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Aplicações da Proteômica em diversas linhas de pesquisa na

área Biomédica

Proteoma ou Proteômica

Definição:

Análise simultânea de misturas complexas de proteínas como extratos de lisados celulares ou de tecidos, assim como fluidos biológicos, visando a identificação e/ou medir as mudanças do nível de expressão de proteínas em diferentes condições fisiológicas e/ou patológicas.

Conjunto das proteínas expressas por uma célula é bastante dinâmico e dependerá das condições particulares/ ou do momento fisio/patológico da mesma.

Aplicações: - Descoberta de novas drogas, - Estudos em patologia, - Diagnóstico, - Terapias, - Microbiologia,- Bioquímica, - Fisiologia de plantas, - Controle de qualidade.

Esquema geral de identificação de proteínas

Genômica x Proteômica

• A Genômica possibilitou o sequenciamento de alta performance de diferentes gens de diversos organismos. Porém não resolveu questões importantes relativo á função de várias proteínas.

• “Podemos ver o Genoma como a descoberta dos hieróglifos que ainda necessitam ser decifrados”

Histórico do sequenciamento de genomas

1977- bacteriófago phi-x174 (5386bp) foi 1. organismo sequenciado.

Sanger et al [Nature 246, 687 (1977)].

1982- bacteriophage lambda (48,502bp) Sanger et al [J. Mol. Biol. 162, 729 (1982)]

anos 80 - genoma mitocondrial, 16kb; Epstein Barr virus, 172kb; human

cytomegalovirus, 229kb

1980’s- final: desenvolvimento de sequenciadores automáticos

1991- menos de 2,000 gens de proteinas humanas conhecidos

1995- 1o. genoma de um organismo de vida livre 1995

bactéria Haemophilus influenzae Rd KW20- 1,8 Mbases

2004 – 160 genomas bacterianos completos, de 130 espécies

19 genomas de archae completos

28 genomas de eucariotos, completos, ou alguns cromossomas completos cromossomas completos, incluindo:

• homem

• camundongo (rato sendo sequenciado)

• 3 plantas: Arabidopsis thaliana e 2 variedades de arroz

• 2 peixes

• 6 protozoários

• 3 artrópodos incluindo Drosophila melanogaster

• 6 fungos

• nematódios, alga, cryptomonas

Gen humano típico: 5 ou 6 introns, tamanho médio dos introns: 2100bp (alguns com 100000 bp)

tamanho médio dos exons: 125bp

Exons de gens celulares: 5% genoma humano

Dados sobre composição do genoma: grande extensão de introns x exons

Dados sobre composição do genoma: tamanho e número de gens

Homem: 30.000 gens 2,8 x 109 bp

Arroz (Oryza sativa): 20.000 gens 3,7 x 108 bp

Drosophila melanogaster:13.600 gens 1,8 x 108 bp

Escherichia coli: 5.300 gens 4,6 x 106 bp

Comparando Homem e E. coli tem-se que:

número de gens: 5,7x tamanho do DNA: 610 x

questão 1: 1 transcrito primário podendo corresponder a mais de um mRNA, e portanto mais de uma proteina

questão 2: 1 mRNA não sendo eficientemente traduzido, como ocorre em alguns casos de transferência lateral

questão 3: alguns RNAs ficam longo tempo sem ser traduzidos em células eucarióticas

questão 4: processamento pós-traducional: várias proteinas, com atividade distinta, vindo do mesmo gen

Um gen vários produtos !

Pos-GenPos-Genôômicamica

GenomicaGenomica Funcional Funcional

ProteômicaProteômica

Genomica EstruturalGenomica Estrutural

DNA-MicroarrayDNA-MicroarrayGel ElectroforesGel Electroforesee 2D 2D

Espectrometria de Massa Espectrometria de Massa Sequenciamento de ProteinaSequenciamento de Proteina

CrystallograCrystallografia de fia de X RayX RayNMRNMR

Sequência - Forma - FunSequência - Forma - Funçãoção

Rede Proteômica

Problemas Biológicos

Gel 2D Cromatografia Gel 2D Gel 2D Gel 2D

Maldi - Tof Maldi - Tof

MS-MS: ESI-Q-Tof MALDI TOF-TOF

Expressão

Cristalização

NMR X- rays

Purificação de Proteína

Bioinformatica

Microarray

Abordagens em ProteômicaAbordagens em Proteômica• Proteômica de ExpressProteômica de Expressãoão

– EExpressão Diferenxpressão Diferenccialial

• Proteômica FuncionalProteômica Funcional– Interação Proteina-ProteinaInteração Proteina-Proteina

– Vias de SinalizaçãoVias de Sinalização

– Modificação PósModificação Pós- traducional- traducional

• Proteômica QuantitativaProteômica Quantitativa

UFP

UFP UFP UFP UFP UFP

UEM-MALDI-TOF

Bio

info

rmát

ica

UFP

UEM-MS-MS UEM-MALDI-TOF

IDENTIFICAÇÃO

UNIDADES DE EXPRESSÃO,

PURIFICAÇÃO E CRISTALIZAÇÃO DE PROTEÍNAS

1) Departamento de Bioquímica Médica - ICB-UFRJ - Russolina Benedeta Zingali

2) Unidade Multidisciplinar de Genômica - IBCCF - UFRJ - Paulo Mascarello Bisch

3) Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, UFRJ - Gilberto Domont

4) Instituto Oswaldo Cruz / FIOCRUZ - Jonas Perales

5) Universidade Norte Fluminense - Elias W. Alves

LaboratorLaboratoriosios Associa Associadosdos

1) Unidade de Apoio em Espectrometria de Massa - Departamento de Física - PUC/RJ - Enio Frota da Silveira

2) Unidade de Apoio de Genômica Estrutural - Centro Nacional de Ressonância Magnética Nuclear de Macromoléculas - ICB/UFRJ - Jerson Lima Silva

3) Laboratório Associado - Agrobiologia - EMBRAPA - RJ - José Ivo Baldani

Unidades de FracionamentoUnidades de Fracionamento e e Identifica Identificaçãoção

PROJECTOS :

1. Proteômica de toxinas animais :Jonas Perales (FIOCRUZ), Gilberto Domont, (DQ-IQ/UFRJ), Russolina Benedeta Zingali (DBM/ICB/UFRJ), Elias W. Alves (UENF)

2. Expression Proteomics of Vibrio cholerae :Wanda Maria Almeida von Krüger, Ana Beatriz Furlanetto Pacheco (UMGe/IBCCF/UFRJ), Ana Coelho (DG/IB/UFRJ) 3. Proteomics of viral infection ( dengue virus): Mônica Montero Lomeli, Andréa Thompson Da Poian, Russolina Benedeta Zingali, (DBM/ICB/UFRJ)

4. Proteome analysis of Gluconacetobacter diazotrophicus :Elias W. Alves (UENF), José Ivo Baldani, Kátia Regina dos Santos Teixeira, (EMBRAPA/RJ), Paulo Ferreira, Adriana Hemerly (DBM/UFRJ)

Bothrops insularis snake venom proteins identified by peptide mass fingerprinting

after 2D SDS-PAGE • Objetivo: caracterização das proteínas

presentes no veneno para identificação de novos princípios ativos.

• Metodologia: separação por 2-D identificação de proteínas por Mapa peptídico e por sequenciamento TOF-TOF

(Busca a partir dos dados da biblioteca de cDNA e ESTs do Dr. Paulo Lee Ho´s)

94,0-

67,0-

43,0-

30,0-

20.1 -

14.4 -

kDa

494 detected spots

Spot 489

Lectin

Spot 434

Lectin like c-type

Spot 394 PLA2

Spot 433, 427, 429

Lectin

Spot 459

Lectin

GEL MASTER Bothrops insularis

799.0 1439.4 2079.8 2720.2 3360.6 4001.0Mass (m/z)

1274.2

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

tens

ity

Voyager Spec #1=>BC=>NR(2.00)=>MC[BP = 1241.5, 1274]1241.5192

1574.7037

1993.9327

2211.0449

1257.5796 2225.05711475.7627 2283.0930 2564.0933

1707.74321417.6908842.5240 3338.69971179.6036 2705.03321908.7714 2409.00491434.8029948.7063 2680.1816 3097.6313 3332.34691193.6047 1874.9449 2154.0491 3568.65772439.66141657.7893913.3586 1442.6818

Spot 489 Lectin

94,0-

67,0-

43,0-

30,0-

20.1-

14.4-

kDa 4 7

Spot 258Serine proteinase B.

insularis

Spot 474Vascular endothelial

growth factor

Spot 428Convulxin beta [Crotalus

durissus]

Spot 427, 429 e 467Lectin [Bitis arietans]

Spot 375, 435 e 459Platelet glycoprotein Ib-binding

protein alpha subunit [B. jararaca]

Spots 255, 260, 261, 262 and 268Metalloproteinase (PI) B.insuaris

Spot 412Anticoagulant protein A

[Deinagkistrodon acutus]

Spot 356Metalloproteinase

(Agkistrodon contortrix laticinctus)

Spot 386 and 394Phospholipase A2 B. insularis

433 e 434Agkisacutacin B chain

[Deinagkistrodon acutus]

489BJcuL precursor [B. jararacussu].

Spot 24, 28, 29, 30, 31, 32, 77, 90, 93 and 96Metalloproteinase (PIII) B.insularis

Spot 444Unnamed Protein Product (Mus Musculus)

Análise de Peptídeos: Peptidomics

• A eletrofores bidimensional separa proteínas entre 10 kDa e 200 kDa: Proteínas maiores ou menores não são detectadas;

• Para análise de peptídeos dependendo da amostra podemos analisar diretamente no MALDI-TOF, ou ainda fazer uma separação prévia e analisar frações cromatográficas contendo peptídeos.

B. insularis crude venom MALDI-TOF/MS

1100 1180 1260 1340 1420 1500Mass (m/z)

1.6E+4

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% Intensity

4700 Reflector Spec #1[BP = 1370.7, 16470]

1370.7482

1196.6423

1279.7783

1392.7262

1218.6238

1414.7090

   

950 1060 1170 1280 1390 1500Mass (m/z)

3.7E+4

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

tensit

y

4700 Reflector Spec #1=>BC=>NF0.7[BP = 1087.6, 36679]

1087

.622

8

1277

.616

1

1373

.722

9

1244

.639

8

1404

.764

0

1037

.544

3

1101

.599

6

1063

.573

6

956.

5493

1370

.700

4

1144

.641

4

1299

.695

2

1395

.700

2

1409

.792

5

Crude venom direct analysis in MALDI-TOF

Lachesis muta MS/MS 1373

610 778 946 1114 1282 1450Mass (m/z)

0102030405060708090

100

% In

tensit

y

4700 MS/MS Precursor 1373.72 Spec #1=>BC=>NF0.7[BP = 1161.5, 46639]

1161

.521

1

1048

.459

4

851.

4226

1133

.560

8

911.

4136

1169

.577

6

1373

.583

5

639.

3297

1258

.647

3

774.

3678

PPI / LHP G

qkpwppghipp Peptídeo potenciador de bradicinina

PROJECTS :

1. Proteomics of animal toxins :Jonas Perales (FIOCRUZ), Gilberto Domont, (DQ-IQ/UFRJ), Russolina Benedeta Zingali (DBM/ICB/UFRJ), Elias W. Alves (UENF)

2. Proteoma de Expressão de Vibrio cholerae :Wanda Maria Almeida von Krüger, Ana Beatriz Furlanetto Pacheco (UMGe/IBCCF/UFRJ), Ana Coelho (DG/IB/UFRJ) 3. Proteomics of viral infection ( dengue virus): Mônica Montero Lomeli, Andréa Thompson Da Poian, Russolina Benedeta Zingali, (DBM/ICB/UFRJ)

4. Proteome analysis of Gluconacetobacter diazotrophicus :Elias W. Alves (UENF), José Ivo Baldani, Kátia Regina dos Santos Teixeira, (EMBRAPA/RJ), Paulo Ferreira, Adriana Hemerly (DBM/UFRJ)

A proteome reference map for Vibrio cholerae El TorAna Coelho, Eidy de Oliveira Santos, Mauro Luiz da Hora Faria, Daniela Palermo de Carvalho, Marcia Regina Soares, Wanda Maria Almeida von Kruger, Paulo Mascarello Bisch

Proteomics Network of Rio de Janeiro-FAPERJ Dep. Genética, I. Biologia Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil

AbstractA proteome reference map has been constructed for Vibrio cholerae El Tor, in the pI range of 4.0 to 7.0. The map is based on two-dimensional gels (2-D) and the identification, by peptide mass fingerprint, of proteins in 94 spots, corresponding to 80 abundant proteins. Two strains are compared, strain N16961 and a Latin American El Tor strain C3294. The consensus map contains 340 spots consistently seen with both strains grown in Luria-Bertani broth (LB) or minimal M9 medium. The results were obtained from nine gels run with 18 cm immobilized pH gradient strips and precast gels. The 2-D gels were anchored to real N16961 proteins identified by mass spectrometry. Various energy metabolism components and periplasmic ATP-binding cassette (ABC) transporter proteins were identified among the abundant proteins. Two isoforms of OmpU were found. Five operons are proposed and seven hypothetical proteins were experimentally confirmed. Comparisons are made with protein 2-D gels for a classical strain and to microarray analysis available for the N16961 El Tor strain. New results were obtained from the proteome analysis, indicating an abundance of periplasmic ABC transporter proteins not found in microarray studies.

Proteomics. 2004 May;4(5):1491-504.

Adherence of Vibrio cholerae El Tor to cell monolayers.

2D-gel, V. cholerae El Tor N16961 strain

Total number of proteins predicted:………3820

In the pI range 4-7 and MW 10-110kDa:…2005

Spots found: ………………………………….539

Coverage in the range: ……………………26.9%

Experimental and predicted proteins for V. cholerae El Tor

Mapa de referência de Vibrio cholerae El Tor com 94 spots

Isoformas: a mesma proteina em spots diferentes

Main cellular roles found: spots proteins

Energy metabolism 36 28

(TCA cycle) (9) (8)

(glycolysis/gluconeogenesis)

(11) (7)

Transport and binding proteins

16 13

(Solute-binding protein of ABC transporters)

(15) (12)

(other transporters) (1) (1)

Identification of spots by peptide mass fingerprint:

94 spots, corresponding to 80 proteins

Hypothetical and conserved hypothetical proteins identified as abundant proteins

Estudo de gens hipotéticos e hipotéticos conservados:

Uma vez identificados a partir de gel, deixam de ser hipotéticos

São proteínas abundantes na célula, provavelmente importantes

Metodologia básica para estudo de gens hipotéticos(ou outros que desejar)

Inativação do gen por mutação dirigida, e estudo do fenótipo;

Verificação da presença de anticorpos em soro de ex-pacientes de cólera;

Superexpressão da proteína, estudo de estrutura.

PROJECTS :

1. Proteomics of animal toxins :Jonas Perales (FIOCRUZ), Gilberto Domont, (DQ-IQ/UFRJ), Russolina Benedeta Zingali (DBM/ICB/UFRJ), Elias W. Alves (UENF)

2. Expression Proteomics of Vibrio cholerae :Wanda Maria Almeida von Krüger, Ana Beatriz Furlanetto Pacheco (UMGe/IBCCF/UFRJ), Ana Coelho (DG/IB/UFRJ) 3. Proteoma da infecção viral (virus da dengue): Mônica Montero Lomeli, Andréa Thompson Da Poian, Russolina Benedeta Zingali, (DBM/ICB/UFRJ)

4. Proteome analysis of Gluconacetobacter diazotrophicus :Elias W. Alves (UENF), José Ivo Baldani, Kátia Regina dos Santos Teixeira, (EMBRAPA/RJ), Paulo Ferreira, Adriana Hemerly (DBM/UFRJ)

membrana: proteína E proteína M

capsídeo: proteína C RNA fita simples positiva

Dengue virusCrio-microscopy Replication cycle

Clinical manifestations

Assymptomatic hemorragic fever / shock sindrome (DHF/DSS)

DHF in Americas

Effect of DEN infection in liver cells

HepG2 cells - human hepatoma cell line

Lima, C.S. ; Leão, S.C.L. and Da Poian, A.T.Dept. Bioquímica Médica, ICB, UFRJ

1. Identificação da modificação do padrão de expressão de proteínas durante a infecção pelo virus da dengue;

(Depto Bioq. Med. Instituto Biof.)2. Identificar as proteínas/ peptídeos secretados pelas

células HepG2 em cultura durante a infecção viral. (Depto Bioq.Med.)

3. Analisar os soros de pacientes com Dengue grave comparado ao soro de pacientes normais.

(Fiocruz)4. Identificar marcadores para diagnostico além de novos

alvos terapeuticos para o desenvolvimento de drogas antivirais.

OBJETIVOS

1a. Parte estabelecimento de protocolo de r1a. Parte estabelecimento de protocolo de replicaeplicação ção do virus da do virus da Dengue 2 Dengue 2 em diferentes tipos celulares em diferentes tipos celulares

Kinetic of Den 2 infection in C6/36 cells

8

8,5

9

9,5

1 2 3 4

Days post-infection

Log

Cop

y N

umbe

r

Extract

Supernatant

Kinectic of Den 2 infection in HepG2 cells

7

7,5

8

8,5

9

9,5

1 2 3 4

Days post-infection

Cop

y N

umbe

r

Supernatant

Extract

Kinetic of Den 2 infection in Vero cells

8,59

9,510

10,511

11,512

1 2 3 4

Days post-infection

Cop

y N

umbe

r

Supernatant

Extract

Célula escolhida Hep G2 (hepática)Com 2 dias de infecção.

control andinfected cells

cellular extracts(intracellular RNAs

and proteins)

2D-electrophoresis

mass spectrometry

2 days

Estabelecimento do protocolo para análise do extrato celular

Proteome of HepG2 cells infected by DEN2

control cells infected cells (2 days)

45

66

29

116

20

4.0 4.07.0 7.0

control andinfected cells

2 days

culture medium(secreted proteins)

2D-electrophoresis(proteins)

massspectrometry

6 hr or 20 hrs

concentration(secreted proteins)

Estabelecimento do protocolo para análise das proteínas secretadas

Proteoma do secretado protéico das células (20 hrs) analisado por

eletroforese 2D

HepG2 infected cells secreted proteins

HepG2 control cells secreted proteins

Análise de Peptídeos e identificação

PEPTIDOMICS

control andinfected cells

2 days

culture medium(secreted proteins)

2D-electrophoresis(proteins)

massspectrometry

ultrafiltration(peptides)

20 hrs

concentration(secreted proteins)

RP HPLC

Concentration by lyophilization

B Conc.

Minutes30 40 50 60 70 80 90 100

mA

U

-500

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

mL/

min

0

20

40

60

80

100

Reversed phase chromatography of ultra-filtrate HepG2 cells. Blue Blanc (DMEM medium in the presence of fungicide and protease inhibitors), Green Ultrafiltrated from controle cells (HepG2) e red ultrafiltrated from 2 days infected cells (HepG2).

Separação do ultrafiltrado por cromatografia de fase reversa

PROJECTS :

1. Proteomics of animal toxins :Jonas Perales (FIOCRUZ), Gilberto Domont, (DQ-IQ/UFRJ), Russolina Benedeta Zingali (DBM/ICB/UFRJ), Elias W. Alves (UENF)

2. Expression Proteomics of Vibrio cholerae :Wanda Maria Almeida von Krüger, Ana Beatriz Furlanetto Pacheco (UMGe/IBCCF/UFRJ), Ana Coelho (DG/IB/UFRJ) 3. Proteomics of viral infection ( dengue virus): Mônica Montero Lomeli, Andréa Thompson Da Poian, Russolina Benedeta Zingali, (DBM/ICB/UFRJ)

4. Proteome analysis of Gluconacetobacter diazotrophicus :Elias W. Alves (UENF), José Ivo Baldani, Kátia Regina dos Santos Teixeira, (EMBRAPA/RJ), Paulo Ferreira, Adriana Hemerly (DBM/UFRJ)

Initial phase of a proteome project to fuel the understanding of Gluconacetobacter diazotrophicus physiology

Lery LMS; Viana, FC; Soares, MR; Teixeira KRS; von Kr¨uger WMA; Bisch, PMRede de Proteomica do Estado do Rio de Janeiro

Gluconacetobacter diazotrophicus is a N2-fixing, aerobic, Gram-negativebacterium found as an endophyte in roots, stems and leaves of sugar

cane, as well as in Pennisetum purpureum, Ipomoea batatas and Coffea arabica. Bacteria were present in the intercellular apoplast of sugar cane stems and they have also been detected in the xylem vessels at the base of the stem. Moreover,

was reported the occurrence of intracellular bacteria in sugar cane root tips.

Growth Curve of G. diazotrophicus

05

1015202530354045

0 10 20 30 40 50 60 70 80

time (hours)

prot

ein

(mg/

ml)

LGI medium (N2 non-fixing condition)

250kD

10kD

3 10

A - Logaritmic phase

10kDa

250kDa

3 10

B) Stationary phase

Analysis of soluble cellular proteins expressed by Gluconacetobacter diazotrophicus

Number of protein spots detected in Coomassie Blue stained gels:

330 from logaritimic phase cells,

356 from stationary phase cells,

Revealing 376 different spots.

203 spots were common to both conditions,

54 present only in stationary phase and

19 only visible in logaritimic phase.

Other detected spots presented quantitative or

qualitative variations.

5.3 5.6 5.65.3

~47kD ~47kD

Two 2DE protein bands expressed by both logaritmic and stationary phases and respective

MALDI-TOF spectrums, showing that they correspond to the same protein (ModC),

Postranslationally modificated.

~16kD ~16kD

6.1 6.16.4 6.4

Spots only visible in logaritmic or stationary cells

(arrows), indicating different protein expression

along growth curve.

Some common spots varied in intensity

with growth phase.

Obrigada pela atenção

Outras abordagens possíveis:

-Proteoma de secreções: plasma, urina, liquor, etc com objetivos de diagnóstico;

-Proteoma de secreções: semem, plasma, leite, etc com objetivo de controle de qualidade;

- Proteoma de organelas celulares, ou do secretado celular;

- Fosforoma; interactoma, peptidoma, ...omas...