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Análise Qualitativa de Microrganismos
Aline Alencar RA: 058691
Cintia Maruiama
RA: 059773
Diogo de Oliveira
RA: 060200
Gustavo Lloret RA: 048790
Pedro Aquino RA: 063624
Renan Joviliano RA: 064035
+Sumário
Atividades Bioquímicas do Microrganismos; Testes Bioquímicos; Controle de Qualidade de Medicamentos e Cosméticos; Provas Adicionais; Métodos Alternativos; Conclusão; Referências Bibliográficas.
+Atividades Bioquímicas de Microrganismos Provas bioquímicas: identificação bacteriana baseada
na detecção do perfil enzimático dos microrganismos. Antes do teste bioquímico, é necessário saber se o
microrganismo é Gram-positivo ou Gram-negativo, pois para cada grupo existe um conjunto de provas.
GRAM + GRAM -
+Testes Bioquímicos
+Provas Fermentativas
Fermentações: reações bioquímicas produtoras de energia (moléculas orgânicas servem como aceitadores e dadores de elétrons).
compostos orgânicos ácidos + H2 ou CO2
Hidratos de C e R-OH
Condições: meio líquido, hidrato de carbono específico indicador de pH e tubo de Durham, que permite detectar a produção de gás.
+Prova do Ácido Sulfídrico
Cisteína: o H2S é produzido pela hidrogenação (redução) do enxofre orgânico.
H2SAminoácidos sulfurados ou
compostos sulfurados inorgânicos
Compostos sulfurados inorgânicos: o H2S é produzido a partir de sua redução. Ex. tiossulfatos (S2O3
2-), sulfatos (SO4
2-) e sulfitos (SO32-).
Ágar SIM: uso do sulfato ferroso amoniacal como indicador, pois o ferro combina-se com o H2S formando sulfureto de ferro que é um precipitado negro insolúvel.
+Hidrólise da Gelatina
Determina a capacidade do microrganismo de secretar gelatinase, uma enzima hidrolítica extracelular capaz de degradar a gelatina.
Se a degradação ocorre, as características de gel da gelatina não são passíveis de restauração, mesmo a baixas temperaturas, ou seja, torna-se líquido.
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+Prova do Indol
Condições: meio de cultura que contenha o aminoácido triptofano e reagente de Kovac’s (amarelo), que reage com o indol produzindo um composto rosado.
IndolTriptofano
Culturas com um anel avermelhado na superfície são indol positivo.
A persistência da coloração amarela do reagente demonstra que o substrato triptofano não foi hidrolisado a indol e indica uma reação negativa.
+Prova da Urease
Determina a capacidade do microrganismo para degradar a ureia através da enzima urease.
É importante para identificar espécies de Proteus. Condições: meio de ureia de Christensen que contém
também o indicador de pH, vermelho de fenol. Quando a ureia é degradada pela
urease, a amônia acumula-se no meio tornando-o alcalino, o que transforma o meio amarelo em rosa.
A ausência da coloração rosa indica uma reação negativa.
+Prova da Oxidase
Verifica a atividade da enzima citocromo oxidase, detectada em bactérias aeróbias, algumas anaeróbias facultativas e microaerófilas.
É importante para distinguir grupos de bacilos Gram negativo patogênicos.
Condições: reagente de oxidase (dihidrocloreto de tetrametil- p-fenilenodiamina).
Após a adição do reagente o desenvolvimento da coloração rosa depois castanha e finalmente negra na superfície das colônias é indicativo da produção de citocromo oxidase e representa uma prova positiva.
+Prova da Catalase
Condições: substrato H2O2. Se houver liberação de bolhas de gás (oxigênio livre), a prova é positiva.
A ausência de formação de bolhas de gás é uma prova negativa.
2 H2O + O22 H2O2catalase
Procedimento alternativo: determinar a produção de catalase adicionando uma porção de bactérias, previamente colocadas numa lâmina, com gotas de H2O2.
+Prova da Coagulase
É utilizada para distinguir espécies patogênicas de Staphylococcus de espécies não patogênicas, sendo um bom indicador da patogenicidade do S.aureus.
Condições: plasma com anticoagulante, como o oxalato, citrato ou heparina, suspensão de microrganismos (caldo de cultura) ou colônias provenientes de um meio sólido.
A formação de coágulos às 2 h, 6 h ou 24 h de incubação é interpretada como uma prova positiva.
A ausência de coagulação após 24 h de incubação é uma prova negativa
+Controle de Qualidade de Medicamentos e Cosméticos Conjunto de técnicas analíticas qualitativas, como o
crescimento bacteriano em um meio sólido;
Importantes microrganismos-chave a serem identificados, como:
Pseudomonas aeruginosas Staphylococcus aureus Escherichia coli Salmonella sp.
+Procedimentos
As amostras podem ser semeadas em dois tipos de meio, de enriquecimento ou diferenciação, dependendo do microrganismo com o qual se está trabalhando;
Para cada classe de bactérias existe um procedimento normatizado cuja recomendação é preconizada em compêndios
+Staphylococcus aureus
Ágar Baird-Parker – colônias pretas com halo transparente;
Ágar Vogel-Johnson – colônias pretas com halo amarelo;
Ágar-Manitol – colônias amarelas com halo amarelo.
+Pseudomonas aeruginosa
Ágar-Cetrimida – colônias esverdeadas, com fluorescência;
Ágar Pseudomonas para Piocianina – colônias esverdeadas, com fluorescência azul;
Ágar Pseudomonas para Fluoresceína – colônias claras e amarelas, com fluorescência amarela.
hν
+Escherichia coli
Ágar MacConkey – colônias vermelho-púrpura, com halo de precipitação de bile;
Ágar-Eosina com Azul de Metileno – colônias vermelho-escuras, com brilho metálico;
Ágar-Endo – colônias rosadas, com brilho metálico.
+Salmonella sp.
Meios de diferenciação: Ágar Tríplice Açúcar-Ferro – colônias avermelhadas na
superfície e amarelas no fundo, com precipitação de sulfeto de ferro;
Meios de enriquecimento seletivo: Caldo Selenito-Cistina e Tetrationato de Bismuto – colônias
pretas ou esverdeadas; Ágar Xililose-Lisina-Desoxicolato (XLD) – colônias vermelhas
com núcleo preto
+Provas Adicionais
A utilização da microscopia pode ser uma importante ferramenta de análise qualitativa;
A observação de uma suspensão bacteriana através de
lâminas microscópicas permite a identificação de características como tamanho, forma, brilho e arranjo da colônia;
Tais informações são importantes na categorização dos microrganismos.
+Métodos Alternativos
Constituem metodologias de vanguarda: automatizadas, rápidas e em sintonia com a agilidade desejável em uma industria;
Normalmente, implicam alto investimento em equipamentos – análise de custo-benefício deve ser levada em conta;
As análises podem ser baseadas na composição genética do microrganismo, seu metabolismo (e produtos dele) ou moléculas características que permitam sua identificação.
+PCR (Polymerase Chain Reaction) Amplifica uma sequência específica de DNA de um
genoma microbiano e pode, portanto, caracterizar a presença de um patógeno;
Amplamente utilizado na determinação da qualidade de alimentos, pois permite avaliar a qualidade microbiana de forma rápida, com precisão, especificidade e potencial para detecção de baixos níveis de contaminação.
Protocolos de extração de DNA não exigem o emprego de solventes, precipitação com álcool, ou outros tratamentos nas amostras que demandem em tempo de preparo antes da análise.
+Aglutinação no Látex
Rápida forma de se determinar a presença ou ausência de um antígeno ou anticorpo proveniente de bactérias;
Se o antígeno ou anticorpo correspondente estiver presente, ocorrerá uma aglutinação da amostra em partículas visíveis, uma vez que a matriz (látex) estará impregnada com seu correspondente específico.
+Imunofluorescência
A utilização de anticorpos fluorescentes para diferentes epítopos pode ser indicada para identificar a presença de determinados microrganismos na amostra de interesse;
A leitura pode ser realizada através da utilização de microscopia óptica com luz polarizada;
A técnica permite a localização de proteínas sem que a colônia (biofilme) seja destruída.
+Gene Reporter
É um gene identificável qualquer utilizado para identificar outros genes específicos na cultura bacteriana, normalmente inserido em meio ao gene de interesse, reportando sua presença ou não no microrganismo;
Determinados genes são escolhidos como reporters, pois conferem aos organismos que os expressam características facilmente identificáveis ou mensuráveis;
+Conclusão
Os métodos alternativos são, em primeira análise, mais onerosos que os convencionais, contudo, conferem maior exatidão, precisão e confiabilidade às análises;
Além disso, o tempo hábil é um fator limitante em ambientes industriais, e isso deve ser levado em conta quando da escolha de uma metodologia;
É importante ressaltar a enorme relevância da validação metodológica em todo e qualquer processo de controle de qualidade, de modo que os procedimentos sempre tenham reprodutibilidade.
+Referências Bibliográficas
Farmacopéia Brasileira, 4. Ed., São Paulo: Atheneu, 1988. pte. 1, p. 526;
www.anvisa.gov.br - acessado em 08/10/2009;
PINTO, T.J.A.; KANEKO, T.M.; OHARA, M.T., “Controle biológico de qualidade de produtos farmacêuticos, correlatos e cosméticos”, São Paulo: Atheneu, 2000, p. 309;
Robert S. Dungan; April B. Leytem; “Qualitative and quantitative methodologies for determination of airborne microorganisms at concentrated animal-feeding operations”; World J Microbiol Biotechnol (2009) 25:1505–1518.
+Agradecemos a Atenção!