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(21) PI0705880-2 A2

(22) Data de Depósito: 26/10/2007 (43) Data da Publicação: 29/06/2010 (RPI 2060)

,111 711111111111111211 (51) Int.CI.: C12N 15/30 C12N 7/01 A61K 39/015 A61 P 33/06

(54) Título: SEQÜÊNCIA GENETICAMENTE MODIFICADA DO ANTÍGENO DBP (PA) DE PLASMODIUM VIVAX, PROTEÍNA RECOMBINANTE DBP E ADENOVÍRUS GENETICAMENTE MODIFICADO QUE EXPRESSA 0 ANTÍGENO DBP RECOMBINANTE

(73) Titular(eS): Universidade Federal de Minas Gerais - UFMG

(72) Inventor(eS): Cristiana Ferreira Alves de Brito, Marisa Cristina da Fonseca, Oscar Bruna Romero, Ricardo Tostes GazzinelliReferente à RPI 2007 de 23/06/2009, quanto ao item (72).

(57) Resumo: SEQÜÊNCIA GENETICAMENTE MODIFICADA DO ANTÍGENO DBP (PA) DE PLASMODIUM VIVAX, PROTEÍNA RECOMBINANTE DBP E ADENOVÍRUS GENETICAMENTE MODIFICADO QUE EXPRESSA 0 ANTÍGENO DBP RECOMBINANTE. A presente invenção diz respeito à construção de uma seqUência genética modificada do antígeno DBP (Duffy-Binding Protein) de Plasmodium vivax obtido de um paciente (PA), uma proteína recombinante codificada pela referida sequência e um adenovírus geneticamente modificado que expressa o antígeno DBP recombinante. A invenção é útil para a imunização de mamíferos contra malária.

1

VIIR111IIIII II II I PI0705880-2

"SEQÜÊNCIA GENETICAMENTE MODIFICADA DO ANTÍGENO DBP (PA) DE

PLASMODIUM VIVAX, PROTEÍNA RECOMBINANTE DBP E ADENOVÍRUS

GENETICAMENTE MODIFICADO QUE EXPRESSA 0 ANTÍGENO DBP

RECOMBINANTE"

5 A presente invenção diz respeito à construção de uma seqüência genética

modificada do antígeno DBP (Duffy-Binding Protein) de Plasmodium vivax obtido de

um paciente (PA), uma proteína recombinante codificada pela referida seqüência e um

adenovírus geneticamente modificado que expressa o antígeno DBP recombinante. A

invenção é útil para a imunização de mamíferos contra malária.

10 A imunização contra malária pode ser baseada na proteína de união ao

antígeno Duffy nos eritrócitos que é chamado DARC e que tem especificidade ao seu

Iigante a Duffy-Binding Protein do plasmódio. Essa invasão eritrocítica envolve uma

complexa cascata de eventos e necessita da interação específica entre receptores

eritrocíticos e proteínas do parasito. Já foi relatado que a infecção por P.vivax é

15 inteiramente dependente dessa interação da Duffy com o eritrócito humano. Há relatos

que grande parte da população na África é resistente à infecção por P.vivax e isso se

deve ao fato da população observada não possuir o receptor DARC, o que impede a

interação covalente da DBP. Isso torna a DBP uma excelente candidata à vacina, uma

vez que anticorpos dirigidos contra essa região poderiam bloquear a interação da DBP

20 com o eritrócito em populações onde o P.vivax é o principal causador de malária.

Em estudos estruturais, foi identificada que a região da DBP responsável pela

ligação ao eritrócito compreende a região II da proteína. Essa região é rica em

cisteína, o que garante sua conformação estrutural e também rica em polimorfismos, o

que permite a evasão ao sistema imune do hospedeiro. Para fins de nomenclatura a

25 região II da DBP de P.vivax tem sido descrita como PvDBPII.

Pesquisadores já expressaram a PvDBPII em sua conformação correta e com

atividade funcional, ou seja, capaz de se ligar aos eritrócitos e reconhecer anticorpos

anti-DBPII. No entanto, a proteína produzida quando utilizada em imunizações não

conferiu proteção completa.

30 Alguns autores sugerem que a construção da proteína mais imunogênica

poderia ser a partir da seqüência conservada da PvDBPII, sugerindo que as regiões

polimórficas distam-se do sítio de ligação da DBPII. No entanto, estudos do

polimorfismo na seqüência da PvDBPII encontrados na área endêmica brasileira tem

demonstrado que os sítios polimórficos situam-se próximos à região de ligação. Isso

V

2,

poderia sugerir que uma vacina contra a DBPII de P.vivax deveria abranger a região

de polimorfismo, evitando assim, a evasão do plasmódio ao sistema imune.

Para tanto, a presente invenção desenvolve uma seqüência da PvDBPII

englobando os polimorfismos nela encontrados. A seqüência utilizada inicia-se no

5 aminoácido 232 e termina no aminoácido 548 tendo como referência a seqüência SAL-

I depositada no GenBank [Gi160275]. Sabe-se que a imunização somente com

proteína recombinante pode não conferir uma resposta imune duradoura, por induzir

principalmente linfócitos TCD4+. Por essa razão, os pesquisadores da presente

invenção construíram adenovírus humano do tipo 5 que expressam a PvDBPII. Esses

10 adenovírus não-replicam em células humanas e representam uma alternativa segura

quando o objetivo é construir uma vacina que induza tanto resposta por células TCD8

quanto TCD4 que possam levar a uma reposta imune duradoura às populações

imunizadas.

A escolha do adenovírus tipo 5 (Ad5) como vetor virai se mostra ideal pois, ao

15 alcançar o meio intracelular, ele expressará a proteína e por conter em sua seqüência

um peptídeo sinal HAAS (do vírus influenza), a proteína será secretada no meio

externo ativando a resposta imune. 0 bloqueio da interação da DBPII com o eritrócito

por anticorpos impedirá a invasão pela espécie do plasmódio em questão.

A expressão de proteínas heterólogas foi feita primeiramente em bactérias.

20 Escherichia coli foi a primeira bactéria utilizada como organismo hospedeiro para

produção de proteínas heterólogas. Uma razão para isso deve-se ao grande

conhecimento genético e fisiológico acumulado sobre o mesmo, facilitando sua

manipulação (SUDBERY, 1996). No entanto, bactérias não possuem sistema de

endomembranas e não realizam modificações pós-traducionais, o que pode impedir o

25 correto processamento de proteínas (SUDBERY, 1996; CREEG, 1999). Assim, as

leveduras destacam-se como hospedeiras alternativas, por serem unicelulares, detêm

as vantagens do sistema bacteriano no que diz respeito à facilidade de manipulação e

cultivo em escala industrial, além serem capazes de realizar modificações pós-

traducionais adequadas de várias proteínas (HINGGS, 1998; CREEG 1999).

30 S. cerevisiae foi a primeira levedura utilizada com propósito de produzir

proteínas exógenas devido ao conhecimento sobre esse organismo, além da

aceitação para utilização dessa levedura em experiências para benefício humano

(CREEG et al., 1993). Porém, o sistema de expressão em S. cerevisiae não atendeu

todas às expectativas, em razão da ineficiência de secreção e produtividade, da

35 hiperglicosilação, da instabilidade das cepas produtoras, das dificuldades em manter

3,

altas velocidades de crescimento e altas densidades populacionais das células

recombinantes (SWINKELS et al., 1993). Vários estudos foram e estão sendo feitos no

sentido de utilizar leveduras alternativas para a produção de proteínas recombinantes.

Entre essas, Pichia pastoris, cujo sistema de expressão foi desenhado mostra-se

5 como uma eficiente hospedeira para a síntese e secreção de proteínas heterólogas

para aplicações clínicas, acadêmicas ou industriais (COS, et al, 2005).

Pichia pastoris é uma levedura metilotrófica capaz de crescer até altas

densidades celulares (na ordem de gramas por litro) e a concentração de proteína

recombinantes produzida é muitas vezes proporcional à biomassa alcançada

10 (HINGGS, 1998). Vários exemplos mostram que Pichia pode alcançar rendimentos

muito maiores que S. cerevisiae, E. coli ou baculovírus (CREGG, VEDVICK e

RASCHKE, 1993; ROMANOS et al., 1992). 0 sucesso do sistema Pichia está

relacionado em grande parte ao promotor AOX1 do gene codificador para a enzima

álcool oxidase que é reprimido no meio de cultura contendo glicerol, mas induzido

15 quando as células são transferidas para um meio contendo metanol como única fonte

de carbono (HINGGS, 1998; CREEG 1999; BOETTNER et al., 2002).

Uma vez que uma cópia do gene está integrada por célula transformada o

aumento da densidade populacional aumenta o rendimento da proteína (CREEG et al.,

1993). Além de atingir altas densidades populacionais P. pastoris detem outras

20 .vantagens como: a alta regulação pelo promotor AOX1; a baixa glicosilação (muitas

vezes similar à glicosilação de proteínas humanas); a simplicidade da indução da

expressão de proteínas por metanol; o baixo nível de secreção de proteínas nativas;

além de crescer em meio simples ou definido, utilizando metanol como única fonte de

carbono (CREEG et al., 1993; DIGAN et al., 1989; CHEN et al., 1996; NOHR et al.,

25 2003; WITTAKER et al., 2004; COS, et al., 2005).

0 meio de crescimento para P. pastoris na produção de proteínas

recombinantes é definido, de baixo custo e ideal para produção em alta escala. 0 meio

é livre de ingredientes complexos, que poderiam gerar toxinas, sendo por isso,

facilmente aceito para emprego na produção de fármacos (CHEN, et al., 1996;

30 GELLISSEN, et al, 2005).

Várias citocinas, vacinas e outros produtos biológicos estão em

desenvolvimento, como a vacinas da hepatite B, comercializada na América do Sul.

Atualmente, já existem alguns peptídeos de importância biotecnológica produzidos em

Pichia como o fator 1 de crescimento tipo insulina (IGF-1) e HSA, em fase de

35 produção e comercialização no tratamento de esclerose lateral amilotrófica e como

4

substituto de soro, respectivamente. (WILLADSEN et al., 1995; CANALES et al., 1997;

CEREGHINO, 2000).

Em vista dessas observações, somado ao fato de sistema P.pastoris secretar a

proteína facilitando o processo de purificação da mesma - no nosso caso utilizando

5 uma coluna de níquel - a expressão da DBPII de Plasmodium vivax por esse sistema

pode ser a forma mais viável de se obter uma proteína biologicamente ativa permitindo

sua utilização como antígeno no processo de imunização, e com potencial de ser

utilizada para uso humano.

A presente invenção descreve uma seqüência genética modificada da proteína

10 de união ao antígeno Duffy — Duffy Binding Protein ou DBP — contra malária causada

por P. vivax. Além disso, descreve-se a construção de um adenovírus que secreta a

proteína recombinante no meio extracelular devido a incorporação do peptídeo sinal

HASS no vetor virai.

A construção é caracterizada pela combinação dos polimorfismos encontrados

15 na população brasileira a fim de aumentar a cobertura vacinai. Para obter os

polimorfismos foram utilizadas seqüências de pacientes da área endêmica brasileira.

A análise de polimorfismos foi feita com base na seqüência de SAL-I

depositada no GenBank cujo acesso é: [Gi160275]. A seqüência utilizada nesse

trabalho tem como padrão a seqüência Sal-I e inicia-se no aminoácido 232 e termina

20 no 548. Para a construção do adenovírus o soro desses pacientes foi obtido e

utilizado para amplificação por PCR utilizando oligonucleotídeos específicos. Os

oligonuleotídeos utilizados inseriram sítios de restrição EcoRI e Xba respectivamente

no início e no final da seqüência. Após a amplificação os clones positivos foram

clonados no pTOPOTA e analisados por digestão enzimática. Desse plasmídeo a

25 seqüência foi retirada com as enzimas de restrição cujos sítios foram incorporados à

seqüência durante a amplificação. 0 produto da digestão foi purificado e clonado no

pcDNA3.1 HASS que contém o peptídeo sinal do vírus influenza que permite a

secreção da proteína pelo adenovírus. A clonagem foi feita entre o sítio de EcoRI e

XBaI desse plasmídeo. Os clones positivos foram digeridos para obtenção da porção

30 HASS-DBPII que foi clonada no pADCMV-Iink1 em fase ao promotor de expressão do

citomegalovírus. Os clones positivos foram seqüenciados para confirmar a inserção

correta no plasmídeo. 0 pADCMVLink1-HASS-DBPII foi utilizado para recombinar de

forma homóloga com outro plasmídeo o pJM17. Esse fenômeno de recombinação

ocorre durante a transfecção e permite a geração dos adenovírus 5.

5

A partir da região 11 foram desenhados primers contendo sítios de restrição

enzimática para as enzimas EcoRI e Xbal que foram utilizadas para a inserção da

seqüência de interesse no vetor pPIC9Z para a trasnformação da levedura P. pastoris

e também para inserção no pTopoTA e posterior clonagem no pcDNA3.1 HASS para

5 obtenção do peptídeo sinal HASS do vírus influenza e em seguida a clonagem de

HASS-DBPII no pAdCMV-IinLys1. Esse útilimo plasmídeo foi utilizado para recombinar

de forma homóloga com o pJM17 para gerar os adenovírus expressando a DBPII. A

seqüência da DBPII obtida por PCR dos soros destes pacientes foi individualmente

clonada nos plasmídeos e o mesmo procedimento foi adotado nas etapas de

10 clonagens da DBPII.

Legenda:

15

20

Localização dos nucleotídeos

Seqüência Identificação

1-103

103-1083

1091 TAA

Peptídeo sinal HASS

Seqüência da DBPII

Códon de terminação

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

25 FIGURA 01: Clonagem de DBPII amplificada por PCR nos sítios de EcorRl e

Xbal do plasmídeo pTopoTA. FIGURA 02: Clonagem de DBPII retirada do pTopoTA com as enzimas EcoRI

e Xbal nos sítios enzimáticos de EcoRle Xbal do pcDNA3.1 HASS para adção do peptídeo sinal HASS. 0 mesmo procedimento foi adotado para os três pacientes; AM,

30 MT e PA. FIGURA 03: (A) Representação esquemática do sítio de clonagem no

pAdCMV-IinLys1 —HASS-DBP AM, MT e PA. (B) 0 promotor CMV e cauda do SV40. DBP AM foi clonada no sítio de EcoRV desse plasmídeo. As setas indicam a posição dos iniciadores.

35 FIGURA 04: Esquema representando a recombianção homóloga ocorrida entre pAdCMV-IinLys-1 e pJM17 durante a trasnfecção das células HELYS293 para a geração dos adenovírus expressandoa DBPII.

FIGURA 05: Esquema de clonagem de DBPII no vetor pPIC9Z utilizado para a

tranformação da levedura P.pastoris por eletroporação. A seqüência clonada no 40 pAdCMV-IinLys-1 será retirada através das enzimas EcoRI e Xbal dispensando assim

a sequência do peptídeo sinal HASS. A DBPII será clonada no pPIC9Z no respectivos

sítios EcoRI e Xbal e terá como peptídeo sinal o fator meeting-alfa de S.cereviseae

presente no sistema de expressão pPIC9z. Ao final da seqüência da DBPII haverão

seis resíduos de histidina.

1/2

LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

Seq. ID n°:01

Características da seqüência:

5 a) tamanho — 969 pares de base

b) Tipo- DNA

c) Conformação da fita: fita dupla

d) Topologia - linear

Características da molécula seqüenciada:

10 a) Tipo : DNA

b) Nome: Duffy Binding-Protein de Plasmodium vivax

c) Produto do gene: Região II da Duffy Binding- Protein de Plasmodium vivax

15

20

25

1 GGT GGC AAT CCT TAC GAT ATT GAT CAT AAG AAA ACG ATC TCT AGT GCT 48

GLY GLY ASN PRO TYR ASP ILE ASP HIS LYS LYS THR ILE SER SER ALA

49 ATT ATA AAT CAT GCT TTT CTT CAA AAT ACT GTA ATG AAA AAC TGT AAT 96

ILE ILE ASN HIS ALA PHE LEO GLN ASN THR VAL MET LYS ASN CYS ASN

97 TAT AAG AGA AAA CGT CGG GAA AGA GAT TGG GAC TGT AAC ACT AAG AAG 144

TYR LYS ARG LYS ARG ARG GLU ARG ASP TRP ASP CYS ASN THR LYS LYS

145 GAT GTT TGT ATA CCA GAT CGA AGA TAT CAA TTA TGT ATG AAG GAA CTT 192

ASP VAL CYS ILE PRO ASP ARG ARG TYR GLN LEO CYS MET LYS GLU LEO

193 ACG AAT TTG GTA AAT AAT ACA GAC ACA AAT TTT CAT AGG GAT ATA ACA 240

THR ASN LEO VAL ASN ASN THR ASP THR ASN PHE HIS ARG ASP ILE THR

241 TTT CGA AAA TTA TAT TTG AAA AGG AAA CTT ATT TAT GAT GCT GCA GTA 288

PHE ARG LYS LEO TYR LEO LYS ARG LYS LEO ILE TYR ASP ALA ALA VAL

30 289 GAG GGC GAT TTA TTA CTT AAG TTG AAT AAC TAC AGA TAT AAC AAA GAC 336 GLU GLY ASP LEO LEO LEO LYS LEO ASN ASN TYR ARG TYR ASN LYS ASP

35

337 TTT TGC AAG GAT ATA AGA TGG AGT TTG GGA GAT TTT GGA GAT ATA ATT 387

PHE CYS LYS ASP ILE ARG TRP SER LEO GLY ASP PHE GLY ASP ILE ILE

385 ATG GGA ACG GAT ATG GAA GGC ATC GGA TAT TCC GAA GTA GTG GAA AAT 432

MET GLY THR ASP MET GLU GLY ILE GLY TYR SER GLU VAL VAL GLU ASN

433 AAT TTG CGC AGC ATC TTT GGA ACT GAT GAA AAG GCC CAA CAG CAT CGT 480 40 ASN LEO ARG SER ILE PHE GLY THR ASP GLU LYS ALA GLN GLN HIS ARG

45

481 AAA CAG TGG TGG AAT GAA TCT AAA GCA CAA ATT TGG ACA GCA ATG ATG 528

LYS GLN TRP TRP ASN GLU SER LYS ALA GLN ILE TRP THR ALA MET MET

529 AC TCA GTT AAA AAA AGA TTA AAG GGG AAA TTT ATG TGG ATT TGT AAA 576

TYR SER VAL LYS LYS ARG LEO LYS GLY LYS PHE MET TRP ILE CYS LYS

577 ATA AAT GTT GCG GTA AAT ATA GAA CCG CAG ATA TAT AGA AGG ATT CGA 624

ILE ASN VAL ALA VAL ASN ILE GLU PRO GLN ILE TYR ARG ARG ILE ARG

5

10

625 GAA TGG GGA AGG GAT TAC GTG TCA GAA

GLU TRP GLY ARG ASP TYR VAL SER GLU

673 CTG AAA GAA AAA TGT GAT GGA AAA ATA

LEO LYS GLU LYS CYS ASP GLY LYS ILE

721 TGT AAG GTA CCA CCA TGT CAA AAT GCG

CYS LYS VAL PRO PRO CYS GLN ASN ALA

TTG CCC ACA GAA GTG CAA AAA 672

LEO PRO THR GLU VAL GLN LYS

AAT TAT ACT GAT AAA AAA GTA 720

ASN TYR THR ASP LYS LYS VAL

TGT AAA TCA TAT GAT CAA TGG 768

CYS LYS SER TYR ASP GLN TRP

769 ATA ACC AGA AAA AAA AAT CAA TGG GAT GTT CTG TCA AAT AAA TTC ATA 816

ILE THR ARG LYS LYS ASN GLN TRP ASP VAL LEO SER ASN LYS PHE ILE

817 AGT GTA AAA AAC GCA GAA AAG GTT CAG ACG GCA GGT ATC GTA ACT CCT 864

15 SER VAL LYS ASN ALA GLU LYS VAL GLN THR ALA GLY ILE VAL THR PRO

865 TAT GAT ATA CTA AAA CAG GAG TTA GAT GAA TTT AAC GAG GTG GCT TTT 912

TYR ASP ILE LEO LYS GLN GLU LEO ASP GLU PHE ASN GLU VAL ALA PHE

20 913 GAG AAT GAA ATT AAC AAA CGT GAT GGT GCA TAT ATT GAG TTA TGC GTT 960

GLU ASN GLU ILE ASN LYS ARG ASP GLY ALA TYR ILE GLU LEO CYS VAL

961 CGT GAT GGT GCA TAT ATT GAG TTA TGC GTT TGT TCC GTT 969

ARG ASP GLY ALA TYR ILE GLU LEO CYS VAL CYS SER VAL

25

1/1

REIVINDICAÇÕES

1. SEQÜÊNCIA GENETICAMENTE MODIFICADA DO ANTÍGENO DBP DE

PLASMODIUM VIVAX caracterizada pela seqüência de DNA compreender a Seq. ID

no(1).

5 2. PROTEÍNA RECOMBINANTE DBP caracterizada pela seqüência de

aminoácidos compreender a Seq. ID no(1).

3. VÍRUS GENETICAMENTE MODIFICADO QUE EXPRESSA 0 ANTÍGENO

DBP RECOMBINANTE caracterizado por compreender a Seq. ID no(1).

1/3

FIGURA 02

FIGURA 0

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2 -

DBPII

2/3

FIGURA 03

A

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-Sal1

3/3

FIGURA 04

HÁS- DBP STOP S

FIGURA 05

pAdCMV-IinLysl

pJM177

Genoma do adenovírus

1/1 T;o-)-0s2 a

RESUMO "SEQÜÊNCIA GENETICAMENTE MODIFICADA DO ANTÍGENO DBP (PA) DE PLASMODIUM VIVAX, PROTEÍNA RECOMBINANTE DBP E ADENOVÍRUS GENETICAMENTE MODIFICADO QUE EXPRESSA 0 ANTÍGENO DBP

5 RECOMBINANTE" A presente invenção diz respeito à construção de uma seqüência genética

modificada do antígeno DBP (Duffy-Binding Protein) de Plasmodium vivax obtido de

um paciente (PA), uma proteína recombinante codificada pela referida seqüência e um

adenovírus geneticamente modificado que expressa o antígeno DBP recombinante. A

10 invenção é útil para a imunização de mamíferos contra malária.