Utilizao de Salmonella enterica Typhimurium no tratamento de tumores slidos

1Luciana Maria de Hollanda (Lu)Professora de Ps-Graduao emBiotecnologia Industrial (ITP)Professora do Curso de Graduao em Enfermagem (UNIT)

Boa Tarde a todos para quem no me conhece ainda, meu nome Luciana mais, podem me chamar de Lu, fico grata pela participao deste evento e por ter sido novamente convidada para participar do mesmo. Fico mais feliz ainda porque, nesta terceira edio a minha terceira participao e pr mim uma enorme alegria estar ministrando essa palestra para vcs. Diferente dos outros anos, esse ano eu no falarei nem de terapia gnica e nem de biologia sinttica... Mas o que eu vou falar, tem um pouco a ver com a aula dos anos anteriores.. Pois trata-se de terapia... S que utilizando nanopartculas para tentar melhorar o quadro clnico de pacientes e, diagnosticar melhor uma das principais patologias que assolam a raa humana.... Que o cncer, por isso esste ttulo... Nanoncologia.... Ou seja o emprego de nanopartculas no tratamento, diagnstico e cura tumoral... Mas antes de falarmos sobre esse assunto faremos uma breve introduo... A respeito de conceitos bsicos....

e Vou explanar um pouco a respeito de Nanoncologia, que o principal enfoque do meu trabalho atual. O que eu j consegui fazer na UNICAMP e como esto as coisas....

1NANONCOLOGIAA Arte de Tratar e Marcar as 2

Clulas tumoraisNanopartculas2Alguns pr-requisitos so necessriosPara isso precisamos entender:O que uma clulaA diferena entre clula normal e tumoralFormas de Tratamento da Clula TumoralO que NanotecnologiaO que Nanoncologia

3Para entender o que NanoncologiaPortanto...

Como todos ns sabemos4

FORMADOS

10 trilhes de clulas

CONSTITURAMOs DIFERENTES TIPOS DE RGOS E TECIDOSPortanto????Ns, os seres humanos5Todos ns seres humanos por mais esquisitos que sejamos, independente de nossa raa, credo ou preferncia sexual temos em nosso corpo aproximadamente 10 trilhes de clulas que constituro os diferentes tipos de tecidos e rgos

Portanto a clula

5 a unidade morfofuncionalDe todos os organismos vivos multicelularesSendo dividida emMembranaCitoplasmaNcleo6A Clula

CromossomosArcabouo Hereditrioque originaro as nossasCaractersticas fenotpicas

Porque????DE TODOS OS ORGANISMOS VIVOS SENDO DIVIDIDA EM MEMBRANA, CITOPLASMA E NCLEO, SENDO QUE NO NCLEO, ENCONTRAMOS OS CROMOSSOMOS QUE ORIGINARO AS NOSSAS CARACTERSTICAS FENOTPICAS

6 formado por umaLonga seqncia de DNAOnde encontraremosDiversas RegiesGnicas

7

Sendo queUm geneCada CromossomoCada cromossomo formado por uma longa sequencia de DNA onde encontramos diversas regies gnicas....7uma sequencia primria de algum produto gnico final polipeptdeo ou protena

um RNA com uma funo cataltica ou estrutural

8

Codificar

9

10Dogma Central da Biologia...para grupos gnicos relacionados...FormaTempo de crescimento Morte celularFormaoClula alterada11

Clula NormalClula Alterada desequilibrio do dogma centralDesequilibriodo dogma centralbiologia

essa clula alterada

Gerando12So limitados em seu crescimentoNo invadem os tecidos adjacentesIncapazes de causar metstases

13

TUMORES BENIGNOSAgora quando....sem invadir os tecidos adjacentes e no causando metstase ela considerada um tumor benigno, agora se o surto.... 13Clula cresce e se divide sem respeitar os limites normaisInvadindo e destruindo os tecidos adjacentesEspalhando-se para outros lugares do corpoDoena Cncer ou Neoplasia Maligna

14

For gravssimo e ela fica que nem uma louca crescendo desesperadamente, invadindo e destruindo os tecidos adjacentes e soltando pequenos fragmentos celulares e espalhando esses fragmentos para diversas partes do corpo conhecido como cncer ou neoplasia maligna. Um importante cientista.... 14Ganhou o premio nobel Sarcoma de RousDeclarou que....Os tumores destroem o homem de maneira peculiar e apavorante, j que a carne de sua prpria carne de alguma forma se torna proliferativa, agressiva, predatria e ingovernvel.

15

Peyton RousDesta maneira 15Doena multifatorial e crnicaDe difcil tratamentoAltamente complexaMuitas vezes incurvel

Alteraes genticas certos grupos gnicosConferem as clulasCaractersticas Especiais comoCapacidade ilimitada de proliferaoIncapacidade de entrar em apoptoseMetastizaoAngiognese

16

O que o Cncer?

doenas multifatoriais crnicas causadas principalmente por alteraes genticas que conferem s clulas algumas caractersticas especiais como, capacidade ilimitada de proliferao, incapacidade de entrar em apoptose, metastizao e angiognese, tornando-as altamente complexas, muitas vezes incurveis e difceis de serem tratadas16

17Como se origina?Causas do Cncer VariadasCausas ExternasCausas Internas

Causas Externas Meio AmbienteHbitos e CostumesDe um ambiente scio-cultural

Causas InternasGeneticamente pr-determinadasRelacionam-seCapacidade do Organismo Se defender dos Fatores Externos18Ambas interrelacionadasentre siO que causa?s causas de cncer so variadas, podendo ser externas ou internas ao organismo, estando ambas inter-relacionadas.

As causas externas relacionam-se ao meio ambiente e aos hbitos ou costumes prprios de um ambiente social e cultural.

As causas internas so, na maioria das vezes, geneticamente pr-determinadas, esto ligadas capacidade do organismo de se defender das agresses externas. Esses fatores causais podem interagir de vrias formas, aumentando a probabilidade de transformaes malignas nas clulas normais.

18

80 a 90% das Causas - Externas19De todos os casos, 80% a 90% dos cnceres esto associados a fatores ambientais. Alguns deles so bem conhecidos: o cigarro pode causar cncer de pulmo, a exposio excessiva ao sol pode causar cncer de pele, e alguns vrus podem causar leucemia. Outros esto em estudo, como alguns componentes dos alimentos que ingerimos, e muitos so ainda completamente desconhecidos.19Geneticamente pr-determinadasMutaes hereditriasCancer de MamaAlteraes nos genes brca1 e brca2Mutaes SomticasAdquiridas por fatores ambientais

20

Enquanto que. Causas Internas20As interaes complexas entre Carcingenos e o genoma do hospeiroExplicam porqueAlguns desenvolvem cncer Aps a exposio a um carcingeno e outros no

Os processos que levam a oncognese so ComplexosO que dificulta o seu tratamento

21PortantoEm todas as idades sendo mais freqente em idosos22

Incidncia Em quem ocorre?CombatePrognstico Tratamento

As neoplasias malignas Apresentam altas incidncias de morte

Segundo relatrio da OMSA incidncia do Cncer mais que dobrouNos ltimos 30 anos2008 12,4 milhes de novos casos7,6 milhes de bitos (Who, 2009)

23Apesar dos grandes esforos

O cncer uma das patologias que mais preocupam a sade pblica mundial (Nagahara et al. 2010). Segundo relatrio da Agncia Internacional para Pesquisa em Cncer (IARC)/OMS, o impacto global dessa doena, mais que dobrou nos ltimos 30 anos. Estatsticas mundiais demonstraram que, no ano de 2008 advieram aproximadamente 12 milhes de casos novos com 7,6 milhes de bitos (WHO 2009). 23

24Cncer de Pulmo o mais comum1,2 milho de casos novos anuais

Cncer de Mama Feminina o segundo mais comum1 milho de casos novos anuais

Cncer Colo-Retal o terceiro mais comum940 mil casos novos anuais Tipos mais incidentes15 milhes de casos novos12 milhes de mortes

25As maiores taxas de incidncia de cncer so encontradas nos pases desenvolvidos (Estados Unidos, Itlia, Austrlia, Alemanha, Canad e Frana)Em 2020?

Segundo dados do INCAPara este ano de 2011489 mil novos casos sero diagnosticadosSendo a segunda principalDoena com causa mortis conhecida

Os tipos mais comuns seroPele tipo no melanoma26No Brasil ???

PROSTATAPULMO

MAMACOLO DE TEROOs tipos mais incidentes, exceo do cncer de pele do tipo no melanoma, sero os cnceres de prstata e de pulmo no sexo masculino e os cnceres de mama e do colo do tero no sexo feminino, acompanhando o mesmo perfil da magnitude observada para a Amrica Latina.

26

27Porque os casos de cncer de Prstata esto aumentando?At o presente momento As principais metodologias curativas so

Embora eficazes, ainda apresentam alguns problemas como28Como Tratar???

QuimioterapiaRadioterapia

CirurgiaAt o presente momento, as principais metodologias curativas ainda so a quimioterapia, radioterapia e cirurgia.

28Distribuio Sistmica no especficaDos agentes tumoraisGerando efeitos colateraisBaixa tolerncia de alguns pacientes aoTratamentoAlta citotoxicidade Tambm para clulas normaisDesenvolvimento de resistncia a drogaDe alguns tumores

29Problemas das metodologias curativas atuaisPortanto.Embora eficazes alguns problemas ainda aconteam como, distribuio sistmica no especfica dos agentes antitumorais, baixa tolerncia de alguns pacientes ao tratamento, alta citotoxidade para as clulas normais e desenvolvimento de mltipla resistncia s drogas (Parveen et al. 2006; Parveen et al. 2008; Misra et al. 2010; Wang et al. 2010). 29Que novas metodologias tecnolgicasDesenvolvam-se com o intuito de:Delinear a margem tumoralSeparar clulas neoplsicas malignas das normaisIdentificar micromesttases - tumorFoi completamente removido ou no

Diante desta ticaDiversos pesquisadores da rea oncolgicaVoltaram a sua ateno para a NanotecnologiaCom o intuito de....30Torna-se importante que.Diante dessa tica, diversos pesquisadores da rea oncolgica, voltaram a sua ateno para a nanotecnologia com o intuito de30Metodologias mais eficazes noCombateControleDiagnstico Cncer.

Para estimular essa rea o

31Encontrar e Descobrir.

Fundaram em 2005

Principais oncologos mundiais reunidos, para incentivar a descoberta de novos paradigmas de deteco, combate e preveno do cncerencontrar metodologias mais eficazes e efetivas no combate ao cncer (Chan 2006; Lacerda et al. 2006; Farrell et al. 2010a; Farrell et al. 2010b).

Para estimular essa rea cientfica, o National Institute of Health (NIH) e o National Institute of Cancer (NCI) montaram no ano de 2005, o programa NCI Alliance for Nanotechnology que reuniu os principais nanotecnlogos mundiais, para incentivar a descoberta de novos paradigmas de deteco, preveno e tratamento do cncer (Farrell et al. 2010a; Farrell et al. 2010b; Jain 2010; Nagahara et al. 2010; Ptak et al. 2010).

31Porque uma cincia que manipulatomosMolculasEm escala nanomtrica (1x10-9m ou 1 milionsimo de milmetro)

Como so partculas Muito pequenasSo facilmenteInternalizadas pelas clulasPor endocitose

Utilizao da Nanotecnologia emSistemas biolgicosNANOBIOTECNOLOGIAPara o tratamento, combate e cura do CncerNANONCOLOGIA32Porque nanotecnologia??A nanotecnologia uma cincia que manipula tomos, molculas e estruturas supramoleculares para criar e utilizar materiais, dispositivos e sistemas em escala nanomtrica. Dessa maneira, dada a pequenez de suas partculas, esses nanomateriais so facilmente endocitados pelas clulas. Assim, a utilizao da nanotecnologia em sistemas biolgicos recebeu o nome de nanobiotecnologia (Jain 2010; Ptak et al. 2010; Shiba 2010). 32

Figura 1. Papel da nanobiotecnologia no tratamento do cncer (nanoncologia). Este esquema demonstra o papel da Nanobiotecnologia e sua interao em vrias outras metodologias no tratamento do cncer (Jain, 2010).

33Lipoplexos e poliplexosMonocamadasBicamadasFosfolipdicasHidrofbicasQue formam micelasCom isso conseguem protegerMaterial nuclearDrogaQue ser inserido na clula tumoralAlm dissoPodem ser modificadosPara que a sua superfcie contenhaReceptores celulares especficosQue se ligariam somente ao cancer

Para melhorar a entrega do DNA novo na pilha, o DNA deve ser protegido dos danos e sua entrada na pilha deve ser facilitada.

s molculas novas desta extremidade, os lipoplexes e os polyplexes, foram criados que tm a habilidade de proteger o DNA da degradao indesejvel durante o processo do transfection.

O DNA do Plasmid pode ser coberto com os lipids em uma estrutura organizada como um micelle ou um liposome. Quando a estrutura organizada complexed com DNA est chamado um lipoplex. 34LipossomosGeralmente apresentamBaixa imunogenicidadeFceis de serem construdosExcelentes carregadores de material genticoApresentam Gama diversificadaTamanhoCaractersticasLiberao do material internalizadoPodem serAlvo especficos

Alm disso, os lipossomasveculos de entrega oferecer versatilidade com uma gama diversificada de mor-phologies, tamanho e caractersticas de liberao, pode ser usado para tis-sue alvo e fornecer a proteo do DNA plasmidialdo ataque de nucleases de degradao. Desde a sua introduocomo sistemas de entrega em potencial em 198735Tipos de LipossomosAninico Carregado NegativamenteNeutros e CatinicosCarregados Positivamente

AninicosCatinicosH trs tipos de lipoplexes, anionic (carregado negativamente), neutros ou cationic (carregado positivamente).

36Lipossomos Aninicos e NeutrosPrimeiramente utilizados como vetores sintticosApresentam baixa citotoxicidadeSo compatveis com lquidos do corpoPodem carregar em sua membranaAnticorposAntgenosReceptores de membrana

Utilizados no tratamento de CncerFibrose CsticaHemofiliaInicialmente, os lipids anionic e neutros foram usados para a construo dos lipoplexes para vetores sintticos.

Entretanto, embora haja pouco toxicity associado com eles, so compatveis com lquidos de corpo e havia uma possibilidade de adapt-los para estar um especfico do tecido, so complicados e tempo - consumindo para produzir assim que a ateno foi girada para as verses cationic.

37Drogas antitumorais utilizando nanocarreadores aprovadas para uso clnico

38Tabela I. Drogas antitumorais utilizando nanocarreadoresa aprovados para uso clnico

38Os principais nanocarreadoresAtualmente utilizados soLipossomosConjugadosDrogasProtenasQue apesar de salvar o pacienteAinda geram efeitos colateraisDiarriaPerda de cabeloPerda de apetiteDores generalizadasNausea e Vmito

39

Como visto anteriormente39

Novos NanocarreadoresE AGORA GALERA O QUE FAZER????4040Foram descobertos por Ijima em 1991E consistem exclusivamentetomos de CarbonoArranjados numa srie de anis de benzenoCondensados e enroladosDe maneira tubular

Classificados de acordo com a sua estruturaSWNT Single Wall Nanotubenica folha de grafeno enrolada

MWNT Multi Wall NanotubeMltiplas folhas enroladas

41NANOTUBOS DE CARBONO

Nanotubos de Carbono (NTC)Os nanotubos de carbono (NTC) consistem exclusivamente de tomos de carbono arranjados numa srie de anis de benzeno condensados e enrolados de maneira tubular. 41SWNT Single Wall Nanotubenica folha de grafeno enroladaDimetro: Entre 0,4 a 3,0nmComprimento: Entre 20 a 1m

MWNT Multi Wall NanotubeMltiplas folhas enroladasDimetro: Entre 1,4 a 100 nmComprimento: Entre 1m a 5m

42Classificao

Devido as suas propriedades fsico-qumicasSo classificados de acordo com a sua estrutura, portanto divididos em, single-walled (SWNT) que possuem uma nica folha de grafeno, e o multi-walled (MWNT) que contm mltiplas folhas concntricas enroladas.

Enquanto que, os MWNT so maiores com dimetro entre 1,4 a 100 nm e comprimento entre 1 a muitas micra (Lacerda et al. 2006; Menard-Moyon et al. 2010).

Devido as suas propriedades fsico-qumicas,

42So endociticamenteInternalizados pelasClulas

TransportandoMolculas orgnicas comoDNARNA principalmente RNAiProtenasDrogas

43

SWNT+DNA

SWNT+RNAi

MNWT+Protena

SWNT+DrogasPrincipal Defeitoso endociticamente internalizados pelas clulas (Shi Kam et al. 2004; Kostarelos et al. 2009; Liu et al. 2009; Liu et al. 2011).

Alm disso, so capazes de transportar drogas e molculas orgnicas como DNA, RNA e Protenas (Ajima et al. 2005; Kam et al. 2005; Zhang et al. 2006; Prato et al. 2008; Al-Jamal et al. 2010; Ciofani et al. 2010; Higuchi et al. 2010; Ladeira et al. 2010; Taratula et al. 2011).

43O que torna a sua manipulaoExtremamente difcil e limitada

O que fazer ento????PARAR DE USAR OS NANOTUBOS DE CARBONO?

FUNCIONALIZAR.... Ou SEJA?Misturar esse nanotubo de carbonoCom outra substncia que fique mais fcil a sua Diluio nos Solventes orgnicos

Principais substncias utilizadasPEGP85Entre outras

44Insolubilidade na maioria dos solventes orgnicosCertamente tanto os SWCNTs quanto os MWCNTs funcionalizados, apresentam boa capacidade de passar pelas barreiras biolgicas agindo como molculas ativamente teraputicas (Kostarelos et al. 2007; Bhirde et al. 2009; Kostarelos et al. 2009; Liu et al. 2010). Corroborando com esses dados, Bachilo e colaboradores no ano de 2002, demonstraram que os SWCNTs so fotoluminescentes quando submetidos aos raios infravermelhos (NIR)(Bachilo et al. 2002). Dessa forma, esse material torna-se de grande serventia nos diagnsticos clnicos em diversos tipos de exames (Welsher et al. 2008; Ruggiero et al. 2010; Thakare et al. 2010; Yang et al. 2010; Markovic et al. 2011). Em contraste, os MWCNTs por possurem maior dimetro interno foram explorados para o encapsulamento de molculas teraputicas. Alm disso, por terem maior superfcie externa, ofereceram mais possibilidades de conjugao e/ou interao com molculas ativas do que os SWCNTs (Ren 2007).

44Tanto osSWNTMWNTFuncionalizadosApresentam boa capacidadeDe passar pelas barreiras biolgicasAgindo como molculas ativamente terapeuticas45At o presente momento sabemos que

SWNT funcionalizado e marcado com fluorforo verde, enquanto o ncleoda clula tumoral, foi marcado em vermelho.Corroborando com esses dados, Bachilo e colaboradores no ano de 2002, demonstraram que os SWCNTs so fotoluminescentes quando submetidos aos raios infravermelhos (NIR)(Bachilo et al. 2002). Dessa forma, esse material torna-se de grande serventia nos diagnsticos clnicos em diversos tipos de exames (Welsher et al. 2008; Ruggiero et al. 2010; Thakare et al. 2010; Yang et al. 2010; Markovic et al. 2011). Em contraste, os MWCNTs por possurem maior dimetro interno foram explorados para o encapsulamento de molculas teraputicas. Alm disso, por terem maior superfcie externa, ofereceram mais possibilidades de conjugao e/ou interao com molculas ativas do que os SWCNTs (Ren 2007).

45Bachilo e Colaboradores 2002Demonstraram que:SWNT so fotoluminescentesQuando submetidos aos raios infravermelhos

Leeum e Colaboradores 2007Demonstrou fotoluminescencia de SWNTEm larvas de Drosophila melanogaster46Alm disso foi demonstrado por

Corroborando com esses dados, Bachilo e colaboradores no ano de 2002, demonstraram que os SWCNTs so fotoluminescentes quando submetidos aos raios infravermelhos (NIR)(Bachilo et al. 2002). Dessa forma, esse material torna-se de grande serventia nos diagnsticos clnicos em diversos tipos de exames (Welsher et al. 2008; Ruggiero et al. 2010; Thakare et al. 2010; Yang et al. 2010; Markovic et al. 2011).

Em contraste, os MWCNTs por possurem maior dimetro interno foram explorados para o encapsulamento de molculas teraputicas. Alm disso, por terem maior superfcie externa, ofereceram mais possibilidades de conjugao e/ou interao com molculas ativas do que os SWCNTs (Ren 2007).

4647

Liu e Colaboradores- 2008ConjugaramSNWTPEGPaclitaxel

48Alm disso

Os autores demonstraram que no modelo de cancer de cabea murinoEsse composto SNWT-PEG-PaclitaxelApresentouBaixa CitotoxicidadeAlta biocompatibilidadeExcreo, via biliar sem causar efeitos txicos as clulas normaisAcumulao principalmente na massa tumoralSendo considerada uma conjugao promissora Terapia Antitumoral, com baixo efeito colateral

48Srivastava e colaboradores 2010 Observaram que:MWCNTInduziram apoptose em Linhagens celulares de A549 (Adenocarcinoma de pulmo)

A internalizao dos MWCNTs foi observadaMicroscopia Eletrnica

E as alteraes apoptticas foram estimadasCondensao NuclearMarcao de DNAConfirmada pela expresso de marcadores apoptticos como:P53, P21, Bax, Bcl-2, Caspase-3 ativada

Os autores observaram queAs clulas entraram em apoptoseDesenvolveram um novo modelo de MWCNTNa induo da apoptose para este tipo celular49Enquanto issoNon-cytotoxic doses of MWCNTs were identified using tetrazolium bromide salt (MTT) and lactate dehydrogenase (LDH) release assays.

Cells were exposed to MWCNTs (0.5-100 mug/ml) for 6-72 h.

Internalization and characterization of CNTs was performed by electron microscopy.

Apoptotic changes were estimated by nuclear condensation, DNA laddering, and confirmed by expression of associated markers: p(53), p(21WAF1/CIP1), Bax, Bcl(2) and activated caspase-3.

49Eu e AlunosFizemos um ensaio de transfeco celularPara ver se o nanotubo produzido pelo Departamento de Fotonica da UNICAMPEntrava dentro da clula tumoral50J que todo mundo testou

Foi funcionalizado com P85poli(xido de etileno)-poli(xido de propileno) pluronic E conjugado com o plasmdeo de fluorescenciapIRES

Desta maneira ns observamos que.....Este nanovetor no citotxicoApresenta boa invasibilidade celularProduzindo melhor fluorescencia que o controle utilizado.51O MWCNT produzido na UNICAMPResultados observados

52Esses resultados originaram

5354

54...as nanopartculas mesoporosas de Slica tambm foram testadasNo tratamento tumoralCom significativos resultados55Alm das nanopartculas de carbono

Utilizadas na indstria como Aditivos emCosmticosFrmacosToners de ImpressorasVernizes

Com a comercializao desses produtosO interesse em sua citotoxicidade Para a populao aumentou

A nica propriedade fsico-qumica que apresentaram Riscos potenciais a sade humanaIncluem maior capacidade de penetrao celularPrincipalmente Pulmo e Circulao Sistmica

56Nanopartculas mesoporosas de slica

Com o crescimento e a comercializao dos produtos nanotecnolgicos, a exposio humana aos NPSs aumentou e, muitos dos aspectos relacionados com o tamanho desses nanomateriais levantaram preocupaes sobre a sua segurana e comercializao (Maynard et al. 2006; Maynard 2007; Napierska et al. 2010).

Investigaram-se as propriedades citotxicas das partculas de slica na forma cristalina entre 0,5 a 10 m de tamanho e foi descoberto que essas partculas possuem diferenas toxicolgicas quando comparadas com as NPSs.

A nica propriedade fsico-qumica das NPSs que apresentam riscos potenciais a sade humana, incluem maior capacidade de penetrao celular principalmente no pulmo e na circulao sistmica (Napierska et al. 2010). 56Alm da biocompatibilidadeQue tornam essas nanopartculasGrandes promessas No tratamento tumoralPrincipalmente se forem direcionadasPara se ligarem a receptores especficos tumorais57Mas so justamente essas propriedades.

Clula tumoral Hela corada em verde

Nanopartcula mesoporosa de slica corada em vermelhoForam utilizadas comoVetores para o carregamento de compostos combinadosDrogas e GenesDrogas e RNAi

Devido a sua grande compatibilidade com frmacosPor possurem grandes reas de superfcieCanais Porosos OrdenadosSo propcias para o carregamento deDrogas Antineoplsicas comoDoxorrubinaPaclitaxelCamptotecina58Dessa forma as NMS.as nanopartculas mesoporosas de slica (NMS) foram utilizadas como vetores no carregamento de compostos combinados como, drogas e genes e, drogas e RNAi.

Devido a sua grande compatibilidade com frmacos e, por possurem grandes reas de superfcie e canais porosos ordenados, essas NMS so propcias para o encapsulamento e carregamento de drogas antineoplsicas como, doxorrubicina, paclitaxel e camptotecina (Vijayanathan et al. 2002; Ravi Kumar et al. 2004; Salata 2004; Lu et al. 2007; Panessa-Warren et al. 2008).

Alm disso, os NMSs possuem a superfcie qumica bem estabelecida facilitando dessa forma, sua modificao com polictions, permitindo a preparao do hbrido orgnico-inorgnico que servir tambm como carreador de cidos nuclicos. Dessa forma, a grande vantagem dos NMSs sobre outros carreadores que sua estrutura porosa permite a ligao tanto de cidos nuclicos na sua superfcie como o encapsulamento de grande quantidade de pequenas molculas no seu interior (Bhattarai et al. 2010).

58Superfcie qumica bem estabelecidaFacilita a sua modificao com polictionsPermitindo que um hbridoOrgnico Inorgnico seja preparadoFacilitando que cidos nuclicos Sejam carreados

Dessa forma, 59Alm disso por possurem.Alm disso, os NMSs possuem a superfcie qumica bem estabelecida facilitando dessa forma, sua modificao com polictions, permitindo a preparao do hbrido orgnico-inorgnico que servir tambm como carreador de cidos nuclicos.

Dessa forma, a grande vantagem dos NMSs sobre outros carreadores que sua estrutura porosa permite a ligao tanto de cidos nuclicos na sua superfcie como o encapsulamento de grande quantidade de pequenas molculas no seu interior (Bhattarai et al. 2010).

59A grande vantagem dos NMSs sobre outros carreadores que sua estrutura porosa permite a ligao tanto de cidos nuclicos na sua superfcie como o encapsulamento de grande quantidade de pequenas molculas no seu interior.

60

Com polictions de carrearemRNAi e GenesCultura de clula in vitroForam relatadas por alguns autoresCom resultados positivos

Xia e Colaboradores 2009 Demonstraram queNMS quando funcionalizadas com PEI (Polietilenoilamina)Carrearam tanto RNAiComo DNA plasmidial61A Habilidade das NMS modificadas.PEIs are synthetic cationic polymers thatcompact DNA and siRNA into complexes that are effectivelytaken up in cells to make nucleic acid deliveryand gene therapy possible.2123Although thepolymer itself is used as a delivery vehicle, PEI canalso be attached to nanoparticle surfaces throughcovalent and electrostatic interactions to achieve thesame goal.11,16,17,19,24Complexing the polymer withthe nanoparticles has the potential advantage of facilitatingDNA and siRNA delivery by a multifunctionalplatform that also allows imaging, targeting,and concurrent drug delivery.

A habilidade das NMSs modificados com polictions entregarem genes e RNAi em culturas de clulas foi relatada e demonstrada por alguns autores (Radu et al. 2004; Xia et al. 2009; Bhattarai et al. 2010).

Xia e colaboradores prepararam SMN catinicos com potencial carregador, pela adsoro de polietilenoimina (PEI) e, demonstraram que as nanopartculas puderam carrear RNAi e DNA plasmidial (Xia et al. 2009).

A presena de PEI, no prejudicou a capacidade dessas nanoestruturas abrigarem frmacos pouco solveis em sua composio, como por exemplo, o paclitaxel. No ano de 2009, Chen e colaboradores combinaram simultneamente numa NMS, um RNAi para Bcl-2 e a droga doxorrubicina. Esse composto complexo, aumentou a sensibilidade das clulas tumorais ao quimioterpico em testes in vitro (Chen et al. 2009). Dessa forma de extremo interesse que novas combinaes sejam feitas, para obtermos novas drogas e qui novas patentes elaboradas por mim.

61So polimeros catonicos sintticos queCompactam o DNA e o RNAiEm complexos que entram maisFacilmente dentro das clulasSendo bastante utilizadosEm terapia Gnica62O que so PEI.

62Quanto maior o tamanho do PEI mais partculas fluorescentes so internalizadas na clula tumoralClulas marcadas em vermelhoNMS marcadas em verde63Xia e colaboradores demonstraram que.

NMS ligada a PEI um sistema de entrega verstilQue facilita a captura celular decidos Nucleicos e Drogas

Embora a citotoxicidade do conjugado seja alta possvel selecionar o tamanho do polmeroQue entregue eficientemente RNAiSem danificar a clula como um todo

Enquanto PEIs de baixo peso molecularSejam ineficientes para a entrega gnicaSo eficientes para aumentar a entrega de drogas antitumorais

DESTA FORMA,ESSES HBRIDOS SO POTENCIALMENTE IMPORTANTESNA ENTREGA DE NUCLEOTDEOS E PEQUENAS MOLCULAS AS CLULAS64Concluindo que.Enquantoineficiente paraa entrega do gene, revestimentocompolmeros de baixopeso molecularPEImesmo assimeficientepara aumentar aentrega dedrogasantitumoraispaclitaxelem clulas cancerosas.

esteshbridosorganicinorganicnanopartculasporosa podepotencialmenteser teis paraa entregasimultnea denucleotdeose pequenas molculasem clulas.

64Construram uma NMSQue carreia simultaneamenteDoxorrubicinaRNAi para Bcl-2Este complexo aumentou a sensibilidadeDas clulas tumorais antes resistentesAo quimioterpico em testes in vitro65Chen e Colaboradores, 2009No ano de 2009, Chen e colaboradores combinaram simultneamente numa NMS, um RNAi para Bcl-2 e a droga doxorrubicina. Esse composto complexo, aumentou a sensibilidade das clulas tumorais ao quimioterpico em testes in vitro (Chen et al. 2009).6566

66At agora descritos naTransferncia do material genticoDiversos laboratrios exploraram a utilizao deVrus e Bactrias atenuadasComo carreadores biolgicos.67Alm dos materiais inorgnicos

Diversos laboratrios exploraram a utilizao de vrus e bactrias atenuados como carreadores biolgicos em ensaios in vivo (Pilgrim et al. 2003; Bangari et al. 2005; Giacalone et al. 2006). 67Bactrias e CncerPrimeiras observaesBactrias utilizadas como agentes antitumoraisForam realizadas ao acaso

W. Busch e F. Fehleisen observaram queCertos tipos de cncer regrediram quando pacientes internados para o tratamento do tumor eram infectados por Streptococcus pyogenes e desenvolviam erisipela

William Coley paciente com cncer cervicalRescindiu do tumor - aps ter erisipela

Nenhum destes pesquisadores desenvolveu nova terapia para o cncerPor causa das complicaes decorrentes deste tipo de terapia

Streptococcus pyogenesAs primeiras observaes de que bactrias poderiam ser utilizadas como agentes anticancergenos foram realizadas independentemente, ao acaso, por dois mdicos alemes no sculo XX. Os doutores W. Busch e F. Fehleisen observaram que certos tipos de cncer regrediram quando pacientes internados para o tratamento de tumores eram acidentalmente infectados por Streptococcus pyogenes e desenvolviam.

William Coley percebeu que um de seus pacientes que sofria de cncer cervical comeou a se recuperar do tumor, aps ser acometido por erisipela.

Infelizmente, nenhum destes pesquisadores desenvolveu uma nova terapia para o cncer utilizando bactrias, devido toxicidade e as complicaes decorrentes deste tipo de terapia. No entanto, suas descobertas motivaram os avanos encontrados nos dias de hoje erisipela.68Bactrias e CncerMuitos anos aps esses trabalhosTratamento de tumores slidos com bactrias Ressurgiu

Porque ???

as bactrias - geneticamente modificadasPerdendo os seus fatores de virulnciaVetores para genes que codificam protenasAtividades Antitumorais

Dentre os diversos trabalhosDestacam-se

69Clostridium X CncerBactrias anaerbiasCapazes de proliferar preferencialmenteDentro de regies de necrose tumoralModelos animaisReduzindo e combatendo a massa tumoralEstimular a resposta imunolgica Atacar e destruir o tumor

Principal Problema utilizaoMesmo com todas as atenuaes realizadasMecanismos de PatogenicidadeAlguns animais ainda morrem

Trabalhos realizados com bactrias patognicas anaerbicas do gnero Clostridium foram capazes de proliferar, preferencialmente, dentro de regies de necrose tumoral em tecidos animais70Bacilo de Calmette-Guerin x CncerEstudos bacilo de Calmette-Guerin (BCG), linhagem de Mycobacterium bovis possui o mesmo mecanismo imunoestimulatrio que Clostridium novyi sem, no entanto, ser patognica em humanos.

At o presente momento, Estudos para o tratamento de cncer de bexiga Utilizando o BCG foram bem sucedidosCom remisso da doena

Salmonella typhimurium x CncerRecentes estudos com Salmonella typhimurium (ST) demonstraramdiferentes linhagens quando atenuadas servem como agentes antitumorais crescendo preferencialmente nestes locais

O mecanismo pelos quais a (ST) prefere a clula tumoral No EsclarecidoMas acredita-se que os principais fatores sejamMaior disponibilidade de nutrientes liberados pelos tumoresEm regies de hipxiaDiminuio da atividade bactericida deMacrfagos e Neutrfilos Em hipxiaSupresso do sistema imuneExposio reduzida a anticorpos e complemento devidoirregularidades da vascularizao tumoral7273

Muitos experimentos foram suspensosUma vez que, modelos murinosApresentaram efeitos colaterais

Alm disso,A reverso para a forma patognicaO risco de transferncia gnica horizontalAumento das respostas a citosinas pr-inflamatriasTambm corroboraram para o descrditoDesta tecnologia.74Apesar da eficcia.

Apesar da eficcia demonstrada, os experimentos foram suspensos, uma vez que, muitos modelos murinos apresentaram efeitos colaterais (Bangari et al. 2005; Wang et al. 2005; Giacalone et al. 2006). As reaes adversas provocadas por esses vetores incluem, a reverso para a forma patognica, o risco de transferncia gnica horizontal e, o aumento de citosinas pr-inflamatrias (Donsante et al. 2001).74Vetores utilizando AdenovrusAdenoassociadosIntegraram no genoma da clula hospedeiraDNA exgenoAlterando a maquinaria transcricionalCriando leses gnicas que levaram o aparecimentoTumoral

Carreadores ViraisTambm possuem limitadaQuantidade de material gentico a ser entregueLimitando sua aplicao75Em alguns casos.

AdenovrusEm alguns casos os vetores utilizando adenovrus ou adenoassociados integraram no genoma da clula hospedeira, DNA exgeno que alterou a maquinaria transcricional criando leses gnicas que originaram o desenvolvimento tumoral (Donsante et al. 2001).

Alm disso, carreadores virais tambm possuem limitada quantidade de material gentico a ser entregue, limitando sua aplicao (Giacalone et al. 2006).

75Apesar de bactrias atenuados Serem eficientes veculos de transferncia de DNASeu alvo continua inespecfico

Dessa forma, surgiu a idia de utilizar miniclulas bacterianas acromossmicas como carreadores gnicos.

As miniclulas So produzidas atravs da septao ectpica Durante a diviso celular, Possuem todos os componentes moleculares, menos o cromossomo76

MiniclulasPela deleo gnica de uma regioDo DNA bacteriano de certas espcies bacterianasComoSalmonellaEscherichia coliPseudomonas aeruginosaListeria monocytogenes

A deleo gnica atrapalha a fisso binria bacterianaE ao invs da bactria produzirDuas clulas filhasElas produz miniclulasCom aproximadamente400 nm de dimetro77Como so produzidas

Desenvolveram um conjugado de MiniclulasCarreando RNAiPara o gene responsvel pela Resistncia ao quimioterpico

Carrearia a droga

Ambas as miniclulas teriam em sua membranaReceptores bi-expecficosQue se ligariam a parede bacterianaA clula tumoral.

Essas miniclulas ligaram-se ao tumorE reduziram a massa tumoralNos modelos in vivoAumentando a sobrevida desses modelos

78Macdiarmid e colaboradores, 2007No ano de 2007, MacDiarmid e colaboradores utilizando miniclulas, desenvolveram um sistema de dupla entrega. A miniclula conteria alm do quimioterpico utilizado para o tratamento tumoral, um anticorpo bi-especfico que se ligaria no lipopossicardeo-O do LPS da miniclula e outra regio que se ligaria diretamente em receptores de membrana da clula tumoral (MacDiarmid et al. 2007a). Essas miniclulas seletivamente ligaram-se ao cncer estabilizando o crescimento e diminuio da massa tumoral nos modelos in vivo (MacDiarmid et al. 2007a; MacDiarmid et al. 2007b; MacDiarmid et al. 2009).

78Os autores demonstraram que Cada miniclula abriga em seu interiorAt 12.000 molculas de RNAiQue cerca de 10x mais o que abriga umNanovetor comum

Os mesmos autores em outro estudoTambm verificaram que,Miniclulas contendo at 100 cpias de um plasmdio que codifica RNAi para EGFR

Os camundongos tiveram seus tumores diminudos permacendo saudveis at 110 dias aps a injeo de miniclulas+RNAi

Com isso os autores demonstraram que Miniclulas conjugadasSo timas ferramentas para A terapia antitumoral79Alm disso,Apesar das miniclulas serem delimitadas por uma membrana lipdica, MacDiarmid e colaboradores demonstraram que cada miniclula pode abrigar aproximadamente 12.000 molculas de RNAi (MacDiarmid et al. 2009). Embora o mecanismo de carreamento ainda permanea obscuro, os autores observaram que as miniclulas contendo RNAi para o fator de crescimento epidrmico (EGRF) foram internalizadas pelas clulas por endocitose e o RNAi foi liberado no citoplasma das clulas neoplsicas.

Semelhantes resultados foram obtidos utilizando miniclulas contendo aproximadamente 100 cpias de um plasmdio que codifica RNAsh para o mesmo RNAm. Utilizando essa tcnica, os autores reportaram que aps 110 dias de implante tumoral 100% dos camundongos estavam saudveis.

Dessa forma, o trabalho realizado por MacDiarmid e colaboradores tornaram-se eficazes na entrega de RNAi em clulas neoplsicas, alm do que melhoraram o quadro clnico dos camundongos transplantados com clulas tumorais (Karagiannis et al. 2009). Assim, desenvolveremos em nosso laboratrio montado com o financiamento deste projeto, uma miniclula um pouco diferente da descrita por MacDiarmid, porque alm de ser feita pela deleo gnica do complexo gnico MinCDE, tambm carrear um duplo conjugado para se ligar a membrana da miniclula e ao tumor, sendo internalizado por este, e fazendo com que este entre em apoptose.

79Investir em nanotecnologiaSignifica investirEm equipamentosVetoresDrogasTecnologiasQue diagnosticaroTrataroMais fidedignamenteAs neoplasias malignas80CONCLUINDO

81OBRIGADO!!!!luciana.hollanda@gmail.comNome Comercial/CompostoTipo de Tumor TratadobFabricanteNanocarreadorProvveis Efeitos Colateraisb

Abraxane/paclitaxelCncer de MamaAbraxis BiosciencesAlbumina ligada ao paclitaxelSensao dedormnciaouformigamento;doresmusculares ou articulares;nuseas,vmitos;diarria,ouqueda de cabelo.

Bexxar/anti-CD20 conjugado para iodina-131Linfoma No HodgkinCorixa/GlaxoSmithKlinRadioimunoconjugadoCausa srias reaes alrgicas principalmente em pacientes que receberam previamente protenas murinas.

DaunoXome/daunorubicinSarcoma de Kaposi devido ao HIVDiatos (disponvel na Frana)LipossomoDiarria, perda de cabelo e do apetite, dor na boca, garganta e estmago, nusea, cansao e fraqueza

Doxil/Caelyx/doxorubicinMetstase de Cncer de Ovrio e Sarcoma de Kaposi devido ao HIVOrtho BiotechLipossomoDiarria, perda de cabelo e do apetite, dor, vermelhido e inchao no local da injeo, cansao, nusea e fraqueza. Urina na cor vermelha aps ter recebido o medicamento

Myoset/doxorubicinNo relatadoCephalon(disponvel na Europa)Lipossomo no peguiladoNo relatado

Oncaspar/PEG-L-asparaginaseLeucemia Linfoblstica Aguda (LLA)EnzonConjugado de Polmero com protenaSevera reao alrgica, alteraes na viso, dor ou inchao na panturrilha e na perna, confuso, tosse com sangue, tontura, dor no local da injeo, dor de cabea intena e no estmago entre outros.

Ontak/IL-2 fusionado a toxina diftricaUsado principalmente para tratar leucemias e linfomasEisai IncFuso de protena imunotxicaSensao anormal na pele, confuso, constipao, tosse, diarria, tontura, dores de cabea, musculares e articulares, indigesto, dor e vermelhido no local da injeo, perda de apetite e de peso, nervosismo, nuseas, dor,coriza,insnia,sudorese,vmitos,fraqueza

SMANCS/zinostatinaNo relatadoYamanouchi PharmaPolmero fusionado com protenaNo relatado

Zevalin/anti-CD20 conjugado para yttrium-90Linfoma no HodgkinCell Therapeutics Inc.RadioimunoconjugadoAnsiedade, constipao,diarria, tontura,rubor, dor de cabea, indigesto,doresmusculares ou nas articulaes, perdade apetite,vmitos,fraqueza,corrimento nasal,nuseasoudor de estmago, sudorese,irritaona garganta,insnia.

Zoladex/goserelin acetateCncer de PrstataAstraZenecaPolmeros redondosAcne,sensibilidade mamria,diminuiodo desejo ou habilidade sexual,diarria,tontura,aumento dos seios, cefalia,ondas de calor,perdade apetite, sudorese,nuseas, cansaooufraqueza,insnia