AVALIAÇÃO DE POTENCIAL ANTIMICROBIANO DE EXTRATO DA

Mimosa tenuiflora (WILD) POIR.(JUREMA PRETA) EM Staphylococcus

aureus ISOLADO DE ALIMENTOS

FREIRE1, Débora Alves de Carvalho; CAMPÊLO1, Maria Carla da Silva; ABRANTES1,

Maria Rociene; SOUSA1, Êlika Suzianny de; SILVA1, Jean Berg Alves;1Laboratório de Inspeção de Produtos de Origem Animal (LIPOA), Departamento de Ciências Animais,

Universidade Federal Rural do Semi-Árido (UFERSA), Mossoró (RN), Brasil.E-mail: debohaa@hotmail.com

Resumo. A resistência de Staphylococcus aureus a antibióticos é preocupante, pois esses podem ser transmitidos ao homem pela ingestão de alimentos contaminados, passando a ser um problema de grande relevância para a saúde pública. A necessidade de encontrar alternativas para o controle microbiano tem direcionado pesquisas com produtos naturais, como os vegetais que apresentam componentes com potencial antimicrobiano. Uma das plantas com notável destaque nesta área é a Mimosa tenuiflora. Neste sentido objetivou-se avaliar a atividade antimicrobiana do extrato da M.tenuiflora em cepas de S.aureus isoladas em queijo coalho, comparando seu potencial com antibióticos de uso farmacológico. Na realização do trabalho utilizou-se 29 cepas de S. aureus, provenientes de amostras de queijo coalho comercializados em supermercados na cidade de Mossoró-RN. O perfil de sensibilidade antimicrobiano foi detectado pela técnica de difusão em discos utilizando a Ciprofloxacin (5µg), Tetraciclina (30µg), Penicilina G (10U), Gentamicina (10µg) e Amicacina (30µg). Para analisar o potencial antimicrobiano do extrato alcoólico da planta utilizou-se a técnica do poço colocando 40μL do extrato nas concentrações de 1:1, 1:4 e 1:10. Observou-se que a Amicacina (30 µg) obteve os maiores valores dos halos entre os antibióticos testados enquanto que a Tetraciclina (30µg) e Penicilina G (10U) apresentaram maior resistência microbiana. Na avaliação da atividade antimicrobiana o extrato apresentou atividade crescente para as concentrações testadas, no entanto observou-se a formação de menores halos em relação a Amicacina (30 µg), utilizado como controle positivo. O extrato da M. tenuiflora demonstrou que a planta possui atividade antimicrobiana, contudo em comparação a alguns antibióticos apresentou menor eficiência frente a amostras S.aureus isoladas de queijo coalho.

Palavras-chave: Staphylococcus aureus, Extrato, Antibióticos

1. INTRODUÇÃO

Conforme MOTA et al. (2005), o termo resistência se refere a micro-organismos que não são inibidos pelas concentrações habitualmente alcançadas no sangue ou tecidos pelo antimicrobiano.

Segundo SILVA (2012), a resistência das bactérias está relacionada com a produção de enzimas (2-lactamases e 2-lactamases de amplo espectro), que atuam sobre a estrutura das penicilinas, inativando-as, característica que constitui um mecanismo de defesa desses agentes. EMERY e WEYMOUTH (1997) constataram que a síntese dessas enzimas era codificada por genes presentes nos plasmídios e/ou cromossomos, portanto transmitidos para as gerações seguintes. Outra forma de resistência está relacionada à composição bioquímica da parede celular bacteriana, as quais conferem impermeabilidade a determinadas substâncias. Ainda, a impenetrabilidade ao antibiótico pode ser aumentada pela diminuição de receptores de membrana para antibióticos e pela existência de proteínas específicas para a exportação de substâncias nocivas ao metabolismo celular, as bombas de efluxo [GILBERT; McBAIN, 2001]. Os micro-organismos com resistência são capazes de se multiplicar mesmo na presença de concentrações de antimicrobianos mais elevadas do que as provenientes de doses terapêuticas convencionais e ocorre devido à evolução natural dos micro-organismos, além do uso desmedido e irracional destes agentes nas práticas médicas, agrárias e veterinárias [WANNMACHER, 2004; HOEFEL et al., 2006].

O gênero Staphylococcus spp. está associado a infecções que acometem tanto humanos quanto animais [ANNEMULLER et al.,1999]. Pertencem a família Micrococcaceae, são bactérias Gram positivas, imóveis, agrupadas em massas irregulares ou cachos de uva, aeróbias ou anaeróbias facultativas e catalase positiva. Os Staphylococcus aureus são coagulase positivos, hemolíticos e fermentadores de manitol. Apesar de classificados como micro-organismos mesofilos, demonstram crescimento em temperaturas entre 7,0 e 47,8°C [JAY, 1994].

Staphylococcus aureus podem provocar intoxicações na ausência do processo infeccioso, através da ingestão de toxinas previamente formadas no alimento contaminado. As enterotoxinas estafilococicas são produzidas entre 10 e 46°C, e apresentam elevada resistência térmica, podendo persistir no alimento cozido e no leite pasteurizado [SMITH et al., 1983].

Atualmente 95% das cepas de Staphylococcus aureus, de todo o mundo, são resistentes à penicilina, ampicilina e penicilina antipseudomonas. A indústria farmacêutica, a fim de prevenir a resistência a estes antibióticos, lançou a síntese da meticilina (penicilina semi-sintética), mas tem-se notado o aumento da resistência de S.aureus a este medicamento em vários hospitais do mundo [NEU, 1992; HATA et al., 2010]. Os riscos da transmissão de bactérias resistentes para o homem é extremamente efetivo através da alimentação [PORTUGAL; BRITO; CASTRO, 2001].

Na busca por alternativas para minimizar esta resistência as plantas têm sido valorizadas como produtos naturais importantes para a manutenção da saúde humana, especialmente na última década, com a realização de muitos estudos sobre terapias naturais [CORRÊA et al., 2008].

No Nordeste brasileiro, onde a vegetação predominante é a caatinga, é encontrada uma grande variedade de plantas que possuem propriedades antimicrobianas, um exemplo é a Mimosa tenuiflora (Wild) Poir. (jurema-preta) típica das áreas semiáridas do Brasil, uma leguminosa da subfamília Mimosoideae e popularmente utilizada por tribos indígenas e pelas populações dessas regiões para fins terapêuticos em países da América Latina. Há estudos que comprovam seu potencial antimicrobiano, analgésico, regenerador de células, antitérmico e adstringente peitoral [MAIA, 2004].

A Mimosa Tenuiflora sendo uma planta característica do semiárido, com grande potencial antimicrobiano possui uma abundância de taninos e flavonóis detectada no extrato de sua casca sendo a provável responsável pela atividade antimicrobiana. Havendo atividade verificada também em Staphylococcus epidermitis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Micrococcus luteus e Acinetobacter calcoaceticus, além de fungos como Microsporum gypseum, Microsporum canis, Thrichophyton mentagrophytes, Thrichophyton rubus e Chaetomium indicum (LOZOYA et al., 1989).

Apesar das indústrias farmacêuticas produzirem um expressivo número de novos antibióticos nas últimas três décadas, a resistência microbiana a essas drogas também aumentou. Em geral, as bactérias têm a habilidade genética de adquirir e de transmitir resistência às drogas utilizadas como agentes terapêuticos [COHEN, 1992]. A necessidade de encontrar alternativas para o controle microbiano tem direcionado muitas pesquisas na busca de produtos que sejam eficazes, econômicos e ecologicamente viáveis. Estudos realizados com produtos naturais possuindo atividade biológica têm sido direcionados no sentido de oferecer alternativas confiáveis para o controle microbiano [ALBUQUERQUE, 2001]. Desta forma, o trabalho teve como objetivo avaliar a atividade antimicrobiana do extrato da Mimosa tenuiflora em cepas de Staphylococcus aureus isoladas de queijo coalho comparando seu potencial com antibióticos de uso farmacológico.

2. MATERIAIS E MÉTODOS

O presente trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Inspeção de Produtos de Origem Animal – LIPOA da Universidade Federal Rural do Semi-Árido (UFERSA).

2.1 Obtenção do extrato de Mimosa tenuiflora (WILD) POIR.

O material vegetal (casca da jurema preta) foi coletado nas primeiras horas da manhã. Depois de realizada a identificação botânica foi armazenada em estufa a 40 °C para secagem. A seguir, a casca foi triturada em moinho, acondicionada em frascos estéreis e pesada. Posteriormente, foram adicionados 1000 mL de etanol PA em 500g da casca da planta, a mistura foi colocada em erlenmeyer de 2000 mL, e conservou-se em repouso por um período de 72 horas para extração. Após o período de extração, foi realizado o processo de filtração á vácuo, seguida por uma filtração simples. Para retirada do etanol PA, a mistura foi colocada no Rotoevaporador, rotação média de 90 rpm, com o banho-maria a uma temperatura de 60 +/- 5ºC. A parte líquida restante foi colocada em banho-maria, uma temperatura média de 45º C, para total evaporação do etanol. O extrato resultante foi armazenado em recipiente de vidro estéril, lacrado, identificado e estocados em ambiente refrigerado com uma temperatura compreendida entre 0 a 8°C, até sua utilização.

Em seguida o extrato foi diluído em água destilada estéril, nas seguintes concentrações: 1:1, 1:4 e 1:10 de p/v., utilizando-se como referência MacFaddin (2000) para os cálculos de elaboração dos extratos nas concentrações em porcentagem de peso/volume ou grama/100mL, através da seguinte equação, Eq.(1):

Gramas de soluto = % (p/v) x volume , (1) 100 mL

onde: Gramas de soluto = peso do extrato seco, %(p/v) = valor da concentração pré-estabelecida,Volume = quantidade em mL do solvente necessária para dissolver o soluto a determinada concentração.

2.2 Reativação das cepas

Foram utilizadas 29 cepas de Staphylococcus aureus, isoladas de amostras de queijo de coalho comercializados em supermercados da cidade de Mossoró-RN. Estas foram reativadas em caldo Brain Heart Infusion –BHI, através da técnica de semeadura em meio líquido. Após 24 – 48h, foi avaliado o crescimento bacteriano, a partir da existência de turvação do líquido, comparando-se o grau de turvação com uma solução padrão de McFarland, de acordo com NCCLS (2000) equivalente a 0,5 da amostra padrão.

2.3 Atividade antimicrobiana dos antibióticos

Para comparação posterior com o potencial antimicrobiano do extrato da Mimosa tenuiflora (Wild) Poir. (jurema-preta), foi realizado a técnica de difusão em discos, com algumas drogas antimicrobianas comuns de uso farmacêutico. Foram utilizadas 29 cepas de Staphylococcus aureus reativadas e suspendidas. As mesmas foram colocadas em placas em duplicata, contendo meio Ágar Mueller-Hinton, com auxílio de swabs pelo método de Kirby-Bauer, com posterior inserção dos discos de antibióticos, sendo os utilizados no experimento: Amicacina (30µg), Ciprofloxacin (5µg), Gentamicina (10µg), Tetraciclina (30µg) e Penicilina G (10U). As placas foram incubadas invertidas a 35ºC em estufa por um período de 48h. Em seguida foi medido, com auxílio de paquímetro, o diâmetro dos halos de inibição. (Fig. 1)

Figura 1: Halos formados por antibióticos na presença de Staphylococcus aureus isolados de amostras de queijo de coalho comercializados em supermercados da cidade de Mossoró-RN 2.4 Atividade antimicrobiana do extrato

Para analisar o potencial antimicrobiano do extrato de M. tenuiflora, foi utilizada a técnica do poço [GROOVE & RANDALL, 1955]. As placas contendo Ágar Muller Hilton foram perfuradas e semeadas, em duplicata, com as cepas de S. aureus. A semeadura foi realizada com o auxílio de swabs, pelo método de Kirby-Bauer. Nos cinco poços perfurados em cada placa, foram colocados em três destes poços, 40μL do extrato nas concentrações de 1:1, 1:4 e 1:10. E nos outros dois poços, o controle positivo contendo o antibiótico mais efetivo no experimento de difusão em disco, a Amicacina (30µg) e o controle negativo, água

destilada estéril. As placas foram incubadas invertidas a 35º C durante 48h. E posteriormente, foram realizadas as medidas dos halos de inibição com auxílio de paquímetro (Fig. 2).

Para a interpretação dos resultados seguiu-se os dados sugeridos pela NCCLS (2000), onde os halos de inibição formados foram comparados com a tabela de referência, sendo os micro-organismos classificados como resistente, intermediário e sensível a S. aureus. [NCCLS, 2000].

Figura 2: Halos formados pelas diferentes concentrações do extrato da M. tenuiflora na presença de S. aureus isolados de amostras de queijo de coalho comercializados em supermercados da cidade de Mossoró-RN.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados da determinação da atividade antimicrobiana foram medidos em milímetros, de acordo com os diâmetros dos halos de inibição dos antibióticos de uso farmacológico, e do extrato da jurema preta sobre o Staphylococcus aureus. Estão representados os resultados destes diâmetros nas Tabelas 1 e 2, respectivamente.

Na análise da atividade antimicrobiana realizada com os antibióticos, observou-se que os S. aureus apresentaram maior sensibilidade para o antibiótico Amicacina (30µg). (Tabela 1) Já com relação ao antibiótico Penicilina G (10U), encontrou-se valores que expressaram resistência, comprovando a afirmação de NEU (1992) e HATA et al.(2010) com referência a resistência atual do S. aureus a penicilina.

Após leitura dos halos de inibição em relação aos discos de antibióticos, as amostras foram testadas com o extrato da M. tenuiflora, onde observou-se o desenvolvimento de maiores halos ao redor dos poços na concentração de 1:1 do extrato, classificando-o como intermediário. E menores valores dos halos na concentração de 1:10. (Tabela 2) O que indica que a diluição é inversamente proporcional a eficácia do extrato, já que ao aumentar a diluição do extrato foi observado menor ação do potencial antimicrobiano do mesmo. Entretanto, a média dos valores dos halos de formação do extrato foram menores do que os formados pelo antibiótico Amicacina (30µg), usado como controle positivo

*não foi possível obter resultados R=Resistente; I =Intermediário; S= Sensível . Padrões Interpretativos de Diâmetros do Halo de inibição baseados na tabela NCCLS (2000)Penicilina G 10UR≤ 28< I < 29 ≥ S ; Tetraciclina 30 µg R≤

TABELA 1: Média aritmética dos halos de inibição (mm) das colônias bacterianas, formados pelos antibióticos.

Amostras

Penicilina G(10U)

Tetraciclina(30µg)

Gentamicina(10µg)

Amicacina(30µg

)

Ciprofloxacin(5µg)

1 17,5R 13,0 R 12,0 R 20,5 S 16,0 I

2 27,5R 27,0 S 22,0 S 27,5 S 32,5 S

3 15,0R 32,0 S 29,5 S 29,5 S 30,5 S

4 9,50R 13,5 R 21,0 S 26,5 S 27,0 S

5 12,5 R 30,5 S 28,0 S 31,5 S 34,5 S

6 33,5 S 26,0 S 25,0 S 32,0 S 28,0 S

7 31,0 S 26,5 S 29,5 S 29,5 S 27,0 S

8 29,5 S 25,0 S 22,0 S 28,5 S 25,5 S

9 16,5 R 30,0 S 30,0 S 33,0 S 30,0 S

10 29,5 S 30,0 S 29,0 S 32,0 S 31,0 S

11 21,5 R 6,5 R 23,0 S 26,0 S 25,0 S

12 29,0 S 28,0 S 23,0 S 29,0 S 23,0 S

13 32,5 S 27,0 S 26,0 S 29,5 S 25,5 S

14 15,5 R 28,0 S 25,0 S 27,5 S *15 35,5 S 25,5 S 27,0 S 36,0 S *16 25,0 R 27,0 S 25,0 S 29,0 S 26,5 S

17 12,0 R 16,0 I 16,5 S 19,5 S 23,5 S

18 31,0 S 26,0 S 25,5 S 30,5 S *19 9,50 R 19,5 S 20,5 S 26,0 S *20 0 R 22,5 S 15,5 S 17,0 S *21 28,0 R 22,5 S 16,0 S 26,0 S 25,0 S

22 9,00 R 22,0 S 19,0 S 29,0 S *23 10,0 R 20,0 S 20,0 S 24,5 S *24 22,5 R 20,0S 25,0 S 26,0 S 24,5 S

25 0 R 0 R 16,0 S 19,5 S 16,5 I

26 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R

27 36,5 S 32,0 S 29,0 S 33,5 S 23,0 S

28 28,5 I 19,0 S 20,0 S 26,5 S 21,0 S

29 20,0 R 29,0 S 18,5 S 21,5 S 18,0 I

Média

19,1 R 22,2 S 22,0 S 25,5 S 23,9 S

14< I < 19 ≥ S; Gentamicina 10 µg R ≤ 12 < I <15 ≥ S; Amicacina 30 µg R≤ 14< I <17 ≥ S; Ciprofloxacina R ≤ 15 < I <21 ≥ S.

.O extrato da M. tenuiflora mostrou maior eficiência apenas na concentração de 1:1 do

extrato, com halo médio de 14.90, classificando-o como intermediário. Já para as outras concentrações testadas do extrato (1:4 e 1:10), foi classificado como resistente (Tabela 2). Estes resultados apresentaram-se diferentes dos encontrados por PEREIRA et al. (2009) quando analisavam o perfil de sensibilidade antimicrobiana in vitro de jurema preta e neem sobre amostras de Staphylococcus sp. isoladas de mastite em búfalas, onde foi observado que o extrato da Jurema preta apresentou atividade biológica efetiva, nas diluições 1:1; 1:2; 1:4; 1:8; 1:16; 1:32; 1:64 e 1:128 com a média do halo de inibição foi de 25 mm.

TABELA 2: Média aritmética dos halos de inibição (mm) das colônias bacterianas, formados pelas diferentes concentrações do extrato da Mimosa tenuiflora.

Amostras Concentrações do extrato da Mimosa tenuiflora[ 0,1] [ 0,4 ] [ 1 ]

1 11,0R 14,5 I 17,5 S

2 10,0 R 11,5 R 14,5 I

3 10,0 R 11,0 R 20,0 S

4 6,0 R 13,5 R 15,5 I

5 5,0 R 15,0 I 17,0 S

6 5,0 R 17,0 S 20,0 S

7 15,0 I 18,5 S 22,0 S

8 12,5 R 16,0 S 18,0 S

9 9,5 R 15,0 S 20,5 S

10 8,5 R 9,50 R 11,5 R

11 8,5 R 11,0 R 14,5 I

12 4,0 R 10,0 R 15,5 I

13 12,0 R 15,0 S 17,5 S

14 9,0 R 14,0 R 15,5 I

15 12,0 R 13,5 R 17,0 S

16 5,0 R 10,0 R 12,5 R

17 12,0 R 14,0 R 16,5 I

18 4,0 R 11,0 R 13,5 R

19 11,5 R 12,0 R 15,0 I

20 9,5 R 12,0 R 14,0 R

21 10,0 R 13,5 R 15,0 I

22 10,0 R 12,5 R 14,0 R

23 9,5 R 13,0 R 14,5 I

24 3,0 R 8,00 R 11,5 R

25 0 R 7,00 R 12,5 R

26 3,0 R 9,00 R 10,5 R

27 11,0 R 13,00 R 15,0 I

28 9,0 R 10,50 R 12,5 R

29 12,5 R 13,5 R 16,5 I

Média 8,5 R 12,5 R 14,9 I

R=Resistente; I =Intermediário; S = Sensível . Padrões Interpretativos de Diâmetros do Halo de inibição baseados na tabela NCCLS (2000); Amicacina30 µg R ≤ 14 < I < 17 ≥ S.

4. CONCLUSÕES

O extrato da Mimosa tenuiflora apresentou atividade antimicrobiana decrescente de acordo com a diluição, mostrando uma menor atividade quando em comparação com as médias dos halos de inibição de antibióticos de uso farmacológico. Representando, portanto, uma alternativa potencial para o desenvolvimento de novos produtos com atividade antimicrobiana.

REFERÊNCIAS

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EVALUATION OF THE ANTIMICROBIAL POTENTIAL OF THE

Mimosa tenuiflora (WILD) POIR. (JUREMA PRETA) EXTRACT ON

Staphylococcus aureus ISOLATED FROM FOODS

FREIRE1, Débora Alves de Carvalho; CAMPÊLO1, Maria Carla da Silva; ABRANTES1, Maria Rociene; SOUSA1, Êlika Suzianny de; SILVA1, Jean Berg Alves;

1Laboratory of Inspection of Animal Products (LIPOA), Animal Science Department, Federal University of the Semi-Arid (UFERSA),Mossoró (RN), Brazil

E-mail: debohaa@hotmail.com

Abstract. The resistance of Staphylococcus aureus to antibiotics is a great concern, for these microorganisms may be transmitted to humans through the ingestion of contaminated food, becoming a serious public health issue. The necessity to find alternatives to microbial control has driven research toward natural products such as vegetables which have components presenting antimicrobial activity. Mimosa tenuiflora is one of the plants that show remarkable prominence in this area. Therefore, this study was aimed at evaluating the antimicrobial activity of M.tenuiflora extracts on S.aureus strains isolated from coalho cheese, and later on comparing their potential to antibiotics of pharmacological use. For this work, 29 S. aureus strains from coalho cheese samples sold at supermarkets in the city of Mossoró-RN. The antimicrobial susceptibility profile was detected through the disc diffusion technique using Ciprofloxacin (5 μg), Tetracycline (30 μg), Penicillin G (10 U), Gentamicin (10 μg) and Amikacin (30 μg). The antimicrobial potential of the plant’s alcoholic extract was evaluated using the well technique where 40 μL of the extract at concentrations of 1:1, 1:4 and 1:10 was placed in each well. It was observed that Amikacin (30 μg) presented the largest halos of all the antibiotics tested, whereas Tetracycline (30 μg) and Penicillin G (10 U) showed greater microbial resistance. The evaluation of the extracts’ antimicrobial potential showed increasing activity as the concentrations became higher, nevertheless the halos formed were smaller when compared to the ones formed by Amikacin (30 μg),which was used as positive control. The M.tenuiflora extract demonstrated that this plant has antimicrobial activity, however compared to some antibiotics it was less efficient against the S. aureus strains isolated from coalho cheese.

Keywords: Staphylococcus aureus, Extract, Antibiotics.