11

BRUNO LEONARDO DE FREITAS SOARESBRUNO LEONARDO DE FREITAS SOARES

EFEITOS DO ALPROSTADIL NA EFEITOS DO ALPROSTADIL NA SÍNDROME DE ISQUEMIA E SÍNDROME DE ISQUEMIA E

REPERFUSÃO EM TECIDO RENAL REPERFUSÃO EM TECIDO RENAL DE RATOSDE RATOS

São PauloSão Paulo20052005

Projeto de Tese apresentado à Projeto de Tese apresentado à Universidade Federal de São PauloUniversidade Federal de São Paulo// Escola Paulista de Medicina, para Escola Paulista de Medicina, para obtenção do título de Mestre em obtenção do título de Mestre em CiênciasCiências

22

1. Introdução 1.1 - Contexto Bywaters, 1941 Bywaters, 1941

Descrição de síndrome associada a extensas lesões musculares Descrição de síndrome associada a extensas lesões musculares traumáticastraumáticas

Haimovici, 1960Haimovici, 1960

Síndrome metabólica pós-revascularização Síndrome metabólica pós-revascularização

Haimovici, 1973 Haimovici, 1973

Síndrome mionefropática ou de reperfusãoSíndrome mionefropática ou de reperfusão

Burihan, 1982Burihan, 1982

O nível de obstrução e a massa muscular envolvida são importantes na O nível de obstrução e a massa muscular envolvida são importantes na síndromesíndrome

Bywaters EGL, Beall D. Crush injuries with impairment of renal function. Br Med Journ 1960,;1:427-32.Bywaters EGL, Beall D. Crush injuries with impairment of renal function. Br Med Journ 1960,;1:427-32. Haimovici H. Arterial embolism with acute massive ischemic myopathy and myoglobinuria. Surgery 1960; 47: 739-47.Haimovici H. Arterial embolism with acute massive ischemic myopathy and myoglobinuria. Surgery 1960; 47: 739-47. Haimovici H. Miopathic nephrotic metabolic syndrome associated with massive acute arterial occlusion. Arch Surg 1999 nov; 18(5): 439-44.Haimovici H. Miopathic nephrotic metabolic syndrome associated with massive acute arterial occlusion. Arch Surg 1999 nov; 18(5): 439-44.Francisco JR, Burihan E. Tratamento das embolias aorto-iliacas. Revista de tema livre do 16 Congresso Brasileiro de Cirurgia 1982; p.79.Francisco JR, Burihan E. Tratamento das embolias aorto-iliacas. Revista de tema livre do 16 Congresso Brasileiro de Cirurgia 1982; p.79.

33

1.1- Contexto

Myers, 1986 Myers, 1986

Injúria renal decorre da magnitude e da duração da Injúria renal decorre da magnitude e da duração da isquemiaisquemia

Joves, 1982 Joves, 1982

A isquemia leva ao edema intersticial com obstrução A isquemia leva ao edema intersticial com obstrução tubular e necrose tubular aguda tubular e necrose tubular aguda

Ward, 1988Ward, 1988

Pouco progresso no tratamento a despeito do Pouco progresso no tratamento a despeito do conhecimentoconhecimento

Myers BD, Mran SM. Hemodinamically mediated acute renal failure. N Eng J Med 1986;314:97.Myers BD, Mran SM. Hemodinamically mediated acute renal failure. N Eng J Med 1986;314:97.

Joves DB. Joves DB. Ultrastructure of acute renal failure. Lab Invest 1982;46:254.Ultrastructure of acute renal failure. Lab Invest 1982;46:254.

Ward MH. Factors predictive of acute renal failure in rhabomyolysis. Arch Int Med 1988; 148: 1553-7Ward MH. Factors predictive of acute renal failure in rhabomyolysis. Arch Int Med 1988; 148: 1553-7 ..

44

1.1- Contexto

Granger, 1988Granger, 1988

Radicais livres de oxigênio e lesão celular Radicais livres de oxigênio e lesão celular

Vargas, 1995Vargas, 1995

Efeito atenuante da PGE1 no tecido isquêmico renal Efeito atenuante da PGE1 no tecido isquêmico renal reperfundido em ratosreperfundido em ratos

Kelly, 1996 Kelly, 1996

Mecanismo direto e indireto de lesão celular: Molécula de Mecanismo direto e indireto de lesão celular: Molécula de adesão intercelular tipo 1 (ICAM1) adesão intercelular tipo 1 (ICAM1)

Granger DN. Role of Xanthine oxidase and granulocytes in ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol 1988;225:1269-75.Granger DN. Role of Xanthine oxidase and granulocytes in ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol 1988;225:1269-75.

Vargas AV. Krishnamuthi V, Masih R, Robinson AV, Schulak JA. Vargas AV. Krishnamuthi V, Masih R, Robinson AV, Schulak JA. Prostaglandin E1 attenuation of ischemic renal reperfusion Prostaglandin E1 attenuation of ischemic renal reperfusion injury in the rat. J AM Coll Surg 1995;180(6):713-7. injury in the rat. J AM Coll Surg 1995;180(6):713-7.

Kelly KJ, Williams JR, Colvin RB, Bonventre JV. Antibody to intercellular adhesion molecule 1 deficient mice are protected Kelly KJ, Williams JR, Colvin RB, Bonventre JV. Antibody to intercellular adhesion molecule 1 deficient mice are protected against ischemic renal injury. J Clin Invest 1996;97:1056-63.against ischemic renal injury. J Clin Invest 1996;97:1056-63.

55

1.1- Contexto Alprostadil: análogo da prostaglandina (PGE1)Alprostadil: análogo da prostaglandina (PGE1) Vargas, 1995Vargas, 1995

Bloqueio de substâncias quimioatrativas Bloqueio de substâncias quimioatrativas Linderman, 1998 Linderman, 1998

Diminuição da adesividade leucocitária Diminuição da adesividade leucocitária Gupta, 1998Gupta, 1998

Diminuição da expressão das moléculas ICAM-1 Diminuição da expressão das moléculas ICAM-1 Linderman, 1998Linderman, 1998

Diminuição da resistência vascular periférica Diminuição da resistência vascular periférica

Vargas AV. Krishnamuthi V, Masih R, Robinson AV, Schulak JA. Vargas AV. Krishnamuthi V, Masih R, Robinson AV, Schulak JA. Prostaglandin E1 attenuation of ischemic renalProstaglandin E1 attenuation of ischemic renalreperfusion injury in the rat. J AM Coll Surg 1995;180(6):713-7.reperfusion injury in the rat. J AM Coll Surg 1995;180(6):713-7.Lindermann S, Gierer C, Darius H. Prostacyclin inhibits adhesion of polymorphonuclear leukocytes to human vascular endothelial cells due to adhesion Lindermann S, Gierer C, Darius H. Prostacyclin inhibits adhesion of polymorphonuclear leukocytes to human vascular endothelial cells due to adhesion

molecule independent regulatory mechanisms. Basic Res Cardiol 2003 Feb;98(1)8-15.molecule independent regulatory mechanisms. Basic Res Cardiol 2003 Feb;98(1)8-15.Gupta PC, Matsushita M, Oda K, Nishikimi N, Sakurai T, Nemura Y. Attenuation of renal ischemia-reperfusion injury in rats by alloprurinol and Gupta PC, Matsushita M, Oda K, Nishikimi N, Sakurai T, Nemura Y. Attenuation of renal ischemia-reperfusion injury in rats by alloprurinol and

prostaglandin E1. Eur Surg Res 1998;30(2):102-7.prostaglandin E1. Eur Surg Res 1998;30(2):102-7.

66

1.2- Hipótese

O uso do alprostadil, por via intravenosa, O uso do alprostadil, por via intravenosa,

atenua o efeito das lesões metabólicas e atenua o efeito das lesões metabólicas e

histológicas e imuno-histoquímicas na isquemia histológicas e imuno-histoquímicas na isquemia

e reperfusão em tecido renal de ratose reperfusão em tecido renal de ratos

77

1.3- Objetivo

Avaliar os efeitos da infusão intravenosa Avaliar os efeitos da infusão intravenosa

do alprostadil num modelo experimental do alprostadil num modelo experimental

de isquemia e reperfusão em tecido de isquemia e reperfusão em tecido

renal de ratosrenal de ratos

88

2. MétodosProjeto aprovado pelo comitê de ética da UNCISAL, protocolo 16-A, em13/10/2004.

2.1-Tipo de estudo

- Ensaio clínico aleatório - Ensaio clínico aleatório em animais de em animais de experimentaçãoexperimentação

2.2-Local

2.2.1-Laboratório do 2.2.1-Laboratório do Departamento de Cirurgia Departamento de Cirurgia Experimental e Técnica Experimental e Técnica Operatória - FMSP-BOperatória - FMSP-BAA

99

2. Métodos2.3 –Amostra

Ratos machosRatos machos

Linhagem OUT B WistarLinhagem OUT B Wistar

Idade - 90 a 120 diasIdade - 90 a 120 dias

Peso - 250 a 350 gPeso - 250 a 350 g

15 dias - observação e adaptação15 dias - observação e adaptação

Condições controladasCondições controladas

2.3.1 – Amostragem

Animais provenientes do biotério do Departamento de Cirurgia Animais provenientes do biotério do Departamento de Cirurgia

Experimental e Técnica Operatória da FMSP-BAExperimental e Técnica Operatória da FMSP-BA

1010

2. Métodos

2.4 Procedimentos

2.4.1 - Randomização

- Envelopes- Envelopes

- Sorteio aleatório- Sorteio aleatório

- Examinadores- Examinadores

1111

2.4 Procedimentos

2.4.2 - Grupos experimentais Grupo ShGrupo Sh (10 animais ) – Realização de microcirurgia sem isquemia (10 animais ) – Realização de microcirurgia sem isquemia

ou reperfusão. Infusão de Solução salina (SF 0,9%) atráves da veia ou reperfusão. Infusão de Solução salina (SF 0,9%) atráves da veia jugular externa (V.J.E) após 1h e 30 minutos de procedimento.jugular externa (V.J.E) após 1h e 30 minutos de procedimento.

Grupo CtGrupo Ct ( 10 animais ) – Procedimento microcirúrgico normal, com ( 10 animais ) – Procedimento microcirúrgico normal, com isquemia e reperfusão. Infusão de SF 0,9% antes da reperfusão. isquemia e reperfusão. Infusão de SF 0,9% antes da reperfusão.

Grupo AlGrupo Al ( 10 animais ) – Procedimento idêntico ao Grupo II, exceto ( 10 animais ) – Procedimento idêntico ao Grupo II, exceto pela infusão de 20microgramas/kg Alprostadil, antes da reperfusão.pela infusão de 20microgramas/kg Alprostadil, antes da reperfusão.

2. Métodos

1212

2.4 Procedimentos

2.4.3 Modelo experimental Pré operatório

Foram submetidos a jejum (6h)Foram submetidos a jejum (6h)

Foram devidamente pesadosForam devidamente pesados

Submetidos a sorteioSubmetidos a sorteio

Anestesia

Fenobarbital sódico (45mg/kg) via intraperitonealFenobarbital sódico (45mg/kg) via intraperitoneal

Sono profundoSono profundo

Estímulos dolorosos irresponsivosEstímulos dolorosos irresponsivos

Doses complementares de anestésicoDoses complementares de anestésico

1313

2.4- Procedimentos2.4.3- Modelo Experimental

Dissecção, isolamento e cateterização da veia jugular externa Dissecção, isolamento e cateterização da veia jugular externa

Tricotomia ventral abdominal com lâmina de barbearTricotomia ventral abdominal com lâmina de barbear

Incisão abdominal medianaIncisão abdominal mediana

Abordagem transperitoneal da aorta, com isolamento do Abordagem transperitoneal da aorta, com isolamento do

segmento abdominal até acima das artérias renaissegmento abdominal até acima das artérias renais

Oclusão da aorta supra-renal por 30 minutos(Grupos Ct e Al)Oclusão da aorta supra-renal por 30 minutos(Grupos Ct e Al)

Liberação do clampe e reperfusão 1 h (Grupos Ct e Al)Liberação do clampe e reperfusão 1 h (Grupos Ct e Al)

No Grupo Sh não há isquemia e reperfusãoNo Grupo Sh não há isquemia e reperfusão

1414

2.4- Procedimentos

2.4.3- Modelo Experimental

Infusão de SF 0,9% (Grupo Ct) e Infusão de SF 0,9% (Grupo Ct) e Alprostadil (Grupo Al), antes da reperfusãoAlprostadil (Grupo Al), antes da reperfusão

Amostras de sangue Amostras de sangue

Nefrectomia esquerda e preparo das peças Nefrectomia esquerda e preparo das peças

Eutanásia – dose anestésica letalEutanásia – dose anestésica letal

1515

2.4 Procedimentos

1616

2.4 Procedimentos

2.4.3 Modelo experimental

Estudo histológico (microscopia ótica)

Hematoxilina eosina Ácido Periódico de Schiff

(PAS) Azul patente (Azul de

Alcion)) Estudo Imunohistoquímico

(Laboratório de biologia molecular da Fiocruz-Salvador)

Amostras de Tecido Renal

1717

2.5.1- Variáveis primárias

2.5.1.1- Estudo imunohistoquímico

Dosagem de Molécula de adesão Dosagem de Molécula de adesão

intercelular do tipo 1 (ICAM-1)intercelular do tipo 1 (ICAM-1)

Análise qualitativa de desarranjo estruturalAnálise qualitativa de desarranjo estrutural

1818

2.5.1- Variáveis primárias

Tecido renal sem isquemia Tecido renal com isquemia e reperfusão

1919

2.4 Procedimentos

Grau I Grau II

2020

2.4 Procedimentos

Grau III Grau IV

2121

2.5.1- Variáveis primárias 2.5.1.2- Estudo histológico Jablonski, 1983

Grau 0: NormalGrau 0: Normal Grau 1: Mitoses e necrose de células individualmenteGrau 1: Mitoses e necrose de células individualmente Grau 2: Necrose de células adjacentes aos túbulos Grau 2: Necrose de células adjacentes aos túbulos

contorcidos proximais, porém sendo estes ainda viáveiscontorcidos proximais, porém sendo estes ainda viáveis Grau 3: Necrose confinada ao terço distal do túbulo Grau 3: Necrose confinada ao terço distal do túbulo

contorcido proximal. Desarranjo estrutural moderadocontorcido proximal. Desarranjo estrutural moderado Grau 4: Necrose abrangendo todas as porções do túbulo Grau 4: Necrose abrangendo todas as porções do túbulo

contorcido proximal com desarranjo estrutural severo contorcido proximal com desarranjo estrutural severo intersticialintersticial

2222

2.5.1 Variáveis primárias 2.5.1.2 Estudo histológico2.5.1.2 Estudo histológico

2323

2.5.1 Variáveis primárias 2.5.1.2 Estudo histológico

Grau I Grau II

2424

2.5.1 Variáveis primárias

2.5.1.2 Estudo histológico

Grau III Grau IV

2525

2.5.2 Variáveis secundárias

2.5.2.1- Avaliação bioquímica sérica

Desidrogenase láticaDesidrogenase lática LeucometriaLeucometria

CreatinCreatinaa-fosfoquinase-fosfoquinase PotássioPotássio

Lactato Lactato HemHemoogasimetria gasimetria

Uréia Uréia

Sódio Sódio

CreatininaCreatinina

CálcioCálcio

2626

2.6.1- Cálculo do tamanho da amostra 2.6.1- Cálculo do tamanho da amostra

2.6.2- Análise estatística2.6.2- Análise estatística

Análise de variância por postos de Kruskal WallisAnálise de variância por postos de Kruskal Wallis

Teste de Mann-Whitney para duas amostras Teste de Mann-Whitney para duas amostras independentesindependentes

P = 0,05 ou 5% Nível de rejeição da hipótese de P = 0,05 ou 5% Nível de rejeição da hipótese de nulidadenulidade

2.6- Modelo Estatístico

2727

3. Resultados 3.3 Variáveis Primárias

Gráfico 1. Distribuição dos graus de necrose entre os grupos

0

1

2

3

4

5

6

7

8

Grau 0 Grau I Grau II Grau III Grau IV

Grupo ShGrupo CtGrupo Al

2828

3. Resultados 3.3 Variáveis Primárias

Gráfico 2. Análise Imunohistoquímica entre os grupos

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Grau 0 Grau I Grau II Grau III Grau IV

Grupo ShGrupo CtGrupo Al

2929

3. Resultados3.3 Variáveis Primárias

Gráfico 3. Comparativo da análise histológica entre os grupos

0

0,5

1

1,5

2

2,5

ausente leve moderada severo

Grupo ShGrupo CtGrupo Al

3030

3. Resultados 3.1 Caracterização da amostra

Gráfico 4. Médias do pesos dos ratos dos três grupos de tratamento.

312

294

306

300

305

310

315

320

325

330

Pes

o (

gra

mas

)

□ Grupo Sh □ Grupo Ct □ Grupo Al

3131

3. Resultados 3.3 Variáveis secundárias

Gráfico 5. Comparação dos níveis de eletrólitos dos três grupos de tratamento.

132 132,7 133,3

5,9 6,9 6,310,4 9,3 10,1

0

20

40

60

80

100

120

140

Sódio Potássio Cálcio

controle SF0,9% alfatocoferol

p=0,1

Grupo Al

Grupo Sh

3232

3. Resultados 3.3 Variáveis secundárias

Gráfico 6. Comparação de LDH e CPK dos três grupos de tratamento.

2432,42981,8

3464,2 3715,7

7269,7

4796,1

0

2000

4000

6000

8000

10000

LDH CPK

controle SF0,9% ■ Grupo Al

3333

3. Resultados 3.3 Variáveis secundárias

Gráfico 7. Comparação da Gasometria (pO2 e pCO2) dos três grupos de tratamento.

151,3 149,8 153,6

54,648,6 50,4

0

50

100

150

200

pO2 pCO2

controle SF0,9% alfatocoferolAlprostadilControle SF0,9%

3434

3. Resultados 3.3 Variáveis secundárias

Gráfico 8. Comparação de Lactato e Uréia dos três grupos de tratamento.

35,4

42,157,3

82,886,3

98,2

0

20

40

60

80

100

120

Lactato Uréia

controle SF0,9% ■ Alprostadil

3535

4. Conclusões

O Alprostadil, na dose de 20 microgramasO Alprostadil, na dose de 20 microgramas//kg, kg, atenua as repercussões imunohistoquímicas e atenua as repercussões imunohistoquímicas e histológicas em tecido renal de ratos submetidos histológicas em tecido renal de ratos submetidos a um modelo experimental de isquemia e a um modelo experimental de isquemia e reperfusão com clampeamento aórtico supra-reperfusão com clampeamento aórtico supra-renal renal

Exceto pelos níveis de CPK, o Alprostadil na Exceto pelos níveis de CPK, o Alprostadil na dose de 20 microgramasdose de 20 microgramas//kg, não foi capaz de kg, não foi capaz de modificar as alterações metabólicas pelos modificar as alterações metabólicas pelos parâmetros utilizados neste estudo parâmetros utilizados neste estudo