摘要

摘 要

本文综述部分简要介绍了化学发光分析的基本情况、发展以及应用.流动化

学发光分析法具有仪器设备简单、分析速度快、灵敏度高、线性范围宽等优点，

所以越来越受到分析化学工作者的重视。本文基于鲁米诺一过氧化氢体系的化学

发光现象，以辣根过氧化物酶(HR尸)和血红蛋白(Hb)作为酶催化剂，采用

固定化酶和可更新表面联用流动注射等技术，建立了测定抗坏血酸、胆固醇及免

疫球蛋白0的流动注射化学发光分析法。研究报告包括以下三部分:

1.基于抗坏血酸对h皿访。1.闭理.H202体系化学发光反应的抑制作用，结合

固定化酶技术，建立了一种简单、快速检测抗坏血酸的流动注射化学发光分析新

方法。该方法线性范围为4.。:1。福~4.oxlo闷mo比，检测限为1.6、10Jmo比。

2.利用血红蛋白任Ib)作为模拟酶催化HZOZ与鲁米诺的化学发光反应，将该

反应与胆固醇氧化酶(con)催化氧化胆固醇生成H众 的反应偶合，联用流动注

射分析技术，建立了测定胆固醉的流动注射化学发光分析法。该方法用于侧定人

体血清中的游离胆固醇及总胆固醇含量，结果令人满意.进样频率为30个/小时，

游离胆固醇线性范围为5.6xlo刁mol.L-一3.sx10-smo卜L-，，检测限为3.0、10-，

mol.口:总胆固醉线性范围为1.1心了mol.L’，~4.3xl护mol·L’，，检测限为

1.5xl了mo卜口. 3.将羊抗人IgG抗体津一抗钧固定于包被有蛋白A的sepbarose4BF别蛇

Flow凝胶微珠表面制成固相抗体，用辣根过氧化物酶(1识P)标记的羊抗人IgG抗

体作为第二抗体，在自制的微型流通式反应器中与人lgG进行免疫反应生成双抗体夹心式抗原航体复合物。该复合物中含有的HRP能够催化发光底物增强化学

发光，其发光强度与人体血清中1盼的含量成良好的线性关系。由于包被有蛋白

A的Sep恤印se4FF凝胶微珠颗粒非常小(45一165四)，每次测定所需的第一抗体

随包被有蛋白A的sepbarose4FF凝胶微珠进入微型流通式反应器中，完成一次测定后微珠即随废液一起排出。从而用自制的微型流通式反应器建立了流动注射

可更新表面非均相增强化学发光免疫法测定人体血清中的免疫球蛋白G的新方

法。体系经优化后，检出限为0.olm叭，分析速率达到10次小，校正曲线的线

性范围为0.05~3.伽叭。本法已成功地应用于人血清中IgG的测定。

关键词:辣根过氧化物酶(HR尸);血红蛋白(Hb):流动注射化学发光;固定

化酶:流通式反应器;可更新表面技术

AbS七日d

ABSTRACT

玩 the review of 伽sthesis，山.baslcPn口心婚les，char朗t晰stics andthe

即pliaatlonsofchemll也过ne“笼nce晚 brienyinth记u以刃.丁七e且ow injection哪一CL)

15悦CO面绍 m。茂朋dmorepoPular。胡朋召toitsslmPleinstr切mentati叽 high

邵璐讯vity，诫ded州画c屁川ge，比producibility， slmPlicity 朗draPidity.New fiow

坷“tlon che而lununeSCenceme比Dds COuPled with Othertech币ques即chas

1朋 1obili双刃。皿yme，兹川吐unoassay‘而cro reactloncen，犷即ew的lesud触ce assay

明限re bu11tforthe detennination ofascorbic 即id， sen从n chole血roland

玩口朋。globulinGb别姆donlwn访OlandhydrogenPeroxi血CLSystems·1、isthesis

比。sehon姆radish pero劝daseolRP)助dhemoglobin(Hb)as tyPicate‘汀meof

讲roxld出犯明dm加eticperoxl山始e.仆c化search，沁tionincludes公肚eesubsectionas

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运叻曲iliZed翻叼叨ewas develo侧泪.丁五elmear rangefo:ascorbic解idis4.。劝护~4.0、10月mo比耐 ‘dete比onlimitisl.6x10-、0比J、e，”力pling丘equencr was

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朋加比icacid.A，戒15压ctoryresultcou1dbeobtainedusingthe novelmethodfor the

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2.Hemoglobin wasused as am如etlcPerO石d出姆 恤 thc Catal州c

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址mogiobin‘atal邓edre朗tlonwas COupled初ththe 喇dationreactionofcholesterol

份taly浏 byCOA(cbOlesteroloxyda那，COA.)todetem血etotalch01esterol(Tc)

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3.A sequenlial 坷ection renewable surface heterOgeneOu5 e瓦比切Ce

chemiluminescence 叮口munoassay systemwithnow.through ~ tioncolulllnwas

develoPedforthedeterminationofh切口an 兹田munoglobulin GOgG) in sen妇n.

Inunobilized幼tib。勿was p茂Pared衍conjugationofsheePanti七umanlgGantibody

(the 五rstan石h刁y)toProteinAcoatedsePh出”，4Bbeads.Horseradlshpero石dase

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Keywords:加招eradishperoxlds阴担RP);hemogl比In任几);nowinjection

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学位论文独创性声明

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第一章 综 述

第一章 综述

1.1引言

发光作为一种生命现象，即发光生物，早在希腊文明时代已经被人们发现.

而“人工斤的化学发光直到1877年凡此血欢，昭匕观察到洛粉碱在碱性乙醇介质

通氧时可产生绿光。1888年德国科学家E进团dtweid已江阳口叮首次提出了化学发光

(仆。i1’，ine“笼ncecL)这个专业术语，自此化学发光才有了一个明确的定义。

化学发光是化学反应所释放的能量激发体系中某种化学物质分子由基态跃迁至

激发态，并由电子激发态的最低振动能缀返回基态时所产生的光辐射。根据化学

发光反应产生的光辐射强度或发光总量来确定反应中相应组分的分析方法叫化

学发光分析法.

化学发光分析法突出的特点是不需要任何光源，避免了瑞利散射和拉曼散射

等噪音，没有空白，因而光电倍增管在高压下工作时具有比荧光法更高的信噪比。

这种方法具有灵敏度高、线性范围宽和仪器简单等优点.将它与流动注射、微透

析、毛细管电泳、传感器技术和芯片技术等结合可以建立许多高灵敏度的、微型

化的和高度自动化的分析方法和器件，而化学发光成像技术可以提供许多丰富直

观的信息来研究各种体系的特性。

化学发光分析法已广泛地应用于环境化学、临床检验、药物分析和工业分析

等领域11月.近年来，化学发光分析法的发展呈现以下三个主要特点:一是化学发

光新体系研究活跃;二是化学发光与其他分析技术联用多样:三是化学发光分析

应用范围广泛同.化学发光分析法的应用领域不断扩大，合成新的高效能的发光

试剂、开发新的发光体系以及与其他技术联用仍将是今后发展的趋势.可以预见，

随着性能更优良的化学发光试剂的开发，并结合其他技术，化学发光分析法的应

用范围将会更加广阔。

1.1.嘴化学发光分析法的原理

化学发光(che面Illmln，cence)是指某些化学反应中发出可见光的现象。其发

光机理是:反应体系中的某些物质分子，如反应物、中间体或者荧光物质吸收了

反应释放的能量而由基态跃迁至激发态，然后再从激发态返回基态，同时将能量

以光辐射的形式释放出来，产生化学发光，其过程主要有图1所示的两种可能:

①物质A和B反应，产生激发态c*，c*为发光物质直接发出可以测量的光:

②物质 A和 B反应，同样产生中间体 C*，当体系中存在另一种易于接受能量

第一章 综 述

如抗坏血酸、肌酸醉、谷耽甘肤、乳糖、葡萄糖等.

巍

从 图1.4光泽精的化学发光反应过程

Figl.4SchemeofLu幼geninChemilumlne别沁nc.代泊ct沁n

3.过氧草酸盐类

草酸盐类化学发光反应大都生成过氧草酞中间体，因此这类反应亦称过氧草

酞类化学发光反应。过氧草酞类化合物被过氧化氢氧化时会产生化学发光，这个

氧化反应所产生的高能中间体不具有荧光性，因此它本身不会发光，而必须经历

一个把能量转移至荧光物质并使之激发到激发态的过程。过氧草酸盐类化学发光

分析应用的推广还有赖于新的衍生试剂的开发。

4.洛粉(切p址nc)

洛粉是文献上记载最早的化学发光试剂，但却迟迟未得到应用，直到1979

年M耐no等人将它应用于co的测定后才得到重视。此试剂已被用于多种金属离

子的测定。

5.叮吮醋

叮咙酷类化合物是一类很有前途的非放射性核酸探针标记物，用作DNA的发

光探针发光量子产率高，稳定性好，标记物对杂交反应的动力学和杂交体的稳定

性无影响，可以直接在碱性介质中进行化学发光反应。

6.钉 (11)一联毗陡配合物

在稀硫酸溶液中，钉毗吮Ru(bipy)3升与。环或脐反应可生成化学发光，草

酸亦有类似反应.但是Ru(biPy)33+在水溶液中的稳定性差，而Ru(b初扩十具有较好的化学稳定性、氧化还原性、激发态性质和发光特性.从原理上讲，获得激发

态Ru(biPy)32+有两种方法: (1)用还原电势大与0.84v的氧化剂x氧化Ru脚州33+:

(2)用氧化电势小与一0.86v的还原剂Y还原Ru(biPy扩+.

在实验应用中，先用电化学方法将Ru(biPv扩氧化成Ru(biPr)32+，Ru(bipy)，2+与合适的有机酸反应产生化学发光。发光体是激发态的Ru(bipy)，2+.

第一章 综 述

2酶联化学发光分析

酶联化学发光分析是指将酶促反应与化学发光反应相偶合的一种化学发光

分析方法。其较早见于BostickandHercules关于血清和尿液中葡萄糖含量测定的

报道因.酶联化学发光分析不仅具有酶促反应的高效、专一的特性，而且具有化

学发光反应高灵敏度的优点。分析过程tg]可采用静态式，也可采用流动式:可将

酶固定化，也可不固定化。

2.1酶概述

酶是由活细胞产生的一类具有高度专一性和催化效率的蛋白质，又称为生物

催化剂伪iocatalyst)，生物体内几乎所有的生化反应都是在酶催化条件下进行的

110]。酶以催化的专一性、特效性、良好的催化活性和温和的反应条件在生物体内

的各种新陈代谢过程中起着重要的作用。而人工提取的酶在合适的条件下能够在

试管中对其特殊底物起催化作用。因此，用化学方法对酶促分析进行研究在理论

和实际应用上都有十分重要的意义1111.

酶作为催化剂普遍存在于动物、植物、微生物中，目前已工业化生产出多种

酶制品应用于食品工业、医学领域、分析领域、化工生产以及废物处理过程。近

年来研究较多的有:用淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶等去处各种有机物(如碳水化合

物、蛋白质、脂肪和油等):利用辣根过氧化物酶，在有过氧化氢存在时，催化

氧化多种有毒的芳香族化合物:利用氰化物酶和氰化物水合酶处理氛化物，等等。

1.过氧化物酶

过氧化物酶是一种从包括植物 (辣根、芜著、无花果树汁)，动物 (甲状腺

碘过氧化物酶)和微生物(酵母中的细胞色素c)中提取的氧化还原酶1121。它能

催化珑仇后氧化其他底物(以SHZ表示，称为氢供体)产生水，反应式如式12

所示。

占月玉 + 场岛 5 + 凡口

(1.2)

第一章 综 述

图LS过氧化物酶辅基血红素结构

F够1.SSubgrouPof此讲roxid叹

天然过氧化物酶蛋白质结构含有辅基血红素 (或称高铁原血n卜琳)，即是酶

的主要活性部位.辅基结构如图1.5所示.以辣根过氧化物酶伽rser碱sh

pero石dase，HRp)为代表的过氧化物酶及模拟酶在其结构、化学性质及应用研究方

面多有报道113·151.

辣根过氧化物酶是一种含有铁叶琳的血红素蛋白，HR卫的催化中心为铁

(n)叶琳结构，结合部位为对底物有亲和性和包合作用的氨基酸多肤中心.由

于来源方便、提纯容易和结构已知，HRP经常作为典型代表用于研究过氧化物

酶分子的结构、动力学和热力学性质p刃。目前圣仅P更是被应用于有机合成、生

物转化、相关酶检测、发光检测、免疫测定、废水处理、临床化学、环境化学和

食品工业等领域12卜”].

2.过氧化物模拟酶

过氧化物模拟酶主要包括自然酶和化学合成酶。自然酶有模拟HR卫催化活

性的血红蛋白124]、肌红素、漆酶、叶绿素、维生素B、细胞色素C及生物小分

子氛化血红素四(hemin)或高经氯化血红素脚l(hematin)等:化学合成的过氧

化物酶网主要包括可溶性金属叶琳化合物1281、金属酞普化合物12n、席夫碱金属

络合物和化学修饰的过氧化物模拟酶1291等。

血红蛋白(Hb)是一种寡居蛋白质，为动物体内氧传递的载体蛋白质，其分

子结构的催化辅基为铁 (11)叶琳。Hb 也具有过氧化物酶活性。在体内主要起

着02和C仇的转运等作用，作为一种氧载体本身又具有过氧化物酶活性.一直

以来人们对Hb 的研究主要集中在其结构、输氧功能、电子传递特性等方面，而

对其所具有的酶催化性能研究不多。最近蔡汝秀，Liul30-32]等研究了Hb的过氧化

物酶活性，发现在他们的催化体系中，Hb 具有较高的催化活性。

第一章 综 述

2.2酶的固定化技术

白图 隐 督 吸附法 包埋法 共价法 交联法

图1.6酶的固定化方法示意图

Fig.1.6Sc比maticdl叫犷日mofE‘守m翻clmmobilizatiom

酶作为专一、高效的生物催化剂具有非常广泛和良好的应用前景.由于酶的

价格昂贵，游离酶难以回收利用，将酶进行有效的固定化一直是酶工程领域的研

究热点。若将酶固定于各种载体上，可以很方便地分离和重复利用，对提高酶的

利用效率，延长使用时间具有重要意义。酶的固定化在生物工程技术、医学、食

品、环保以及酶生物传感器等领域具有重要的作用田1，如图1.6所示，传统的固

定化酶技术主要包括吸附法、包埋法、共价法、交联等1341。

1.吸附法

吸附法是通过酶分子极性键、氢键、疏水键以及静电等作用，将酶吸附于不

榕性载体上.吸附法具有酶活性中心不易被破坏和酶高级结构变化少的优点，因

而酶活力损失少，但是它有酶与载体相互作用力弱、易脱落等缺点，若能找到适

当的载体，这是很好的固定化酶的方法1341.

2.包埋法

包埋法是指将酶包埋在凝胶/聚合物的细微格子里。此法多以天然或合成的

聚合物凝胶为载体，如:树脂、藻酸盐、聚丙烯酞胺、聚乙烯醇等。包埋法一般

不需要与酶蛋白的氨基酸残基进行结合反应，几乎不改变酶的高级结构，酶活回

收率较高。但是在包埋时发生化学聚合反应，酶容易失活，必须巧妙设计反应条

件。

溶胶一凝胶(sof一gel)包埋法是物理包埋过程，凝胶网络是围绕酶逐渐形成的，

对酶的尺寸无特殊要求;温和的反应条件和凝胶的非晶态结构都有利于保持酶

的结构完整性和表面微观结构的各向同性;常用的基质材料如二氧化硅比有机聚

合物材料更具有化学和热稳定性、良好的坚固性和抗磨性。另外，由于基质含有

足够的水，生物酶处于水溶液的微环境中，保持了它的活性和稳定性，与在水溶

液中有相似的行为13，刁叼.因此，此法被广泛应用于酶的固定.

3，共价键合法

共价键合法是酶与载体以共价键结合的固定化方法。归纳起来有两类:一是

第一章 综 述

将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生偶联反应:另一种是在载体上接上

一个双功能试剂，然后将酶偶联上去。共价键合法的优点是酶与载体结合牢固，

但是该方法操作复杂，反应条件苛刻，会引起酶蛋白高级结构变化，破坏部分活

性中心，因此往往不能得到比活力高的固定化酶。酶活回收率一般为30%左右，

甚至底物的专一性等酶的性质也会发生变化。

4.交联法

通过借助交联剂在酶分子、酶分子与载体之间交联形成网络结构而使酶固定

化的方法称为交联法.常用的交联剂是戊二醛，交联法中最常用的固定化酶载体

是牛血清白蛋白田SA)，也有人用酩蛋白代替BSA.

2.3酶联化学发光分析的应用

酶联化学发光分析可用于酶活性的测定以及酶底物含量的测定135].

1.酶活性的测定

利用偶合反应化学发光分析法测酶活性的范例是黄嗦吟氧化酶活性的测定。

该方法是基于黄嗦吟氧化酶对次黄嗦吟氧化生成尿酸反应的催化作用，在这一反

应过程伴随着过氧化氢的产生.生成的过氧化氢利用铁(n)催化的鲁米诺化学发

光反应加以检测.

酶联化学发光分析还可用于辣根过氧化物酶，脂肪氧化物酶，乙醇脱氢酶，

乳酸脱氢酶，异柠檬酸脱氢酶，丙酮酸激酶，肌氨酸酶，肌氨酸激酶同工酶，葡

萄糖一6一磷酸盐烯醇酶等酶的活性测定13，确9].

2.酶底物的测定

许多重要的化学发光反应都能用于测定过氧化氢。许多产生过氧化氢的酶促

反应都可以与这些化学发光反应相偶合，进行多种重要生化物质及其它物质的化

学发光测定。

基于生成过氧化氢的酶联化学发光分析已用于葡萄搪，乳糖，氨基酸，尿酸，

胆固醉，丙三醇，胆碱，乙酞胆碱，细胞色素c，3一经基丁酸，苹果酸，甲醇，

磷酸盐，亚硫酸盐以及草酸盐等物质的分析测定，“31.

3化学发光免疫分析

化学发光免疫分析包含两个部分，即免疫反应系统和化学发光分析系统【641。

化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化，形成一

个激发态的中间体，当这种激发态中间体回到稳定的基态时，同时发射出光子，

利用发光信号测量仪器光量子产率16习.免疫反应系统是将标记物质直接标记在抗

第一章 综 述

原或抗体上，经过特异性反应后，形成抗原一抗体复合物。然后进行相应标记物

的检测方法进行检测。

3.1免疫分析概述

免疫分析法(扮皿助。assar)是利用抗原一抗体反应而建立起来地一种高选择性

的分析方法圆.免疫分析根据标记与否可分为标记免疫分析法和非标记免疫分析

法。抗原和抗体直接结合之后，理化性质有一定变化，如产生沉淀，利用这种性

质的变化可以检测抗体或抗原，即实现非标记免疫分析。但是利角此方法难以进

行痕量检测.按标记物有无放射性将免疫分析方法分为放射免疫分析法和非放射

免疫分析法.标记免疫分析法中，最为成熟的方法是放射免疫分析法，但由于放

射性物质的毒害，限制了它的应用。非放射免疫分析法包括酶联免疫分析法、荧

光免疫分析法、电化学免疫分析法、电化学发光免疫分析法和化学发光免疫分析

法等16刀.

由于标记物的引入，不可避免地带来了结合的抗原一抗体与过量的抗原或抗

体的分离问题，因而标记免疫分析法根据分离与否又分为均相免疫分析法和非均

相免疫分析法。非均相免疫分析法是将标记的抗原和抗原样品加入到含有一定抗

体的固相中，发生竞争性反应，洗去游离的抗原后对免疫复合物进行测定。均相

法无需分离，这种方法操作简单，但灵敏度受到限制。同时因为没有经过分离步

骤，样品中的杂质对发光的影响较大。而异相法就大大减少了样品中的杂质对发

光反应的干扰，提高了灵敏度.

化学发光免疫分析(ChemilUminescence 玩助unoassay CLIA)是化学发光与免疫分析相结合的产物，它同时具有化学发光法的高灵敏度和免疫分析法的高选择

性.CLIA是用化学发光反应的试剂(可以是发光剂或催化剂等)标记抗原或抗体，

标记后的抗原和抗体与待测物经过一系列的免疫反应和理化步骤(如离心分离，

洗涤等)，最后以测定发光强度形式侧定待测物的含量.

化学发光免疫分析根据标记物的不同分为以化学发光试剂为标记物的化学

发光标记免疫和以酶为标记物的化学发光酶联免疫。

3，2化学发光免疫分析方法的建立

1.抗体的制备

任何一种CLIA法都需要使用抗体，所以在建立CLI人法时必须先制得满足方

法中所需的抗体。抗体的制备是利用动物对外来异己物质的排斥效应，在体液(血

液)中产生针对该异己物的免疫球蛋白IgG，即抗体。提取这些动物的体液便可

第一章 综 述

得到所需的抗体。

抗体制备时，只有抗原分子量较大的化合物(》S000D)注射到动物体内时才

能诱导动物体内产生抗体。如果是小分子激素，如雌二醇，分子量仅二三百(这

类化合物叫半抗原，H即ten)，它不能直接诱导动物产生抗体，为了制得它的抗

体，需将它偶联于大分子载体(如牛血清白蛋白，BSA)上制得抗原，再将其用于

免疫动物，制备抗体。一些载体激素和药物的抗体都需经这一方法制备哪1.抗体

的纯化方法有:中性盐沉淀法，亲和层析法等。制备的抗体一般需进行亲和力和特

异性的鉴定。

近来，在cLIA法中越来越多地应用单克隆抗体侧。单克隆抗体是利用细胞

杂交技术，通过杂交细胞的不断分裂繁殖产生抗体。这种方法产生的抗体特异性

强，而且抗体的性能绝对均一。它的应用提高了方法的选择性，同时它也是大量

提供标准化抗体的一个途径1701.

2.化学发光免疫分析的标记技术

抗原和抗体的标记是化学发光免疫分析中十分关键的一个环节.标记免疫步

骤不仅要求标记产物不易脱落，性质稳定，更主要的是标记后标记物应保持原抗

原或抗体的活性，保持标记基团的发光活性17lj.韩刚毅圈以蛋白质为标记对象

列举了一些常用的方法，方法见表1.1(A、B分别为参与偶联的两种物质所具有的

反应基团)。

表1.1参与标记的双方结构特点及标记方法的选择

标记方法 主要偶联方式

-洲2 碳二亚胺法 一乙卜组氨酸、色氨酸残基 ~N二N·C

棍合酸配法

N一轻基玻泊酞亚氨活化法

环内酸酥法

硫氛酸醋衍生物法

0--(，甲基)。胺法 ‘二Noc、艺，

-NH2

硼

-NH2

-NH2

讹

1.3.3化学发光免疫分析的主要类型

化学发光免疫分析法根据其标记物的不同可分为三大类，即化学发光免疫分

第一章 综 述

析、化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析法。

1.化学发光免疫分析

化学发光免疫分析是用化学发光试剂直接标记抗体或抗原的一类免疫测定

方法。用于标记的化发光试剂应符合以下几个条件:(1)偶联后能保持光试剂高

的量子效应和反应动力;(2)与抗原或抗偶联后能形成稳定的结合物;(3)在很少

程度的改被标记物的理化特性，尤其是其免疫活性。鲁米类和叮睫酷类化学发光

试剂是最常用的标记发光剂。

2.化学发光酶免疫分析

从标记免疫分析角度，化学发光酶免疫分析 (Chemilumme scenceE几卿me

玩叻助。assay ，cLE认)，应属于酶免疫分析，只是酶反应的底物是发光剂，操作

步骤与酶免疫分析完全相同:以酶标记生物活性物质进行免疫反应，免疫反应复

合物上的酶再作用于发光底物，根据测定的发光信号进行定量分析。目前，常用

的酶标记物有辣根过氧化物酶(印汗)[73]和碱性磷酸酶(肛P)【741，它们有各自的发光底物。

以酶为标记物的化学发光酶免疫分析特异性强，但灵敏度不够高。人们在研

究中发现，向化学发光反应系统中加入某种化学试剂，这种试剂可显著地增强酶

催化的化学发光反应，使化学发光信号提高并可使发光信号持续几十分钟至 24

小时，根据这一特性，将传统的酶免疫分析与化学发光免疫分析相结合，建立了

一种完全新型的“杂交”标记免疫分析技术，即增强化学发光酶联免疫分析

正汕助cedch。‘1耐nescence lnlinUnoassay， EcLIA)方法1均.将加入的化学试剂

统称为增强剂伍汕胡沈r).利用增强剂可以提高发光信号、增加发光信号的稳定时间，克服仅有酶催化的化学发光体系几秒内瞬时闪光、发光强度低、不易测量

等缺点【周.自八十年代中后期出现以来，增强化学发光酶联免疫分析已经在免疫

分析、分子杂交、蛋白质印迹、基因检测等诸多领域得到了广泛的应用。

3.电化学发光免疫分析

电化学发光(ECL)是指由电化学反应引起的化学发光过程。在电极上施加一

定的电压或电流时，电极上发生电化学反应，在电极反应产物之间或电极反应产

物与溶液中某种组分之间发生化学反应而产生激发态，当激发态返回到基态时产

生发光现象。

从整体上讲，电化学发光免疫分析是化学发光和免疫测定的结合，它包括了

电化学和化学发光两个过程，故是化学发光免疫分析的一种发展。目前，在实际

应用中的电化学发光体系主要是钉联毗陡[Ru帅y)312+体系.它可以通过活化“手

臂”实现与蛋白的连接。这种标记物非常稳定，且由于分子量小(~1000)，可实现

一分子蛋白标记多个【Ru(bpy)3]2+.

第一章 综 述

电化学发光免疫分析有其突出的优点:标记物稳定，灵敏度高，可实现多元

检测，可实现均相免疫分析，可实现全自动化。由于电化学发光免疫分析具有优

越性，是一种很有发展前途的免疫分析法，日益受到人们的重视.

3.4化学发光免疫分析研究展望

随着化学发光免疫分析方法的日趋成熟，各种技术与化学发光免疫分析的

联用成为一种发展趋势。例如，化学发光免疫分析与流动注射技术联用可以实现

化学发光免疫分析的自动化;化学发光免疫分析与高效液相色谱(HpLc)、毛细

管电泳(CE)等技术联用，可以使免疫分析的选择性和灵敏度得到完美体现，同时，

也可以提高方法的检测速度。

CLIA 除具有灵敏度高、特异性强等优点，日益受到人们的青睐。CLIA 分

析方法多样，适用面广，广泛地用于抗原、抗体和半抗原的免疫测定，其线性范

围也较宽，符合临床检验的需要。CLIA技术为临床诊断和科学研究提供了一种

超微量的非同位素免疫检测手段，其在医学、食品分析、环境等方面具有广阔的

应用前景.CLIA技术的发展趋势在于合成新的发光标记物、优化抗体制备、标

记技术以及建立新的免疫分析方法等;在新的分析原理上力求创新，追踪生命科

学和环境科学发展的前沿领域，建立对生命过程和环境毒理有重要内源性和外源

性物质分析的新方法，促进生命科学、环境科学的研究和发展。

4流动注射化学发光分析

4.1流动注射化学发光概迷

化学发光 (Chemil.旧Inescence，CL)分析大多是基于物质间的氧化还原反

应产生激发态发光体，进而产生发光现象等分析特征为基础的发光分析方法。该

现象往往是一个短暂、发光信号随时间变化较大的两组动态进行化学反应的过

程;此外，相关化学反应所产生的激发态发光体的形成和发光信号的产生空间‘区

域，是在两个进行化学反应的质粒相的反应界面、‘介观’区域，化学发光反应

的这些特点就决定了化学发光反应的反应器与信号检测器是一个有机的整体。因

此，当早期使用间隙式手工操作获得化学发光和对相应的发光信号检测时，就很

难取的良好的精度。

流动注射分析比传统的常规手工分析、程序分析器、连续流动分析等有更多

的优点:

(1)操作简便

第一章 综 述

(2)分析速度快

(3)重现性好

(4)节省试剂和样品

(5)分析系统封闭

(6)容易实现自动化

(7)应用范围广泛

为此，在流动注射分析技术建立之后不久(即 1979 年)，美国分析化学家

W.凡seitZ教授率先将 FIA 技术引入到化学发光分析领域，成功的实现了流动注

射技术与化学发光分析技术的结合。流动注射化学发光分析技术保存了一般 CL

法的优点而同时也具备了FIA的一般优点。曰A是从实验室操作中的最基础部

分入手来提高整个化学分析过程的效率及改善提供信息的能力。流动注射一化学

发光 (Fl一CL)的应用主要包括对水体及大气中无机金属离子、无机非金属离

子、有机化合物以及生物大分子的测定m侧.

流动注射化学发光分析法的应用领域不断扩大，合成新的发光试剂，建立新

的发光体系，以化学发光试剂标记核酸分子，制备基因探针，并运用化学发光分

析进行核酸分子杂交分析，这是流动注射化学发光分析的前沿，其发展将为基因

工程、基因诊断和治疗提供有效的检测手段，对于推动生命科学的发展具有重要

的理论意义和应用价值。

4.2鲁米诺化学发光体系

鲁米诺是人们最早了解的流动注射化学发光化合物之一。它的发光机理

甲 公 丫 犷 一甲

以井于卿 一忧 {

灌夔互 1.7辣根过氧化物酶催化鲁米诺化学发光反应机理

Figl.7SchemeofLumino1Chemilumi~ nce reactionwithHRp咔翔talysing

应条件有很大关系18刀.辣根过氧化物酶可以催化鲁米诺— 过氧化氢反应，其催

第一章 综 述

化机理如图1，7所示。

髻米诺体系化学发光反应有一个决定性的氧化步骤，辣根过氧化物酶标记到

抗原或抗体上时，由于蛋白质大分子的空间位阻作用，往往使氧化步骤受到抑制。

所以，鲁米诺体系化学发光反应通常需要在强碱性介质中进行，而强的碱性对酶

的活性会产生一定的抑制作用，因此利用鲁米诺一过氧化氢一辣根过氧化物酶直接

测定生物大分子灵敏度低。

增强剂的出现，使得鲁米诺化学发光体系在免疫领域得到更加广泛的应用。

TbOrPe阅等使用了对碘苯酚及对苯基苯酚作为化学发光增强剂，用HRI，作为标记物，鲁米诺为发光剂，对绒毛膜人促性腺激素，地谷新等进行了测定，并

与不加增强剂的化学发光酶免疫分析方法进行对照，灵敏度提高至少1000倍。

章竹君【州等采用对碘苯酚增强的鲁米诺化学发光体系，对铁蛋白及甲胎蛋白

进行了定量测定，方法的线形范围宽、灵敏度很高，比酶联免疫吸附测定高1-2

个数量级。章竹君阅等以对碘苯酚为增强剂对血清中麻疹病毒抗体进行检测，方

法简便、快速、经济、灵敏度高。

4.3流动注射化学发光免疫分析

流动注射免疫分析通过非平衡态条件进行测定，不仅可以大大缩短免疫分析

时间，减少珍贵的免疫试剂的用量，而且还可以实现免疫分析自动化。均相和非

均相免疫分析均可以在流动体系中实现.非均相免疫测定根据实验中是否使用固

相支持物作为吸附抗原或抗体的载体，分为固相免疫和液相免疫测定，其中以固

相免疫法用得最多。固相免疫分析与流动注射技术的联用，可以提高固相免疫的

分析速度和自动化程度，同时因其具有使分析时间大大缩短、分析试剂用量减少、

易于实现自动化、可进行在线检测等优点而成为化学发光免疫分析的发展趋势。

流动注射化学发光免疫分析多采用非均相免疫法，将抗体或抗原以物理或化

学方法固定到固相载体表面上，装填于一个体积很小的流通池内，制成免疫反应

柱.免疫柱是流动注射分析系统的重要组成部分，也是影响流动注射化学发光免

疫分析准确度和精密度的关键因素之一。在流动注射免疫分析完成一次测定之

后，用pH值约为2的酸性洗脱溶液将固相载体上的抗体和抗原之间分离，可以

实现免疫柱再生。再用磷酸盐缓冲溶液将再生后的免疫柱平衡一段时间，能使其

恢复到分析测定前的状态。

osiPovlgl]建立了测定人血清中IgG的夹心增强化学发光免疫分析方法·用

llR卫标记的兔抗血清抗体固化到聚苯乙烯微球上制成免疫反应器，采用双泵双

阀进样，将含人IgG的血清试样(待测抗原)和兔抗人IgG.HR卫的偶联物相继载入

到固化抗体的免疫反应器中，抗原试样先于偶联物到达，分别停流2而n，用缓

第一章 综 述

冲溶液洗脱未同抗原结合的酶标抗体后，抗原抗体复合物在免疫反应器中同鲁米

诺和过氧化氢混合进行发光反应，该方法对人IgG的检出限为1、1护mo比，分

析一个试样的时间约为5~10mln.

章竹君等阅用控制孔径的多孔玻璃(cPG)作为抗体固定化的载体，以IIRp标

记抗原，建立了一种夹心式的流动注射增强化学发光免疫分析技术，用于血清中

乙型肝炎表面抗原(HbsAg)的测定。采用该技术可使单次测定时间从EL气法的二

十多小时降至二十分钟。以CPQ为载体，采用化学键合制成的免疫反应器具有

稳定性好，可重复使用，容易保存的优点。用此方法对人血清中乙型肝炎表面抗

原进行了测定，测定结果与酶联免疫吸附测定法所得结果一致，却克服了常规的

固相免疫分析法操作复杂费时，难以自动化等缺点。其缺点是有时填充材料产生

光辐射，及难以填充均匀等因素均会影响反应器的性能，同时由于柱子阻力大分

析速度慢，从而影响免疫分析的灵敏度。

沁e勿evl931描述了一个增强化学发光反应检测甲状腺素的流动注射增强化学

发光免疫法.以HRP为标记物，对碘苯酚为增强剂，将待测半抗原试样(T4)注

入载流环中溶液同过量的酶标抗体反应后，多余的游离酶标抗体由固化有过量抗

原的亲合柱吸附分离，然后检测含有酶标的抗原抗体复合物。该法采样频率 12

样l，J、时，可检测低至10一”mo况 的甲状腺素，100次分析实验后免疫柱的性能未

见降低.还有利用T-gel，Sephacry1S一3005树脂、蛋白A、蛋白G等作为固相吸附

剂的报道。这种以固相吸附剂作为免疫反应器的特点是固定方法简单、对抗原抗

体的活性损伤小，缺点是免疫吸附剂的再生较费时间，影响分析效率。

流动注射与化学发光及免疫分析技术的联用，克服了选择性差的弱点，达到

了灵敏、准确的分析目的。食品、环境、生物、医学等领域都得到了广泛的应用，

特别是将化学发光分析、流动注射与生化、免疫分析相结合，为其在生物、医学

领域的应用开拓了更广阔的应用前景。在拓宽应用领域的同时，流动注射化学发

光技术也在向微型化，自动化方向迈进。因此流动注射化学发光分析是一种大有

发展前途的分析技术。

4.4流动注射可更新表面分析技术

在流动注射免疫分析系统中，一次测定后免疫反应柱的再生需消耗大量时

间，分析速度难以大幅度提高，而且固相抗体多次使用后，其免疫反应活性降低，

影响测定的重现性。

为了克服流动注射非均相免疫分析法的上述缺点，Pullelna 等194.均首创了固

相抗体一次性使用的顺序注射可更新表面非均相免疫分析技术(sequentiai

injection代Dewablesurfaceheterogenco usiInm uno assa:y，sIRSIA)。由于固相抗体在

第一章 综 述

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transPOrtingthem directlyintothegraPhitetobe，asdemonstratedforthedete而inationof

nicke1inenvironmentalandbioIogicaIsampIes IJ].AnalyticaChimlca Acta， 2001，435:331·34

第二章 固定化酶反应柱联用流动注射化学发光法铡定抗坏血酸

第二章 固定化酶反应柱联用流动注射化学发光法

测定抗坏血酸

2.1引言

抗坏血酸 (又称维生素C，简称vc:Asco比IcAcid，从)是人体内不能自行

合成而有必不可缺少的一种重要营养物质。它参与人体内一系列氧化还原反应及

新陈代谢;促进肠道内铁的吸收，参与解毒功能:增强对某些疾病的抵抗力;阻

止致癌物 (亚硝胺)的产生;可用于预防坏血病11]。因而对它的检验在临床和生

化分析上具有重要意义。目前，测定抗坏血酸含量的方法主要有碘量法12]、光度

法131、荧光法141、电化学法阎和化学发光分析法t6]等.其中，碘量法操作繁琐，费时

较长。分光光度法选择性不高，重现性较差。电化学法包括极谱法、离子选择电

极法等，具有仪器简单，操作简捷，线性范围宽的优点，缺点是样品的前处理比较

繁琐.

化学发光法(Chemilujnine别笼nCelCL)测定抗坏血酸多以鲁米诺(L切minul)化

学发光体系为基础。流动注射化学发光分析法测定抗坏血酸具有仪器简单、操作

方便和灵敏度高等显著优点，引起人们的极大兴趣16].由于化学发光反应发光为

瞬间产生，光信号持续时间短，造成检测结果稳定性、重现性不佳.研究发现，

向化学发光反应系统中加入一种化学试剂，可以使发光信号提高并可使发光信号

持续几十分钟至24小时，这类化学试剂统称为增强剂。本实验采用少有报道的

4--(1一哇基卜苯酚(4.IMp)作为鲁米诺化学发光体系的增强剂.

酶的固定化在生物工程技术、医学、食品、环保以及酶生物传感器等领域具

有重要的作用闭，酶分子固定化程度的好坏将直接影响研究结果。传统的固定化

酶技术主要包括高分子材料包埋法、吸附法、共价键合法及交联法[s1。其中包埋

法在包埋时发生化学聚合反应，易导致酶的生物活性丧失:吸附法酶与固相载体

表面结合力弱，易造成酶流失:共价键合法是酶与载体以共价键结合的固定化方

法，优点是酶与载体结合牢固，但该方法操作复杂，反应条件苛刻，会引起酶蛋

白高级结构变化，破坏部分活性中心:此外，共价键合和交联过程所发生的剧烈

化学反应对酶的存活十分不利.相比之下，溶胶一凝胶(501一geD法具有独特的

技术优势。采用溶胶凝胶技术将生物分子固化于无机陶瓷或玻璃材料内，生物组

分的活性保持能有明显改善.选用二氧化硅做基质材料比有机聚合物材料具有良

好的坚固性、抗磨性和化学惰性、低的体积变形性、高的光稳定性和透过性[9].

第二章 固定化酶反应柱联用流动注射化学发光法测定抗坏血酸

另外，由于基质含有足够的水，生物酶处于水溶液的微环境中，保持了其活性和

稳定性11叼2]，与在水溶液中有相似的行为.

本实验采用溶胶凝胶技术制备了固定化的辣根过氧化物酶伪。邝盯adish

拌mxi山ase，印理)柱，并结合流动注射技术和化学发光检测法建立了基于

L也过nol一HR卫一抗坏血酸反应体系的固定化酶一流动注射化学发光测定抗坏血酸

含量的新方法.该方法进样频率为50 样/小时，线性范围为4.0、10一mol·L’，~

4.0、lrmol.L-l，检出限为1.6二10-smo卜L’l，相对标准偏差为2.4%.将该方法应

用于药物中抗坏血酸的测定，结果与标准方法一致。

2.2实验部分

2.2.1仪器和试剂

柳1一 型多参数化学分析测试系统数控流动注射进样器(西安瑞迈电子科技

有限公司);MCFLesA型多功能化学发光/生物发光分析系统(西安瑞迈电子科技有

限公司)。

鲁米诺(以皿inol)储备液(0.olmol·L’l):准确称取。.17729鲁米诺(sigma

公司)溶解于0.IOIno卜L’l的Na0H溶液中，并用0.10mo卜L’I的Na0H溶液定容于100

mL容量瓶中，避光保存。

抗坏血酸储备液(0.01mo卜L’l):准确称取。1769抗坏血酸(分析纯，上海试

剂三厂)，少量水溶解后转入100 mL容量瓶中，定容。使用前配制，使用时逐

级稀释。

H202工作液通过稀释30Ok的玩氏 (上海桃浦化工厂)获得，然后用高锰酸

钾法标定其浓度，避光保存，使用前用水逐级稀释至不同浓度。

HR卫(sigma公司);十(1一哇基卜苯酚(4.IM[P，Lancaster);硅酸乙酷(TE0s);

乙醇，实验所用其他药品均为分析纯试剂，水为二次去离子水。

2.2.ZHRP固定柱的制备

在ZmL硅酸乙酷(TEos)溶液中加入lmL乙醇、0.smL水和0.smLO.1

mo卜L’皿的盐酸，超声混合lh后溶液变清，形成溶胶.取制备好的溶胶储备液1

mL，加入含。.smof·L皿HRP的磷酸盐缓冲溶液lmL，混合均匀后制成掺杂H即

的溶胶液.再在此溶胶液中加入1.59粒径为100 目左右的分子筛，并超声混匀.

将其放入冰箱中静置2~4h，用水洗涤2次后，将凝胶微珠填充到40Inm xl.5

mmi.d.玻璃毛细管柱中，两端用玻璃棉固定，4“C保存在磷酸盐缓冲溶液中。

第二章 固定化酶反应柱联用流动注射化学发光法测定抗坏血酸

2.2.3实验方法

反应流路如图2.1所示，同时开启泵1、泵2，以Tris.HCI缓冲溶液调节基

线，待基线稳定后，通过换向阀vl、vZ分别向流路中注入鲁米诺发光底液和样

品溶液.两组溶液在Tris-Hcl缓冲溶液的带动下混合进入反应器，发生化学发光

反应，完成一次检测。

本文流动注射分析所用管道均为内径0.75 llnn 的聚四氟乙烯管，反应柱采

用内径 1.snlr。，长40 lDnl的玻璃管。

L.口Inol+4-IMP

TfLI-HCI

mLl m抽H，0:+维c

图2.1实验装置结构图

Fig.2.ISchematic diagr别mofaPparatos

vl:选择阀(selecling丫ajve):vZ:进样阀(samPlingvalve):PI，巴:蠕动泵(Peristalticpump);c:固定化酶反应柱份泊c石叩colunin 初小immobili酬 en砂me)

D:检测器(detector):w:废液(w世触);NHv:负高压(negativehighvoltage):PMT:光电

倍增管印hOIO-multinlier):A:放大器(alnnli血r): 助:记录仪(recorder)

2.3结果与讨论

2.3.1鲁米诺、今IMP浓度的选择

今IN口对L切minol.HR卫一HZ仇化学发光体系有增强作用1131，试验表明，加入

村Mp溶液后，体系发光信号明显增强。当过氧化氢浓度为1.。、1护mo卜L’l，

Tris.Hcl缓冲溶液pH=8.5，HR卫固定液浓度为0.smo卜mL，1时，试验了鲁米诺和

4户n吐P的最佳浓度，如图2.2所示。结果表明，在该条件下，当鲁米诺和4一IMP

的浓度分别为3.0、1丫mo卜ul和6.。、1。礴Ino卜L’l时，发光强度最大。

第二章 固定化酶反应柱联用流动注射化学发光法铡定抗坏血酸

匡噩习

溯潮瀚姗洲潮11洲扣

cl(10闷mol.L，)

图2.2普米诺、4一IMP浓度对相对发光强度的影响

FigZ.ZE佰ectofL.minol、今】州田conCen加tiononCLintenslty

CH八=1.oxlrmol.ul. HRP:0.smol.mL.1

2.3.ZHRP固定液浓度的选择

辣根过氧化物酶的固定量会影响催化化学发光反应和检测的灵敏度。如果酶

的固定量太少，检测的灵敏度低;如果固定量太多，又将造成酶的浪费。因此，

我们对制备过程中HRP固定液的浓度进行了考察.实验结果表明，当固定液浓度

在0.05mo卜mL’，一0.smo卜mL’‘范围内，化学发光强度随着固定液浓度的增大而增强，当固定液浓度大于0.smo卜mL..后，化学发光强度增强不明显.因此，本

实验选择HR卫固定液的浓度为0.smo卜mL’，.

2.3.3缓冲溶液pH值的选择

在溶液PH值为6.。~7.5范围内HR卫的催化活性最高，而鲁米诺与过氧化氢

化学发光反应的最大发光强度在pH值为10一11之间【141，本实验考察了0.10

mo卜L-ITris一Hcl缓冲溶液PH值在7.。~10.5范围内，Lumi加1.HRP.HZ伍体系化

学发光的情况。结果表明，当PH值在7.0~9刀范围内，化学发光强度随PH值

增大而增强;当PH值大于9.0时，化学发光强度逐渐降低.因此，本实验选择

pH值为9.0的Tris-Ha缓冲溶液为缓冲介质。

2.3.4泵速的选择

在0.5~2.4mL.面‘，范围内考察了泵速对化学发光强度的影响，结果表明，

第二章 固定化酶反应柱联用流动注射化学发光法测定抗坏血酸

发光强度随泵速的加快而增加，当达到2.2mL.min.1以后，由于催化反应不充分，

发光强度有下降趋势，兼顾到灵敏度与经济运行的关系，本实验选取泵速为2.1

mL.min，1。

2.3.5玩02的影响

试验表明，在优化的实验条件下，氏仇浓度在5.0:10-， mo卜L’l~6.。、lr

mo卜口范围内分段呈良好的线性关系。

2.3.6方法的线性范围和检测限

抗坏血酸具有强还原性，能与珑伍定量发生氧化还原反应而使体系发光信

号减弱。在本实验条件下，逐级分段固定玩q浓度，测定了抗坏血酸的含量.

试验表明，抗坏血酸浓度在4.。、1砂mo卜ul~4.。二1了mol.L’1范围内有良好的线

性关系。

图2.3为固定比认浓度为8.。、10-，mo卜L’，时绘制的标准曲线.曲线的回归

方程为:△卜一1.0xl夕C+6264.9，相关系数R闭.9992，对4.0、10-;mo卜L’，抗坏

血酸10次平行测定的相对标准偏差为2.妈。以空白值的三倍标准差除以工作曲

线斜率定义检测限，则该方法的检测限为1.6、10-smo卜L-l.

7000

6000

5000

卜叫 4000

心 3000

2000

1000

0 +es一一

0。OOE+00 2。00E一06

C /

4.00E一06

(moi·L一1)

6。00E一06

图2.3 工作曲线

FigZ·3T七eregressivecurves

CLum耐 =3.0x1丫 mol.口.C牛翻p场.0、1o4

2.3.7千扰实验及反应柱的稳定性

本实验所测样品为医用维生素C片剂，主要研究了维生素C片剂中可能添加

第二章 固定化酶反应柱联用流动注射化学发光法测定抗坏血酸

的辅剂对抗坏血酸含量的干扰。对4.0、l0’，mo卜L’1抗坏血酸进行测定，试验表明，

在保持相对测量误差在士5%范围内，1000倍的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、柠檬酸钠、

苯甲酸钠、淀粉，100倍的果糖、乳糖、酒石酸、乙醇均不干扰。

实验发现，在一个月内，固定化酶反应柱可以反复使用200次，其活性无明

显变化。

2.3.8样品分析

将维生素C药片5片研细，混匀，称取1。。mg用蒸馏水溶解，定容于1。。功工容量瓶中。按图2.1所示流路，选定仪器负高压为SO0v，在室温下测定。应用

本法对市售维生素C片剂中抗坏血酸含量进行测定，并与药典法11]所测数据进行

比较，结果见表2.1。可见，本方法与药典规定方法检测结果完全一致。

表2，1 维生素C中抗坏血酸含量的分析结奥

介bleZ.IE阳t七n力1钊时ionr已SUItsofA鱿刀rbicAcidinVC

样品 标示含量/《mg/片〕 100

1oo

5O

50

本法测得t/(m以片) 98，6

97 .1

48.5

490

药碘法 /(m砂片) 971

98.3

49 .6

48一1

1

.

内‘

月J

刁，

2.4结论

本实验基于抗坏血酸对LUminol一HRP一氏伍体系化学发光反应的抑制作用，

即体系化学发光强度与抗坏血酸浓度在一定范围内呈负的线性关系，建立了一种

简单、快速检测抗坏血酸的流动注射化学发光分析新方法。该方法利用溶胶纯度

高，均匀性强，反应条件易于控制的特点tsl，将酶包埋于溶胶一凝胶的网状结构

中，使酶的各个部位得以充分舒展，并且呈均匀分布，保持了酶的催化活性和稳

定性，并填充于玻璃材料内制成固定化酶反应柱，大大减少了酶的用量。

本实验采用少有报道的4一IMPtI2]作为鲁米诺一辣根过氧化物酶化学发光体系

的增强剂，该方法用于维生素C片剂中抗坏血酸的测定，结果令人满意。

2.5反应机理的探讨

1.辣根过氧化物酶的固定化

辣根过氧化物酶 (horseradishperoxldase，简称H即)是一类商品化较早、

第二章 固定化酶反应柱联用流动注射化学发光法测定抗坏血酸

应用最为广泛的一类酶制剂.

溶胶一凝胶法是指前驱物等溶于溶剂中(水或有机溶剂)形成均质溶液，溶质

与溶剂发生水解或醇解反应，反应生成物聚集成Ilun左右的粒子并形成溶胶，将

酶液加入其中后，溶胶经蒸发干燥转变为凝胶，同时酶也被固定其中的一种方法。

酶包埋于此溶胶一凝胶的网格之后，酶的各个部位得以充分舒展，并且呈均匀分

布，有利于保持酶的催化活性:溶胶一凝胶内部形成的硅氧键象“网兜”一样将

酶分子牢固地包埋于其中，酶固定于溶胶一凝胶中后不易流失。

2.HRP催化鲁米诺化学发光体系反应机理

在过氧化氢存在下，辣根过氧化物酶能分解鲁米诺，并发出可见光。一定

条件下，发光强度与过氧化氢的浓度成正的线性关系。辣根酶催化鲁米诺化学发

光体系反应机理如下图所示:

书::立锐:习 一辫小

激发态

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h丫’写饰口。. O

基态

3.抗坏血酸测定原理

抗坏血酸结构如下图所示:

第二章 固定化酶反应柱联用流动注射化学发光法测定抗坏血酸

刁1。|习

0，C

lHO一C

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」HO一C

! H一C

l

Ho一亏一H HO一C一H

I CH20H CH20H

醉式结构 酮式结构

在溶液中，醇式结构抗坏血酸易被过氧化氢氧化失氢，生成酮式结构抗坏血

酸，从而使化学发光信号强度降低.本实验条件下，抗坏血酸浓度与化学发光信

号强度呈负的线性关系。

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[13]Y山IlllsD，物misL.L.EmPloymentof似1·imidaZ0lyl)Phenolasaluminolsignalenhancer玩

第二章 固定化酶反应柱联用流动注射化学发光法测定抗坏血酸

acompetitive勺pecheminuluminescence immunoassayand治cOmpan，Onwiththe

叨nv.ntio耐.滋igen七。。褚mdishpero粗d巴姆conjugale一basedassay闭.AnalyticaChemica Acta，2004，509(1):103一109

[14]LIBX.，2卜川gzJ，JinYchemiluminescenceflOwbiosensorfor卜ydrogenperoxi配with

immobiliz目比昭ents [月.Sens昭 断dActU成OrSB夕001.72:115·119

第三章血红蛋白催化化学发光反应联用流动注射测定人体血清中的胆固醉含遥

第三章 血红蛋白催化化学发光反应联用流动注射

测定人体血清中的胆固醇含量

3.1引言

胆固醇是人体中最丰富的类固醇，分为游离胆固醇 (斤ee。holesterol，Fc;

大约占30%)和酷化胆固醉 (比。】esterolester，大约占70%)两种形式tl]，合称

为总胆固醉(total ch01esterol，Tc)。胆固醇主要储存于大脑及肌肉。胆固醇在血

液中会与脂蛋白结合形成极低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)与高

密度脂蛋白(HDL)三种脂蛋白，与心脑血管系统疾病有着密切的关系121.因而血

清胆固醇测定可作为肝脏功能、胆汁功能、肠吸收、冠状动脉疾病、甲状腺功能

和肾上腺疾病的诊断指征。

血清中胆固醇含量的测定方法有比色法、酶法、化学发光法、色谱法、气质

联用法和荧光法等[3司.本实验在胆固醇氧化酶催化胆固醇氧化释放出凡伍的基

础上与发光试剂鲁米诺(L切叮InOI)发生反应并用血红蛋白模拟酶催化，形成偶

合的化学发光反应，联用流动注射技术，从而建立双酶促反应偶合一化学发光联

用流动注射技术测定胆固醇的新方法。这种用法尚未见报道.

血清中胆固醇酷可被胆固醇酷酶(cholesterolesterase，CE)水解为游离胆固

醇和游离脂肪酸(FFA)。本文测定血清中游离胆固醇和总胆固醇原理为:

总胆固醉 :二二二二二游离胆固醉 +胆固醉困

胆固醉.诬通鲤遁里迎鱼今 游离胆固醉，脂肪酸 游离胆固醉.匹竺鲤里壁竺些里些些理竺吐竺些眯胆省一4潇一酮，叭

奋米诺，卿:』望坐竺勇户2卜氧化还原产物，。，

血红蛋白(Hb)是一种寡居蛋白质，为动物体内氧传递的载体蛋白质，其分

子结构具有类似于天然辣根过氧化物酶(HRP)的催化活性部位和空间结构19].所

以，血红蛋白可以模拟过氧化物酶的催化特性，催化活化 践伍，其作为过氧化

物模拟酶可以克服辣根过氧化物酶等生物酶价格昂贵且不易保存的缺点。据此有

人用血红蛋白作为催化剂已成功的实现了尿液中Hb 和雨水中玩氏的高灵敏催

化动力学测定110】。本实验将廉价且常温下可长期保存的血红蛋白作为化学发光反

应的催化剂，应用到LUmi加1一玩伍的化学发光体系，不仅明显提高了测定的灵

敏度，而且降低了实验成本.建立了血红蛋白催化化学发光反应联用流动注射测

定胆固醇含量的新方法，该方法用于测定人体血清中的游离胆固醇及总胆固醇含

第三章 血红蛋白催化化学发光反应联用流动注射测定人体血清中的胆固醇含t

量，结果令人满意。进样频率为 30 样/小时，游离胆固醇线性范围为

5.6、10-，mol.口~3.8xl护mo卜L-l，检测限为3.0、10-，mo卜L-1:总胆固醇线性范围

为1.lxlo硒mol·L-，~4.3xlo-smol一L-，，检测限为1.5:10一mol·L-l.

3.2实验部分

3.2.1仪器和试剂

MPI一型多参数化学分析测试系统数控流动注射进样器(西安瑞迈电子科技

有限公司):MCFLA型多功能化学发光/生物发光分析系统(西安瑞迈电子科技

有限公司):电子继电器6402(上海市宝山五金电器厂):恒温水槽(自行组装)。

胆固醇标准物质 (特康科技有限公司):血清胆固醉标准物质 (4.7llunol/L

特康科技有限公司):胆固醇酷酶(CE，)ZOOU/L，特康科技有限公司);胆固醇

氧化酶 (CO，>100U/L特康科技有限公司);鲁米诺(Luminol，Slgms公司);牛

血红蛋白(Hb，上海丽珠东风生物技术有限公司):pH:7.4磷酸二氢钠 (上海

嵌晨化工实业有限公司)和磷酸氢二钠 (核工业实验化工厂)缓冲溶液

(0.lmol/L)，;过氧化氢 (上海桃浦化工厂):人血清 (江西省肿瘤医院提供):

阳离子交换树脂(上海树脂厂产品牌号732离子交换树脂):阴离子交换树脂(上

海树脂厂产品牌号717离子交换树脂);所用药品均为分析纯试剂，水为二次去

离子水。

3.2.2实验方法

胆固醇氧化酶催化胆固醇反应生成H八需要进行10~巧分钟 (游离胆固醇

标准溶液或总胆固醇和胆固醇酷酶混合溶液加胆固醇氧化酶，37℃水浴温热)，

故在进入FIA流路之前采用手工进行操作。

流动注射化学发光流程如图3.1所示，连接管路并调定各参数。启动主泵

Pl和副泵PZ，以磷酸盐缓冲溶液为载流，调定基线。血红蛋白和鲁米诺分别从

vl和vZ注入载流中，汇合后通过检测器得发光信号本底值1.。样品 (标准样或

血样)通过v3以体积进样方式注入载流，vl和VZ协同操作，使血红蛋白、鲁

米诺、样品在交汇处准确汇合，经反应盘管Rc后进入检测器，得到发光信号值

1。以△1(△1=1一工。)对胆固醇系列标准溶液的浓度C做工作曲线。本文使用

的聚四氟乙烯管管径为0.75 恤，反应盘管长度20 cm，负高压为600v.

第三章 血红蛋白催化化学发光反应联用流动注射测定人体血清中的胆固醉含量

HbPBS

PBS

W

Lum inol

VZPZ

图3.1实验装里结构图

Fig.3.lschem如cdiagr别旧ofaPParatuS

5:H八或样品 (翻旧ple):vl、VZ:选择阀(selecti鸣阔ve):v3:进样阀(sam plingvalve);Pl、PZ:姗动泵俩ristaltic即mP):Rc:反应盘管(几actioncoil):0:检测器(deteCtor);W: 废液(w魄)

3.2.3流路设计

如图3.1所示，胆固醇酶催化反应在进入FIA流路前采用手工进行操作，生

成的珑仇以体积进样方式注入流路，同时考虑到试剂的准确汇合及节省问题，

血红蛋白和鲁米诺试剂均以时间进样方式通过选择阀Vl和vZ 进入流路。流动

注射运行程序与参数设定见表3.1。

表3.1运行程序与参数

介ble3.1Prog。”nandParanleter

工 运行时间 姗动泵 进样阀 工作内容

步 (5) PI PZ yl yZ V3

1 20 0 0 L R x 调定基线

2 15 0 0 R L O 将样品、试剂插入载流

3 75 0 0 L R x 读取发光数值井清洗管道

4 20 0 0 L R x 重复上述步骤，开始下一次测定

注 0:开:x:关;R:右阀位:L:左阀位

3.3结果与讨论

第三章 血红蛋白催化化学发光反应联用流动注射测定人体血清中的胆固醇含量

3.3，1血红蛋白和合米诺浓度的影响

实验发现若将鲁米诺与血红蛋白先混合再与过氧化氢汇合，不如将过氧化氢

与血红蛋白先混合再与鲁米诺汇合反应的灵敏度高，可见试剂注入具有一定的顺

序性，并且出峰时间较快。同时考察了血红蛋白和鲁米诺浓度对发光信号强度的

影响，结果如图3.2所示。当血红蛋白浓度为9.0、1了mol.L’1，鲁米诺浓度为8.0、1护mo卜L’，时发光信号最强.

. 0 2 ，

H伙1刀xl加咖比 ) L口旧inO(l刀xl砂mo比)

图3.2血红蛋白和鲁米诺浓度对相对发光强度的影响

Fig3.2EffectofHb andluminocon centrationonrelativeCLintensity

3.3.ZpH的影响

(1) 胆固醇酷的水解和胆固醇的氧化反应相当于在人体中进行，故模拟人

体内环境pH选定为7.4:

(2)在FIA流路中，玩伍和血红蛋白、鲁米诺在碱性条件下能够发光，本

文对pH从8.5-13.5进行了实验，结果如图3.3所示，随着碱浓度的增强，发光

信号明显增强，当PH达到13.0后，发光信号强度变化趋于平缓。故本实验选

取缓冲溶液pH值为13:0

3.3.3泵速和反应盘管的影响

本实验属于快反应，泵速的快慢和反应盘管的长短将直接影响发光信号的强

第三章 血红蛋白催化化学发光反应联用流动注射测定人体血清中的胆固醇含量

弱。泵速高、反应盘管短则发光信号强。但是，泵速过高，反映盘管过短，将会

使试剂混合不均匀，反应不完全。实验中，综合考虑了这两种因素的影响，分别

固定泵速和反应盘管的长度观察发光信号强度变化，发现当泵速为1.9血[Jmin，

反应盘管长度为20厘米时溶液发光信号最强。

45ro40003500溯绷溯15rol000铆。

△

10 11 12 13

图3.3PH值对相对发光强度的影响

F妙.3EffectofpHon比Iative CLintensity

3.3.4酶浓度的影响

胆固醉氧化酶的适宜温度为37℃，在37℃条件下，当胆固醇氧化酶用量为

25U/L，和胆固醉反应10分钟后释放的H八的量在本实验室条件下发光信号强度

最大。

3.3.5胆固醇的测定

3.3.5.1游离胆固醇的测定

用。.lmol.L-lpH为7.4的磷酸盐缓冲溶液配置一系列胆固醇标准溶液，分

别加入0.ZmL胆固醇氧化酶，37℃水浴温热十分钟。按实验方法上流路操作，回

归方程为△1二1.0、10.x+775.32，线性范围为5.6xlo一mol·L-l~3.sxlo”mol·L‘，，

如图3.4所示。以空白值的三倍标准偏差除以工作曲线斜率定义检出限，则检出

限为3.oxlo·7伽1.L’l，相关系数R=0.9952.

33.52总胆固醇的测定

第三章血红蛋白催化化学发光反应联用流动注射测定人体血清中的胆固醇含量

用磷酸盐稀释标准血清胆固醇，得一系列标准溶液，分别向溶液中加入

0.smL胆固醉酷酶，37℃水浴孵育五分钟，再加入0.2mL胆固醇氧化酶，37℃水

浴温热十分钟.同上方法测定.得回归方程为△1=2.0x10sX+401.37，线性范围为

1.lxl砰mol.L-，~4.3xlo-smol.L-，，如图3.5所示，检出限为1.5二10一咖1.L’l，相关系数R二0.9963。

y二IE代拍

姗8.二舰+081+40137

侧姗潮姗洲绷姗。

训潮姗灿姗侧 0一 -~~~‘-一目-一-Jee ee..‘叫.，，，，，，曰

0.加E代幻1.的E刃5么加E刃53.阅E刊万4.佣E刃5

游离胆固醉浓度c/ 的1.L-’

图3.4游离胆固醇溶液的回归曲线

Fig3.4T七ereg陀ssivecurV“ofFC

0.00卜 1.ooE-- 2.00E- 3.的E- 4.加E一5.00卜

加 05 0B 05 O5 05

血清总胆固醉浓度c/.卜口

图3.5血清总胆固醉溶液的回归曲线

F论15Thereg陀ssivecurvesofTC

3.3.6干扰实验

考察了血液中常见离子r、时、C扩、M广、Fe卜、Fe卜、Zn，对测定的干扰实

验，发现其含量较血液中的正常含量值高出10倍时仍不干扰实验，但是Cus+会

产生干扰，血液中的纤维蛋白的存在也会对测定产生千扰，故实验在样品的前处

理中要除铜和纤维蛋白。

3.3.7样品的测定

取人体血清0.25mL，向其中加入lmL体积比为3:3:4的丙酮、乙醇和介iton

x-100混合溶液，室温下放置一小时，离心除去胆固醇结合蛋白。取上清液加入

3.75切山pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液14].之后再使溶液经过阴阳离子交换树脂去除干扰离子的影响，最终得到的待分析液按实验方法处理后上流路，依校正曲线

的回归方程计算样品血清中游离胆固醇和总胆固醇含量。

取两组不同年龄段人血清样品各 3份，分别测定其游离胆固醇和总胆固醇

浓度，各组所测结果见表3.2.

第三章 血红蛋白催化化学发光反应联用流动注射测定人体血清中的胆固醇含t

表3.2不同年龄段人血清中游离胆固醉和总胆固醉含t

几b】e3.2C劝.ce川比时ionofFCand祀 ins.rum6勺mdi们触IenlageS

。mU以age) Fc(mmol.L’b M已幼少em已fits me日11

Tc (mmol·L.1)n】己月n

1.(18一5) 1.19，131.1.22

2.(50凌刃) 1.89，174，1.80

!.24

1.81

3.81.3.75.384 3一80

5.23.538.5.50 5。37

取三份不同人血清，分别用本法和Tc 酶法(双试剂盒由特康科技有限公司

生产提供)测定其总胆固醉浓度，每份测定三次，结果见表3.3.

表3.3血清中总胆固醇的测定结果

几ble3.3D以erm ination ofTCins已nn”

Me朋Ur已ments toe日】1

4.58，4.62，4.63

5.41，5.44，5.45

4.91，4。89，4.87

461 4.58

5.43 5。50

4一89

4.57，4.62，4.55

5.48，5.49，5.53

4.93，4.93.4.94 4.93

由表中数据可知，两种方法无显著性差异，故本方法结果可信。

3.4反应机理探讨

1.第一个酶促反应:胆固醇氧化酶 (COA)在溶解氧的存在下催化胆固

醇氧化并释放玩伍。下图为胆固醇化学结构图，胆固醇在胆固醇氧化酶催化作

用下被水中氧氧化为胆幽-4一烯一3一酮，同时释放出过氧化氢。

胆固醇化学结构如下图所示:

2)3 、、 _ CHM白 2

第三章 血红蛋白催化化学发光反应联用流动注射测定人体血清中的胆固醇含t

2.第二个酶促反应:

由于血红蛋白{Hb}有类似与辣根过氧化物酶(HRP)催化部位的结构，其可

以模拟辣根过氧化物酶的催化性能.而在模拟酶催化反应中，血红蛋白首先与

场仇作用，中心的F矛十氧化为F护+，同时氏02还原为玩0.F产与活性氧原子

结合，形成给氧中间体(PP)Fev叼，给氧中间体释放活性氧原子(催化剂(PP)

Fev叼转化为(PP)Fe口幻);催化剂(PP)Fe田司进攻鲁米诺分子，形成叠氮

酿，叠氮醒在进一步催化氧化，形成激发态分子，当该分子从激发态跃迁回基态

时，就发出一定波长的波。

Hb催化鲁米诺化学发光反应机理如下图所示:

Hb[0=Pe”(PP)]+HZ压二一 士Hb[0=Fem(PP)]+H20

\ Hb〔。=Fev、PP):/Hb[0=Pe”(PP)]

盛氮醒

鲁米诺

hv +

， 一* NH， 0

发久。一 尸亏人。-

11 0 O _

基 态 滋 发 态

第三章血红蛋白催化化学发光反应联用流动注射测定人体血清巾的jJO固醇含量

参考文献

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第四章微型流通式反应器可更新表面非均相免疫分析法测定人体血清中的lgG

第四章 微型流通式反应器可更新表面非均相免疫分析法

测定人体血清中的免疫球蛋白G

4.1引言

免疫球蛋白是一类具有具有抗体活性的蛋白质，存在于血液、体液、外分泌

液及某些细胞的膜上。而其中含量最高的抗体是免疫球蛋白G(IgG)，占血清中

免疫球蛋白总量的70%~5004 ，也是唯一能通过胎盘的免疫球蛋白.在人体内IgG

浓度的变化多与慢性感染、慢性肝病、肝癌、淋巴瘤，以及系统性红斑狼疮、类

风湿性关节炎等自身免疫性疾病有关。故而对人体血清中190含量的测定具有重

要的临床意义。

目前测定人体免疫球蛋白的方法主要有免疫扩散法川，免疫比浊法12)]，放射

免疫法(斑A)141以及酶联免疫法伍IA)，，6]等等.放射免疫法灵敏度高，特异性强，

但该方法存在严重的放射污染问题，而传统的EIA虽然消除了放射性材料的污染

问题，但这种方法耗时长，精确度低且不易实现自动化。

流动注射免疫分析法口刊将流动注射(Fl)与免疫分析结合，简化了免疫分

析的操作步骤，提高了分析速度，但在流动注射系统中，一次测定后免疫反应柱

的再生需耗费大量的时间，且多次使用后固相抗体免疫活性降低，从而影响测定

的重现性。为了克服流动注射非均相免疫分析法的缺点，Pollema 等〔，0，111首创了

固相抗体一次性使用的流动注射可更新表面免疫分析技术任low injection

renewables也face份 assay，FIRSIA)，并以鼠IgG为对象，结合荧光法分别考

察了夹心式与竞争型反应的最佳操作条件。由于固相抗体在每次测定后即随废液

排放，无需再生，因而该方法大大提高了非均相免疫分析的速度.王建雅等[1刀31

研制成用于顺序注射可更新表面技术的简易芯片式流通池，用于血清中葡萄糖的

检测。朱海霖等114]将顺序注射可更新表面分析技术与荧光免疫分析技术结合应用

于人体血清中IgG的测定.

化学发光免疫分析是将抗原与抗体的高特异性的免疫反应与高灵敏的化学

发光检测技术相结合的分析方法，它克服了荧光免疫分析中所需仪器复杂，背景

干扰大的缺点。以其高的灵敏度、低的仪器价格、使用简便、安全、无放射性污

染等独特的优势，倍受人们的青睐。

本实验用自制的微型流通式反应器，以双抗体夹心式非均相免疫反应为模

式，联用FIA技术，建立了流动注射可更新表面非均相增强化学发光免疫分析测

定人体血清中的免疫球蛋白0的新方法.实验采用4一(1一哇基卜苯酚 (4一IMP)

第四章微型流通式反应器可更新表面非均相免疫分析法测定人体血清中的IgG

llfl作为鲁米诺一0广HRp化学发光体系的增强剂，设计了两种双抗体夹心式免疫

反应模式，并对两种模式产生的信号作了比较，以效果较好的模式优化了实验条

件并测定了人体血清中的IgG 含量，结果令人满意。体系经优化后，检出限为

0.01mg.L-1，分析速率达到10样/小时，校正曲线的线性范围为0.05mg’口一3.0

mg’口。

4.2实验部分

.1，

2

4.2.1仪器与实验装1

即1一 型多参数化学分析测试系统-

数控流动注射进样器(西安瑞迈电子科技

有限公司):McFL-A型多功能化学发光/

生物发光分析系统(西安瑞迈电子科技有

限公司):电子继电器 6402 (上海市宝山

五金电器厂)。

图4.IFI系统检测用反应器

Fig4.IFlowcellforfiowinjeCtionsy雍m

1.溶液流通管道(solution月owchannel);

2.微珠流通管道 (卜纽dnow channel)

将自制的四通道反应器(如图4.1所示)与流动注射进样系统和化学发光检

测器相连接，构成流动注射可更新表面非均相免疫反应增强化学发光检测体系，

实验装置如图4.2所示。

图4.2实验装置结构图

Fig42Schematicdia乎别旧ofaPParatus

RI:鲁米诺刊~(1一哇基卜苯酚(Luminol体IMP):RZ:过氧化氢(H202):R3:磷酸盐缓冲

溶液困为HPo月-NaHZpo月buffer);R4:HRP标记的羊抗人1四(HRP一labeledanti一IgG);RS:人19。(humanlgG)。R6:结合羊抗人1灼抗体的proteinAsePharose凝胶微珠悬浊液(】gG加mobilizedmicrobeadsconju叫edshe叩anti一humanlgG):w:废液(waste)

第四章微型流通式反应器可更新表面非均相免疫分析法测定人体血清中的IgG

vl:选择阀(故!忱tingy目v.):vZ，v3:进样阀(蜘 pling词ve):v4:截止阀(劝诚司ffvalve)。

PI，PZ:蠕动泵(ped川alticPumP):RC:流通式反应器依渔口loncell):NHv:负高压(negativehighvoltage):PMT:光电倍增管印hot卜multinlier):A:放大器(axnvli血r):Re:记录仪(reCOrder)

4.2.2试剂

ProteinA-sepharose4BFastFIow凝胶微珠(悬浊液，2~8℃低温保存，519叮a

公司);人体IgG粉末(北京中杉金桥);羊抗人犯G抗血清(北京中杉金桥);HRp

标记的羊抗人地G抗体(北京中杉金桥);人血清(江西省肿瘤医院提供);鲁米诺

(s19优以公司):4一(1一哇基卜苯酚(L坦。韶ter公司):过氧化氢(上海桃浦化工厂).

用于配制缓冲溶液的其他药品均为分析纯试剂，水为二次去离子水。

4.2.3固相抗体的制备

移取0.2mLProtein九Sepharose4BFastFIow凝胶微珠悬浊液并向其中加入

3.OmL羊抗人犯G抗血清和3.omLPH=7.5的磷酸盐缓冲溶液，室温下轻微振摇1

小时，，使羊抗人IgG抗体与ProteinA一Sepharose4BFastFIow凝胶微珠充分反应。

反应完成后，吸尽上层清液，再加入3.OmL磷酸盐缓冲溶液形成悬浊液备用。当

天制备当天使用。

4.2.4微型流通式反应器的设计

本文根据实验条件自行设计并制作了微型流通式玻璃反应器(见图4.1):通

道1为溶液流通通道，通道两端用玻璃棉封口，反应溶液可以自由通过而固相载

体不能通过此通道;通道2为固相载体流通通道，用进样阀控制上端入口，截止

阀控制下端出口。固相载体在反应开始前由通道2入口进入反应器，反应结束后

由出口排出反应器。

试验证明，该流通式反应器操作方便，作为免疫反应的反应器切实可行，并

能得到满意的实验结果。

4.2.5流动注射可更新表面化学发光免疫分析体系及系统操作程序设计

将羊抗人IgG抗体固定于包被有蛋白A的sephaxose4FF凝胶微珠表面制成

固相抗体，用辣根过氧化物酶(HR尸)标记的羊抗人地G抗体作为第二抗体，与人

体IgG抗原进行免疫反应生成双抗体夹心式抗原一抗体复合物，反应完成后导入发光底物 (体系)，HR卫催化发光底物增强发光强度，完成一次测定。

本实验设计了两种生成双抗体夹心式复合物的免疫反应模式:

第四章微型流通式反应器可更新表面非均相免疫分析法测定人体血清中的190

模式1如图4.3所示，人IgG、1王R卫标记抗体分别由流动注射系统注入流通

式反应器，依此与截留在反应器中的固相抗体反应形成夹心式双抗体复合物。

畔 。 畔 气 卜毛<曰 +-一 咔价 +*<一 阮《户任< <> 卜任心) t< I{妒

固相抗 体 抗 原抗体复合物 双抗体夹 心式 复合物

包彼有蛋白A的凝胶徽珠载体 合一人体IgG抗原

丫一羊抗人1‘抗体 丫一，RP标记的第二抗体

图4.3双抗体夹心是免疫复合物形成模式(1)

Fi妙.3MOdel(I)oftWO antibodiess朗d袱ch比旧ction

模式11如图4.4所示，人体IgG抗原和HRp标记抗体以脱线手工操作模式预孵育生成抗原抗体复合物，再由流动注射系统注入反应器，与截留在反应器中

的固相载体形成夹心式双抗体复合物。

阵 K 畔匹+~<一 田阵 一 卜〔<

固相抗体 抗原抗体复合物 双抗体夹心式复合物

星止已星，包被有蛋白A的凝胶微珠载体 令一人体Igc抗原

丫一羊抗人1邪抗体 丫一H。标记的第二抗体

图4.4双抗体夹心是免疫复合物形成模式(n)

Fi梦.4Model(11)Of卜剐Oantibodiessandwi比reaction

依据两种不同模式所设计的流动注射操作程序见表4.1。以下实验数据由免疫反应模式1所得。

第四章微型流通式反应器可更新表面非均相免疫分析法测定人体血清中的IgG

表4.1系统操作程序

Table4.10Peration procedurefor theFIsyst印

模式 工步 运行时间 蠕动泵

(5) PI PZ

工作内容

yl yZ Y3 V4

O

x

O

X

X

.X

Lx xX 调定墓线

L O Ox PBS缓冲液将固相抗体带入反应器

Lx x x 人1四注入反应器

Rx xx 人地。在反应器中停留2分钟

RX xx HR尸标记抗体注入反应器

Lx X x HRP标记抗体在反应器中停留2分钟

Lx x x 冲洗未结合的酶标抗体

Lx x x 注入发光底液，读取发光值

LX x O 将微珠排除反应器

Lx X x 重复第一步，进行下一次铡定

15

20

10

120

15

120

25

15

20

15

6

7

5

9

10

一 X X X

一O O X

l5

加

l0

120

一 X X X

一 X X X

一 X X X

一 X X X

X X O

X X X

调定基线

PBS缓冲液将固相抗体带入反应器

预孵育的抗原抗体复合物注入反应器

停留，生成双抗体夹心式复合物

冲洗未结合的酶标抗体

注入发光底液，读取发光值

将微珠排除反应器

重复第一步，进行下一次测定

25

15

加

15

注 0:开:X:关

4.3结果和讨论

4.3.1化学发光测定条件的选择

今IN印对L切滋inol一玩伍一HR夕发光体系有着明显的增强作用1旧.由于增强剂

的存在，化学发光信号增强，发光时间延长，测定灵敏度大大提高。实验表明，当

HRP浓度稀释1500倍时，珑02的浓度为7二10.3mol一 ，Luminol浓度为

第四章 微型流通式反应器可更新表面非均相免疫分析法测定人体血清中的IgG

3xlo闷mol.L’1，今IN份浓度为6、1o4mo卜L盆时，发光信号最强.图4.5为过氧化

氢浓度为7.ox10-slno卜L’1时，普米诺和今1州田浓度对化学发光信号的影响.本

实验所用L山双恤01、玩伍、今价企溶液均由PH为8.5的Tris-HCL缓冲溶液配置而成。

尹尹 一 ~ ~

图4.5鲁米诺、小IMP浓度对相对发光强度的影响

Fis4.5EffectofLuminol、今lMPconcentratiOnonrelativeCLinienSity

4.3.2两种反应模式的比较

模式1由于要两次反应器内孵育、冲洗，所以流路复杂，在线操作时间长，

完成一次操作需要360秒，而且信号稍弱，但是这种模式革除了线下手工操作步

骤，重现性比较好，同时大大节省了试剂和试样的用量。

模式n信号强，流路设计简单，线上完成一次操作仅需225秒，但是此模式

下酶标抗体与人IgG的预孵育需线下手工进行操作，所以数据的重现性较差，不

能充分发挥流动注射的优势。

实验结果表明，模式1所测得的发光信号比模式H要低 巧%左右，但是信

号比较稳定，所得数据精密度明显高于模式n所的数据。所以，本实验采用模式

1来优化实验条件。

4.3.3微珠用量的选择

固相抗体是以悬浊液的形式注入流通池。调节悬浊液的注入体积即可改变截

留于流通池内的微珠量.实验表明，当凝胶微珠悬浊液的用量在30两~50灿 范

第四章 微型流通式反应器可更新表面非均相免疫分析法测定人体血清中的1药

围内时，发光强度最大。本实验选择固相抗体悬浊液用量为45两。

4.3.4磷酸盐缓冲溶液pH值的选择

由于免疫反应一般需在中性的环境下进行，所以本考察了PH从7.0~8.5的

磷酸盐缓冲溶液对发光强度的影响，结果如图4.6所示.本实验选择PH 为7.5

的磷酸盐缓冲溶液作为载体缓冲溶液，在缓冲溶液中加入0.05%的Tween.20，可

以减少非特异性吸附和增强抗原抗体的结合作用【1气

3300

3100

2900

2700

八1 2500

2300

2100

1900

1700

1500

7‘5 8.5

pH值

图4.6州值对相对发光强度的影响

F论4.6 E伍双ofPH onrelativeCL intensity

4.3.5抗原、酶标抗体在反应器中的停留时间

人IgG和HRp一羊抗人IgG分别在反应器中停留的时间越长:夹心反应越完全，发光信号也就越强，本文考擦了1分钟~4分钟内停留时间对发光强度的影

响。实验表明，1分钟~2分钟之间化学发光信号随停留时间的增加明显增强，2

分钟~4分钟之间，发光信号的变化则趋于缓慢，出于尽可能发挥FIA快速特点

的考虑，本实验选择抗原、抗体反应物在反应器中停留的时间分别为2分钟。

4.3.6线性范围和检出限

将HRp标记的羊抗人IgG稀释1000倍，同时配置一系列标准人体地G溶液，

根据免疫反应模式1操作方法在最佳条件下进行测定。结果如图4，7所示，工作

第四章微型流通式反应器可更新表面非均相免疫分析法测定人体血清中的lgG

曲线线性范围为0.05mg.L-l一3.Omg.L’l，回归方程为厂1449.lx+502.46，相关系数为0.9947，检出限为0.oZmg.f，.

6阅0

5川沁

4口刀

△1 3000

2以刃

二 1449.lx+ 502.46

RZ二 0.9896 )

姗阱

1盼伪nCentration/毗.ul

图4.7工作曲线

Fig4.7T七e化greSSivecurve因

4，3.7样品的测定

取人体血清样品0.05mL，用磷酸盐缓冲溶液进行稀释，再按实验方法测定

其中1四 的含量，分析结果见表4.2.

表4.2血清样品分析结果(下3)

几ble4.2〔硬Ien”inationresults inhl.m明 ，erum

样品

5叨Ple

测定量

Found(.g’L-’)

相对标准偏差

RSD %

3.界

1.钱

2.既

..几

.

月口

，二

0

︸

，几

，几

口

曰

八」

4.4结 论

本实验将免疫分析法特异性强，化学发光分析法的灵敏度高，流动注射分析

法的重现性好、易于自动化和可更新表面分析操作步骤简单、分析速度快等优点

集为一体，采用自制的流通式反应器作为免疫反应的反应器，以HRP标记抗体，

今IMP增强的L切minol一氏仇发光底液作为发光体系，建立了流动注射微型流通

第四章微型流通式反应器可更新表面非均相免疫分析法测定人体血清中的】那

式反应器可更新表面非均相增强化学发光免疫分析法，用于测定人体血清中的

IgG含量并获得满意结果.该方法快速、灵敏、重现性好、特异性强、易于自动化，并且所用仪器简便、试剂和样品消耗少.

实验采用的包被proteinA的sePb盯ose4FF凝胶微珠是一种通用型固相载体，可适用于各种免疫反应体系.因此，所建立的流动注射可更新表面增强化学发光

免疫分析法亦可应用于其它免疫分析体系。

4.5反应机理探讨

1.蛋白A结合特性

葡萄球菌蛋白A(StaPhyloco司 ProteinA)是一种从金黄色葡萄球菌细胞壁

分离的蛋白质， 简称SPA或蛋白A(ProteinA)。SPA 具有和人与许多动物如

豚鼠、猪、小鼠、猴等IgG结合的能力.sPA结合部位是Fc段而不是Fab段，

这种结合不会影响抗体的活性.所以，蛋白A可利用来提纯、分析免疫球蛋白

制剂。本实验所用ProteinA.sepharose 4BFastFlow 即为一种固定有蛋白A的琼

脂糖凝胶微珠，在双抗体夹心免疫反应过程中，根据蛋白A特性结合羊抗人1所

作为第一抗体而存在，同时它又是免疫免疫反应的载体。

2.双抗体夹心反应机理

Ab(1)+Ag +Ab.U卫卫(11)=Ab(1)·Ag ·Ab.HRp(11)

(A议1):第一抗体;Ag:抗原:人卜HRP(n):第二抗体)

将羊抗人IgG抗体固定于包被有蛋白A的Sepharo阴4FF凝胶微珠表面制成

固相抗体作为夹心反应的第一抗体Ab(1)，用辣根过氧化物酶(HR卫)标记的羊

抗人地G抗体作为第二抗体Ab.H卫卫(H)，与人体IgG抗原Ag，进行免疫反

应生成双抗体夹心式抗原一抗体复合物Ab(1)·Ag·Ab.HF卫(n)。

第四章 微型流通式反应器可更新表面非均相免疫分析法测定人体血清中的r灼

3.HRP催化鲁米诺化学发光反应机理

一剧洛

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攻读学位期间的研究成果

攻读学位期间的研究成果

〔1]吴东梅，杨佳，汪敬武.固定化酶反应柱联用流动注射化学发光法测定抗坏血酸.南昌大

学学报 (已排版，特发表)

[21汪敬武，吴东梅，杨佳.流动注射化学发光法侧定人体血清中的胆固醉.化学研究与应用 (已排版，待发表)

致谢

致谢

本论文的研究工作从选题、论证、设计、实验直至论文完成过程，无不倾注着汪敬武教授的心血。汪老师严谨的治学态度，良好的学术修养和忘我的工作精神，使我在三年的求学过程中受益非浅.在此，向汪老师表示衷心的感谢的深深的敬意. 感谢三年来无私给予我知识和关心的老师们.在实验过程中，还得到许许多

多同学的大力支持和帮助，在此表示深深的谢意. 最后，我要感谢我所有的家人，他们的默默支持是我奋发向上的动力.祝愿

我的家人和所有关心支持我的朋友永远平安、健康、幸福!

吴东梅

2007年5月