19º Simpósio Internacional de Esclerose Lateral AmiotróficaBirmingham – Reino unido3-5 Novembro de 2008

O simpósio Internacional de Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) ocorreuentre os dias 3-5 de novembro de 2008 na cidade de Birmingham, ReinoUnido.

Este ano contou com a participação de 860 pesquisadores do mundotodo e com a apresentação de pelo menos 300 resumos científicos, além deinstituições de apoio ao paciente com ELA como a “MNDA – Motor NeuroneDisease Association ” (sigla em inglês para Associação da Doença doNeurônio Motor), “Hope ” (Esperança), “Patients like me ” (do inglêsPacientes como eu), Associação Brasileira de Esclerose Lateralamiotrófica (ABrELA) e Instituto Paulo Gontijo , que apresentou o próximoPrêmio para a Pesquisa em ELA em 2009.

O simpósio teve início com as palavras do Ministro da Ciência eInovação do Reino Unido, Lord Drayson, que se diz admirado pelo excelentetrabalho realizado pela Associação da Doenca do Neurônio Motor e o apoiodado pelas associações aos pacientes com Esclerose Lateral Amiotrófica.

O presente relatório reporta o conteúdo mostrado no simpósio pelosmédicos e cientistas, não representando portanto a opinião da relatora.

O resumo de todos os trabalhos apresentados nesse simpósio podemser acessados pela internet no site (em inglês):

http://www.mndassociation.org/research/for_researchers/international_symposium/19th_international_symposium/abstract_book.html

Introdução

A Esclerose Lateral Amiotrófica, também conhecida como Doença doNeurônio Motor na Inglaterra e Doença de Lou Gehrig nos Estados Unidos, éuma doença neurodegenerativa progressiva que atinge principalmente osneurônios motores. Com a progressão da doença, os neurônios motores sedegeneram causando fraqueza muscular das pernas e dos braços,dificuldades na fala, deglutição e respiração.

Existem outras doenças com as mesmas características da ELA e ocorreto diagnóstico às vezes ocorre após inúmeros exames e visitas adiferentes médicos.

Podemos classificar a ELA entre forma familial (isto é, genéticapassando de geração a geração) e esporádica (existe somente uma pessoacom a doença na família).

A ELA familial pode ser causada por mutações (alterações genéticas)nos genes SOD1 (superóxido dismutase 1), alsina, senataxina, VAP-B e maisrecentemente angiogenina e TDP-43.

A ELA do tipo esporádica pode ser causada por alterações nos genescitados acima, mas também por fatores ainda não definidos.

Para facilitar o entendimento de alguns termos aqui citados descrevouma breve explicação da chamada dogma central da biologia moderna, querelaciona DNA, RNA e proteínas.

O DNA contém toda a informação genética de um indivíduo, desde o serhumano até a mais simples bactéria e está presente dentro de todas ascélulas. O DNA contém seqüências específicas que são denominadas genese por meios de uma codificação complexa dentro da célula, ocorre aprodução do RNA que sera lido e traduzido em proteína. Portanto se ocorre

alguma alteração (mutação) no DNA, fará com que se produza uma proteínatambém alterada e, portanto a sua função será modificada (figura 1).

Figura 1: Dogma central da biologia molecular. A) situação normal. B) quandoocorre uma mutação no DNA, a proteína estará alterada podendo ser a causa dadoença.

O simpósio teve início com a sessão Biologia Celular e Patologia

Angiogenina

Recentemente Matthew Greenway publicou um trabalho mostrando quealterações no gene da angiogenina poderia ser responsável pela ELA do tipofamilial e esporádica.

A angiogenina foi inicialmente identificada como uma moléculaenvolvida na formação de vaso sanguíneos (angiogênese). A angiogeninatem função parecida com o VEGF (vascular endothelial growth factor – fatorde crescimento vascular endotelial), que atuaria como fator de proteção àELA.

O grupo da Dra. Vasanta Subramanian por meio de estudos com célulasde camundongos verificou que a angiogenina é expressa nas fases iniciais dodesenvolvimento embrionário, principalmente nos neurônios motores, quesão os mais atingidos na ELA. Além disso, essa proteína seria importantepara o desenvolvimento e migração dos neuritos.

A angiogenina tem a capacidade de organizar as células endoteliais emestruturas parecidas a tubos, o que ajudaria na migração celular durante avascularização dos tecidos. Além disso, essa proteína estaria tambémenvolvida na proliferação de outras células com a ajuda de fatoresneurotróficos como o VEGF.

RNAtranscrição traduçãoDNA

Proteína

RNA

Mutaçã

transcrição traduçãoDNA Proteína

alterada

A

B

Pouco é conhecido sobre a função da angiogenina e sua participação napatologia da ELA. Futuros estudos devem ser realizados a fim de se entendermais sobre o envolvimento dessa proteína e a ELA.

Ainda estudando a angiogenina, Michael Van Es estudou 39 famíliasholandesas com Esclerose Lateral amiotrófica e 275 indivíduos normais dapopulação.

Em uma família holandesa com 44 indivíduos, Van Es encontrou umamutação (K17I) no gene da angiogenina em três pacientes com ELA, quenão estava presente nos demais indivíduos da família nem nos 275 controlesnormais da população. Todos os pacientes dessa família tiveram uma rápidamanifestação da doença.

Aparentemente essa mutação altera a função da proteína fazendo comque não exista a formação dos tubos endoteliais.

Curiosamente um paciente de 72 anos foi diagnosticado com Doença deParkinson cinco anos antes de desenvolver ELA. Recentemente demonstroualterações de comportamento, desinibição sexual e foi diagnositicado comdoença fronto-temporal (DFT).

Não é sabido se esse paciente com diagnóstico da doença fronto-temporal apresenta alterações em outros genes como o TARDBP ou seexiste alguma relação entre angiogenina e DFT.

Ácido Retinóico e ELA

Mudando de tema, Christi Kolarcik e colaboradores estudaram o efeitodo ácido retinóico em ELA. O objetivo inicial era identifica e explorar osefeitos funcionais de alterações na via dos retinóides em ELA e testar comoestes componentes atuam nos neurônios motores.

Os autores obtiveram material post-mortem de pacientes com ELA e pormeio de imunohistoquímica, imunoblot e microscopia confocal, verificaram aexpressão e distribuição dos retinóides nas células. Além disso, estudarammodelos celulares para estudos funcionais.

O ácido retinóico é um importante fator para o desenvolvimento neural,especificidade e plasticidade neuronal assim como reparar neurôniosdanificados.

Os autores observaram diferenças em três proteínas relacionadas comos retinóides: cellular retinol binding protein (CRBP) e cellular retinoic acidbinding proteins (CRABP) I e II.

Observou-se que a expressão do CRBP estava aumentada nosneurônios motores da medula espinhal dos pacientes enquanto que aproteína CRABP-1 estava diminuída. O CRABP-II estava concentrado nonúcleo das células dos pacientes com ELA, enquanto que em indivíduoscontroles a proteína exibia um padrão citoplasmático.

Além disso, os autores estudaram a expressão e distribuição dosreceptores de ácido retinóico nucleares. Os autores testaram o RAR alfa,RAR beta e RAR gama em células. Observaram que os receptores alfa egama mantêm o mesmo padrão nuclear, entretanto o receptor beta estádramaticamente alterado em pacientes com a ELA esporádica. Há um

aumento da proteína no núcleo desses pacientes em comparação com oscontroles normais. Essa alteração foi observada em 66% dos casosesporádicos e somente 11% dos casos familiais.

Células expostas a ácido retinóico apresentaram diferença no númerode neuritos.

Os autores concluem que a via de sinalização do ácido retinóico estáenvolvido na patologia da ELA e representa um potencial alvo terapêutico.

Microdissecção à laser e perfil de expressão em ani maistransgênicos

John Ravits da Universidade de Washington mostrou que é possívelenriquecer a amostra de neurônios motores utilizando microdissecção comlaser. Amostras de camundongos transgênicos com a mutação G93A nogene SOD1 foram retiradas em três diferentes tempos: 20, 60 e 90 dias.Essas amostras da medula espinhal foram processadas com o uso de laser eneurônios motores e a porção anterior da medula (anterior horn) sem osneurônios motores foram estudados. O objetivo é saber quais são os genesque apresentam diferença na expressão gênica antes e depois dos animaisdesenvolverem a doença.

Figura 2: extraída e modificada de Perrin e cols. mostrando um exemplo deneurônios motores extraídos da medula espinhal utilizando microdissecção comcaptura a laser. e) antes da microdissecção e f) depois da captura à laser. O tecidoreminiscente permanece intacto após a microdissecção.

Os autores observaram uma diferença na expressão gênica entre osneurônios motores e no compartimento anterior da medula espinhal, comoesperado. Uma lista de genes foi apresentada pelos autores, incluindo genesimportantes para a via apoptótica, genes estruturais, de sinalização celular eainda, genes responsáveis pela regulação de outros genes.

Os genes expressos aos 20 dias de idade são diferentes dos genesexpressos aos 60 dias e 90 dias, quando os animais já apresentam sintomasda doença.

De acordo com os autores a identificação de determinados genes emdiferentes fases do desenvolvimento do animal é muito importante e entenderas conexões entre elas será um grande desafio para este tipo de estudo.

Esforço físico e ELA – estudo em “camundongos espor tistas”

Muito se tem falado sobre a ligação entre esforço físico como um dosfatores desencadeadores da ELA.

Recentemente jogadores de futebol italianos foram notícia não pelo fatode jogarem futebol, mas por portarem ELA. Esta não foi a primeira vez queesforço físico foi relacionada à ELA. O primeiro caso entre esportistasocorreu na década de 30 quando Lou Gehrig, famoso jogador de beiseboldesenvolveu a doença.

Em sua apresentação Laura Ferraiuolo da Universidade de Sheffield,mostrou um trabalho inicial em que camundongos de 12 semanas de idadeforam treinados a correr durante 3 semanas. Os animais correram em média13km por dia por 5 horas enquanto que os animais sedentários correram 1km por dia.

Após três semanas de treinamento, os pesquisadores isolaram amedula espinhal destes animais usando o método de microdissecção à lasere obtiveram RNA dessas amostras. Uma análise de expressão gênicarevelou que 444 genes estão diferentemente expressos entre os animaistreinados e os não treinados. Dos 444 genes, 203 estão superexpressos e241 estavam sendo pouco expressos. Dentre eles destacam-se fatoresneurotróficos e seus receptores, importantes para o crescimento edesenvolvimento dos neurônios, genes importantes reguladores de canaisiônicos e genes responsáveis pela organização do citoesqueleto.

Além de amostras da medula espinhal, o grupo estudou o músculo doscamundongos. Eles verificaram que 370 genes estavam alterados, sendo quemuitos deles estão envolvidos no metabolismo, neovascularização(angiogênese), mais especificamente o receptor do VEGF-2 e formação denovas fibras musculares, como esperado.

Os autores atestam que ocorre diferença sexual e as fêmeas tendem acorrer mais que os machos.

Ainda não está claro por que ocorre essa diferença entre machos efêmeas e os autores não esclarecem qual seria a ligação entre esforço físicoe ELA, na medida que os autores estudaram somente animais normais. Elesconcluem que em indivíduos com uma predisposição gênica, o esforço físicoexarcebado associado à regulação de fatores neurotróficos e alterações nasjunções neuromusculares poderiam ser desencadeadores da doença.

Um estudo realizado pelo grupo com animais transgênicos mostrouresultados diferentes. Nesse simpósio Ferraiuolo mostrou somente resultadosde animais normais. (Ferraiuolo L e cols., 2007)

Transporte Axonal: VAP-B e Espastina

VAP-B

Um dos temas que dominou o Simpósio desse ano foi o transporteAxonal.

Kurt de Vos, do King’s College London desenvolveu um trabalhomostrando que a mutação no gene VAP-B (vesicle associated membrane

protein-associated protein B) leva a uma alteração no transporte axonal daproteína.

Mutações no gene VAP-B foi descoberto em uma grande famíliabrasileira por pesquisadores do Centro de Estudos do Genoma Humano, sobcoordenação da Dra. Mayana Zatz.

A proteína VAP-B está localizada na membrana do RetículoEndoplasmático e da mitocôndria. A mutação P56S nesse gene formaagregados celulares, fazendo com que essa proteína não se localize mais noretículo endoplasmático, porém ela se mantém na mitocôndria.

De Vos introduz o seu estudo com a seguinte analogia: “umamitocôndria de 2µm de comprimento transportada ao longo de um metro deneurônio motor é equivalente a um homem de dois metros de altura viajandode Birmingham a Berlin” (sede do próximo Simpósio de ELA). Em outraspalavras, o neurônio motor é a célula mais comprida do corpo humano,saindo da coluna espinhal e chegando ao dedo do pé. A proteína que éproduzida no núcleo presente no corpo celular do neurônio motor devepercorrer todo esse caminho até chegar ao seu destino, ao final de 1 m dedistância (figura 3). Se por alguma razão uma dessas proteínas está alterada,sua função poderá mudar completamente e interferir em toda uma via detransporte, denominada transporte axonal.

A via de transporte que leva proteínas do corpo celular para os dentritosé denominada anterógrado . A via de transporte que faz o caminho inverso édenominada retrógrado . Esse transporte de proteínas e organelas como amitocôndria é realizado por moléculas motoras como a quinesina e a dineína.

Por meio de estudos com neurônios de camundongos, De Vos mostrouque a mutação P56S diminui o número de mitocôndrias transportadas peloaxônio em comparação com as mitocôndrias normais, alterando assim otransporte anterógrado. Aproximadamente 30% das mitocôndrias sãotransportadas normalmente, entretanto com a mutação P56S o número caipara 10-15%. A maioria das mitocôndrias com a mutação permanecem nocorpo celular dos neurônios e poucas são observadas ao longo dos axônios eneuritos. Curiosamente o transporte retrógrado se mantém inalterado nesteestudo.

Além disso, foi mostrado que a velocidade de transporte se mantémconstante, indicando que as proteínas motoras não foram danificadas.

O autor conclui que a mutação inibe especificamente o transporteanterógrado da mitocôndria afetando a regulação da proteína motoraquinesina-1. Curiosamente essa alteração no transporte da mitocôndria ésimilar ao observada pela mutação no gene SOD1, mostrando que essasduas proteínas apresentam uma via comum e que este poderia ser umpossível alvo terapêutico.

Modificado de De Vos KJ, et al. 2008Figura 3: Transporte axonal defeituoso: alterações na mitocôndria ocorre em

várias doenças neurodegenerativas, como ELA, Doença de Parkinson, Doença deAlzheimer e Paraplegia Espástica. A disfunção mitocondrial pode ocorrer em duasmaneiras. Primeiro, a inibição da função mitoncondrial reduz o transporteanterógrado das mitocôndrias e vesículas. Segundo, a diminuição de mitocôndriasnos axônios provavelmente diminuirá o suprimento de ATP para as moléculasmotoras leavando a um decréscimo no movimento anterógrado e retrógrado deoutras proteínas no axônio, que levará a morte dos axônios.

Espastina

Seguindo no mesmo tema, Paul Kasher, utilizando o mesmometodologia de Kurt de Vos, estudou o transporte da espatina ao longo doaxônio dos neurônios.

Mutações no gene da espastina é responsável pela paraplegia espásticahereditária 4 (SPG4).

A espastina é uma proteína que interage com o microtúbulo,responsável pela formação do citoesqueleto, que dá a forma da célula.

Em 2006, Anne Tarrade e colaboradores apresentaram um camundongotransgênico com uma mutação no gene da espastina. Esse grupo mostrouque a medula espinhal desses animais apresentam a formação dos

VAPB

anterógradoretrógrado

chamados “inchaços axonais” (axonal swellings), que são estruturasformadas pelo inchaço do citoesqueleto e sequestro de organelas e vesículasno axônio dos neurônios. Esse inchaço leva a um bloqueio do transporte deproteínas, nutrientes e organelas ao longo do axônio e consequentemente amorte do neurônio (figura 4).

Outros grupos mostraram que a superexpressão e completa ausênciade espastina leva a uma alteração no transporte axonal.

Kasher estudou a mutação K388R no gene da espastina e sua formanormal como controle. Esta mutação está localizada em um sítio doador desplicing e quando traduzida em proteína leva a um código prematuro deparada, formando uma proteína totalmente malfuncional.

Os autores também estudaram camundogos transgênicos e verificaramque esses animais apresentam ‘estrangulamento ou inchaço’ axonal queestão associados a um significativo acúmulo de citoesqueleto e de vesículasno axônio da célula.

Além disso, observou-se que os animais transgênicos apresentam umaalteração na locomoção de acordo com o grau de comprometimentopatológico.

Assim como a mutação no gene VAP-B, mutações no gene da espastinacausamm uma redução do transporte anterógrado ao longo do axônio, fatoque é independente dos ‘inchaços’ axonais.

O autor conclui que duas mutações diferentes levam a uma alteração notransporte axonal e que o atual modelo animal para a SPG4 será de sumaimportância para a compreensão dessa patologia.

4 meses 12 meses

Figura extraída e modificada de Tarrade, A. et al. Hum. Mol. Genet. 2006 15:3544-3558.Figura 4: “Inchaço axonal” na medula espinhal de camundongo transgênico para espastina em diferentes idades (4 e 12 meses). Cortes transversos corados com toluidine blue. A e D) camundongo controle. B e D) camundongo mutante. Observe a presença dos chamados “inchaços axonais” (seta)

Estudo de novas drogas para a ELA

O desenvolvimento de novas drogas para o tratamento da ELA foi temade duas apresentações nesse simpósio.

O primeiro apresentado por Thierry Bordet, Trophos - França mostrouque um novo componente denominado TRO19622 poderia atuar como umcandidato para o tratamento da ELA.

Esta droga protege os neurônios motores de injúrias causadas peladeprivação de fatores neurotróficos em cultura de células, além de acelerarem 54% a recuperação de nervos que foram danificados em experimentocom animais (auxotomia do nervo facial).

Além disso, o TRO19622 retarda o avanço da doença em animaistransgênicos para SOD1 e altera a dinâmica do microtúbulo nas células,auxiliando na sua extensão em 20%.

Esta droga já foi testada em animais sem conhecido efeito colateral eatualmente o estudo está na Fase II esperando por um aval positivo paratestar em pacientes com ELA. Espera-se que nos próximos 18 meses essadroga possa ser testada em 470 pacientes cadastrados.

Mais informações vide:http://www.trophos.com/download/TrophosFaqs.pdf ehttp://www.trophos.com/

Um outro estudo apresentado nesse simpósio tem como alvo o uso deantioxidantes que ativariam a via do NRF2/ARE e que teriam um potencialefeito protectivo.

Os autores não entraram em detalhes sobre a pesquisa, mas afirmamque existem mais de 6000 drogas disponíveis na literatura, entretanto muitosestudos devem ser efetuados antes de iniciar tratamento em humanos.

Utilizando um sistema de triagem em células, os autores iniciaram otrabalho com 2000 moléculas e somente 46 alvos apresentaram respostapositiva na primeira triagem. Posteriormente, na segunda seleção, os autorestestarem essas drogas em células neuronais e chegaram ao seguintenúmero: 9 drogas mostraram resultados positivos, 17 eram tóxicas para ascélulas e 20 não mostraram resposta.

Ao pesquisarem na literatura observaram que 17 delas já sáoconhecidas e 4 foram testadas no homem sem efeito negativo.

Duas dessas moléculas serão testadas em animais em futuro próximo.

TDP-43

Em 2006 uma nova proteína foi descoberta alterada na medula espinhalde pacientes com ELA e demência Fronto-Temporal. Aparentemente essasduas doenças não apresentam conexões uma com a outra, entretantoalterações no gene TARDBP pode causar ambas.

A proteína TDP-43 é produzida pelo gene TARDBP localizado nocromossomo 1 e está envolvida no processamento do RNA e produção denovas proteínas; além de estar envolvida no splicing de outras proteínas.

Além disso está envolvida na ligação do RNA mensageiro com outrasproteínas e outras moléculas de RNA.

Jemeen Sreedharam do King’s College London publicou um trabalhonesse ano na revista Science mostrando que mutações no TARDBP causamELA em pacientes da Inglaterra e da Austrália.

A mutação M337V está presente em pacientes com a forma familial e amutação Q331K em um paciente com a forma esporádica.

Esse trabalho contou com a colaboração da Dra. Vineeta Tripathi domesmo laboratório, que estudando embriões de galinha mostrou quemutações nesse gene causam um atraso no desenvolvimento dos embriões emorte prematura dos neurônios motores.

O grupo continua estudando este e outros genes para a ELA.

Figura gentilmente cedida pela Dra. Vineeta Tripathi.Figura 5: Efeito da superexpressão da proteína TDP-43 em embriões de

galinha. Embriões eletroporados com o vetor contendo o gene normal não apresentaalterações no seu tamanho nem morfologia (A). Entretanto em 50% dos embriõesexpressando as formas mutantes M337V (B) e Q331K (C) apresentam um atraso nodesenvolvimento (B e C).

Figura extraída e modificada de Sreedharan J, et al., Science 319(5870), 2008Figura 6: A mutação no gene TARDBP causa atraso no desenvolvimento nos

embriões de galinha. A medula espinhal dos embriões foram transfectadas complasmídeos contendo a sequência selvagem do TDP-43 (A, D e G), mutante Q331K(B, E e H) ou M337V (C, F e I). As imagens e os cortes histológicos foram obtidos24hs após a eletroporação. Os embriões expressando a forma normal do TDP43apresentam desenvolvimento normal dos membros e cauda (seta) (A). Os embriõesexpressando a forma mutante não se desenvolvem normalmente (B e C). Maioresdetalhes vide Sreedharan et al., 2008.

VAP-B e TDP-43

Elizabeth Tudor mostrou o primeiro modelo transgênico para a mutaçãono gene VAP-B. De acordo com a cientista os animais não apresentamnenhuma alteração comportamental ou locomotora até os 18 meses deidade.

A nálise histológica revelou presença de agregados protéicos na medulaespinhal destes animais. Além disso, verificou-se que que a proteína TDP-43se encontra no citoplasma dos neurônios motores, mostrando pela primeiravez uma mutação em outro gene alterando a localização do TDP-43.

O uso de animais transgênicos

Modelos animais transgênicos foram o tema de uma sessão inteiradurante o simpósio. Apesar dos animais transgênicos não apresentaremtodos os sintomas observados em pacientes com ELA, discutiu-se asvantagens e desvantagens do uso destes animais na pesquisa dessadoença. Os pesquisadores concordam que apesar de não ser o modelo ideal,este é o único que existe, portanto será necessário adequar o estudo deacordo com as necessidades.

Existem inúmeras variáveis que influenciam a doença nesses animais euma delas é saber qual é o componente genético desses animais (geneticbackground). Os animais disponíveis no momento são os chamados inbredstrains, gerados pelo cruzamento de irmãos por aproximadamente 50gerações. Dessa forma assegura-se que todos os animais apresentarão asmesmas alterações genéticas. Por outro lado, esses animais são menosrobustos que os outbreds strains e são menos férteis também.

Outra limitação quanto ao uso de animais transgênicos é o número decópia do transgene inserido nesses animais. Ao se produzir um animaltransgênico, o pesquisador não sabe onde esse transgene e quantas cópiasserão inseridas no animal. Há uma possibilidade de que esse transgene selocalize no meio de outros genes, o que poderia ser fatal para asobrevivência do animal.

Além disso, a gravidade da doença poderá ser proporcional ao númerode cópias desse transgene, isto é, quanto maior o número de cópias, maisgrave será a doença.

Discute-se muito quanto ao número de cópias do transgene porque nagrande maioria das doenças genéticas hereditárias, o paciente apresentasomente uma cópia do gene alterado (recebido por um dos pais). Entretanto,os animais transgênicos podem conter desde 1 a 30 cópias, nãorepresentando portanto o modelo ideal da doença.

Por não ser um bom modelo para o estudo da ELA, algunspesquisadores acreditam que os testes para a descoberta de novas drogasdeveriam ser realizadas diretamente em humanos, idéia que foi descartadapela maioria dos pesquisadores presentes na sessão.

Os modelos animais para ELA mais estudados são aqueles commutações no gene SOD1. Dependo da mutação e do número de cópias do

trasgene, o animal apresentará um alteração na gravidade do quadro e maiorfraqueza muscular.

Acredita-se que uma mutação em um gene deverá desencadear umaalteração global, principalmente em como esta proteína irá interagir comoutras proteínas. Por essa razão vários grupos buscam correlacionar oestudo da proteína SOD1 com outras proteínas.

Animais transgênicos SOD1 vs outros genes

SOD1 e SMN1

Bradley Turner mostrou resultados do cruzamento de animaistransgênicos para a mutação G93A do gene SOD1 com o modelo animalpara AEP (amiotrofia espinhal progressiva). Os autores reportam que essesanimais duplamente transgênicos apresentam um déficit motor maior queanimas transgênicos para SOD1.

SOD1 e Gars

Elizabeth Fisher do Reino Unido, têm estudado animais transgênicoscom diferentes doenças genéticas. Um desses mutantes apresentam defeitosno gene glicina tRNA sintetase (Gars). Mutações nesse gene resulta emmanifestação clínica desde Charcot-Marie Tooth até atrofia muscularprogressiva.

Ao cruzarem dois animais (um mutante para a SOD1 e mutante paraGars) os autores mostram que os animais apresentam um retardo no início eprogressão da doença em 20-28%. Aparentemente não há nenhumainteração entre essas duas proteínas e não é sabido porque essa mutaçãocausa uma melhora nos animais.

SOD1 e HSJ1

Outro estudo mostrando duplo transgênico foi realizado por Mustil ecolaboradores. Eles mostraram que uma alteração no gene HSJ1(chaperona) teria um papel importante na sobrevivência dos neurôniosmotores e extendem a sobrevida desses animais.

Componente capaz de alterar a progressão da doença em animaistransgênicos

Soon e colaboradores mostraram que Diacetilbis(N4-metil-3-tiosemicarbazonato) Cobre (II) (Cu(ATSM)) seria importante para otratamento de ELA. Os autores administraram essa droga em animais com amutação G93A no gene SOD1 e verificaram que o uso dessa droga retarda oaparecimento da doença e que Cu(ATSM) poderia prevenir a deterioração noneurônio motor e poderia ser um importante alvo terapêutico no futuro.

Outros modelos In Vivo

VAP-B em moscasDois trabalhos mostraram modelos alternativos para o estudo da ELA.

Giuseppa Pennetta da Universidade de Edinburgo mostrou um novo modelopara a ELA8. Os pesquisadores mostraram que a mutação P56S no gene daVAP-B causa a formação de agregados nos neurônios das moscas e umadiminuição na sua capacidade em se locomover causado por alteração nasjunções neuromusculares.

SOD1 em cãesJoan coates mostrou cães com doenças neuromusculares. Esses

animais apresentam mutações espontâneas e foram estudados ao longo deuma década. A pesquisadora mostrou um canil com vários animais comdoenças neuromusculares e um estudo com DNA mostrou que uma alteraçãono gene SOD1 canino poderia ser o responsável pelo desenvolvimento dadoença nesses animais.

Genética da ELANa sessão de genética, vários pesquisadores mostram estudos em

diferentes populações americana e européia.Alterações nos genes KIFAP3, DPP6 e FBX08 foram encontradas em

diferentes populações, entretanto os autores reportam a necessidade em seaumentar o número de pacientes estudados, e replicação desses estudos emoutras populações.

A função de células não-neurais na ELA

Células do bulbo olfatórioO estudo de células não neuronais na patologia de ELA foi tema de

outra sessão nesse simpósio.Os astrócitos e células da glia são fundamentais para o bom

funcionamento dos neurônios.Geoffrey Raisman do Instituto de Neurologia em Londres, mostrou um

estudo realizado em seu laboratório com ratos com lesões na medulaespinhal. Os animais foram tratados com células tronco obtidas do bulboolfatório de outros animais e após algumas semanas foi observado umamelhora na locomoção.

O pesquisador diz que não há perspectiva de início de testes emhumanos e nem se células tronco do bulbo olfatório humano seriam capazesde regenerar danos causados à medula espinhal de pacientes.

Células da gliaJá Nicholas Maragakis mostrou um estudo com células tronco adultas

em ratos transgênicos.

O pesquisador mostrou que uma linhagem de células tronco precursorade glia levam a um atraso na idade de início da doença e um aumento nasobrevid a sobrevida dos animais em 20 dias.

Estas células precursoras da glia foram obtidas de embriões de ratos ese diferenciam especificamente em astrócitos e microglia.

O uso de outras células não causou o mesmo efeito, mostrando que osastrócitos e células da glia seriam importantes para os neurônios motores.

O autor diz ainda que o estudo em humanos está longe de ser umarealidade, pois seria necessário um número muito grande de células capazde causar o mesmo efeito. Além disso o ser humano é mais complexo e umadose errônea poderia ter um efeito negativo para o paciente.

Terapia com células troncoPouco foi discutido nesse simpósio quanto ao uso de células tronco

como terapia para a ELA. Na última sessão, Clive Svendsen citoubrevemente uma nova linhagem de células tronco, as chamadas célulastronco pluripotentes induzidas (iPS cells – induced pluripotent stem cells).

As iPS foram descritas inicialmente por um grupo japonês liderado peloDr. Shinya Yamanaka em 2006. As células de pele (fibroblastos) sãomodificadas pela introdução de quatro genes e após um período que podevariar de 1-4 meses, os fibroblastos se transformam em células tronco. Elasmantém as mesmas características que as células tronco embrionárias semos problemas éticos amplamente discutidos pela mídia.

As células-tronco induzidas podem ser obtidas de qualquer pessoa e emtermos de pesquisa seu estudo abre novas portas para o entendimento dasdoenças genéticas e possivelmente tratamento futuros.

As iPS podem se diferenciar em vários tipos de células, como porexemplo músculo, células epiteliais, células cardíacas e até neurônios. Onúmero de neurônios motores é reduzido (somente 10% das células sãoneurônios motores) o que é pouco para tratamento.

O pesquisador diz que tentar substituir os neurônios motores afetadospela doença é um desafio muito grande. Alternativamente, é possível tentarresgatar os neurônios motores que estão morrendo com o auxílio de fatoresde crescimento celular como o GDNF (glial cell line-derived neurotrophicfactor).

O uso de outros tipos de células tronco tem gerado inúmerasdiscussões. O pesquisador diz que as células-tronco embrionárias humanassão tão poderosas e causam tantos dilemas éticos e que em termos práticoselas se diferenciam em muitos tipos de células, ocasionamente formandotumores. Já as células-tronco neuronais (neural stem cells) não produzemneurônios motores, sendo portanto inviáveis para o estudo de doenças doneurônio motor. As células progenitores restritas da glia (glial restrictedprogenitors – GFP) se diferenciam em células da glia como o próprio nomediz, mas também em astrócitos. Ambas são importantes para o bomfuncionamento do neurônio, além de dar suporte e protegê-los secretandofatores neurotróficos.

Um estudo realizado pelo pesquisador mostrou que células expressandoGDNF foram injetadas em um lado da medula espinhal de animaistransgênicos. As células migraram para a porção anterior da medula espinhal

e se mostraram funcionais. Entretanto, não há diferença entre os animaistratados e não tratados.

O autor acredita que os músculos dos pacientes devem ser tratadostambém na medida que o neurônio motor morre, deixa de mandar sinaisnervosos para os músculo que consequentemente atrofia e morre também.Svendsen acredita que uma terapia injetando células produzindo fatores decrescimento nos músculo e medula espinhal será mais eficiente e aumentaráo tempo de sobrevida do paciente (vide Suzuki e Svendsen, 2008).

No momento não há um tratamento eficaz com o uso de células tronco,entretanto ele acredita que haverá um protocolo eficaz nos próximos anos.

Uma vacina para a ELAA última palestra apresentada no simpósio foi do pesquisador Jean-

Pierre Julien do Canadá. O tema escolhido por Jean-Pierre foi uma vacinapara ELA.

Existem aproximadamente 140 mutações genéticas para o gene daSOD1 e a maioria delas causa um aumento na toxicidade dentro da célula,além de um dobramento incorreto da proteína e formação de agregadoscelulares.

Em 2003 um estudo mostrando uma possível vacina para a doença deAlzheimer causou euforia entre os pesquisadores de doençasneurodegenerativas. Ainda hoje não existe a tal vacina, mas a idéia ébrilhante.

Uma forma de se acabar com o acúmulo de proteínas (agregadosproteícos) em doenças neurodegenerativas tardias seria seguir os seguintespassos: a) identificar o início da doença o mais rápido possível, b) levar umainjeção de anticorpos contra a proteína em questão e c) esperar que o corpohumano processe a informação e destrua a proteína alterada.

Obviamente não é tão fácil assim, mas vários pesquisadores vêmestudando diferentes maneiras de se impedir que essas proteínas seacumulem nas células.

Como já foi discutido anteriormente, os animais transgênicos podemexibir até 20 vezes o número de cópias de um gene alterado e o uso devacinas para esses animais seria ineficaz pois seria necessário uma grandequantidade de anticorpo. O ser humano apresenta uma única cópia alterada,mas o seu tamanho e sua complexidade é muito maior que um camundongode 20 gramas.

Existem duas formas de imunização: imunização ativa e passiva (videDodel e cols 2003 e figura 7).

Em um estudo realizado anteriormente foi observado que o uso deimunização ativa leva a encefalite e portanto é preferível se tentar aimunização passiva.

Julien mostrou um estudo em que vários anticorpos contra a SOD1estão sendo testadas. O estudo ainda está no ínicio, mas alguns anticorposjá foram selecionados e espera-se que em breve esses anticorpos possamser testados em animais transgênicos. É necessário optimizar o protocolo devacinação primeiro antes de se iniciar testes em humanos.

Figura retirada de Dodel e cols.2003Figura 7: Imunização ativa e passiva na doença de Alzheimer. Esquerda:

imunização passiva com o uso de anticorpo monoclonal contra Aβ. As placasneurais são atraídas pelos anticorpos e destruídas. Direita: alguns anticorpo contraAβ podem atravessar a barreira do sangue-cérebro e se ligar nas placas neuronais eser degradada pela glia.

Conclusão

Nesse simpósio foi mostrado pesquisas interessantes como porexemplo a descoberta de uma nova droga (TRO19622) que poderia ser maiseficiente que o Riluzol.

É de consenso geral não iniciar tratamentos alternativos sem pesquisarprimeiro se o médico e sua equipe é competente. Todo tratamento commedicamento deve ser realizado após muitos anos de pesquisa em células,animais e posteriormente em humanos.

Tratamento com células tronco ainda está longe de ser realidade, masaparentemente Svendsen e colaboradores acreditam que uma intervenção namedula espinhal do paciente e nos músculos seriam potencialmente um alvopara futuros tratamentos.

Muitas pesquisas não foram apresentadas nesse simpósio como porexemplo o trabalho publicado por Eggan e cols (Dimos e cols. 2008)mostrando a geração de células tronco induzidas (iPS) de pacientes comELA. As células são capazes de se diferenciarem em neurônios emotoneurônios e poderão esclarecer um dos mistérios dessa doençachamada ELA.

Quando começamos com o estudo famílias brasileiras portadoras deELA em 2004 não imaginávamos como isso iria repercutir mundo afora.

Nesse simpósio foi mostrado dois modelos transgênicos para a VAP-B(camundongo e mosca de fruta). O camundongo não apresenta fraquezamuscular até os 18 meses de idade nem outro sinal da doença. Entretanto a

análise histológica desses animais mostrou uma alteração na proteínaTDP-43. Outra pesquisa relacionada a VAP-B foi a descoberta que a formamutante apresenta um déficit no transporte axonal podendo explicar por queo neurônio motor morre após um determinado período.

Na secção de posteres, um grupo inglês mostrou uma nova mutaçãopara a VAP-B localizada em uma região próxima à mutação P56S.Aparentemente essa alteração não forma agregados protéicos tão intensosquanto a P56S mas é mais uma evidência da importância da VAP-B napatologia da ELA.

No geral o simpósio trouxe informações positivas e o desejo emencontrar um tratamento para a Esclerose Lateral amiotrófica.

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A Dra Agnes L. Nishimura participou do 19º Simpósio Internacional deELA à convite do IPG.

O tema de dissertação de sua tese durante o doutorado foi aidentificação de uma nova forma familial de ELA (ELA8) em famíliasbrasileiras. O grupo liderado pela Dra Mayana Zatz do Centro de Estudos doGenoma Humano identificou um novo gene (VAP-B) relacionado por essaforma de ELA em 2004.

Atualmente a pesquisadora trabalha no Instituto de Psiquiatria do King’sCollege Londres. Seu projeto atual é estudar alterações nos genesconhecidos para a ELA utilizando células tronco e auxiliar na identificação deum novo gene ainda não descrito na literatura. O grupo liderado pelo Dr.Christopher Shaw identificou mutações no gene TARDBP em pacientes comELA, além de trabalhar em diferentes áreas de pesquisa desde genética,biologia molecular, biologia celular e modelos em embriões de galinha.