, intraperitonial, de 5-

FU (450mg/Kg). Todos os animais ficaram em jejum de 18h. No dia do experimento (d7), os

animais receberam por gavagem 0,3 ml de solução glicosada (5%) contendo vermelho de

fenol a 0,75 mg/ml.

46

FIGURA 7 - Representação esquemática do centro geométrico de uma refeição teste. O

produto da retenção fracional de cada segmento (estômago, intestino proximal, intestino

medial, intestino distal) é obtido pelo dígito identificador de cada segmento: (1, 2, 3, 4,

respectivamente). A somatória desses valores indica o centro geométrico da refeição com o

corante propelida ao longo do intestino, aos moldes do centro de massa dos objetos (Trânsito

gastrintestinal = 1 x Estômago+ 2 x Proximal+ 3 x Medial + 4 x Distal)

3.6. Efeito do tratamento com Saccharomyces boulardii no retarde do esvaziamento

gástrico e trânsito gastrintestinal observado na mucosite intestinal induzida por 5-FU

em camundongos

Os camundongos foram divididos aleatoriamente em quatro grupos (n= 6-8, por

grupo) e foram tratados durante 3 e 6 dias com Saccharomyces boulardii (800 mg/kg). O

grupo pré-tratado (6D) recebeu durante 3 dias Saccharomyces boulardii (800 mg/kg) antes e

após receber a dosagem de 5-FU, totalizando 6 dias de tratamento com o Saccharomyces

boulardii. No 4º dia, todos os animais foram tratados com uma dose única intraperitoneal de

5-FU (450 mg/kg). O grupo pós-tratado (3D) recebeu as doses de Saccharomyces boulardii

(800mg/Kg) somente nos 3 dias após a administração do 5-FU. No 7º dia experimental, o

esvaziamento gástrico e o trânsito intestinal foram avaliados conforme descrito no item

anterior.

47

3.7. Análise estatística.

Os resultados foram expressos como média ± EPM (variáveis com distribuição

normal) ou como mediana ± mínimo e máximo (variáveis sem distribuição normal). A análise

estatística foi feita usando o teste de análise de variância ANOVA seguido do teste de

Bonferroni. Os escores histológicos foram avaliados pelo teste não paramétrico de Kruskal-

Wallis seguido pelo teste de múltiplas comparações de Dunns. Significância estatística foi

observada para valores de p<0,05. Para realização dos testes estatísticos foi utlizado o

software Prism versão 5 da GraphPad Software.

48

RESULTADOS

49

4 RESULTADOS

4.1. Efeito do tratamento com SB sobre a leucopenia induzida por 5-FU em

camundongos

O 5-FU induziu uma significativa leucopenia nos animais quando comparados

com os do grupo controle (salina). Os tratamentos com SB não modificaram

significativamente a leucopenia causada pelo 5-FU (Tabela 2).

TABELA 2 – SB não alteram a leucopenia induzida por 5-FU.

Os

val

ores representam a média ± E.P.M. * p <0,05 quando comparado ao grupo controle (salina).

ANOVA e teste de Bonferroni.

4.2. Efeito do tratamento com SB na variação de peso corporal dos animais tratados com

5-FU

A variação de peso corporal dos camundongos já se mostrou significante no

primeiro dia após a administração do 5-FU, houve perda de massa corporal nos animais

tratados somente com 5-FU (4,24 ± 0,64%) quando comparados ao grupo controle que

ganhou massa corporal (3,62 ± 3,70%) em relação ao peso inicial. Os animais tratados com

SB (3D e 6D) tiveram uma perda de peso significantemente reduzida em relação ao grupo

tratado somente com 5-FU (5-FU + 3D: 2,51 ± 0,46% e 5-FU + 6D: 2,57 ± 0,86%).

Observou-se ganho de peso corporal no grupo controle durante todo o período

experimental, sendo o ganho máximo no último dia do experimento (8.497±0.48%).

Grupos Experimentais (n=8) nº células/mm3

CONTROLE (salina) 5289,00851,80

5-FU + SALINA 1675,00138,90 *

5-FU + SB 3D 2825,00303,30

5-FU + SB 6D 3100,00341,30

50

O grupo 5-FU teve uma perda de peso de 9.75 ± 0.58% no último dia do

experimento em relação ao primeiro dia. E, os animais dos grupos tratados com SB

apresentaram redução do peso corporal significante com relação ao grupo tratado somente

com 5-FU (SB 3D: 2.70 ± 0.64% e SB 6D: 2.64 ± 0,81%) no último dia de experimento em

relação ao primeiro dia (Figura 8).

1 2 3

-15

-10

-5

0

5

10controle

-

sacha 3D

sacha 6D

*

#

#

Pe

so

do

s a

nim

ais

(g

)

FIGURA 8 – Efeito do tratamento com SB na variação de peso corporal nos grupos do

experimento. Os animais foram tratados com SB (800mg/Kg) durante seis dias (d1-d6; SB

6D) ou três dias (d4-d6; SB 3D), no quarto dia (d4) todos os animais receberam dose única,

intraperitonial, de 5-FU (450mg/Kg). Os animais foram pesados diariamente durante todo o

experimento. Os valores foram expressos como média ± E.P.M. *p<0,05 comparado com o

grupo controle (C), # p<0,05 comparados com o grupo 5- FU + salina, pelo teste ANOVA

seguido de Bonferroni.

4.3. Efeito do SB na análise histopatológica da lesão intestinal causada por 5-FU em

camundongos.

Em relação aos escores histopatológicos foi evidenciado que os animais que

receberam somente salina (controle) apresentaram mucosa e camada muscular normais no

jejuno e íleo. O grupo que recebeu 5-FU + salina apresentou nos dois segmentos estudados as

seguintes características: mucosa com vilos encurtados com células vacuolizadas, necrose das

criptas, intenso infiltrado inflamatório, vacuolização e edema, mas camada muscular normal,

o que conferiu um escore muito mais alto que o do grupo controle. Os grupos que receberam

51

5-FU + SB 3D ou 5-FU + SB 6D apresentaram uma significativa melhora nos escores

microscópicos (Tabela 4).

Nas fotomicrografias (100x), observamos que o tratamento com SB 3D ou SB 6D

reverteram o encurtamento dos vilos e aprofundamentos das criptas induzidos por 5-FU, no

jejuno (Figura 9) e íleo (Figura 10). Observa-se ainda, no aumento de 400x, o intenso

infiltrado inflamatório, vacuolização e edema na mucosa e no tecido muscular devido à

administração do 5-FU, que foram revertidos pelo tratamento com o SB, em ambos os

segmentos (Figura 9 e 10).

TABELA 3: Escores histopatológicos nos segmentos intestinais de camundongos

submetidos à mucosite intestinal induzida por 5-FU e tratados ou não com

Saccharomyces boulardii.

ESCORES HISTOPATOLÓGICOS

GRUPOS EXPERIMENTAIS (n=8) ESCORES

JEJUNO ÍLEO

CONTROLE (SALINA) 0 (0-1) 0 (0-1)

5-FU + SALINA 2,5* (1-3) 2,5* (1-3)

5-FU + SB 3D 1# (0-2) 0

# (0-1)

5-FU + SB 6D 1# (1-2) 1 (1-2)

Os valores representam a media ± E.P.M. *p<0,05 quando comparado ao grupo salina e #

p<0,05 quando comparado ao grupo 5- FU + salina. ANOVA e teste de Bonferroni.

52

FIGURA 9 – Efeito do tratamento com SB nas alterações histopatológicas no jejuno

induzidas por 5-FU em camundongos. (A, C, E, G) - Fotomicrografias (100X) do jejuno de

camundongos tratados com salina (A), 5-FU + salina (C), 5-FU + SB 3D (E), ou 5-FU + SB 6D

(G). Observa-se que os tratamentos com SB 3D (E) ou SB 6D (G) reverteram o encurtamento dos

vilos e aprofundamento das criptas induzidos por 5-FU (C, setas). (B, D, F, H) –Fotomicrografias

(400X) do jejuno de camundongos tratados com salina (B), 5-FU + salina (D), 5-FU + SB 3D (F),

ou 5-FU + SB 6D (H). Observa-se que os tratamentos com SB 3D (F) ou SB 6D (H) reverteram o

intenso infiltrado inflamatório, vacuolização e edema na mucosa e na camada muscular induzidos

por 5-FU (D, cabeça de seta).

A B

C D

E F

G

G

H

53

FIGURA 10 – Efeito do tratamento com SB nas alterações histopatológicas no íleo induzidas

por 5-FU em camundongos. (A, C, E, G) - Fotomicrografias (100X) do íleo de camundongos

tratados com salina (A), 5-FU + salina (C), 5-FU + SB 3D (E), ou 5-FU + SB 6D (G). Observa-se

que os tratamentos com SB 3D (E) ou SB 6D (G) reverteram o encurtamento dos vilos e

aprofundamento das criptas induzidos por 5-FU (C, setas). (B, D, F, H) - Fotomicrografias

(400X) do íleo de camundongos tratados com salina (B), 5-FU + salina (D), 5-FU + SB 3D (F), ou

5-FU + SB 6D (H). Observa-se que os tratamentos com SB 3D (F) ou SB 6D (H) reverteram o

intenso infiltrado inflamatório, vacuolização e edema na mucosa e na camada muscular induzidos

por 5-FU (D, cabeça de seta).

G

G

H

G

F

G

E

G

C

G

D

G

A

G

B

G

54

4.4. SB reduziu as alterações intestinais morfométricas induzida por 5-FU em

camundongos

5-FU induziu uma significativa diminuição na altura dos vilos, como observado

na Figura 11A, causou um aumento na profundidade das criptas (Figura 11B) e uma

diminuição na razão vilo/cripta (Figura 11C), tanto no jejuno como no íleo, quando

comparados ao grupo controle (salina). Em relação à altura dos vilos, o tratamento com SB

reverteram, significativamente, o efeito do 5-FU no jejuno e no íleo.

No painel B da figura 11, observamos que o SB 6D e SB 3D reverteram também o

aumento da profundidade das criptas e a diminuição da relação vilo/cripta (Figura 11C)

induzido pelo 5-FU, em ambos os segmentos analisados.

55

C - 3D 6D C - 3D 6D0

100

200

300

400

500

5-FU 5-FU

Jejuno Íleo

*

*

# #

#

#

A l

t u r

a d

o s

V i

l o s

( µ m

)

C - 3D 6D C - 3D 6D0

50

100

150

200

250

5-FU 5-FU

Jejuno Íleo

* *

##

##

P r

o f u

n d

i d

a d

e d

a s

C r

i p t

a s

( µ

m )

C - 3D 6D C - 3D 6D0

1

2

3

4

5-FU 5-FU

Jejuno Íleo

*

*

# ##

#

A l

t u r

a

V i

l o /

P r

o f

u n

d i d

a d

e

C r

i p

t a (

µ m

)

FIGURA 11 – Efeito do tratamento com SB nas alterações morfométricas nos segmentos

intestinais induzidas por 5-FU em camundongos. Os animais foram tratados com SB

(800mg/Kg) durante seis dias (d1-d6; SB 6D) ou três dias (d4-d6; SB 3D), no quarto dia (d4)

todos os animais receberam dose única, intraperitonial, de 5-FU (450mg/Kg). Todos os animais

foram sacrificados no sétimo dia (d7) do experimento. Segmentos do jejuno e íleo foram obtidos

para a medida da altura dos vilos (painel A), profundidade das criptas (painel B) e razão

vilo/cripta (painel C). Os valores foram expressos como media ± E.P.M. *p<0,05 comparado com

o grupo salina (C), # p<0,05 comparados com o grupo 5- FU + salina, pelo teste ANOVA seguido

de Bonferroni.

A

B

C

56

4.5. Efeito do tratamento com SB no aumento da atividade de MPO nos segmentos

intestinais induzidas por 5-FU em camundongos

Nos animais que receberam somente 5-FU, foi encontrado um importante

aumento do infiltrado neutrofílico especificamente nos segmentos do jejuno (5,87±1,06

UMPO/mg) e do íleo (14,09±2,99 UMPO/mg), com valores 2 e 8 vezes maiores (238,6% e

828,5%), respectivamente, quando comparados aos segmentos dos animais controle (100%)

(jejuno:1,73±0,36 UMPO/mg e íleo:1,51±0,17 UMPO/mg).

Os tratamentos com SB reduziram a infiltração neutrofílica no jejuno (SB 3D:

3,08±0,46 UMPO/mg e SB 6D: 3,26±0,50 UMPO/MG), e também no íleo (SB 3D: 3,67±0,85

UMPO/mg e SB 6D: 4,9±0,97 UMPO/MG), quando comparados aos animais que receberam

somente 5-FU.

C - 3D 6D C - 3D 6D0

5

10

15

20

SB (dias de tratamento)

5-FU


5-FU

Jejuno Ileo

*

*

# ##

#

U d

e M

PO

/ m

g t

ec

ido

FIGURA 12 – Efeito do tratamento com SB no aumento da atividade de MPO nos

segmentos intestinais induzidos por 5-FU em camundongos. Os animais foram tratados

com SB (800mg/Kg) durante seis dias (d1-d6; SB 6D) ou três dias (d4-d6; SB 3D), no quarto

dia (d4) todos os animais receberam dose única, intraperitonial, de 5-FU (450mg/Kg). Todos

os animais foram sacrificados no sétimo dia (d7) do experimento. Segmentos do jejuno e íleo

foram obtidos para a realização do ensaio da atividade de MPO. Os valores foram expressos

como média ± E.P.M. *p<0,05 comparado com o grupo salina (C), # p<0,05 comparados com

o grupo 5- FU + salina, pelo teste ANOVA seguido de Bonferroni.

57

4.6. Efeito do tratamento com SB na diminuição da concentração de GSH nos segmentos

intestinais induzido por 5-FU em camundongos

O tratamento com 5-FU induziu uma significativa redução da concentração de

GSH no jejuno (270,9±38,5 µg/g) e no íleo (46,01±6,3 µg/g), quando comparados com o

controle (jejuno: 477,6±25,2 µg/g e, íleo: 186,8±22,8 µg/g).

O tratamento com SB 3D reverteu o consumo de GSH no jejuno em 52,43%

(521,3±48,53 µg/g) e no íleo em 52,94% (144,9±29,83 µg/g). E, para os animais que

receberam tratamento com SB 6D também observou-se redução no consumo de GSH no

jejuno de 31,98% (423,7±43,89 µg/g) e no íleo de 37,44% (116,0±17,62 µg/g) (Figura 13).

C - 3D 6D C - 3D 6D0

200

400

600

GS

H/g

tecid

o


5-FU


5-FU

Jejuno Ileo

*

*

#

#

##

FIGURA 13 - Efeito do tratamento com SB na diminuição da concentração de GSH nos


com SB (800mg/Kg) ou salina durante seis dias (d1-d6; SB 6D) ou três dias (d4-d6; SB 3D),

no quarto dia (d4) todos os animais receberam dose única, intraperitonial, de 5-FU

(450mg/Kg). Todos os animais foram sacrificados no sétimo dia (d7) do experimento.

Segmentos do jejuno e íleo foram obtidos para aferir a concentração de GSH. Os valores

foram expressos como média ± E.P.M. *p<0,05 comparado com o grupo salina (C), #p<0,05

comparados com o grupo 5- FU + salina, pelo teste ANOVA seguido de Bonferroni.

58

4.7. Efeito do tratamento com SB no aumento das concentrações de NITRITO nos

segmentos intestinais induzidas por 5-FU em camundongos

Na figura 14, observamos que no jejuno e íleo dos animais que receberam

somente 5-FU, houve um aumento significativo das concentrações de nitrito, no jejuno de

86,43±10,93 µM e no íleo de 44,66±5,46 µM, quando comparados ao grupo de animais

controle (jejuno: 37,00±2,39 µM e íleo: 25,08±1,38 µM).

Os tratamentos com SB reduziram as concentrações de nitrito tanto no jejuno (SB

3D: 40,28±9,85 µM e SB 6D: 40,57±9,27 µM), como no íleo (SB 3D: 32,26 ± 5,23 µM e SB

6D: 22,27± 2,90 µM), quando comparados aos animais que receberam somente 5-FU.

C - 3D 6D C - 3D 6D0

50

100

150


5-FU


5-FU

Jejuno Ileo

*

*# #

#

#

Nit

rito

(µ

M)

FIGURA 14 – Efeito do tratamento com SB no aumento dos níveis de nitrito nos





Segmentos do jejuno e íleo foram obtidos para a determinação dos níveis de nitrito. Os

valores foram expressos como média ± E.P.M. *p<0,05 comparado com o grupo salina (C), #

p<0,05 comparados com o grupo 5- FU + salina, pelo teste ANOVA seguido de Bonferroni.

59

4.8. SB reverteu o aumento dos níveis de IL-1β e CXCL1 nos segmentos intestinais

induzidos por 5-FU em camundongos

Nas figuras 15 e 16, observa-se que o 5-FU, no jejuno e íleo, induziu um aumento

na concentração de IL-1β (jejuno: 3405,0±272,1 pg/ml, referente a 81,79% e, no íleo: 2197,0±

249,3 pg/ml, referente a 107,49%) quando comparados ao grupo controle (100%), o mesmo

aumento ocorreu com a CXCL-1 (jejuno: 1443,0±396,8 pg/ml, referente a 507,24% e, no íleo:

1991± 837,5 pg/ml , referente a 288,76%) quando também comparados ao grupo controle

(100%).

Observou-se ainda que os tratamentos com SB diminuíram significativamente, no

jejuno, as concentrações de IL-1β em relação aos tratados somente com 5-FU, nos animais

tratados com SB 3D essa redução foi de 58,59% (2178±295,3 pg/ml) e nos tratados com SB

6D foi de 75,80% (1873±364,5 pg/ml). Mas, na mucosa do íleo essa redução foi bem maior,

para SB 3D de 128,22% (839,3±79,85 pg/ml) e para SB 6D de 126,13% (861,5±117,5 pg/ml).

Com relação às concentrações de CXCL1, observamos também que nos animais

tratados com SB houve uma diminuição significante nas concentrações tanto no jejuno do SB

3D de 541,15% (198,9±151,5 pg/ml) e no SB 6D de 542,22% (195,7±90,58 pg/ml),

respectivamente para SB 3D e SB 6D. Como no íleo, de 315,23% (376,6±107,1 pg/ml) e

333,31% (284,0±74,02 pg/ml), respectivamente para SB 3D e SB 6D.

60

C - 3D 6D C - 3D 6D0

1000

2000

3000

4000


5-FU

Jejuno


5-FU

Íleo

*

*#

#

# #

IL-1

(p

g/m

l)

FIGURA 15 - Efeito do tratamento com SB na diminuição dos níveis de IL-1β nos





Segmentos do jejuno e íleo foram obtidos para a determinação dos níveis de IL-1β. Os valores

foram expressos como média ± E.P.M. *p<0,05 comparado com o grupo salina (C), # p<0,05

comparados com o grupo 5- FU + salina, pelo teste ANOVA seguido de Bonferroni.

61

C - 3D 6D C - 3D 6D0

1000

2000

3000

###

**

SB (dias de tratamento) SB (dias de tratamento)

5-FU 5-FU

Jejuno Íleo

#

CX

CL

1 (

pg

/ml)

FIGURA 16 - Efeito do tratamento com SB na diminuição dos níveis de CXCL1 nos





Segmentos do jejuno e íleo foram obtidos para a determinação dos níveis de CXCL1. Os

valores foram expressos como média ± E.P.M. *p<0,05 comparado com o grupo salina (C), #

p<0,05 comparados com o grupo 5- FU + salina, pelo teste ANOVA seguido de Bonferroni.

4.9. Esvaziamento gástrico de líquidos em camundongos acordados e tratados com 5-FU

ou salina

Na figura 17, observa-se que nos tempos de 10, 20 ou 30 minutos após a refeição,

os animais tratados com 5-FU apresentaram um maior retardo do esvaziamento gástrico,

quando comparado ao controle que recebeu somente salina.

62

0 10 20 300

15

30

45

60

controle

5-fu

Tempo (min)

**

*

R E

T E

N Ç

Ã O

N

O

E S

T Ô

M A

G O

(%

)

FIGURA 17 - Esvaziamento gástrico de líquidos em camundongos acordados e tratados

com 5-FU ou salina (controle). Os animais foram tratados com 5- FU ou salina. Após 3 dias,

receberam gavagem de 0,3 ml da solução glicosada (5%) contendo vermelho de fenol a 0,75

mg/ml. Os resultados mostram a quantidade de vermelho fenol recuperada no estômago, 10,

20 ou 30min depois da gavagem. Os valores foram expressos como porcentagem da atividade

total no trato gastrointestinal. Os valores foram expressos como média ± E.P.M. * p<0.05

comparado ao grupo controle (salina), pelo teste ANOVA seguido de Bonferroni.

4.10. SB reverte o retardo do esvaziamento e do transito gastrintestinal associado a

mucosite intestinal induzida por 5-FU em camundongos

Na figura 18, observa-se que, no tempo de 20min, o 5-FU induziu um

significativo aumento na retenção gástrica (painel A), quando comparado com o controle

(salina). Estes aumento foi revertido com o tratamento com SB 3D ou SB 6D.

O tratamento com SB melhorou o atraso no esvaziamento gástrico (Figura 18A) e

no trânsito gastrintestinal medido pelo centro de massa (Figura 18C).

No que diz respeito à retenção intestinal, observa-se na figura 18B que houve um

aumento da retenção no segmento medial e uma diminuição no segmento distal nos grupos

tratados com SB, tanto 3D como 6D.

63

Controle - 3D 6D

0

20

40

60

80

*

# #


5-FU

A T

I V

I D

A D

E P

E R

M A

N E

C I

D A

N

O E

S T

Ô M

A G

O (%

)

C - 3D 6D C - 3D 6D C - 3D 6D0

25

50

75

100

*

#

# #

*

*

#

#

5-FU 5-FU 5-FU

Proximal Medial Distal

A T

I V

I D

A D

E P

E R

M A

N E

C I D

A

N O

I N

T E

S T

I N

O (%

)

A

B

64

Controle - 3D 6D1

2

3

4

5

*

#

#

5-FU

C E

N T

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I Ç Ã

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FIGURA 18 - Efeito do tratamento com SB no retardo do esvaziamento gástrico, na

atividade permanecida no intestino e no trânsito gastrintestinal induzidos por 5- FU em

camundongos. Os animais foram tratados com SB (800mg/Kg) ou salina durante seis dias

(d1-d6; SB 6D) ou três dias (d4-d6; SB 3D), no quarto dia (d4) todos os animais receberam

dose única, intraperitoneal, de 5-FU (450mg/Kg). Todos os animais ficaram em jejum de 18h.

No dia do experimento, os animais receberam por gavagem de 0,3 ml a solução glicosada

(5%) contendo vermelho de fenol a 0,75 mg/ml. Os resultados mostram a quantidade de

vermelho fenol recuperada no estômago (painel A) e intestino (painel B), 20 min depois da

gavagem e, o centro geométrico da distribuição da refeição (painel C). Os valores foram

expressos como porcentagem da atividade total no trato gastrintestinal. Os valores foram

expressos como média ± E.P.M. * p<0.05 comparado ao grupo salina, pelo teste ANOVA

seguido de Bonferroni.

C

65

DISCUSSÃO

66

5 DISCUSSÃO

O presente estudo demonstrou que o tratamento com o Saccharomyces boulardii

foi capaz de reverter de forma significante todas as alterações causadas pelo 5-FU, o qual,

resultou na indução de uma lesão intestinal apresentando um importante comprometimento da

barreira epitelial funcional com a presença das seguintes alterações: encurtamento acentuado

das vilosidades intestinais, necrose parcial das criptas, achatamento e vacuolização de

enterócitos, com importante redução da relação vilo/cripta, presença de infiltrado mono e

polimorfonucleares, leucopenia, aumento nas concentrações de óxido nítrico (NO) intestinal,

produção de radicais livres com consumo de GSH intestinal, que poderia ser secundário ao

aumento de espécies reativas de oxigênio (ROS), aumento da produção de citocinas pró-

inflamatórias (IL-1β e CXCL1) no jejuno e íleo e, alterações na motilidade digestiva.

Sonis ST (2004) relata que a mucosite é um processo de complexa fisiopatologia e

classifica sua patogênese em cinco fases: iniciação, resposta primária ao dano, amplificação

de sinais, ulceração e cicatrização. A primeira fase é considerada quando a quimioterapia e/ou

radioterapia têm início e agridem tanto as células epiteliais quanto as do tecido conjuntivo por

meio de dano ao DNA e formação de espécies reativas de oxigênio (ROS), o que diminui a

renovação celular, afetando, em especial, epitélio e vasos sanguíneos. Nesta fase a mucosa

apresenta aspecto normal. Na fase II ocorre a ativação dos fatores nucleares de transcrição da

família Kappa-B (NF-kB), que induz mais de 200 genes, entre eles citocinas pró-inflamatórias

como o TNF-α (fator de necrose tumoral), IL1-β (interleucina 1β) e IL6 (interleucina 6), que

estimulam enzimas pró-apoptóticas, bloqueando os mecanismos de crescimento e

diferenciação celular e dando início às injúrias teciduais. A fase III é consequência da

ativação das citocinas pró-inflamatórias (TNF-α e IL 1-β), que causam dano ao epitélio,

endotélio e fibroblastos. Na fase IV ocorre perda de integridade da mucosa, causando lesões.

Na fase V, denominada de cicatrização, as moléculas mensageiras são lançadas direto da

matriz extracelular ao epitélio contíguo à úlcera, induzindo-o à divisão, migração e

diferenciação, a fim de possibilitar a formação de uma mucosa íntegra.

Os antineoplásicos têm efeito direto na atividade proliferativa das células

epiteliais provocando destruição das células de divisão presentes nas criptas, responsáveis

pela renovação epitelial dos vilos (DUNCAN; GRANT, 2003, KEEFE et al., 2000; 2004).

Ocorre também a liberação de vários mediadores inflamatórios, incluindo citocinas pró-

inflamatórias como IL-1β, IL-6, TNF- (SONIS et al., 2000). As citocinas pró-inflamatórias

podem estimular a produção de outras citocinas, de metabólitos do ácido araquidônico e de

67

proteases por macrófagos, neutrófilos, células do músculo liso, fibroblastos e células epiteliais

(SARTOR, 1994).

A mucosite induzida por antineoplásicos provoca a destruição das células

epiteliais e subsequente indução de resposta inflamatória local (SONIS et al., 2004;

RUBEINSTEIN et al., 2004).

Destacou-se a importante participação dos neutrófilos onde foi observado um

aumento importante da atividade da enzima mieloperoxidase. A liberação da enzima

mieloperoxidase dos grânulos azurófilos catalisa a formação de um poderoso ácido oxidante,

o ácido hipocloroso, o que pode levar a danos no DNA, proteínas e lipídeos. Além disso, a

mieloperoxidase pode agir no endotélio vascular promovendo a liberação de mediadores pró-

inflamatórios e expressão de moléculas de adesão, levando ao aumento da permeabilidade

vascular e aumento da adesão de neutrófilos. Após desgranulação, o neutrófilo também libera

várias substâncias como proteínas antimicrobianas, proteases, componentes da resposta

oxidativa, vários receptores de membrana para moléculas de adesão endotelial,

metaloproteinases de matriz (“Matrix Metalloproteinases” - MMPs) e mediadores solúveis da

inflamação (FAURSCHOU & BORREGAARD, 2003).

Nossos dados estão de acordo com a literatura, que demonstra que a injúria

epitelial associada à utilização de quimioterápicos antineoplásicos, geralmente, ocorre com

infiltração de neutrófilos para a mucosa intestinal que configura a fase inflamatória da

mucosite (SONIS et al., 2004) também descrita por Duncan e Grant (2003) e, o SB reverteu

essa migração de neutrófilos de forma significante. Outros achados da literatura revelam os

neutrófilos como componentes centrais da resposta inflamatória, fato relevante para os

mecanismos de fagocitose, produção de radicais livres e bem como para produção e ativação

de mediadores inflamatórios (REAVES; CHIN; PARKOS, 2005). Trabalhos de Edens et al.

(2002) que usam o modelo ex vivo, mostram que a migração de neutrófilos para as células

epiteliais pode induzir alterações de permeabilidade do epitélio intestinal. Essas alterações da

permeabilidade poderiam estar relacionadas a eventos dispépticos associados à mucosite

intestinal por 5-FU.

De acordo com Sezer et al., (2008) em um estudo de mucosite intestinal induzida

por irinotecano, observou-se que a migração de leucócitos e a inflamação foram

significativamente menores nos animais que receberam o tratamento com SB, melhorando a

mucosite intestinal induzida pelo irinotecano. Estes autores demonstraram também que a

espessura das vilosidades intestinais nos animais tratados com irinotecano é

significativamente menor em relação os animais que receberam irinotecano + SB, mostrando

68

que o SB tem um efeito protetor proeminente sobre a lesão na mucosa intestinal induzida por

irinotecano.

Wu et al (2007), em um estudo sobre a colite induzida por Citrobacter rodentium

(2,5 x 108 UFC, gavagem, dose única) em camundongos tratados com SB (25 mg; 5x10

8

células vivas) duas vezes por dia, por 8 dias, demonstrou que o SB manteve a integridade da

barreira epitelial do cólon e reverteu as sequelas inflamatórias associadas à colite por

Citrobacter rodentium. Nos camundongos infectados, o tratamento SB atenuou

significativamente a perda de peso, melhorou hiperplasia das criptas intestinais, os escores de

danos histológicos e reduziu a atividade de mieloperoxidase.

Para que ocorra a remissão completa das doenças inflamatórias é necessário que

haja a cessação da inflamação e da migração dos enterócitos para reparar o epitélio

danificado. Canonici et al 2011, demonstraram que o SB secreta compostos que aumentam a

migração dos enterócitos, independentemente da proliferação celular. Esta migração avançada

foi associada com a capacidade do SB de favorecer a interação de células-matriz extracelular.

Estes autores concluiram que o SB secreta fatores mitogênicos que aumentam a restituição

celular através da regulação dinâmica da atividade A2B1 integrina.

No decorrer da presente investigação, observou-se ainda, que o SB reduziu

significantemente as concentrações de citocinas pró-inflamatórias, especificamente IL-1β e

CXCL1, aumentadas nos segmentos do jejuno e íleo dos camundongos com a administração

do 5-FU e isso se correlaciona com os outros achados inflamatórios citados. A literatura tem

mostrado que outras drogas utilizadas na quimioterapia do câncer podem levar a uma

mucosite intestinal com a participação de citocinas. Melo (2008) demonstrou que o

irinotecano (CPT-11), importante quimioterápico bastante utilizado na clínica, causa

significante dano à mucosa intestinal, induzindo um aumento significativo na concentração de

TNF-, IL-1β e CXCL1 no intestino de camundongos. Outros trabalhos observaram que a

radioterapia também é capaz de induzir aumento dos níveis de TNF- e IL-1 em modelos

animais de mucosite oral (SONIS et al., 2000). Essas evidências mostram a importância de

citocinas no desenvolvimento da mucosite gastrintestinal induzida pelo tratamento anticâncer.

Assim, o efeito protetor do SB, encontrado no nosso estudo, pode ser explicado por sua

capacidade em inibir o aumento destas citocinas pró-inflamatórias (IL-1β e CXCL1). As

citocinas e as vias de sinalização inflamatória, modificada pelo SB, poderiam também reduzir

a lesão intestinal induzida pelo irinotecano (SEZER et al., 2008).

69

Trabalhos de Lima et al (2005) demonstraram que a administração de talidomida

e pentoxifilina, ambas substâncias agem por inibição de citocinas (TNF-α e IL-1β), protegiam

a mucosa oral de hamster dos efeitos provocados pelo tratamento com o 5-FU.

Fidan et al (2009), demonstraram que o SB pode apresentar redução da resposta

pró-inflamatória, através da diminuição da secreção de citocinas pró-inflamatórias como a IL-

1β nos animais tratados com SB, mas observaram que os níveis de citocinas anti-

inflamatórias, como IL-4 e IL-10, foram maiores nesses animais, demonstrando que o SB

pode apresentar efeito protetor pela redução da resposta pró-inflamatória.

Jawhara e Poulain (2007), demonstraram, que o SB diminui a reação inflamatória

e a colonização do intestino de ratos, na infecção por C. Albicans, em modelo de colite

induzido por sódio dextrana-sulfato (DSS). Nesse estudo os animais foram tratados por

gavagem durante uma semana com SB (107 UFC) e as fezes foram coletadas diariamente

durante duas semanas. Os grupos de camundongos constituído por aqueles que foram

administrados ou C. albicans ou S. boulardii ou ambos foram sacrificados após 14 dias e

amostras do cólon foram retiradas para a classificação histológica e análise de PCR (RT-PCR)

de citocinas inflamatórias e receptores toll-like (TLRs).

Cunha (2010) comparou a influência da irradiação laser de baixa potência (nos

comprimentos de onda 660nm e associação de 660nm e 780nm) somada aos cuidados de

higiene bucal na redução da severidade da mucosite oral induzida pelo uso de antineoplásico

5-Fluoruracil (5-FU) e na alteração de padrão alimentar durante o tratamento. A amostra

totalizou 18 pacientes portadores de neoplasias e que desenvolveram mucosite oral segundo

os sinais e sintomas da Organização Mundial de Saúde (WHO). Ele observou que as citocinas

pró-inflamatórias tem uma função indireta na amplificação da injúria da mucosa iniciada pela

radioterapia e quimioterapia.

A CXCL1 é uma quimiocina que possui muitas funções, incluindo participação na

imunidade, indução de respostas inflamatórias e apoptose (JAIN et al., 2007). É expressa por

macrófagos, neutrófilos e células epiteliais, está envolvida no processo de angiogênese,

inflamação, cicatrização e tumorigênese. Esta quimiocina induz seus efeitos através de

sinalização através do receptor de quimiocina CXCR2 (HH TSAI et al, 2002). CXCL1 é

reconhecida como um poderoso fator quimiotático de neutrófilos (REAVES et al, 2005), logo

o aumento na expressão dessa quimiocina no tratamento com 5-FU, pode justificar o aumento

do infiltrado neutrofílico.

Outra citocina do nosso interesse foi a IL-1. Estudos demonstraram que esta

citocina encontra-se aumentada na mucosa intestinal de pacientes com doenças inflamatórias

intestinais e em tecidos intestinais de animais submetidos à colite experimental

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70

(YOUNGMAN et al., 1993). Com isso, acredita-se que IL-1 possa ter importância no

desenvolvimento de doenças inflamatórias intestinais. Yan et al. (2006) demonstraram que a

IL-1 estimula a expressão de genes responsáveis pela produção de fatores inflamatórios

COX-2, MCP-1, MIP-2, iNOS, e RANTES em cultura de células epiteliais. E que

possivelmente, o aumento da expressão desses genes ocorre pela ação de NF-kβ.

Alguns estudos demonstraram que as citocinas regulam e ampliam a resposta

imune, induzem lesão tecidual e mediam complicações, como a diarreia (SARTOR, 1994).

Williams (2001) relatou que citocinas inflamatórias como IL-1β, IL-6, TNF-α, IFN-γ e IL-2

contribuem com a gravidade e manutenção de lesões na mucosa intestinal. De Koning et al,

(2006) demonstraram que a resposta imune da mucosa tem um papel importante durante a

mucosite induzida por metotrexato. TNF-α e IL-10 contribuem para regular o dano da mucosa

através da restrição excessiva da mucosite. Sabe-se também que a IL-1α, IL-1β e TNF-α

estimulam a secreção de outras citocinas, outros metabólitos do ácido araquidônico e

proteases por macrófagos, neutrófilos, células musculares lisas e células epiteliais (SARTOR,

1994).

De acordo com Soares et al (2008) em estudos utilizando animais deficientes para

receptores PAF como também com animais pré-tratados com antagonistas do receptor de

PAF, o BN52021, mostraram que ambos os grupos apresentaram significantemente menos

mucosite intestinal induzida por 5-FU, demonstrando assim a participação do PAF na

mucosite intestinal induzida por 5-FU, não por meio da inibição da migração de neutrófilos ou

por um mecanismo independente desse. O PAF é um mediador inflamatório produzido pelo

intestino durante lesões agudas (SUN; HSUEH, 1988) é um mediador importante na

patogênese da enterocolite necrozante (HSUEH et al, 2003).

Observamos também em nossos estudos que o tratamento com SB reduziu as

concentrações de nitrito que estão aumentadas com a administração do 5-FU, essa redução

das concentrações de nitrito está de acordo com os dados da literatura. DIJKSTRA et al.,

(1998) demonstrou que a produção de níveis elevados de NO está associada a efeitos

inflamatórios. A atividade da iNOS é regulada durante a ativação imune e pode resultar na

síntese de níveis elevados de NO. O efeito inibitório do SB na atividade da iNOS foi exibido

em modelo de indução de diarréia pelo óleo castor (mamona/ricínio) em ratos. O nível de

citrulina (um marcador de produção de NO) estava aumentada no cólon desses ratos,

considerando que a administração de SB foi mostrada por bloquear esta produção. O mesmo

efeito é relatado com o inibidor de iNOS. Estes resultados sugerem que a inibição da iNOS

por SB pode ser benéfico no tratamento da diarréia e inflamação associada a produção

exagerada do NO (GIRARD et al., 2005).

71

Soares et al., (2008) demonstraram que a mucosite intestinal induzida por 5-FU

está associada ao retardo no esvaziamento gástrico / trânsito intestinal de líquidos, e associado

à hipercontratilidade no fundo gástrico e no músculo do duodeno, tanto na fase inflamatória (3

dias) como pós-inflamatória (15 dias), depois do tratamento com 5-FU.

O presente trabalho também teve como objetivo fazer um estudo funcional dos

animais tratados com SB na mucosite intestinal induzida por 5-FU, tendo em vista que os

efeitos colaterais mais frequentes da quimioterapia antineoplásica são os sintomas

gastrintestinais. A mucosite intestinal induzida por 5-FU em camundongos está associada a

significativo retardo no esvaziamento gástrico e no trânsito gastrintestinal. Em nosso estudo,

através da análise do centro de massa da refeição, observamos que o SB reverteu as alterações

na motilidade digestiva no curso da mucosite por 5- FU, melhorando o retarde no trânsito

gastrintestinal, aumentando a retenção no segmento medial e causando uma diminuição no

segmento distal, o que pode ser explicado pela eficácia do SB em inibir a inflamação

associada à mucosite por 5-FU.

Várias evidências indicam que pacientes submetidos à terapia anticâncer podem

sofrer vários sintomas gastrintestinais, tais como, dispepsia, disfagia e diarréia (RIEZZO et

al., 2005). Esse conjunto de sintomas foi denominado síndrome dispéptica associada à

quimioterapia do câncer (CADS). Recentemente, dados da literatura sugerem que as

desordens da motilidade gastrintestinal podem ser uma das causas de CADS (NELSON et al.,

2002, RIEZZO et al., 2005).

De acordo com VERDÚ et al 2004, os probióticos diminuem a

hipercontratilidade de músculo em um modelo animal de síndrome do intestino irritável pós-

infecciosa. Este provavelmente ocorre tanto via modulação imunológica da resposta à

infecção como por um efeito do probiótico (Lactobacillus paracasei) ou através de um

metabólito produzido pelo probiótico na hipercontratilidade muscular pós-infecciosa.

O retardo no esvaziamento gástrico, observado nos camundongos tratados com 5-

FU, pode ser devido a um aumento na complacência gástrica e/ou a um aumento na

resistência antro-duodenal (HABA; SARNA, 1993). Dados da literatura demonstraram que a

inflamação intestinal está associada com anormalidades do controle da motilidade

gastrintestinal em modelos de lesão inflamatória (MARTINOLLE et al., 1995; ANNESE et

al., 1997; MOREELS et al., 2001; AKIHO et al., 2005). Também foi demonstrado que a

hipomotilidade intestinal e o retardo do esvaziamento gástrico podem ser encontrados em um

modelo de íleo paralítico em rato (DE JONGE et al., 2003). Observou-se ainda, que a sepse

inibe a motilidade gastrintestinal podendo ser influenciada pela produção de óxido nítrico (DE

WINTER et al., 2002).

72

Nosso trabalho foi delineado para testar a eficiência do SB na mucosite intestinal

induzida pelo 5-FU e, nos seus danos inflamatórios e funcionais em camundongos. Nos

animais que receberam 5-FU + SB, a lesão da mucosa foi significativamente menor e foi

registrado melhoria na funcionalidade intestinal.

Mais estudos, inclusive estudos clínicos, precisam ser conduzidos para revelar

todos os possíveis mecanismos de ação do SB na lesão da mucosa intestinal induzida pelo 5-

FU.

Saccharomyces boulardii de baixo custo, uso conveniente, droga não interativa, e

desprovida de toxicidade, fornece uma interessante abordagem alternativa de tratamento na

mucosite intestinal induzida por 5-FU.

O SB pode combater o processo inflamatório estabilizando o ambiente microbiano

intestinal, a permeabilidade da barreira intestinal e a degradação de antígenos enterais

alterando sua imunogenicidade. Podem, também, mediar esse processo através do controle do

equilíbrio entre citocinas pró e antiinflamatórias. Uma modificação na microflora intestinal

para aumentar o predomínio de determinadas bactérias não-patogênicas e, assim, alterar o

meio intestinal pode ser considerado como uma alternativa para alcançar efeitos intestinais

profiláticos ou terapêuticos nas doenças inflamatórias intestinais. MURZIN et al (2010),

demonstrou que o extrato de SB produz, além de outras substâncias não identificadas, o ácido

cáprico que é capaz de inibir a formação de hifas, a adesão e a formação de biofilme da

levedura de Candida albicans.

Por fim, concluímos que o Saccharomyces boulardii reverte a mucosite intestinal

causada pelo 5-Fluorouracil, em camundongos, com a participação de IL-1β, CXCL-1, bem

como reverte a mucosite intestinal associada à dismotilidade gastrintestinal. Nossos achados,

em parte, poderiam explicar os sintomas persistentes de CADS nos pacientes sob o tratamento

5-FU, além de contribuir para o entendimento da patogênese da mucosite intestinal e seu

tratamento com SB, auxiliando, na descoberta de novas abordagens terapêuticas com o uso de

Saccharomyces boulardii.

73

Com base nos dados que obtivemos, sugerimos o seguinte modelo hipotético:

FIGURA 19 – Hipótese do Mecanismo de ação do Saccharomyces boulardii

74

CONCLUSÃO

75

6 CONCLUSÃO

Saccharomyces boulardii apresentou atividade antiinflamatória no modelo de lesão

intestinal induzida por 5-FU em camundongos.

Saccharomyces boulardii normalizou o trânsito gastrintestinal no modelo de lesão

intestinal induzida por 5-FU em camundongos.

76

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mailto:[email protected]

88

ANEXOS

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ANEXO A - Aprovação pela CEPA do projeto de pesquisa do estudo do tratamento com

Saccharomyces boulardii na mucosite intestinal induzida por 5-FU em camundongos

Saccharomyces boulardii REVERTE A RESPOSTA … · motilidade digestiva associadas à mucosite por...

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