Post on 15-Oct-2015
UNIVERSIDADE DE SO PAULO FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRO PRETO
TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE
Alexandra A. C. Nascimento Enilza Maria Espreafico Maria Luisa Pa Larson Ndia Monesi Nilce Maria Martinez Rossi Vanderlei Rodrigues
Reviso 1: Eliana Valria Patussi Mrcia A. S. Graminha
Reviso 2: Fbio Mrcio Squina Josane de Freitas Sousa Roberto Ruller Valeria Valente
2003
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I. CONCEITOS BSICOS
1. INTRODUO
At a dcada de 70, o DNA era o componente celular mais difcil de ser analisado.
Sua sequncia de nucleotdeos de enorme tamanho e monotonia qumica era geralmente
analisada atravs de meios indiretos como a sequncia de protenas e anlise gentica. A
partir da dcada de 70 novas tecnologias foram desenvolvidas permitindo o isolamento e a
purificao de genes especficos num processo chamado de clonagem gnica. Na verdade,
muitas destas tcnicas so provenientes da Microbiologia, Bioqumica, Imunologia e
Gentica Microbiana e permitiram que a anlise do DNA ganhasse um novo enfoque. O
DNA tornou-se ento, a molcula mais fcil de ser analisada, sendo possvel isolar regies
especficas, obt-las em grande quantidade e determinar a sua seqncia numa velocidade
de milhares de nucleotdeos por dia.
A Tecnologia do DNA recombinante, como se convencionou denominar este
conjunto de tcnicas, tem uma ampla aplicao. Ela pode ser usada para estudar mecanismos de replicao e expresso gnica, na determinao da seqncia de um gene e
conseqentemente da protena que ele codifica, ou no desenvolvimento de culturas
microbianas capazes de produzir substncias teis tais como a insulina humana, hormnio
de crescimento, vacinas e enzimas industriais em grandes quantidades. Sua aplicao
comercial ou biotecnolgica parece ter um potencial inesgotvel.
Como conseqncia do desenvolvimento desta tecnologia atualmente possvel
realizar investigao de paternidade e o diagnstico de doenas genticas e infecciosas
atravs da anlise de DNA.
2. CONCEITO DE CLONAGEM MOLECULAR
A origem do termo clonagem vem da Gentica Bacteriana que considera uma colnia
de bactrias como um clone porque todos os indivduos so geneticamente idnticos
bactria inicial.
A tcnica central da metodologia do DNA recombinante a clonagem molecular, a
qual consiste no isolamento e propagao de molculas de DNA idnticas. A clonagem
molecular compreende pelo menos dois estgios importantes. Primeiro, o fragmento do
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DNA de interesse chamado de inserto ligado a uma outra molcula de DNA chamada de
vetor para formar o que se chama de DNA recombinante. Segundo, a molcula do DNA recombinante introduzida numa clula hospedeira compatvel, num processo chamado de
transformao. A clula hospedeira que adquiriu a molcula do DNA recombinante agora chamada de transformante ou clula transformada.
Um nico transformante, em condies ideais, sofre muitos ciclos de diviso celular,
produzindo uma colnia que contm milhares de cpias do DNA recombinante.
3. ENZIMAS DE RESTRIO Em 1953 foi descrito um estranho fenmeno no qual a eficincia da replicao de um
bacterifago (vrus de bactrias) dependia da clula hospedeira na qual ele estava inserido. Algum tempo depois percebeu-se que a inabilidade de certos fagos crescerem em
determinadas linhagens bacterianas era devido a presena de nucleases altamente
especficas que clivavam o seu DNA. Isto pode ser encarado como um sistema de defesa
bacteriano que degrada DNA que lhe estranho (restrio). A bactria protege seu prprio DNA desta degradao camuflando-o atravs da metilao de algumas bases especficas
(modificao). Como conseqncia, este sistema frequentemente descrito como fenmeno da restrio/modificao e existe em um grande nmero de bactrias.
As enzimas de restrio ou endonucleases de restrio so divididas em vrias
classes, dependendo da estrutura, da atividade e dos stios de reconhecimento e clivagem.
As enzimas do Tipo II, as mais importantes na Tecnologia do DNA Recombinante, so
proteinas monomricas ou dimricas e clivam o DNA no mesmo stio do seu
reconhecimento. O stio de reconhecimento deste tipo de enzima normalmente uma
seqncia palindrmica, isto , ela tem um eixo de simetria e a seqncia de bases de uma fita a mesma da fita complementar, quando lida na direo oposta (Figura 1).
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Figura 1. Os dois tipos de clivagem feitos por enzimas de restrio. As setas indicam os stios de clivagem e as linhas pontilhadas representam o centro de simetria da sequncia.
Estas enzimas reconhecem seqncias especficas de 4 a 8 pares de base (pb) na molcula de DNA e fazem dois cortes, um em cada fita. H 2 tipos distintos de clivagens: a) os dois cortes ocorrem no eixo de simetria da seqncia especfica, gerando extremidades
abruptas, ou b) os cortes so feitos simetricamente, porm, fora do eixo de simetria, gerando extremidades coesivas. Estes dois tipos de clivagens e suas conseqncias esto mostrados
na Figura 1.
Atualmente, mais de 1000 enzimas de restrio j foram identificadas. A nomenclatura desenvolvida foi baseada na abreviao do nome do microrganismo do qual a
enzima foi isolada. A primeira letra representa o gnero e as outras duas a espcie, seguido
de um algarismo romano (ou outra letra) que indica a ordem da descoberta ou a linhagem da qual ela foi isolada. Por exemplo, a enzima de restrio denominada de EcoRI purificada
de uma Escherichia coli que carrega um fator de transferncia de resistncia RI, enquanto
que a Hind III isolada da Haemophilus influenzae, linhagem d III. A Tabela 1 mostra a seqncia palindrmica e o local de clivagem de algumas
enzimas de restrio. Note que algumas enzimas deixam terminaes coesivas enquanto que
outras fazem cortes abruptos ou no coesivos.
a) Clivagem no eixo de simetria
Molculas com extremidades abruptas Molculas com extremidades coesivas
b) Clivagem simtricamente situada aoredor do eixo de simetria
...TC GA...
...AG CT...
3
5 3
5
+
...GAA TTC...
...CTT AAG...
+3
5
3
5
4
Tabela 1. Algumas endonucleases de restrio: origem e stios de clivagem. A seta indica o local de
clivagem. Pu e Pi referem-se, respectivamente, a qualquer purina e pirimidina.
O interesse por estas enzimas de restrio aumentou em 1973 quando se percebeu que elas poderiam ser usadas para fragmentar o DNA deixando extremidades de fitas
simples de DNA que permitiam a ligao dos fragmentos. Isto significava que a
recombinao poderia ser efetuada em tubos de ensaio. Alm disto, DNA bacteriano
poderia recombinar com DNA humano ou de qualquer outra espcie, abrindo a
possibilidade de clonar genes humanos ou isolar protenas de culturas bacterianas.
Uma importante conseqncia da especificidade destas enzimas de restrio que o
nmero de clivagens feito por cada uma delas no DNA de qualquer organismo definido e
Microrganismo Enzima Sequncia Alvo
EcoRIEscherichia coli
Bacillus amyloliquefaciens H
Haemophilus aegyptius
Haemophilus aegyptius
Haemophilus aegyptius
Providencia stuartii
Streptococcus albus G
Thermus aquaticus
Serratia marcescens
Brevibacterium albidium
Bacillus globigii
BamHI
BglII
PstI
BalI
SmaI
HaeIII
TaqI
SalI
HindIII
HaeII
G A A T T CC T T A A G
G G A T C CC C T A G G
A G A T C TT C T A G A
P G C G C P iP i C G C G Pu
y u
A A G C T TT T C G A A
C T G C A GG A C G T C
G T C G A CC A G C T G
T G G C C AA C C G G T
A G G C C T
T C C G G A
C C C G G GG G G C C C
T C G AA G C T
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permite o isolamento de fragmentos deste DNA. Portanto, cada enzima de restrio gera
uma famlia nica de fragmentos quando cliva uma molcula de DNA especfica. Enzimas
que reconhecem stios de restrio compostos por 4 pares de bases clivam o DNA em mdia
a cada 256 nucleotdeos (44=256). Aquelas que reconhecem stios com 6 e 8 pb clivam o DNA em mdia a cada 4096 e 65536 pb, respectivamente. No entanto, esta mdia pode sofrer variaes significativas, dependendo principalmente da composio de bases do
DNA analisado. Por exemplo, a enzima NotI reconhece um stio de restrio contendo 8pb,
incluindo nucleotdeos CpG, que raramente ocorre no DNA de mamferos.
A famlia de fragmentos gerados por digesto com enzima de restrio geralmente
detectada pela separao destes fragmentos por eletroforese em gel de agarose. Os
fragmentos migram em funo de seus pesos moleculares sendo que os menores migram
mais rapidamente (Figura 2).
Figura 2. Molculas de DNA de tamanhos diferentes podem ser separadas por eletroforese. Molculas menores movem-se mais rapidamente que molculas maiores, tornando-se portanto separadas em bandas. O DNA corado com brometo de etdio, uma molcula que fluoresce quando iluminada com luz Ultra Violeta.
4. CONSTRUO DO DNA RECOMBINANTE Uma enzima de restrio particular reconhece somente uma seqncia nica de
bases. DNAs de origens diferentes sob a ao da mesma enzima de restrio produzem
fragmentos com o mesmo conjunto de extremidades fitas simples. Portanto, fragmentos de
Sentid
o d
a mi
gra
o
Pares debase
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dois diferentes organismos (por exemplo, bactria e homem) podem ser ligados por renaturao das regies de fita simples. Alm disto, se a ligao for "selada" com a enzima
DNA ligase, depois do pareamento de bases, os fragmentos sero ligados permanentemente.
A tcnica de DNA recombinante tem um interesse especial se uma das fontes de
DNA clivado for um plasmdeo.
Figura 3. Construo de uma molcula de DNA hbrida a partir de fragmentos de diferentes organismos obtidos com o uso de enzima de restrio.
A figura 3 mostra uma molcula de DNA de plasmdeo que tem somente um stio de
clivagem para uma determinada enzima de restrio. A mesma enzima usada para clivar
DNA humano. Se os fragmentos de DNA humano so misturados com o DNA plasmidial
linearizado, permitindo a ligao entre eles, uma molcula de DNA plasmidial contendo
DNA humano pode ser gerada. Este plasmdeo hbrido pode ser inserido numa bactria
atravs de transformao e ento o inserto ser replicado como parte do plasmdeo.
Geralmente, antibiticos so acrescentados ao meio da cultura para selecionar somente as
linhagens que portam os plasmdeos (o plasmdeo usado para esta finalidade porta resistncia a pelo menos um antibitico).
Plasmdeo de
E.coli
DNA humano
DNA ligase
Plasmdeo hbrido
Enzima Enzima
GCA T T ACG
TGCA TGCAACGT ACGT
TGCAACGT
TG
CA
TGCA
AC
GT
ACGT
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5. DNA LIGASE
Conforme mencionado anteriormente, esta enzima promove a ligao dos fragmentos de
DNA em vetores previamente clivados por endonucleases de restrio. A DNA ligase requer um
grupo OH livre na extremidade 3' de uma das cadeias de DNA e um grupo fosfato na
extremidade 5' da outra cadeia (Figura 4). A E.coli e o fago T4 codificam uma DNA ligase capaz de selar fragmentos de DNA com dupla fita. DNA ligase isolada de E.coli e de outras
bactrias requer NAD+, enquanto que a isolada do bacterifago T4 requer ATP como
cofator.
Figura 4. DNA ligase cataliza a juno de duas fitas de DNA que so partes da molcula da dupla-hlice.
5.1. Tipos de fragmentos de DNA que so ligados pela DNA ligase
a) Fragmentos com extremidades coesivas
As extremidades coesivas produzidas por vrias enzimas de restrio permitem que
dois fragmentos de DNA sejam mais facilmente ligados. Isto porque ocorre inicialmente o pareamento das fitas simples das extremidades coesivas das duas diferentes molculas,
atravs da formao de pontes de hidrognio pela complementariedade das bases.
Finalmente, a ligao covalente (fosfodister) dos fragmentos realizada pela DNA ligase (ver figura 4).
b) Fragmentos com extremidade no coesivas
DNAs portando extremidades no coesivas so ligados com muito menos eficincia
que aqueles que tem extremidades coesivas. Uma concentrao muito maior de DNA ligase
DNA DNA3 OH-
O O 5P
O
-
O
DNA DNA3 O O 5
O
P-
O
+
DNA-LigaseATP ou NAD
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e mesmo dos DNAs envolvidos necessria para que as molculas com extremidades no
coesivas sofram reao de ligao.
No entanto, a ligao deste tipo de fragmento facilitada pela transformao prvia
das extremidades no coesivas em coesivas. Este procedimento pode ser feito atravs de
dois processos:
a) Adio de polidesoxiadenina na extremidade 3' de um fragmento de DNA e polidesoxitimina na extremidade 3' de um outro fragmento de DNA, atravs da enzima
desoxinucleotidil-transferase-terminal ou simplesmente transferase. Esta enzima, uma DNA
polimerase incomum, adiciona nucleotdeos extremidade 3-OH de fragmentos fita
simples proeminentes de uma cadeia de DNA. Para gerar este tipo de extremidade
proeminente a molcula tratada previamente com uma exonuclease 5-especfica para remover alguns nucleotdeos terminais. Aps a mistura dos dois tipos de fragmentos
complementares e anelamento dos mesmos, as molculas so unidas preenchendo-se os
espaos existentes com o auxlio da DNA pol I e selando-os com DNA ligase (Figura 5) b) Adio de adaptadores s extremidades no coesivas. Os adaptadores so
oligonucleotdeos sintticos que contm stios de clivagem para uma ou mais enzimas de
restrio. Eles so unidos ao DNA com o auxlio da DNA ligase (Figura 6). Alternativamente, no lugar de modificar a extremidade no coesiva, pode-se optar pela
utilizao de T4 ligase em grande concentrao, o que permitir a ligao entre molculas
de DNA sem proeminncias.
6. TRANSFORMAO BACTERIANA
6.1.Conceito de transformao induzida
O processo de transformao constitui um evento de alta importncia na tcnica de
manipulao gnica. A transformao natural descrita por Griffith, em 1928, e por Avery e colaboradores, em 1944, um evento raro. No entanto, em 1970, Mandel e Higa encontraram que a E.coli tornou-se marcadamente competente para transformao com
DNA exgeno, quando a bactria foi suspensa em cloreto de clcio gelado e submetida a
um curto choque trmico 42oC. Estes mesmos autores tambm verificaram que as
bactrias crescidas at a fase log eram mais competentes do que aquelas isoladas de outros
estgios do crescimento.
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Figura 5. Fragmentos de DNA com extremidades no coesivas podem ser transformadas em coesivas pela adio de poli
(A) e poli (T).
Figura 6. Fragmentos de DNA com extremidades no coesivas podem ser transformados em coesivas pela adio de adaptadores e posterior tratamento com a enzima de restrio que reconhece o adaptador.
5 55 53
3
AAAA TTTT
33
3
AAAA TTTT
3
3
3
5 - Exonuclease especfica
Deoxinucleotdio transferase terminal
Espaos preenchidos com DNA Pol I. DNA ligasepara completar a ligao
+dATP +dTTP
DNA a ser inserido
+
GAATTCCTTAAG
AdaptadorSinttico
T4 DNA ligase
GAATTCCTTAAG
GAATTCCTTAAG
EcoRI
AATTC G
GCTTAA
GAATTCCTTAAG
Vetor
EcoRI
G AATTCCTTAA G
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O procedimento do cloreto de clcio que usado at hoje produz uma eficincia de transformao da ordem de 105 a 107 transformantes por micrograma de DNA (a eficincia de transformao geralmente expressa como o nmero de clulas transformadas, obtido a
partir de um micrograma de DNA plasmidial intacto). O tamanho e a conformao da molcula do DNA, afetam o processo de
transformao. Plasmdeos pequenos so mais facilmente incorporados pela clula
bacteriana competente; DNA linear pobremente incorporado, talvez pelo fato de sofrer
degradao pelas enxonucleases presentes no espao periplasmtico.
6.2. Mecanismos de captao do DNA
O mecanismo de captao da molcula do DNA pela bactria competente ainda
desconhecido. Uma hiptese que as molculas do DNA passam atravs de canais situados
nas chamadas zonas de adeso, que so locais onde a membrana interna e externa da clula
bacteriana unem-se formando poros. Estes poros s esto presentes durante o crescimento
bacteriano (fase de crescimento exponencial). Em condies naturais, a captao do DNA torna-se difcil devido a repulso
eletrosttica existente entre as cargas negativas da camada de fosfolipdeos da membrana
bacteriana e dos grupo fosfato da molcula do DNA.
O papel do clcio explicado pela hiptese de que a 0oC a fluidez da membrana
celular cristalizada, estabilizando a distribuio dos fosfatos carregados. Os ons Ca+2
formam um complexo com este grupamento, cobrindo as cargas negativas e assim
facilitando a atrao eletrosttica com as molculas do DNA na zona de adeso. O choque
trmico, complementa este processo de captao, provavelmente criando um desbalano
trmico entre o interior e o exterior da clula bacteriana, auxiliando o bombeamento do
DNA atravs da zona de adeso. A figura 7 ilustra este processo.
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Figura 7. Mecanismo molecular proposto para explicar a transformao de E. coli com uma molcula de DNA exgeno.
II. VETORES DE CLONAGEM MOLECULAR
Aps o isolamento de uma informao gentica, por exemplo um fragmento de DNA
obtido pela clivagem com enzimas de restrio, este fragmento dever ser inserido numa
outra molcula de DNA diferente, capaz de amplificar aquela informao gentica em
centenas de cpias. Este processo de amplificao obtido atravs do uso de molculas de
DNA que so os chamados vetores de clonagem molecular.
Atualmente, os tipos bsicos de vetores usados na metodologia do DNA
recombinante apresentam caractersticas especiais que os tornam excelentes veculos de
clonagem em diferentes situaes.
A seguir, vamos apresentar os principais tipos de vetores atualmente em uso na
biologia molecular.
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- -- -
----
Zona de adeso
Plasmdeo
Bicamada lipdica(interna)
Bicamada lipdica(externa)Fosfolipdeoson de clcio
Camada peptidoglucan
DNA genmico ClulaBacteriana
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1. PLASMDEO Plasmdeos so pequenas molculas de DNA dupla fita, contendo os elementos
necessrios para a sua replicao e pelo menos um gene que confere resistncia a
antibitico. Estes elementos genticos extra cromossomais variam de 5 a 400 kilobases e comumente esto presentes em duas ou mais cpias por clula. Os plasmdeos presentes
num grande nmero de cpias so usados como veculos de clonagem desde que capacitem
a amplificao do segmento do DNA neles clonado.
Um plasmdeo para ser um bom vetor de clonagem deve conter as seguintes
propriedades:
a) possuir uma origem de replicao (O), ou seja, uma seqncia de DNA que permita que o vetor seja replicado na clula hospedeira; b) apresentar dois ou mais stios nicos de clivagem para endonucleases de restrio. O conjunto destes stios, denominado de Mltiplos Stios de Clonagem (MSC), o local onde o inserto incorporado ao vetor de clonagem;
c) possuir um gene que codifica um produto que distingue a clula transformada da clula no transformada. Por exemplo, muitos vetores de clonagem carregam o gene que confere
resistncia ampicilina (AmpR). As clulas transformadas com tais vetores so capazes de crescer num meio contendo o antibitico, enquanto que as clulas no tranformadas acabam
morrendo.
A figura a seguir ilustra as principais caractersticas estruturais de um plasmdeo.
Figura 8. Estrutura molecular de um plasmdeo tpico usado em clonagem molecular. Esto representados o gene de resistncia (AmpR), a regio de mltiplos stios de clonagem (MSC) e a origem de replicao (O).
AmpR
O
MSC
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Um dos passos fundamentais no processo de clonagem molecular o uso de enzima
de restrio que produz extremidades compatveis durante a clivagem do DNA a ser
clonado (inserto) e a do DNA receptor (vetor). Uma vez que o DNA foi ligado ao vetor, esta molcula hbrida dever ser
introduzida numa clula hospedeira geralmente bactrias, por um processo chamado de
transformao, para que o vetor possa sofrer replicaes e consequentemente amplificar o
nmero de cpias do inserto. A bactria transformada ser facilmente reconhecida pela
aquisio de um novo fentipo dado pelo plasmdeo, ou seja, capacidade de crescer em meios contendo antibitico.
2. FAGOS Um dos vetores mais utilizados nos processos de clonagem molecular o
denominado bacterifago , o qual comporta-se como um vrus da E.coli. Antes de analisarmos o uso deste elemento como veculo de clonagem molecular, vamos mostrar
resumidamente as suas propriedades biolgicas e estruturais.
2.1 Biologia do fago
O fago um parasita obrigatrio da E.coli, o qual necessariamente deve injetar o seu DNA na bactria hospedeira para a sua multiplicao. Aps a infeco da E.coli o
genoma do fago pode seguir duas vias:
a) No primeiro caso denominado estado ltico, o DNA do fago permanece na bactria como uma molcula independente, havendo a ativao de alguns genes do fago e a concomitante
inativao de outros, dentro de um programa estritamente definido. Como resultado o
cromossomo do fago replicado ativamente, ocorre a sntese das protenas da capa e da
cauda e formam-se novas partculas virais. Em aproximadamente 45 minutos aps a infeco a clula hospedeira lisada havendo a liberao de cerca de 100 novos fagos.
b) A outra via que o cromossomo do fago pode seguir o denominado estado lisognico. Neste caso, o DNA do fago integrado no cromossomo da bactria passando a ser chamado
profago. No estado lisognico, todos os genes do profago esto inativos com excesso do
gene que produz a protena repressora. A bactria hospedeira carregando o profago
multiplica-se e este replicado passivamente e distribudo para as bactrias descendentes.
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Em condies naturais a opo entre seguir o estado ltico ou lisognico depende das
condies do meio. Assim, via de regra, em meio rico em nutrientes o estado ltico
preferencial, por exemplo o fago na bactria E.coli intestinal. Por outro lado, em meio pobre de nutrientes como o caso da E.coli no solo, o fago prefere o estado lisognico. Em
condies experimentais, o estado a ser seguido depende de um balano entre os fatores do
meio intra e extra celular e de fatores genticos da bactria hospedeira e do bacterifago.
2.2 Genoma do fago
O bacterifago uma partcula viral constituda de aproximadamente 50% de
protenas e 50% de DNA. O DNA do fago , na forma como ele isolado da partcula viral, uma molcula linear com dupla fita de aproximadamente 48.500 pares de bases. As extremidades da molcula contm uma frao de DNA fita simples com cerca de 12
nucleotdeos, os quais so complementares na sequncia de bases e atravs delas que o
DNA assume a forma circular quando ele injetado na clula hospedeira. Estas extremidades so denominadas de stios cos. O genoma do fago codifica para aproximadamente 50 protenas, cujos genes tem um cronograma de expresso bem definido, o que determina a instalao do estado ltico ou lisognico.
As figuras 9 e 10 ilustram o ciclo biolgico do fago em uma clula hospedeira e
o genoma do fago com alguns dos seus principais genes, respectivamente.
2.3 Controle de expresso dos genes do fago
Seja qual for a via a ser seguida pelo fago , ou seja via ltica ou lisognica, a expresso dos genes envolvidos nestes circuitos comea pelos produtos dos genes N e Cro, regulados pelos promotores pL e pR respectivamente situados esquerda (pL) e direita (pR) do gene cI.
Durante o transcurso da via ltica, o produto do gene cro est diretamente
relacionado com a replicao do genoma do fago , atravs da induo da expresso dos
genes OP. Por outro lado, o produto do gene N est diretamente relacionado com a expresso dos genes da regio de empacotamento, ou seja genes A e J, responsveis pela
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sntese das protenas da cabea e da cauda do fago , como tambm da expresso dos genes
S e R, diretamente envolvidos com a lise da clula hospedeira.
Figura 9. Replicao do fago no interior da clula hospedeira. Aps adsoro (1) e injeo (2) do genoma do fago na bactria, a via ltica indicada pelos nmeros 3, 4 e 5 leva a formao de novas partculas virais. Alternativamente, a via lisognica (6) pode ser ativada levando integrao do material gentico viral ao genoma da bactria hospedeira.
Figura 10. Representao esquemtica do genoma do fago .
Durante a via lisognica, a transcrio tambm inicia-se pelos promotores pL e pR coordenando a expresso dos genes cII e cIII. O produto destes dois genes coordena a
expresso do gene cI que produz uma protena repressora inibindo a expresso dos genes
responsveis pelo empacotamento e a lise. Por outro lado, um outro gene importante o int,
12
6
34
5
Empacotamento Recombinao Regulao Replicao Lise
cos A J
N CropL pr
.cIII cI cII O P S Rint
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cujo produto relaciona-se com a integrao do fago no genoma bacteriano estabelecendo o estado lisognico.
2.4 O uso do fago como vetor de clonagem molecular Durante o ciclo ltico, os genes envolvidos no processo de lisognia so
dispensveis e consequentemente a regio de integrao do genoma do fago pode ser
totalmente substituda por um outro fragmento de DNA, sem que haja qualquer alterao nos processos envolvidos na via ltica.
Uma das maiores vantagens de usar o fago como vetor de clonagem que o DNA inserido no fago empacotado in vitro. Embora a eficincia de empacotamento seja cerca de 10%, uma vez que os fagos so empacotados teremos 100% de eficincia na infeco da
E.coli hospedeira. Este processo altamente eficiente quando comparado com o da
transformao bacteriana com plasmdeos. Neste caso, os melhores resultados situam-se ao
redor de 108 transformantes por g de DNA o que significa que menos de 1 em 1000
plasmdeos so incorporados na E.coli hospedeira.
Atualmente, existem vrios derivados do fago nos quais um ou mais stios de restrio flanqueiam a regio de recombinao, facilitando a sua substituio por um outro
DNA. Estes so os chamados vetores de substituio. Um exemplo tpico destes vetores
o EMBL3, no qual a regio de recombinao flanqueada pelas enzimas de restrio EcoRI, BamHI e SalI. Esse vetor quando quando clivado pode receber fragmentos de DNA
variando de 10,4 a 20 kb, como mostra a figura abaixo.
Outros derivados do fago so os chamados vetores de insero. Neste tipo de vetor, os fragmentos de DNA que podem ser inseridos devem ter no mximo at 7kb de
tamanho para no alterar os processos de empacotamento do genoma do fago.
Os vetores de insero derivados do fago mais bem utilizados especialmente na
clonagem de cDNA, so os vetores gt10 e o gt11. Vamos a seguir fazer algumas consideraes sobre estes dois tipos de vetores.
No fago gt10, o inserto geralmente cDNA, inserido no stio da EcoRI situado no
gene repressor cI. O fago recombinante ter agora o gene cI obstrudo e consequentemente
durante a cultura provocar a lise das colnias de bactrias transformadas. Essas colnias
lisadas so visualizadas como crculos com o centro claro (placas de lise), bastante distintos
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das colnias no recombinantes, que por possurem o gene cI ntegro no so lisadas e
permanecem como colnias turvas.
Figura 11. Representao esquemtica da clonagem de um fragmento de DNA genmico no fago . As regies indicadas por a contm todas as informaes necessrias para replicao em E. coli e empacotamento in vitro. Os diferentes fragmentos obtidos da digesto do DNA de interesse com enzima apropriada esto indicados pelas letras b e c, onde somente c possui tamanho adequado para o empacotamento.
Por outro lado, o fago gt11 contm um stio de restrio EcoRI localizado num gene chamado LacZ, a 53 nucleotdeos do cdon de trmino da enzima codificada por esse
gene (-galactosidase). Essa enzima, cuja expresso pode ser induzida por IPTG (isopropil-
EcoRI
EcoRI
ligase
empacotamentoin vitro
a
a
b
b
b
b
c
DNA bacterifago
DNA camundongo
bacterifagocontendogenes do
camundongo
informaesdesnecessrias replicao
c
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-D-galactosdeo), degrada o substrato X-gal produzindo um precipitado de cor azul. Portanto, colnias de bactrias carregando o DNA do fago com o gene LacZ intacto (sem inserto), na presena do indutor IPTG e do substrato X-gal, ficaro azuis. Enquanto que, aquelas portanto o DNA o fago que incorporou o inserto no stio de EcoRI, no expressam a
-galactosidade e permanecem de cor branca, o que facilita a identificao dos clones recombinantes.
3. COSMDEO A clonagem de fragmentos de DNA no fago apresenta uma limitao, pois o
fragmento a ser clonado no pode ser maior do que cerca de 15kb (Figura 12). Na maioria das vezes, esta dimenso suficiente para conter um gene completo, incluindo as
sequncias flanqueadoras. Entretanto, muitos genes apresentam dimenses da ordem de 35 a 40 kb e nestes casos, a tcnica usada para a clonagem deste tipo de fragmento a chamada
clonagem em cosmdeos.
Os cosmdeos, so plasmdeos que contm um fragmento de DNA do fago que
inclui o stio cos. Estes cosmdeos podem ser usados como veculos de clonagem molecular
empregando o sistema de empacotamento in vitro que reconstitui a estrutura do fago
(cabea e cauda) e assim usado para infectar a clula hospedeira. As enzimas do sistema de empacotamento do fago reconhecem os dois stios cos
situados de 35 a 49 kb de distncia e neste caso, somente fragmentos desta ordem de tamanho sero convenientemente empacotados.
O DNA genmico de interesse clivado com uma enzima de restrio que produz
grandes fragmentos de DNA, os quais sero ligados ao cosmdeo, tambm clivado com a
mesma enzima.
A situao ideal que cada fragmento do DNA genmico apresente um stio cos
nas suas extremidades. Durante o empacotamento, as enzimas do sistema reconhecem os
stios cos situados a uma distncia dentro de 49Kb, clivam estes stios e empacotam estas molculas.
O DNA do cosmdeo injetado no interior da clula hospedeira, circulariza igual ao DNA do fago e replica como um plasmdeo normal, sem expresso de qualquer funo do
19
fago. As clulas infectadas sero selecionadas com base na resistncia adquirida a um
determinado antibitico. A figura 12 ilustra um tpico processo de clonagem em cosmdeo.
Figura 12. Esquema de clonagem em cosmdeo.
4. VRUS A biologia molecular dos vrus de DNA e RNA foi extensivamente estudada antes do
advento da metodologia do DNA recombinante. O vrus SV40, isolado de clulas tumorais de macacos, foi um dos primeiros sistemas virais utilizados para introduzir genes em clulas
de mamferos. O DNA do SV40 apresenta 5.200 pares de bases e pode ser dividido em duas
regies quanto a expresso gnica viral. Estas regies so chamadas de regio precoce e
regio tardia.
fragmentos de restriode
35 a 40 kb
AmpRStio alvo de restrio
cos
DNA circularizaaps infeco
seleo de clones resistentes a ampicilina
20
A regio precoce expressa atravs do ciclo ltico, enquanto que a expresso dos
genes da regio tardia ocorre somente aps o incio da replicao do DNA viral. Entre estas
duas regies situa-se a origem de replicao do DNA do vrus.
Um produto de expresso da regio precoce o antgeno T, o qual responsvel pela transformao maligna de clulas no permissveis (clulas nas quais o vrus no completa a sua replicao), como tambm pelo incio da replicao viral em clulas permissveis. Os produtos de expresso codificados pela regio tardia correspondem s
protenas que formam o capsdeo da partcula viral. A figura 13 ilustra o genoma do virus SV40.
Figura 13. O DNA do virus SV40
4.1. Clonagem no vrus SV40 A produo de DNA recombinante no vrus SV40, pode ser realizada atravs da
substituio do segmento de expresso precoce ou do segmento de expresso tardia.
No primeiro caso, o vrus recombinante no produz o antgeno T, ao passo que na segunda opo no haver produo das protenas do capsdeo. Entretanto, estas funes deletadas podem ser suprimidas como veremos a seguir.
4.1.1. Clonagem no SV40 pela substituio da regio tardia Quando a regio tardia do SV40 substituda com outro DNA, perde-se a
expresso das protenas do capsdeo (funes tardias). Para que o sistema de clonagem
o
Expressoprecoce
Expressotardia
SV40
Genoma do SV40
21
funcione adequadamente pode-se realizar a infeco simultnea com um outro vrus SV40
que tem uma deleo nos genes da regio precoce, mas a regio tardia intacta. Nas clulas
co-infectadas as protenas da regio precoce sero produzidas pelo vrus recombinante e as
protenas do capsdeo pelo vrus deletado. Como resultado, teremos a produo de uma
populao de partculas virais mistas, ou seja, vrus deletado e vrus recombinante. A figura 14 ilustra este procedimento.
Figura 14. Clonagem no SV40 pela substituio da regio tardia
SV40
gene
cotransfeco
partculas Virais
SV40
Regio funcional tardia
Regio funcionalprecoce
O
daglobina
SV40-globina
empacotamento e lise
22
4.1.2. Clonagem no SV40 pela substituio da regio precoce Quando a clonagem no SV40 feita na regio precoce, a produo de partculas
virais depende do suprimento, por uma outra fonte, das protenas codificadas pela regio
precoce (antgeno T). Para evitar uma infeco mista com um vrus SV40 deletado, usa-se uma linhagem celular, as clulas COS as quais, apresentam uma poro do genoma do
SV40 integrado ao seu prprio cromossomo. Esta linhagem celular produz a protena viral
denominada antgeno T, a qual liga-se na origem de replicao do vrus e induz a sua
replicao. A figura 15 ilustra este tipo de clonagem. Apesar deste sistema viral ter sido usado como vetor de expresso em muitas
estratgias de clonagem, existem algumas desvantagens de seu uso. Uma delas que o gene
a ser clonado no pode ser grande, a outra que as clulas hospedeira s podem ser clulas
de macacos e finalmente, o genoma da clula hospedeira pode sofrer rearranjados ou delees.
Atualmente, dois outros sistemas virais mais versteis esto em uso, so eles o
vrus da vacina e o Baculovrus, os quais podem aceitar genes bem maiores do que aqueles aceitos pelo SV40. Um inconveniente para estes dois sistemas virais que ambos
apresentam um grande genoma e o gene a ser clonado s pode ser inserido por processos de
recombinao dentro das clulas, o qual bastante lento em relao aos processos
tradicionais em uso na metodologia do DNA recombinante.
Finalmente, um sistema viral bastante promissor so os retrovrus que so vrus cujo material gentico o RNA e apresentam um ciclo bastante diferente dos mencionados anteriormente que so ciclos lticos. Os retrovrus infectam uma grande variedade de clulas
de mamferos e o seu RNA transcrito reversamente para DNA o qual incorporado ao
genoma da clula hospedeira. Neste estado ele produz continuamente novas partculas
virais, juntamente com o produto do gene nele clonado. Devido a sua versatilidade, os retrovrus so atualmente os vetores eleitos para uso em terapia gnica.
5. BACTERIFAGO M13 O bacterifago M13 um fago filamentoso da E. coli e contm uma nica fita de
DNA envolvida por protenas virais. Durante o seu ciclo, a clula hospedeira infectada
23
pela fita (+) a qual servir como molde para a sntese da outra fita (-). A dupla fita denominada de forma replicativa, permanece no interior da clula hospedeira e
amplificada at 200 cpias por clula, quando ento a fita negativa no mais se replica e a
fita positiva continua a ser sintetizada, adquire as protenas da cpsula viral e sai da clula
hospedeira atravs de processo no ltico (Figura 16).
Figura 15. Esquema de clonagem no SV40 pela substituio da regio precoce.
SV40
gene
Partcula Viral
O
da
Regio funcionaltardia
Regiofuncionalprecoce
SV40-Ha
hemaglutinina (Ha)
co-transfeco
SV40mutante
empacotamentoe lise
SV40 mutanteintegrado aogenoma da clula COS
antgeno T replicao
24
Figura 16. Replicao do bacteriofago M13.
5.1. Clonagem no bacterifago M13 A grande utilidade deste sistema de clonagem a sua facilidade na produo de
DNA fita simples, facilmente recupervel do sobrenadante de uma cultura lquida da E.coli
infectada com este vetor. Como veremos futuramente, este DNA fita simples bastante til
no processo de sequenciamento do DNA pelo mtodo desenvolvido por Sanger e
colaboradores (1977). Para facilitar o seu uso especialmente em estratgias de seqenciamento, foram
desenvolvidos vetores da srie M13mp, os quais contm o MSC inserido no gene que
expressa a -galactosidase. Mutaes foram realizadas de tal modo que a enzima s ativa quando o vetor est
na clula hospedeira, convenientemente preparada. Este processo denomina-se de
alfacomplementao. A incluso do mltiplo stio de clonagem no gene da galactosidade visa a identificao dos possveis recombinantes quando na presena de um substrato
cromognico o X-gal ou Bluogal (5-bromo-4-cloro-indolil--D-galactosdeo) e o indutor IPTG. Quando o vetor est intacto (no recombinante), a enzima funcional e frente ao substrato cromognico este clivado produzindo placas de cor azul. Por outro lado, quando
um fragmento de DNA inserido no mltiplo sitio de clonagem, a expresso da enzima
suprimida, portanto as clulas so incapazes de metabolizar o substrato cromognico
formando placas incolores.
++ ++
+
-
M13
E.coli
25
5.2. Estratgia de clonagem em vetores da srie M13mp A utilizao de vetores com diferentes orientaes do mltiplo stio de clonagem,
tais como M13mp8 e o M13mp9, facilita a insero de um fragmento de DNA em ambas as orientaes. Como veremos adiante, esta estratgia apresenta grande aplicao no programa
de sequenciamento de um DNA pelo mtodo de Sanger.
A figura 17 ilustra a insero de um fragmento de DNA clivado com as enzimas Pst1
(P) e EcoRI (E) nos vetores M13mp8 e M13mp9, ambos clivados com as mesmas enzimas. Esta clonagem orientada permite a insero do fragmento de DNA na orientao 5'3' no
vetor M13mp8 e na orientao 3'5' no vetor M13mp9.
Figura 17. Clonagem de um fragmento de DNA nos vetores M13mp8 e M13mp9 clivados com as enzimas EcoRI (E) e PstI (P).
6. FAGOMDEOS Apesar do bacterifago M13 apresentar grande aplicabilidade especialmente nos
processos de seqenciamento de DNA, foram desenvolvidas outras geraes de fagos, os
quais reunem as vantagens do fago M13 e a do plasmdeo. Os primeiros foram os vetores da
srie pEMBL e mais tarde os plasmdeos pTZ, pBluescript e pGEM (+/-). Estes vetores so chamados de fasmdeos ou fagomdeos e apresentam as seguintes caractersticas principais:
P5 3
P E
EP
E
E P
PE
M13 mp9 M13 mp8
26
fagomdeo apresenta um verstil MSC, permitindo a clonagem de grandes
insertos sem maiores dificuldades, alm de que, as enzimas situadas neste stio
foram ordenadas de tal modo a permitir uma alternativa interessante durante o
processo de sequenciamento.
utilizando uma combinao estratgica de duas enzimas de restrio, possvel
criar terminaes 5' e 3' proeminentes, tornando agora uma extremidade (a do inserto) susceptvel ao da Exonuclease III. Esta estratgia, permite a obteno progressiva e controlada de vrios fragmentos deletados do inserto, os
quais aps a recircularizao tornam-se apropriados para o sequenciamento.
Este procedimento, facilita o seqenciamento de um grande inserto de DNA,
sem a necessidade de mltiplas subclonagens como usual no sistema M13 ou a
sntese de vrios oligonucleotdeos internos, usados como iniciadores no
processo de seqenciamento.
6.1. Clonagem no fagomdeo Vamos utilizar como exemplo, o fagemdeo ZAP que particularmente til para
clonagem de cDNA. Este vetor, incorpora a biologia do fago M13 de tal modo que um
cDNA clonado neste vetor pode ser automaticamente excisado do fago para um fagomdeo
denominado pBluescript.
Basicamente, qualquer DNA clonado no MSC inativa o gene LacZ, produzindo
uma protena de fuso quando na orientao correta, podendo assim tambm ser rastreada
com anticorpos.
Quando uma cepa da E.coli (F') infectada com o fago recombinante e superinfectada com o fago auxiliar, esse produz as protenas do sistema M13. Essas
protenas reconhecem os sinais de iniciao e trmino da sntese de DNA do fago auxilar
(f1) que esto flanqueando o pBluescript, que por sua vez est incorporado no fago ZAP e carrega o inserto. Com a clivagem destas duas seqncias, o DNA automaticamente
circularizado na bactria para originar a forma recombinante do plasmdeo Bluescript
SK(M13). O inserto clonado no Bluescript flanqueado por promotores para as RNA
polimerases dos fagos T3 e T7. Neste sentido, aps o vetor ser convenientemente
27
linearizado, cpias do RNA relativo ao inserto, podem ser obtidas em ambas as direes
atravs do uso das RNA polimerases T3 e T7.
7. VETORES PARA TRANSFORMAO DE LEVEDURAS O grande interesse existente no estudo das leveduras Saccharomyces cerevisiae e
Schizosacharomyces pombe deve-se ao fato de que tratam-se de organismos eucariotos
inferiores e como tais possuem organizao celular similar de eucariotos superiores. Alm
disso, muitas protenas de leveduras so similares estrutural e funcionalmente s suas
homlogas em mamferos. A utilizao de leveduras como um modelo de estudo traz as
seguintes vantagens:
tempo de crescimento reduzido que permite a obteno de grandes quantidades
de leveduras em pouco tempo.
genoma de pequeno tamanho, cerca de 200 vezes menor que o genoma de
mamferos, o que simplifica anlises moleculares e genticas.
possibilidade de manter as leveduras como clulas haplides ou diplides, o que
permite a obteno de mutaes recessivas em clulas haplides, bem como a
realizao de experimentos de complementao gentica. As clulas de
mamferos so diplides o que torna impossvel a deteco de mutaes
recessivas.
Existem diferentes marcadores de seleo que so utilizados em leveduras. A maior
parte dos genes marcadores utilizados em leveduras so genes envolvidos na biossntese de
aminocidos e nucleotdeos. Um dos marcadores frequentemente utilizados o gene de
levedura LEU2 que codifica para uma das enzimas da via de sntese da leucina, a enzima -isopropilmalato dehidrogenase. A linhagem mutante de levedura, leu2, no cresce em meio
de cultura que no contm leucina. Assim quando o gene LEU2 utilizado na
transformao da linhagem leu 2, as clulas desta linhagem que adquiriram o gene LEU2
sero capazes de crescer em meio de cultura deficiente no aminocido leucina. Esta
estratgia semelhante a resistncia ampicilina adquirida por bactrias que foram
transformadas com plasmdeos que contm o gene que promove a resistncia ampicilina.
A tabela a seguir lista alguns dos marcadores de seleo comumente utilizados em
levedura.
28
GENE ENZIMA SELEO HIS3 Imidazol glicerolfosfato desidratase Histidina LEU2 -Isopropilmalato desidrogenase Leucina LYS2 -Aminoadipato redutase Lisina TRP1 N-(5'-fosforibosil)- antranilato isomerase Triptofano URA3 Orotidina-5'fosfato decarboxilase Uracil
Tabela 2. Genes marcadores de seleo em levedura. Os meios de cultura utilizados em geral contm todos os aminocidos necessrios manuteno da levedura com exceo de um. Assim, por exemplo, clulas transformadas com o gene HIS 3 so selecionadas em meio de cultura deficiente em histidina.
Os vetores utilizados na transformao de leveduras so capazes de se propagar
tanto em E. coli quanto em levedura. A manipulao destes vetores (clonagem, mutagnese, seqenciamento, etc) realizada em bactria como para qualquer plasmdeo convencional e ento o mesmo transferido para levedura, organismo onde os ensaios de interesse so
realizados. Tais vetores so denominados vetores do tipo ponte (shuttle vectors) e contm entre outros elementos origens de replicao de bactria e levedura bem como genes
marcadores que funcionam para a seleo nos dois organismos.
Diferentes tipos de vetores so utilizados na transformao de leveduras:
Vetores de integrao: tais vetores contm origem de replicao de bactrias e genes
marcadores para seleo em bactria e levedura. Neste caso o plasmdeo no capaz de
replicar de modo autnomo na levedura. O modo pelo qual este tipo de vetor propagado e
capaz de expressar o marcador de seleo atravs da integrao em um dos
cromossomos de levedura.
Vetores que replicam em levedura: tais vetores tambm contm origem de replicao de
bactria e genes marcadores para seleo em bactria e levedura. Dois tipos de origens de
replicao de levedura so empregadas nestes plasmdeos. O primeiro tipo consiste na
origem de replicao do plasmdeo de 2 m, que de ocorrncia natural em levedura. O
segundo consiste de origens de replicao isoladas de DNA cromossomal denominadas
ARS (Autonomously Replicating Sequence, sequncias de replicao autnoma). Plasmdeos contendo a origem de replicao do plasmdeo de 2m ou sequncias tipo ARS
replicam em mltiplas cpias em levedura (Figura 18). Uma variante deste tipo de vetor inclui, alm da sequncia ARS, uma sequncia tipo centromrica, denominada CEN, que
garante que a replicao destes plasmdeos seja estvel, ocorrendo uma nica vez por ciclo
29
celular e que eles sejam segregados de modo preciso durante a mitose e meiose. Vetores contendo sequncias tipo CEN so mantidos em cpia nica na levedura (Figura 18). YACs: (Yeast Artificial Chromosome, cromossomo artificial de levedura) so uma variao de um vetor de cpia nica, que contm sequncias centromricas (CEN) e sequncias telomricas, que so sequncias das extremidades dos cromossomos. A presena de
sequncias telomricas nestes vetores permite que sejam replicados como molculas lineares, com comportamento semelhante ao do DNA cromossomal. YACs no so
utilizados de rotina em experimentos de clonagem, entretanto, tm se mostrado uma
ferramenta valiosa na caracterizao de grandes segmentos genmicos na medida em que
possvel clonar em um YAC fragmentos que vo de 100 a 2000 kb (Figura 19).
Figura 18. Vetores de levedura. Contm sequncias de plasmdeo (aqui de pUC118) que permitem a propagao e do resistncia a ampicilina em E.coli, o gene de seleo em levedura (neste caso LEU 2) e stios nicos de restrio. Vetores multicpias: Estes plasmdeos existem na forma circular na levedura. Alguns destes vetores empregam a origem de replicao do plasmdeo de 2 m, outros utilizam origens de replicao isoladas de cromossomos que so denominadas ARS. 2m e ARS permitem a replicao do plasmdio em mltiplas cpias. Vetores cpia nica: Vetores que contm origens de replicao tipo ARS podem ser mantidos estavelmente atravs da adio de sequncias centromricas, CEN. A existncia de sequncias tipo CEN assegura que o plasmdeo seja mantido em 1 ou 2 cpias na levedura e segregado de modo preciso durante a diviso celular.
GLOSSRIO - ARS: (autonomous replication sequence, sequncia de replicao autnoma). Sequncia
que funciona como uma origem de replicao em cromossomos de levedura.
- BAC: (bacterial artificial chromosome, cromossomo artificial de bactria). Vetor utilizado na clonagem de DNA genmico, baseado no fator F de plasmdeo que assegura
que o plasmdeo seja mantido em pequeno nmero de cpias na bactria. - Centrmero: regio do cromossomo que apresenta uma constrico e qual liga-se o
fuso mittico durante a meiose ou mitose. necessria para a manutno da estabilidade e segregao correta dos cromossomos durante a diviso celular.
LEU2 LEU2
ARS ARS
Puc118 Puc118
DNA LeveduraDNA Levedura
Cpia nicaCEN
Multicpias
30
- Origem de replicao: regio onde iniciada a sntese de DNA em um dado fragmento de DNA.
- Telmero: extremidade do cromossomo que contm sequncias repetitivas de DNA sintetizadas pela enzima telomerase e importantes na manuteno da integridade
cromossomal.
- YAC: (yeast artificial chromosome, cromossomo artificial de levedura). Sistema de clonagem em levedura que consiste de um vetor linear que tem capacidade de replicao
autnoma e que contm um centromro de levedura e duas sequncias telomricas em
suas extremidades.
Figura 19. YACs: Contm um centrmero, dois telmeros, gene(s) marcadores para seleo em levedura e uma seqncia tipo ARS. Devido presena destas seqncias os YACs so replicados como pequenos cromossomos lineares na levedura.
III. CONSTRUO E USO DE BIBLIOTECAS DE DNA RECOMBINANTE
A obteno de uma molcula de DNA recombinante, atravs da ligao de um
fragmento de DNA de interesse com o DNA de um vetor, um processo direto e
relativamente simples. Entretanto, problemas especiais surgem quando o fragmento de
interesse constitui uma frao pequena do DNA total. Este o caso encontrado comumente
quando o objetivo o isolamento de genes presentes em uma nica cpia num genoma complexo, ou quando o objetivo o isolamento de clones portadores do DNA complementar RNA mensageiro raro. Deste modo, claro que quando queremos clonar
um determinado gene ou o DNA complementar da mensagem ou mensagens por ele
codificado(s) necessrio obteno de colees de clones recombinantes, portadores de
AmpR
TRP1
ARS1CEN4
EcoRI
URA3
+EL+EL HIBam
YAC
31
molculas representantes de todo o genoma, ou de colees de clones de cDNAs derivados
de toda a populao de mensageiros da clula ou tecido de interesse. Essas colees de
clones de DNA recombinante so chamadas de bibliotecas: Biblioteca Genmica, no caso dos clones terem sido obtidos a partir do DNA genmico ou Biblioteca de cDNA, no caso
dos clones terem sido construdos a partir de DNA complementar.
O DNA de organismos superiores bastante complexo: por exemplo, o genoma
haplide de mamfero composto de aproximadamente 3x109 pares de bases (pb). Portanto, se o fragmento de interesse tiver 3000 pb, ele compreender somente 1 parte em
106 de uma preparao do DNA total. De modo similar, uma espcie de RNAm particularmente rara pode compreender somente 1 parte em 105 ou 106 da frao de RNA mensageiros de uma clula. Deste modo, para que seja garantida a presena na biblioteca de pelo menos uma verso de todas as seqncias da populao alvo, um dos pontos principais
na construo de bibliotecas teis a obteno de grandes quantidades de clones. Embora a
soluo deste problema envolva estratgias especficas no preparo do DNA alvo e na
escolha do vetor de clonagem, em linhas gerais a construo de bibliotecas genmicas e de
cDNAs segue um procedimento bsico bastante semelhante. Nos dois casos, o DNA
genmico ou os cDNAs so preparados para a insero no vetor escolhido. O vetor e o
DNA alvo so ligados e introduzidos em E. coli atravs de infeco ou em alguns casos, por
transformao direta (Figura 20).
1. BIBLIOTECA DE cDNA
A descoberta da enzima transcriptase reversa, uma DNA polimerase dependente de
RNA encontrada predominantemente em vrus de RNA de tumor, tornou possvel a sntese
in vitro de DNA usando-se como molde RNAm. O DNA produto dessa reao o DNA
complementar ou cpia da mensagem, abreviadamente chamado de cDNA. A sntese e possvel clonagem de cDNAs contriburam para grandes avanos na anlise da estrutura e
expresso de genes de eucariotos e propiciaram uma revoluo tecnolgica nas indstrias
farmacutica e de alimentos. Esses clones so comumente isolados de bibliotecas de cDNA,
construdas a partir da populao de RNAm isolada da clula ou do tecido de interesse.
Portanto, em comparao com bibliotecas do genoma total essas bibliotecas so
enriquecidas com seqncias gnicas. Uma vez que o cDNA cpia da mensagem, ele no
contm introns e apresenta significativamente poucas seqncias que no codificam para
32
protenas (Figura 21). A ausncia de introns permite que cDNAs relativos a clulas de eucariotos superiores sejam diretamente transcritos e traduzidos em bactrias e em outros microorganismos, permitindo assim a produo em grande escala de polipeptdios
importantes tanto na rea de pesquisa como na rea aplicada. A ausncia de introns tambm
facilita a determinao direta da seqncia da mensagem e subseqente deduo da
seqncia de aminocidos da protena por ela codificada. Isso tem resultado na identificao
da seqncia de uma enorme quantidade de protenas, algumas vezes mesmo antes de terem
sido identificadas gentica ou bioquimicamente.
Figura 20. Passos envolvidos na construo de Bibliotecas de cDNA e Bibliotecas genmicas.
Escolha doVetor
mRNA
Tecido
DNA
cDNA
Digerir o DNA,
Fracionar por tamanho
DNA clonvel
Titulao e caracterizaoda Biblioteca
Ligar DNA a um vetor
Introduzir o produto da ligao em E.coli
Parcial ou completamente
33
Figura 21. Diagrama representando de forma simplificada as diferenas entre um fragmento de DNA genmico e do cDNA relativo a ele.
De modo resumido, o procedimento para a sntese, clonagem e isolamento de cDNAs
especficos envolve 4 etapas:
1) Sntese in vitro de cDNAs de fita dupla a partir de RNAs mensageiros isolados do tecido de interesse.
2) Preparo dos cDNAs para a ligao com o vetor escolhido.
3) Introduo dos cDNA recombinantes nas clulas hospedeiras, onde sero replicados. Isto resultar na amplificao dos recombinantes e dependendo do vetor utilizado, na
expresso das protenas codificadas pelas mensagens que deram origem aos cDNAs.
4) Identificao dos clones de interesse atravs de um processo de triagem dos clones recombinantes.
1.1. Sntese de cDNAs de fita dupla
A construo de uma biblioteca de cDNA inicia-se com o isolamento do RNA total
do tecido e subseqente seleo da frao de RNA poli(A)+, que compreende a maioria das mensagens presentes na clula. O isolamento de RNA poli(A)+ de boa qualidade
34
essencial, uma vez que qualquer degradao do RNAm afetar a representatividade das
seqncias na biblioteca.
Uma vez obtida a frao de RNA poli(A)+, procede-se sntese dos cDNAs atravs de uma srie de reaes enzimticas (Figura 22). Nos ltimos dez anos foram descritos vrios mtodos para sntese de cDNA, cada um apresentando vantagens e desvantagens
particulares. Como exemplo, apresentamos a seguir um procedimento amplamente usado
para esse fim:
a) Sntese da fita de DNA complementar ao RNAm (cDNA) atravs da enzima transcriptase reversa. Essa enzima capaz de catalisar in vitro a polimerizao de DNA a partir RNA e
requer um "primer" com a extremidade 3'OH livre para iniciar a sntese. Na maioria das
vezes, a molcula utilizada como "primer" um oligo (dT), que se anela na cauda poli (A)+ do RNA.
b) Aps a sntese dessa fita de cDNA, o RNAm parcialmente removido, pelo uso da RNase A para cortar pedaos do RNA da molcula hbrida RNA-DNA.
c) Utilizando como "primer" os fragmentos de RNA no digeridos pela RNaseA, a DNA polimerase de E. coli substitui eficientemente o RNA por DNA, resultando em uma
molcula de cDNA de fita dupla.
d) O cDNA fita dupla tratado com T4 polimerase. Atravs da atividade 3'-5' exonuclesica dessa enzima remove-se possveis nucleotdeos extras nas extremidades 3'.
e) O produto final desse conjunto de reaes uma molcula de DNA de fita dupla, cpia exata da mensagem.
1.2. Preparo dos cDNAs para a ligao com o vetor Uma vez obtido o cDNA, o prximo passo prepar-lo para a insero em um vetor
de clonagem (Figura. 22). Para isso tambm existem vrios mtodos disponveis, que diferem entre si dependendo do tipo de vetor escolhido: plasmdio ou fago. O fago tem sido o vetor de escolha para a construo de bibliotecas de cDNA. A razo bsica desta
preferncia a eficincia. Em comparao com plasmdios, o fago requer cerca de 16
vezes menos cDNA por g do vetor para produzir nmero equivalente de clones
recombinantes. Alm disso, bibliotecas em fago so mais fceis de serem manipuladas do
35
que bibliotecas em plasmdios. Entretanto, uma desvantagem dos vetores que no so favorveis para procedimentos de seqenciamento do DNA e de mutagnese dirigida. Mais
recentemente, outro tipo de vetor foi idealizado para suprir essas deficincias. Essa classe
de vetores compreende os fagemdios que, como o prprio nome sugere, so plasmdios
contendo pores do genoma de fago e que renem vantagens desses dois vetores.
Figura 22. Sntese de cDNA fita dupla.
Para dar uma noo dos passos implicados na clonagem do cDNA relatamos a seguir
um procedimento adotado para a clonagem de cDNA em fago .
metilao dos stios de EcoRI atravs do tratamento do cDNA com EcoRI, na presena de
S-adenosil metionina. Esse passo essencial para proteger os stios EcoRI que possam
existir no cDNA contra a ao da EcoRI em digesto a ser realizada subseqentemente
no processo de clonagem.
adio de adaptadores, com o stio EcoRI, nas duas extremidades do cDNA. Essa reao
resulta em molculas de cDNA com adaptadores mltiplos ligados nas duas pontas (ver figura 23).
36
um nico stio de EcoRI produzido em cada ponta do cDNA pela digesto com EcoRI,
liberando o excesso de adaptadores ligados na molcula. A metilao prvia do cDNA
garante que no haja digesto interna do cDNA.
antes de ser inserido no vetor, o cDNA separado do excesso de molculas de
adaptadores. Isso feito atravs de filtrao em colunas de Sephadex.
as molculas de cDNA so ligadas ao vetor, atravs de reao com T4 ligase.
o produto da ligao empacotado com as protenas formadora do capsdeo do fago.
os fagos obtidos so utilizados para infectar bactria de linhagem que favorece o
crescimento dos recombinantes.
aps a infeco da bactria com os cDNA recombinantes temos como produto uma
biblioteca de cDNA, que deve conter cpias de toda as seqncias de RNAm da
populao original. Essa biblioteca pode ser estocada na geladeira, ou submetida a uma
triagem em busca do clone de interesse.
2. BIBLIOTECA GENMICA
Para se obter informaes sobre a estrutura molecular de um gene de eucariotos
necessrio o isolamento da poro do DNA genmico que contenha toda a unidade de
transcrio, mais as regies flanqueadoras onde se localizam os elementos controladores da
expresso desse gene. O modo mais eficiente para se conseguir isolar essa poro do DNA
atravs do uso de uma biblioteca genmica, que deve conter clones portando fragmentos
de DNA representantes de todo o genoma do organismo em questo. Deste modo, o
aspecto principal considerado na construo de uma biblioteca genmica est na obteno
de um nmero grande de clones portando fragmentos do genoma, obtidos aleatoriamente. O
tamanho necessrio de uma biblioteca genmica, para que um dado fragmento de interesse
esteja entre os fragmentos clonados, determinado pelo tamanho do fragmento clonado e pelo tamanho do genoma. Deste modo, a estratgia bsica na construo de bibliotecas
genmicas busca minimizar o nmero de clones necessrios atravs da clonagem de
fragmentos de DNA de maior tamanho possvel, e maximizar a eficincia da clonagem,
37
atravs da utilizao de vetores baseados no fago . Basicamente, a construo da biblioteca genmica envolve os seguintes passos:
a) isolamento de DNA de alto peso molecular, que posteriormente quebrado de modo a produzir fragmentos de tamanho compatvel com o vetor de clonagem.
b) ligao desses fragmentos no vetor e introduo dos recombinantes obtidos nas clulas hospedeiras.
Figura 23. Clonagem de cDNA em fago .
Dentre esses passos, o modo de preparo dos fragmentos a serem clonados (insertos) merece ser discutido criticamente dada sua importncia na representatividade da biblioteca.
1
5 6
2 3
4
7 8 9
Me
Me
Metilao do cDNA para protegeros stios internos de RIEco
Ligao dos adaptadores RIcom o cDNA
Eco Digesto com RI paragerar stios coesivos RI
EcoEco
Separao do cDNA do excesso deadaptadores
cDNA purificado Ligao do cDNA dos braosdo fago lambda
Empacotamento dos recombinantescom as protenas formadoras dapartcula viral
Infeco da bactria hospedeira o fago recombinante
Plaqueamento dos recombinantes
38
2.1. Preparo do DNA do inserto
A representatividade de uma biblioteca genmica depende grandemente da
aleatoriedade com que os fragmentos a serem clonados so gerados, para que no haja excluso sistemtica de nenhuma seqncia. O fracionamento mecnico do DNA o meio
de se obter completa aleatoriedade na fragmentao do DNA. Entretanto, esse mtodo no
comumente adotado devido trabalhosa manipulao necessria para que os fragmentos
assim obtidos possam ser inseridos no vetor. Com bom senso e cuidado possvel conseguir
fragmentao suficientemente aleatria atravs de digestes parciais do DNA com enzimas
de restrio. Uma vantagem em se utilizar a digesto parcial do DNA a produo de
fragmentos com pontas coesivas e que, portanto, podem ser diretamente ligados ao vetor.
Para garantir que a digesto atinja todo o genoma so utilizadas enzimas de restrio que cortam freqentemente o DNA e que no apresentam desvios de distribuio de stios. A
enzima Sau3A I, que reconhece o stio de 4 bases GATC, e que gera fragmentos
compatveis com stios de clonagem de vrios fagos e cosmdios, tem provado ser bastante
til na produo de bibliotecas de DNA genmico digerido parcialmente. Aps a digesto
parcial, os fragmentos gerados precisam ser fracionados antes de serem ligados ao vetor.
Sem esse fracionamento, fragmentos pequenos podero ligar-se entre si produzindo falsos
recombinantes. Fragmentos muito grandes que no permitem o crescimento do fago
podero ligar-se aos braos do fago, alterando a relao entre as quantidades de DNA de
inserto e vetor.
Um mtodo de fracionamento freqentemente adotado o de centrifugao em
gradiente de sacarose. Aps a digesto parcial, a soluo de DNA aquecida para que
possveis fragmentos agregados se dissociem, e ento, aplicada sobre um gradiente de
sacarose de alta salinidade. Aps a centrifugao, so coletadas fraes desse gradiente.
Essas fraes so analisadas por eletroforese em um gel de agarose. As fraes contendo os
fragmentos de DNA de tamanho apropriado so utilizadas para a ligao com o vetor. A
figura abaixo ilustra esse procedimento.
39
Figura 24. Mtodo para fracionamento do DNA por centrifugao em gradiente de sacarose. O gradiente aspirado, de baixo para cima, com ajuda de uma bomba peristltica. A poro mais densa do gradiente contendo o DNA de maior peso molecular, aspirada primeiro.
Uma vez garantida a aleatoriedade dos fragmentos clonados, bastante razovel se
pensar que a probabilidade de uma dada seqncia de interesse estar presente em uma
biblioteca genmica possa ser estimada estatisticamente, com base na distribuio de
Poisson. Especificamente, o nmero de clone independentes (N) que precisam ser triados para uma probabilidade (P) de se isolar uma seqncia especfica dada por:
N = ln(1-P)/ ln[1-(I/G)]
onde I o tamanho mdio dos fragmentos clonados, em pares de base, e G o tamanho do
genoma, em pares de base.
Deste modo, precisamos triar cerca de 690.000 clones de uma biblioteca que usa
como vetor um fago , para termos 99% de chance de isolar qualquer dada seqncia presente em uma nica cpia em um genoma tpico de mamfero.
N = ln(1-0,99)/ln[1- (2x104/3x109)]= 690.000
2.2. Vetores utilizados na construo biblioteca genmica
Fagos e cosmdeos so comumente usados na construo de bibliotecas genmicas.
Nos dois casos, fragmentos grandes de DNA gerados por fragmentao aleatria so ligados
com o DNA do vetor para formar concatmeros que podem ento ser empacotados em
partculas de fago . As bibliotecas construdas em vetores so armazenadas e propagadas
1
Tubo de plsticoTubo capilar
Tubos de coleta
Bomba
Gradiente desacarose 2 3 4 5
40
na forma de fagos recombinantes. No caso de clonagem em cosmdios, entretanto, essas
partculas virais servem meramente como veculos para introduzir o DNA recombinante
dentro da bactria. Uma vez dentro da bactria o cosmdio se comporta como um plasmdio
grande. Os cosmdios podem aceitar insertos de aproximadamente 45kb, quase duas vezes o
tamanho dos insertos clonveis em fago . Deste modo, usando-se o cosmdio como vetor, necessrio gerar somente 350.000 recombinantes para atingir 99% de probabilidade de uma seqncia de cpia nica estar representada em uma biblioteca genmica de mamfero.
Entretanto, bibliotecas em cosmdios so mais difceis de se construir e manter do que as
bibliotecas de fagos. Cosmdios so ento usados quando o gene de interesse muito
grande ou quando uma regio extensa do DNA cromossomal desejada. No caso de isolamento rotineiro de segmentos de genes ou em circunstncias onde a biblioteca ser
usada muitas vezes, o uso de vetores mais recomendado.
Na figura abaixo apresentamos um diagrama da estrutura de um vetor tipo , bastante utilizado na construo de bibliotecas genmicas.
Figura 25. Estrutura do vetor EMBL3. BE=brao esquerdo; BD=brao direito; stuffer= fragmento central; S=SalI; B=BamHI; E=EcoRI.
Conforme indicado no diagrama este vetor apresenta um fragmento central
flanqueado por dois fragmentos essenciais (direito e esquerdo). O fragmento esquerda, chamado de brao esquerdo, codifica para as protenas do capsdeo e o fragmento direita,
chamado de brao direito, contm a origem de replicao do fago e promotores de outros
genes essenciais. Entre o fragmento central e os dois braos encontram-se os stios de
restrio utilizados na clonagem - SalI, BamHI, EcoRI - em orientao inversa.
5'5'3'
3'BE
BE=brao esquerdo BD=brao direito
B BS E E S
BDFragmento centralcos cos
41
Como todo fago , a extremidade de cada brao apresenta um segmento de fita simples (cos). Esses segmentos so complementares entre si e permitem a recircularizao da molcula, e a conseqente replicao do DNA do fago dentro da clula hospedeira.
Esse tipo de vetor chamado de vetor de substituio por que no processo de
clonagem a parte central do DNA do fago substituda pelo fragmento de DNA a ser
clonado, originando a molcula recombinante.
Mais recentemente outros vetores com capacidade para grandes insertos foram
desenvolvidos. Os cromossomos artificiais de levedura (YACs) so molculas lineares de DNA cuja arquitetura mimetiza a estrutura de um cromossomo autntico (Figura 26). Os YACs recombinantes so criados pela ligao de fragmentos grandes de DNA genmico
exgeno (at 2000 kb) com os dois "braos" do vetor YAC e o produto da ligao introduzido na levedura por transformao. Nos YACs recombinantes, o segmento de DNA
genmico exgeno flanqueado de um lado por um centrmero, uma origem de replicao
e uma marca de seleo e pelo outro lado, por uma segunda marca de seleo. As leveduras
transformantes com cromossomo artificial so selecionadas como colnias em meio com as
drogas de seleo.
Os cromossomos artificiais de bactrias (BAC) so molculas de DNA circulares que carregam uma marca de seleo a antibitico. Os segmentos de DNA genmico
exgeno so clonados no vetor BAC in vitro e o produto da reao de ligao introduzido
por eletroporao em cepas de E. coli, onde mantido como um plasmdio de cpia nica.
Os vetores BACs carregam marcadores que permitem a discriminao dos clones vazios e
cheios. A mdia de tamanho dos clones de BACs 120 kb, mas alguns clones podem
chegar 300kb.
Os vetores de bacterifago P1 acomodam fragmentos genmicos de 70 a 100Kb. Neste sistema, as molculas lineares recombinantes geradas a partir de seqncias do vetor
e do genoma so empacotadas in vitro em bacterifago P1. Aps a injeo em E. coli, as molculas se tornam circulares pela atividade de uma recombinase, que promove a
recombinao de seqncias especficas presentes no vetor. Estes vetores carregam marca
de seleo para antibitico, marca de seleo positiva para seleo dos clones com inserto
de DNA genmico exgeno e uma origem de replicao plasmdial P1, que mantm uma ou
duas cpias dos plasmdios recombinantes na clula. Uma segunda origem de replicao
pode ser ativada para amplificao dos plasmdios antes do isolamento do DNA.
42
Figura 26. Construindo um cromossomo artificial de levedura (YAC). O vetor YAC carrega uma origem de replicao (ORI), um centrmero (CEN), dois telmeros e marcas de seleo (X e Y). Lehninger, Principles of Biochemistry. Figura 29-16, p. 1139.
Os cromossomos artificiais P1 combinam as caractersticas dos bacterifagos P1 e
dos BACs, incluindo a marca de seleo positiva e as origens de replicao do bacterifago
P1. Os clones circulares recombinantes de PACs gerados durante a reao de ligao in
vitro so introduzidos em E.coli por eletroporao e mantidos como um plasmdio de cpia
nica na clula. Os insertos da biblioteca de DNA do genoma humano em PACs variam de
60kb a 150kb.
43
IV. DETECO E ANLISE DO CLONE RECOMBINANTE Um passo crucial na Tecnologia do DNA recombinante encontrar o clone correto
na mistura de clones que foi criada durante os procedimentos da confeco da biblioteca
genmica ou de cDNA. Embora seja relativamente fcil selecionar as colnias que abrigam os vetores de clonagem usando os marcadores de resistncia a antibiticos que esto
presentes nos vetores (Figura 27A), muito mais difcil selecionar o clone que contenha o gene de interesse. Note que no caso do vetor ser um plasmdio devero ser examinadas
milhares de colnias de bactrias crescidas em placas de petri contendo agar, para a
deteco daquela(s) colnia(s) que produza(m) pequenas quantidades da protena expressa pelo gene de interesse ou ento que possua(m) o gene de interesse sem qualquer expresso protica que o caracterize (Figura 27B). Ser discutida inicialmente a situao na qual a protena expressa no hospedeiro. Em seguida ser discutida a situao mais comum onde a
protena no expressa e a anlise ser feita atravs da prpria presena do DNA de
interesse no fago ou na bactria.
1. QUANDO O GENE DE INTERESSE EXPRESSO NO HOSPEDEIRO Se o gene de interesse capaz de se expressar na clula hospedeira pode-se
identificar o clone que carrega este gene pela presena desta protena entre as colnias
recombinantes. Para isto, o hospedeiro no deve produzir esta protena, a menos que ele
carregue o clone que a produza. Se esta protena for produzida normalmente pela clula
hospedeira, ser ento necessrio o uso de uma clula hospedeira defectiva ou mutante para
o gene de interesse. Quando este gene for incorporado ele pode ser detectado por complementao daquela funo. Se a protena a ser detectada for especfica de mamfero,
por exemplo, a clula hospedeira j ser naturalmente defectiva. Se a protena for uma enzima que catalisa uma reao mensurvel pode ser possvel triar as colnias por sua
atividade enzimtica.
Se a protena de interesse no for uma enzima com funo detectvel, uma outra
estratgia ser necessria para a identificao do clone correto, como por exemplo, o uso de
um anticorpo especfico para a protena de interesse. Anticorpo uma protena do soro
produzida pelos mamferos que se combina com alta especificidade com outra protena, o
antgeno. Neste caso, a protena de interesse o antgeno. Como o anticorpo se combina
especificamente com o antgeno, se o antgeno estiver presente em uma ou mais colnias de
44
uma placa de petri, a identificao destas colnias poder ser feita observando-se a reao
antgeno-anticorpo.
Figura 27. Em A, estrutura do plasmdio pBR322, um tpico vetor de clonagem. Em B, mtodo da inativao insercional para isolar plasmdios contendo DNA exgeno. A insero do DNA exgeno no plasmdio pBR322 causa inativao da resistncia tetraciclina, permitindo o isolamento de transformantes contendo o fragmento de DNA clonado (B). Lehninger, Principles of Biochemistry. Figura 29-6, p. 1126.
Para que o antgeno seja produzido na clula hospedeira a biblioteca de cDNA ter de ser construda num vetor de expresso. Neste caso os cDNAs so inseridos nestes vetores em regies que promovam sua expresso em E.coli, normalmente em promotores
que possam ser regulados. Esta protena antignica ser expressa como uma protena de fuso, ou seja, ser sintetizada subseqente a alguns aminocidos pertencentes protena do vetor bacteriano. Estas protenas de fuso so geralmente mais estveis que a
45
correspondente protena de eucarioto produzida em bactria e, portanto podem ser obtidas
em grande quantidade. Para visualizar a produo destas protenas, uma parte dos fagos de
cada placa de lise (ou bactrias) recombinantes desenvolvidos numa placa de Petri so transferidos (como um carimbo) para uma membrana de nitrocelulose, tratados para expor suas protenas e ento submetidos a uma soluo contendo um anticorpo especfico para a
protena desejada. Depois que os anticorpos livres so removidos, um segundo anticorpo adicionado para localizar a posio do primeiro. O segundo anticorpo normalmente
radioativo e pode ser identificado por autoradiografia utilizando-se um filme de raio X. Se
uma colnia radioativa estiver presente, uma mancha no filme de raios-X ser observada
depois que o filme for revelado (Figura 28). A localizao desta mancha no filme corresponde localizao da colnia que produziu aquela protena, na placa de petri
original. Esta colnia ser ento recuperada da placa original e cultivada.
Uma limitao deste procedimento que o anticorpo utilizado nesta triagem precisa
ser especfico para a protena de interesse. A produo de anticorpos pode ser obtida pela
injeo da protena (antgeno) em um animal. No entanto, esta protena injetada deve ser pura, caso contrrio mais que um anticorpo ser formado.
2 O USO DE SONDAS MOLECULARES DE CIDOS NUCLICOS PARA IDENTIFICAR O GENE DE INTERESSE
Como pode ser detectado um gene de interesse entre as colnias da biblioteca
genmica ou de cDNA, se este gene no expresso?
Quando o DNA em soluo aquosa aquecido 100C, ou exposto pH alto, as bases complementares que normalmente seguram as duplas hlices juntas so dissociadas em duas fitas simples. Este processo chamado de desnaturao. Estas mesmas fitas
simples podero se reassociar se forem conservadas 65C, por longos perodos, num
processo chamado de renaturao (ou hibridao, quando a associao ocorre entre cidos nuclicos de diferentes origens). Reaes de hibridao ocorrem entre quaisquer duas cadeias de cidos nuclicos de fita simples (DNA:DNA, RNA:DNA ou RNA:RNA) desde que tenham seqncias de nucleotdeos complementares.
46
Figura 28. Triagem de bibliotecas de expresso com anticorpos. Se o inserto estiver na orientao correta e na apropriada seqncia aberta de leitura traduzido em protena de fuso (antgeno). Os anticorpos identificam as placas de lise especficas destes antgenos.
Promotor
EcoRI lac
-Galactosidasegfll
EcoRI
EcoRI EcoRI
EcoRIlinker
cDNA
Proteina de Fuso
Empacotamento dos fagos e plaqueamento em
camada bacterianain vitro
Membrana denitrocelulose
Placas de lise
Nitrocelulosesobre as placasde lise
Remoo damembrana
Protenas se ligama nitrocelulose
Incuba membrana com anticorpo primrio
Lava membrana
Incuba membrana comanticorpo secundrio
anticorpo secundrio
anticorpo primrio
Filme de raio-X
""
47
Este princpio da hibridao molecular fundamental para caracterizar DNAs
recombinantes quando o gene de interesse no expresso. Sondas de cidos nuclicos
(fragmentos de cido nuclico marcados radioativamente, geralmente com 32P) so utilizadas para localizar clones, numa biblioteca genmica ou de cDNA, que carreguem
uma seqncia de DNA de interesse. Aps a confeco da biblioteca genmica (ou de cDNA) os fagos carregando DNA recombinante so espalhados juntamente com uma suspenso de bactrias numa placa de petri contendo meio de cultura slido. Uma vez
visualizada as placas de lise (ou as colnias, no caso do vetor ser um plasmdio) preparada uma rplica de cada placa de petri com uma membrana de nilon ou de nitrocelulose. Este
processo permite a transferncia de uma poro de fagos de cada placa de lise (ou de bactrias de cada colnia) para a membrana, de tal maneira que o padro das placas de lise da placa de petri original seja mantido na membrana. Para identificar qual das placas de lise porta o gene de interesse esta membrana tratada para expor e desnaturar o DNA das
colnias ali presentes e incubados com uma soluo de DNA ou RNA fita simples, marcada
radioativamente e complementar ao gene de interesse para permitir a hibridao. Dois
polinucleotdios simples fitas somente iro se hibridar se forem complementares. A
localizao da placa de lise que se hibridou sonda determinada aps a exposio da
membrana a um filme de Raios-X (autoradiografia) e a comparao deste filme com a disposio das colnias na placa de petri original (Figura 29).
Esta sonda molecular radioativa pode ser parte de um gene j clonado para o qual se procura o gene total, pode ser o DNA de um gene vizinho ao gene de interesse, pode ser o
RNA de genes que so expressos em tecidos especficos ou em estgios especficos do ciclo
celular, ou mesmo o gene de uma outra espcie que codifica para a mesma protena. Neste
ltimo caso, a reao de hibridao pode ser realizada em baixa temperatura (420C ao invs de 650C) e em baixa concentrao de sal (baixa estringncia) para permitir a hibridao mesmo entre DNAs que tenham algumas bases no complementares.
48
Figura 29. Triagem de uma biblioteca genmica ou de cDNA, construdas no fago , com uma sonda molecular para encontrar um clone de interesse. Esta triagem feita espalhando-se os fagos previamente incubados numa cultura de bactrias, em vrias placas de agar. Depois que as placas de lise tornam-se visveis, so feitas as rplicas em membrana de nitrocelulose, seu DNA exposto e hibridizado com a sonda molecular. A posio do clone recombinante de interesse identificada atravs de autoradiografia. O DNA isolado dos fagos presentes na placa de lise positiva, identificada na placa de petri original e submetida a anlises posteriores.
Membrana denitrocelulose
Placas de lise Fagos absorvem anitrocelulose
Placa mestra
Membrana rplica
Sonda de cidonucleico marcadacom 32p
Sonda HibridizaDNA ligado ao filtro
Lavagem das sondasno incorporadas
Sonda hibridiza ao DNA do fagoque contem a sequncia complementar Filme de raio-X
Placa mestra
DNA lambdaisolado da placa delise
DNA clonado
Clone lambda purificado
49
Genes que respondem a um mesmo mecanismo de regulao podem ser identificados
numa biblioteca de cDNA por hibridao diferencial. Isto , genes expressos em tecidos
especficos, em estgios especficos do desenvolvimento ou do ciclo celular e genes
regulados por fatores de crescimento so adequados para serem analisados por este tipo de
abordagem. Para esta identificao necessrio produzir duas populaes celulares (ou extrair mRNA de dois diferentes tecidos) uma na qual eles no se expressam e outra na qual eles se expressam. Suponha por exemplo, que uma biblioteca de cDNA seja preparada usando o mRNA isolado de clulas tratadas com fatores de crescimento. Esta biblioteca
plaqueada e transferida para dois conjuntos de membranas de nitrocelulose. Um conjunto ensaiado com DNA marcado radioativamente preparado por transcrio reversa do RNA
das clulas tratadas com os fatores de crescimento. O outro conjunto de filtros hibridado com cDNA preparado de clulas no tratadas. Clones positivos identificados por hibridizar
mais fortemente com a primeira sonda codificam mRNAs induzveis pelos fatores de
crescimento (Figura 30). Quando o DNA a ser clonado expressa uma protena cuja seqncia conhecida
pode-se inferir a seqncia de um trecho de DNA que lhe deu origem e sintetizar
oligonucleotdeos que lhe sejam complementares para serem utilizados como sondas moleculares. Estes nucleotdeos devem ter pelo menos 17 a 20 nucleotdeos de
comprimento para ser especfico para a seqncia procurada. Um problema enfrentado para
sintetizar estes oligonucleotdeos a degenerecncia do cdigo gentico. Alguns
aminocidos so codificados por quatro ou mesmo seis diferentes cdons e, portanto mesmo
um pequeno polipeptdio pode ter sido codificado por vrias seqncias de DNA. Para
contornar este problema as sondas oligonucleotdicas so algumas vezes sintetizadas como
uma mistura de todas as possveis combinaes dos cdons que so traduzidas naquela
seqncia protica (Figura 31). Uma destas seqncias correta e ir hibridar com o clone de interesse, mas a possvel hibridao dos outros oligonucleotdeos com seqncias sem
interesse pode levar a obteno de clones falsos positivos.
Uma variao deste mtodo utilizar o menor nmero possvel de oligonucleotdeos
como sonda, escolhendo a regio da protena que contm o menor nmero possvel de
cdons degenerados (por exemplo, metionina somente codificada pelo cdon AUG). Deve-se levar em conta tambm qual o cdon de uso mais freqente para cada
aminocido, na espcie que est sendo analisada.
50
Figura 30. Clonagem de genes regulados por fatores de crescimento atravs de hibridao diferencial. Esta estratgia utilizada para clonar uma famlia de genes que so induzidas quando clulas quiescentes so estimuladas a crescer pela adio dos fatores de crescimento.
AAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAA
Clulas com fatoresde crescimento
Clulas Quiescentes
Cresce em 3 hsIsola o mRNA poli(A)
Isola o mRNA poli(A)
mRNA induzido pelosfatores de crescimento
Oligo(dt)TranscritaseReversa32p-dNTPA
hibridao
Oligo(dt)TranscritaseReversa32p-dNTPA
hibridao
Prepara bibliotcade cDNA com fagolambda e infecta Ecoli
Placa mestra
Rplica em membrana de nitrocelulose
Autoradiogrfia Autoradiogrfia
Filmede raio-X
Filmede raio-X
cDNAcomum Clone de cDNAindusvel por
fatores de crescimento Isola o clone
do fago
Placa mestra
Hibridaonegligenciavel
51
Figura 31. Desenho de sondas oligonucleotdicas baseadas na seqncia protica. Como a maioria dos aminocidos especificada por dois ou mais cdons estes oligonucleotdeos so sintetizados usando-se uma mistura dos nucleotdeos das posies ambguas. A seqncia correta estar representada entre os oligos. Uma outra possibilidade usar uma sonda tentativa cuja escolha baseada na freqncia de uso do cdon na espcie em estudo. Neste caso pareamentos incompletos podem ocorrer.
3 ANLISE DO DNA E RNA POR ELETROFORESE EM GEL E BLOTTING Vrias tcnicas foram desenvolvidas baseadas nas propriedades de hibridao dos
cidos nuclicos visando a triagem e isolamento de seqncias especficas destas molculas.
A maioria destas tcnicas, conforme j mencionado, trabalha com uma rplica do DNA de interesse imobilizado num suporte slido tal como uma membrana de nilon ou de
TG -ATG-GA -GA -ATG-AA -AG -AA -ATTTC
CT
AG
AG
AG
CT
A
C
CGACGT
TGTATGGATGAAATGAA
TGTATGGACGAAATGAATGCATGGACGAAATGAA
TGCATGGATGAAATGAA
TGTATGGATGAGATGAA
TGTATGGATGAGATGAA
TGCATGGACGAGATGAATGCATGGATGAGATGAA
TGCATGGACGAGATGAAGCGCAACATC
TGCATGGACGAAATGAA
TGCATGGACGA ATGAAGCGCAA ATC
---ACGTACCTGCTTTACTTCGCGTTATAG---
---ACGTACCTGCT TACTTCGCGTT TAG---
5'
5'
5'
3'
3'
3'G C
T A
Cys-Met-Asp-Glu-Met-Lys-Arg-Asn-Ile Sequncia Parcialde Aminocidos
Sequncias Possveisdo DNA
Parte da sequncia compouca ambigidade
Sondas contendotodas as possveis combinaes
de condons de parteda sequncia
Sonda tentativa
Hibridao com cDna
52
nitrocelulose. Um destes mtodos, desenvolvido na dcada de 70 por E. M. Southern,
tornou-se conhecido por "Southern blotting". Nesta tcnica o DNA digerido com uma ou mais enzimas de restrio e os fragmentos resultantes separados por eletroforese num gel de
agarose. Os fragmentos de DNA dupla fita so visualizados por colorao com brometo de
etdio, desnaturados 'in situ' com hidrxido de sdio e transferidos para uma membrana por
capilaridade, com o auxlio de uma soluo de alta concentrao salina. Tais condies
permitem que o DNA seja retido na membrana no ponto de contacto entre o gel e a membrana, criando uma rplica do gel. O DNA covalentemente ligado membrana
usando-se calor ou luz ultravioleta. Sondas de cidos nuclicos (DNA ou RNA marcados radioativamente) podem ser utilizadas para hibridar com o DNA fixado na membrana e a posio na qual a ligao especfica ocorrer pode ser detectada por autoradiografia da
membrana (Figura 32). O padro de hibridao pode ser comparado diretamente com a regio no gel original que contm a seqncia de DNA de interesse. Southern blotting
uma tcnica to poderosa que permite que as informaes obtidas sejam utilizadas para a construo de um mapa de restrio de uma determinada parte do DNA clonado, por
exemplo, para identificar a regio que contm o gene de interesse. Esta tcnica possibilita
tambm que as sondas de cidos nuclicos sejam utilizadas para diagnsticos de distrbios genticos, ensaiando-se o DNA genmico