2007 carcinoma hepatocelular como fator de risco para recorrência da infecção pelo vírus da...

LUCIANA COSTA FARIA

Carcinoma hepatocelular como fator de risco para

recorrência da infecção pelo vírus da hepatite B ap ós o

transplante de fígado: possível envolvimento das cé lulas

neoplásicas na replicação viral

FACULDADE DE MEDICINA

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS

BELO HORIZONTE

2007

LUCIANA COSTA FARIA

Carcinoma hepatocelular como fator de risco para

recorrência da infecção pelo vírus da hepatite B ap ós o

transplante de fígado: possível envolvimento das cé lulas

neoplásicas na replicação viral

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina, Área de Concentração Gastroenterologia, da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial à obtenção do Título de Doutor em Medicina Área de Concentração: Gastroenterologia

Orientadora: Profa. Teresa Cristina de Abreu Ferrar i



BELO HORIZONTE

2007


REITOR: Prof. Dr. Ronaldo Tadêu Pena

PRÓ-REITOR DE PÓS-GRADUAÇÃO

Prof. Dr. Jaime Arturo Ramirez

Faria, Luciana Costa F224c Carcinoma hepatocelular como fator de risco para recorrência da infecção pelo vírus da hepatite B após o trasnsplante de fígado: papel das células neoplásicas na replicação viral/Luciana Costa Faria. Belo Horizonte, 2007. 81f., il. Tese.(doutorado) – Universidade Federal de Minas Gerais. Faculdade de Medicina. Área de concentração: Gastroenterologia Orientadora: Teresa Cristina de Abreu Ferrari 1.Hepatite B/virologia 2.Hepatite B/prevenção & controle 3.Carcinoma hepatocelular/virologia 4.Transplante de fígado/efeitos adversos 5.Recidiva/prevenção & controle 6.Fatores de risco 7.Replicação viral 8.DNA circular/isolamento & purificação 8.Reação em cadeia da polimerase I.Título NLM: WC 536 CDU: 616.36-002


DIRETOR: Prof. Dr.Francisco José Penna

COORDENADOR DO CENTRO DE PÓS-GRADUAÇÃO

Prof. Dr. Carlos Faria Santos Amaral

COLEGIADO DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA

ÁREA DE CONCENTRAÇÃO GASTROENTEROLOGIA

Prof. Dr. Marco Túlio Costa Diniz (Coordenador)

Prof. Dr. Luiz Gonzaga Vaz Coelho (Subcoordenador)

Profa. Dra. Cláudia Alves Couto

Profa. Dra. Luciana Dias Moretzsohn

Profa. Dra. Teresa Cristina de Abreu Ferrari

Dr. Luiz Fernando Veloso (Representante discente)

TRABALHO REALIZADO COM SUPORTE FINANCEIRO DAS

INSTITUIÇÕES:

- CAPES, Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível

Superior, por meio do programa de bolsa de doutorado sanduíche no

exterior, durante um ano.

- Agence Française de Recherche contre le SIDA et les Hepatites

(ANRS) ANRS HB 022.

Dedico esta tese aos meus pais, Raymundo e Maria de Lourdes, que sempre me

incentivaram e estiveram ao meu lado, mesmo quando a distância física era grande,

e que com seu exemplo de vida, me transmitiram valores éticos sólidos. Também

dedico este trabalho a minha querida irmã, Ana Paula.

AGRADECIMENTOS

- Ao Prof. Didier Samuel, por ter me dado a oportunidade de trabalhar durante dois

anos no Centre Hépato-Biliaire, Hôpital Paul Brousse, onde pude aprimorar

enormemente meus conhecimentos em hepatologia e transplante de fígado, onde

tive a oportunidade de aprender técnicas de biologia molecular e de conviver com

profissionais médicos e pesquisadores de elevado nível. Foi uma grande experiência

profissional e pessoal.

- À Profa. Dra. Teresa de Abreu Ferrari, que desde o momento em que a realização

desse trabalho era apenas uma idéia, me deu todo o apoio necessário, me

incentivou e esteve sempre disponível a me ajudar. Teve participação essencial na

análise e interpretação dos resultados e na redação deste estudo. Espero poder

continuar a contar com sua orientação científica e apoio no prosseguir de minha vida

acadêmica.

- A Michelle Gigou, que me ensinou todas as técnicas de biologia molecular

utilizadas nesse estudo, com muita paciência e que me acolheu de forma muito

carinhosa e amiga no Laboratório de Pesquisa Unité INSERM 785.

- À Dra. Anne Marie Roque-Afonso, virologista do Hôpital Paul Brousse, pelos

ensinamentos em virologia e pela grande ajuda na realização desse trabalho.

- À Dra. Mylene Sebagh, patologista do Hôpital Paul Brousse que participou

ativamente na realização desse estudo.

- Ao Dr. Philippe Ichai e ao Prof. Faouzi Saliba, responsáveis pelo Serviço de

Reanimação do Centre Hépato-Biliaire, Hôpital Paul Brousse, onde durante um ano

aprendi enormemente sobre a Reanimação Hepática.

- Ao Prof. Dr. Agnaldo Soares Lima e a Corinne Andrée Imbs pelo incentivo e ajuda

na busca de novos horizontes.

- Ao Prof. Dr. Luiz Gonzaga Vaz Coelho, pelo apoio e incentivo.

- Ao Prof. Dr. Aloísio Sales da Cunha e à Profa. Dra. Maria de Lourdes de Abreu

Ferrari, pela grande contribuição para a minha formação médica gastroenterológica,

pelo incentivo e pela amizade.

- Ao Prof. Dr. Aloísio Joaquim Freitas Ribeiro, pela grande contribuição à análise

estatística dos resultados desse estudo.

- Aos colegas do Grupo de Transplante de Órgãos do Instituto Alfa de

Gastroenterologia, onde tive o primeiro contato com o Transplante de Fígado e, a

partir dessa experiência, nasceu um grande interesse e desejo de buscar novos

conhecimentos e respostas na área.

- À Profa. Wanessa Clemente Rosenvald, pela amizade e incentivo.

- Ao acadêmico de medicina Felipe Batista Lima Barbosa e ao Dr. Luiz Fernando

Veloso, pela ajuda na confecção dos gráficos desse trabalho.

- A minha prima Cláudia Márcia Costa Mangualde, pela grande, longa e sincera

amizade.

- A toda minha família, tias, tios, primas e primos, pelo carinho e atenção.

RESUMO

Introdução: Nos últimos anos, o transplante hepático (TH) tornou-se importante

opção terapêutica para os pacientes com doenças hepáticas relacionadas ao vírus

da hepatite B (VHB). No entanto, a infecção pelo VHB pode recorrer após o TH e

medidas de profilaxia são necessárias para se evitar tal recorrência. Os objetivos

desse estudo foram investigar o papel do carcinoma hepatocelular (CHC) na

recorrência da infecção pelo VHB após o TH e a ocorrência de replicação viral B em

células do CHC e em células hepáticas não tumorais, pela quantificação do cccDNA

(covalently closed circular DNA) e do DNA total do vírus da hepatite B no fígado

explantado de pacientes AgHBs-positivo com diagnóstico de CHC submetidos a TH.

Métodos: Foram incluídos no estudo, de forma retrospectiva, 113 pacientes AgHBs-

positivo submetidos a TH. Todos receberam globulinas hiperimune anti-HBs (HBIG)

após o transplante e 56 receberam também lamivudina e/ou adefovir. O tempo

mediano de seguimento pós-TH foi de 53 meses (0.25 a 125 meses). 33 pacientes

(29.2%) tiveram o diagnóstico de CHC confirmado pelo exame histopatológico do

fígado nativo. O DNA total do VHB e o cccDNA foram quantificados em células

tumorais e não-tumorais do fígado nativo de 16 desses pacientes por técnica de

reação de polimerase em cadeia em tempo real. O cccDNA foi quantificado em

células do CHC em três pacientes que apresentaram recorrências do VHB e do

CHC. Resultados: Quatorze pacientes (12.4%) apresentaram recorrência da

infecção viral B após o TH. Os fatores de risco independentes para a infecção viral B

recorrente foram o CHC, níveis séricos de DNA viral ≥ 30.000 cópias/mL no

momento do transplante, e a monoprofilaxia com HBIG (vs. profilaxia combinada

pós-transplante). CccDNA foi detectado em células do CHC em 11 pacientes e em

células não tumorais de 12 de 16 pacientes, no fígado explantado. O cccDNA foi

também detectado em células do CHC recidivado em dois dos três pacientes

testados que apresentaram recorrências viral B e do CHC. Conclusões: CHC, carga

viral no momento do transplante e monoprofilaxia com HBIG foram os fatores de

risco independentes para a recorrência viral B após o TH. A recorrência do CHC e

da hepatite B em sete pacientes e a detecção do cccDNA e do DNA total do VHB em

células do CHC são fortemente sugestivas da ocorrência de replicação viral B nas

células tumorais. Esses fatos, provavelmente, estão implicados na recorrência da

hepatite B após o TH e novos estudos são necessários para se investigar essa

associação.

ABSTRACT

Background and aims: In the last years, ortothopic liver transplantation (OLT) has

become an important modality of treatment for hepatitis B virus (HBV)-related liver

disease patients. However, HBV infection may recur in the transplanted liver and

prophylactic measures are necessary to avoid this recurrence. The aims of this study

were to investigate the role of hepatocellular carcinoma (HCC) in HBV recurrence

after OLT and to assess HBV replication by cccDNA (covalently closed circular DNA)

and total HBV DNA quantification in HCC and non-tumor cells from the native liver of

HBsAg-positive transplanted patients. Methods: 113 HBsAg-positive transplanted

patients were retrospectively studied. All patients received hyperimmune anti-HBs

globulins (HBIG) after OLT and 56 also received lamivudine and/or adefovir. Median

follow-up was 53 months (range 0.25 to 125). 33 patients (29.2%) had HCC. Total

HBV DNA and cccDNA were quantified in HCC and in non-tumor cells from the

native liver of 16 patients by a real time polymerase chain reaction assay. CccDNA

was quantified in HCC cells in three patients who presented HBV and HCC

recurrences. Results: 14 patients (12.4%) presented HBV recurrence after OLT. The

independent risk factors for HBV recurrence were HCC, serum levels of hepatitis B

virus DNA ≥ 30,000 copies/mL at the time of OLT, and HBIG monoprophylaxis (vs

combined prophylaxis). CccDNA was detected in HCC cells from 11 patients and in

non-tumor cells from 12 out of 16 patients on the explanted liver. CccDNA was

detected in HCC metastatic cells after tumoral recurrence in two out of three tested

patients who presented HBV and HCC recurrences. Conclusions: HCC, hepatitis B

virus DNA viral load ≥ 30,000 copies/mL at the time of liver transplantation and HBIG

monoprophylaxis were independent risk factors for HBV recurrence after OLT. HBV

replication in HCC cells is strongly suggested by the concomitant recurrence of HCC

and HBV infection and by the detection of cccDNA and HBV DNA in tumor tissues.

These facts are probably implicated in HBV recurrence and other studies are

necessary to investigate this association.

LISTA DE ABREVIATURAS

AgHBc – antígeno do core do vírus da hepatite B

AgHBe – antígeno e do vírus da hepatite B

AgHBs – antígeno de superfície do vírus da hepatite B

Anticorpo anti-HBe – anticorpo anti-antígeno e do vírus da hepatite B

Anticorpo anti-HBs –anticorpo anti-antígeno de superfície do vírus da hepatite B

CccDNA – covalently closed circular DNA

CHC – carcinoma hepatocelular

DNA – ácido desoxirribonucléico

Gene P – gene que codifica a polimerase do vírus da hepatite B

Genes pré-C/C – genes que codificam os antígenos pré-core e do core do vírus

da hepatite B

Genes pré-S1, pré-S2 e S – genes que codificam os antígenos pré-superfície 1,

pré-superfície 2 e de superfície do vírus da hepatite B

Gene X – gene que codifica a proteína X do vírus da hepatite B

HBIG – globulina hiperimune anti-HBs

HBSP – hepatitis B spliced protein

IC 95% - intervalo de confiança a 95%

PCR – reação de polimerase em cadeia

rcDNA – relaxed circular DNA

RNA – ácido ribonucléico

RR – risco relativo

TGF-β - fator transformador de crescimento-β

TH – transplante hepático

VHB – vírus da hepatite B

VHC - vírus da hepatite C

VHD – vírus da hepatite delta

VIH - vírus da imunodeficiência humana

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Características dos 113 pacientes AgHBs-positivo submetidos a

transplante hepático...................................................................................................23

Tabela 2. Características histológicas e virológicas dos 16 pacientes AgHBs-positivo

submetidos a transplante hepático com diagnóstico de carcinoma hepatocelular, nos

quais o DNA total do VHB e o cccDNA foram quantificados em espécimes de tumor

e não-tumor do fígado nativo.....................................................................................25

.

Tabela 3. Risco atuarial de recorrência da infecção pelo VHB em pacientes AgHBs-

positivo submetidos a transplante hepático, em relação às variáveis

analisadas..................................................................................................................37

Tabela 4: Taxas de recorrência da infecção pelo vírus da hepatite B em pacientes

com e sem carcinoma hepatocelular associado no momento do transplante hepático

(TH) e com DNA do VHB no soro ≥ e < 30.000 cópias/mL no momento do TH, que

receberam monoprofilaxia (HBIG) ou profilaxia combinada (HBIG + lamivudina e/ou

adefovir)......................................................................................................................42

Tabela 5: Características clínicas e virológicas, momento da recidiva do CHC e da

recorrência da infecção viral B após o TH e resultados da quantificação do DNA total

do VHB e do cccDNA no tecido do CHC recidivado pós-TH, em sete pacientes que

apresentaram recidiva do VHB e do CHC..................................................................46

Tabela 6: Resultados da quantificação do DNA do VHB e do cccDNA em espécimes

de tumor e não-tumor do fígado explantado de 16 pacientes AgHBs-positivo com

carcinoma hepatocelular submetidos a transplante hepático.....................................55

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Exame histológico de tecido de congelação, corado por hematoxilina-

eosina, confirmando o diagnóstico de cirrose (fígado não-tumoral)...........................31

Figura 2: Exame histológico de tecido de congelação, corado por hematoxilina-

eosina, confirmando o diagnóstico de carcinoma hepatocelular................................32

Figura 3: Risco atuarial de recorrência da hepatite B em 33 pacientes AgHBs-

positivo com carcinoma hepatocelular (CHC) associado, submetidos a transplante

hepático (TH), e em 80 pacientes AgHBs-positivo sem CHC submetidos a TH (teste

log rank)......................................................................................................................38

Figura 4: Risco atuarial de recorrência da hepatite B pós-transplante hepático em 17

pacientes com DNA do vírus da hepatite B (VHB) no soro ≥ 30.000 cópias/mL e em

79 pacientes com DNA do VHB < 30.000 cópias/mL no momento do transplante

(teste log rank)............................................................................................................39

Figura 5: Risco atuarial de recorrência da hepatite B pós-transplante hepático (TH)

em 57 pacientes que receberam apenas imunoglobulina anti-HBs (HBIG) após o TH

(grupo monoprofilaxia) e em 56 pacientes que receberam lamivudina e/ou adefovir

associado(s) à HBIG (grupo profilaxia combinada) (teste log rank)...........................40

Figura 6: Organograma mostrando pacientes transplantados com carcinoma

hepatocelular (CHC), que apresentaram ou não recidiva tumoral e recorrência da

hepatite B após o transplante de fígado.................................................................... 44

Figura 7: Paciente submetido a transplante hepático (TH) devido aos diagnósticos de

cirrose viral B e carcinoma hepatocelular (CHC). Antes do transplante, a

quantificação do DNA do VHB no soro era de 4,76 x 105 e tornou-se negativa após o

tratamento com lamivudina. Após o TH, como profilaxia da recidiva viral B, ele

recebeu globulina hiperimune anti-hepatite B (HBIG) e lamivudina. Vinte e sete

meses após o TH, ocorreu recorrência da infecção pelo VHB. Nove meses mais

tarde, foi diagnosticada recidiva do CHC na glândula adrenal. Após ressecção da

metástase adrenal, o AgHBs no soro tornou-se negativo. Em seguida a uma nova

recidiva do CHC (mandibular), o AgHBs e o DNA do VHB no soro tornaram-se

positivos. O paciente evoluiu a óbito devido à recidiva do CHC seis anos após o

TH...............................................................................................................................47

Figura 8: Risco atuarial de recorrência da hepatite B após o transplante hepático

(TH) em 10 pacientes que apresentaram recidiva do carcinoma hepatocelular (CHC)

após o TH e em 23 pacientes que não apresentaram recidiva do CHC após o TH

(total de 33 pacientes AgHBs-positivo transplantados com CHC) ............................48


hepatocelular (CHC), que receberam quimioterapia, que apresentaram ou não

recidiva tumoral e recorrência da hepatite B após o transplante de fígado...............49

Figura 10: Sobrevida global dos 113 pacientes AgHBs-positivo transplantados no

período de dezembro de 1995 a dezembro de 2004.................................................51

Figura 11: (A) Níveis de cccDNA em células tumorais do carcinoma hepatocelular

(CHC) e em células hepáticas não-tumorais do fígado nativo em pacientes AgHBs-

positivo, submetidos a transplante hepático (TH). (B) Níveis de DNA total do VHB em

células tumorais do CHC e em células hepáticas não-tumorais do fígado nativo em

pacientes AgHBs-positivo, submetidos a TH. Cada ponto representa um paciente e

as barras indicam os valores da mediana. LID: limite inferior de detecção...............54

SUMÁRIO

1- INTRODUÇÃO.....................................................................................................1

2- ANTECEDENTES CIENTĺFICOS.........................................................................5

2.1- O vírus da hepatite B..................................................................................6

2.1.1- Genes e proteínas virais...............................................................7

2.1.2- O ciclo de replicação viral.............................................................8

2.1.3- O cccDNA.....................................................................................9

2.2- Mecanismos da carcinogênese hepática relacionada ao VHB................11

2.2.1- Inflamação crônica......................................................................12

2.2.2 Integração do DNA do VHB ao DNA celular................................13

2.2.3 Expressão dos genes X, pré-S2/S incompleta e da spliced protein

do VHB podem modular a proliferação e a viabilidade celulares.........14

2.3- Transplante hepático para doenças hepáticas relacionadas ao VHB......15

3- OBJETIVOS.......................................................................................................19

4- PACIENTES E MÉTODOS................................................................................21

4.1- Pacientes..................................................................................................22

4.2- Profilaxia da recidiva da hepatite B..........................................................26

4.3- Exames virológicos...................................................................................27

4.4- Definição de recidiva viral B.....................................................................28

4.5 Quantificação do cccDNA e do DNA total do VHB em espécimes de tecido

tumoral e não-tumoral do fígado nativo de pacientes transplantados por

CHC ................................................................................................................28

4.6 Análise estatística......................................................................................33

5- RESULTADOS..................................................................................................35

5.1-Tempo de seguimento e freqüência global de recorrência da infecção pelo

VHB..................................................................................................................36

5.2- Fatores preditivos de maior risco de recorrência da infecção pelo VHB..36

5.3- Evolução da reinfecção pelo VHB............................................................43

5.4- Reinfecção pelo VHB nos pacientes transplantados com CHC...............43

5.5- Sobrevida global.......................................................................................50

5.6- Níveis de cccDNA e de DNA total do VHB no CHC e no fígado não-

tumoral no fígado nativo..................................................................................52

5.7- Níveis de cccDNA e de DNA total do VHB no tecido tumoral após a

recorrência do CHC.........................................................................................53

6- DISCUSSÃO.....................................................................................................56

7- CONCLUSÕES.................................................................................................65

8- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................66

ANEXOS

Anexo 1 - Autorização do Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de

Minas Gerais (COEP)

Anexo 2 - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

1

1 – Introdução

2

1 - Introdução

A infecção pelo vírus da hepatite B (VHB) é importante causa de hepatite

crônica, cirrose hepática e carcinoma hepatocelular (CHC) em todo o mundo

(1). Na Europa e nos Estados Unidos, 4% a 9% dos pacientes submetidos a

transplante hepático (TH) apresentam doença hepática relacionada ao VHB (2,

3). A sobrevida pós-TH a longo prazo depende da prevenção da reinfecção do

enxerto pelo VHB. Na ausência de medidas profiláticas, o risco de recidiva da

infecção viral pode chegar a 80% (4, 5). A infecção recorrente pode levar à

disfunção do enxerto, à necessidade de retransplante e ao óbito (4, 5).

Ao longo dos últimos anos, muito se avançou no tratamento dos

pacientes com hepatite B, submetidos ao TH. Inicialmente, o uso por longo

prazo da globulina hiperimune anti-HBs (HBIG) após o TH permitiu a redução

das taxas globais de recorrência da infecção viral B a 20%-36% (6-8).

Entretanto, as taxas de reinfecção permaneceram elevadas nos pacientes de

maior risco, ou seja, aqueles com cirrose viral B com DNA do VHB detectável

no soro por técnica de hibridização (6, 9, 10). Alguns anos mais tarde, com a

disponibilidade de agentes antivirais eficazes como lamivudina e adefovir

dipivoxil, o uso de profilaxia combinada desses agentes com a HBIG

proporcionou melhora significativa dos resultados, mesmo nos grupos de alto

risco, com redução das taxas de reinfecção a aproximadamente 10% (9, 11-

14).

A infecção crônica pelo VHB é um dos mais importantes fatores de risco

para o CHC (15, 16). Diversos mecanismos parecem estar envolvidos na

3

patogênese do câncer na infecção pelo VHB (17). Um fator importante é a

inflamação crônica associada à necrose hepatocelular, aos efeitos das

citocinas e o desenvolvimento de fibrose (18). A integração do DNA do VHB ao

genoma da célula hospedeira pode alterar ou promover a expressão de genes

que são importantes no crescimento e diferenciação celulares (19).

Demonstrou-se que proteínas expressas por esses genes integrados

apresentam atividades intracelulares que poderiam contribuir para o efeito

carcinogênico do VHB (17). Dados recentes têm demonstrado que a carga viral

é um importante fator preditivo do risco de desenvolvimento de CHC,

independentemente da positividade do antígeno e do vírus da hepatite B

(AgHBe), dos níveis de alanina aminotransferase e da presença de cirrose

hepática (20-22), embora seja comumente aceito que os níveis de DNA do

VHB no soro sejam menores nos pacientes com CHC. Em estudos prévios,

utilizando-se métodos menos sensíveis do que as técnicas de reação de

polimerase em cadeia (PCR) atualmente disponíveis, a ocorrência de

replicação viral em células tumorais do CHC permaneceu uma questão

controversa (23, 24).

Em torno de 30% dos pacientes com cirrose viral B submetidos ao TH

apresentam CHC associado. Diversos estudos não observaram associação

entre a presença do CHC no momento do TH e maior risco de recorrência da

infecção pelo VHB pós-TH (9, 25-28). Apenas um estudo mostrou maior risco

de recorrência da hepatite B em pacientes transplantados com CHC (29).

O cccDNA (covalently closed circular DNA) é uma forma replicativa do

DNA do VHB, que acredita-se ser responsável pela manutenção da infecção

crônica pelo VHB. Durante a infecção pelo VHB, o cccDNA acumula-se no

4

núcleo da célula, onde persiste como epissoma estável, e funciona como

“molde” para a transcrição dos genes virais (30, 31). Pouco se conhece sobre a

presença da forma epissomal do DNA do VHB nas células tumorais do CHC e

sua relação com as células do tecido não-tumoral adjacente. Entretanto,

estudos recentes mostraram a presença do DNA do VHB e do cccDNA em

células de CHC (32-34), sugerindo a possibilidade de replicação viral no tecido

neoplásico.

O presente estudo foi realizado objetivando-se responder a lacunas

existentes no conhecimento atual sobre a relação entre o CHC e o risco de

recorrência da hepatite viral B pós-TH e sobre a possibilidade de ocorrência de

replicação do VHB nas células do CHC.

5

2 – Antecedentes científicos

6

2 – Antecedentes científicos

Em todo o mundo, mais de 350 milhões de pessoas estão infectadas

pelo VHB. A infecção crônica pelo VHB é importante causa de hepatite crônica,

cirrose hepática e CHC e é responsável por cerca de um milhão de óbitos

anualmente (1). O Brasil é considerado um país de endemicidade intermediária

(prevalência entre 2% e 7%), exceto na Bacia Amazônica Ocidental, onde a

infecção pelo VHB apresenta alta endemicidade (prevalência maior ou igual a

8%) (36). O CHC é uma das mais freqüentes neoplasias malignas em todo o

mundo (37, 38). A infecção crônica pelo VHB é um dos principais fatores de

risco para o desenvolvimento do CHC (15, 16, 39). Esse risco é atribuído à

presença de cirrose que por si só é um estado pré-neoplásico e também ao

próprio VHB. Sabe-se que os pacientes portadores crônicos do VHB podem

desenvolver CHC mesmo na ausência de cirrose (39, 40).

A infecção crônica pelo VHB é causa comum de doença hepática

avançada, incluindo cirrose hepática descompensada. O prognóstico desta é

ruim: a sobrevida em cinco anos, que varia entre 80% e 86% nos pacientes

com cirrose hepática compensada, reduz para 14% a 28% naqueles com

doença descompensada (40). Muitos pacientes com cirrose hepática causada

pelo VHB tornam-se potenciais candidatos ao TH.

2.1 O vírus da hepatite B

O VHB pertence à família Hepadnaviridae, que inclui outros vírus DNA

hepatotrópicos com características semelhantes. O vírion completo é uma

7

esfera de 42 nm de diâmetro, constituída por envelope lipoprotéico, que

envolve o core ou nucleocapsídeo, o qual contém o genoma viral (1).

2.1.1 Genes e proteínas virais

O genoma do VHB consiste em uma seqüência de DNA circular

parcialmente dupla, constituída por aproximadamente 3.200 pares de base. O

filamento longo de DNA contém toda a informação genética do vírus e liga-se

covalentemente, pela sua extremidade 5’, à polimerase viral. O filamento curto

tem extremidade 5’ fixa, mas extremidade 3’ variável, à qual se liga seqüência

de oligorribonucletídeos. Os dois filamentos se organizam em uma estrutura

circular, não fechada covalentemente, conhecida como relaxed circular DNA

(rcDNA). O DNA do VHB apresenta organização complexa, com quatro janelas

de leitura, que se sobrepõem parcialmente: genes pré-S/S, pré-C/C, gene P e

gene X (1).

As proteínas do envelope viral são codificadas pela região pré-S/S (pré-

superfície – superfície) do genoma viral (genes pré-S1, pré-S2 e S), que

codifica três diferentes antígenos de superfície, de acordo com a região onde

se inicia a transcrição. A proteína mais abundante é a proteína S, que é

conhecida como antígeno HBs (AgHBs). O início da transcrição na região pré-

S2 gera a proteína M (média). A proteína L (large = grande) é gerada pelo

início da transcrição na região pré-S1 e desempenha, provavelmente, papel na

ligação do vírus a receptores da célula hospedeira e sua entrada na mesma e,

ainda, na formação do vírion e sua liberação pela célula (41 – 43). Além dos

vírions, as células infectadas pelo VHB produzem duas partículas lipoprotéicas

8

distintas: esferas e filamentos de 20nm de diâmetro. Essas partículas contêm

proteínas do envelope e lipídeos derivados da célula hospedeira e, em geral,

superam quantitativamente os vírions em 1.000:1 a 10.000:1.

As regiões pré-C/C (pré-core – core) do genoma do VHB codificam o

antígeno do core (AgHBc) e o antígeno e do VHB (AgHBe). O AgHBc é o

polipeptídeo estrutural do capsídeo viral (1).

O gene longo P codifica a DNA polimerase, enzima que também

apresenta função de transcriptase reversa, uma vez que a replicação viral

requer intermediário RNA. O gene X codifica a proteína viral X (HBx), que

modula transmissão de sinal na célula hospedeira e é necessária à replicação

viral (44).

2.1.2 O ciclo de replicação viral

A principal característica da replicação do VHB é a replicação do DNA

por transcrição reversa a partir de RNA intermediário (45). O vírion maduro ou

partícula de Dane entra na célula após ligação a um receptor de superfície.

Após a fusão de membranas, o core é liberado no citoplasma da célula e

transportado até o núcleo. No núcleo, o DNA, que se encontra na forma circular

aberta, “relaxed circular” (rcDNA), é convertido à forma circular fechada,

“covalently closed circular” DNA (cccDNA) (30). A partir do cccDNA, RNAs

virais são sintetizados pela enzima RNA polimerase, sendo, então,

transportados até o citoplasma, onde a sua tradução produz as proteínas virais.

Formam-se capsídeos no citoplasma e, durante esse processo, uma única

molécula de RNA pré-genômico é incorporada ao interior do capsídeo (46). Em

9

seguida, ocorre a transcrição reversa do RNA viral, pela ação da polimerase

viral. A síntese dos dois filamentos do DNA é seqüencial: o primeiro a partir do

RNA e, o segundo, a partir do filamento de DNA recém-sintetizado (45, 47).

Alguns nucleocapsídeos retornam ao núcleo, onde o DNA pode ser convertido

à forma cccDNA, para manter estável o pool intra-nuclear deste (30). A maioria

dos capsídeos, entretanto, migram para o retículo endoplasmático, onde

adquirem o envelope viral e transformam-se em vírions completos, podendo ser

exportados para o exterior da célula.

2.1.3 O cccDNA

Acredita-se que a infecção crônica pelo VHB seja mantida pelo cccDNA.

A formação do cccDNA ocorre após o transporte do nucleocapsídeo e a

entrada do DNA na forma rcDNA no núcleo do hepatócito. Em seguida, a

polimerase é removida do filamento negativo, o segmento de

oligorribonucleotídeos é removido do filamento positivo, o DNA do filamento

positivo é completado e as duas extremidades do DNA são covalentemente

ligadas (48). Durante a infecção pelo VHB, o cccDNA acumula-se no núcleo da

célula, onde persiste como epissoma estável e serve como modelo para a

transcrição dos genes virais, o que dará origem aos RNAs pré-genômico (a

partir do qual ocorre a transcrição reversa) e subgenômicos, necessários à

síntese das proteínas virais (48). Considerando-se a longa meia vida dos

hepatócitos, o fator limitante à eliminação da infecção é o clareamento dos

reservatórios de cccDNA das células infectadas (49).

10

Apesar do papel crucial do cccDNA na persistência da infecção pelo

VHB e da importância do conhecimento dos mecanismos de seu clareamento,

a maior parte do conhecimento atual sobre o cccDNA foi obtida utilizando-se

modelos animais, existindo poucos estudos em seres humanos. Obstáculos

históricos ao estudo do cccDNA foram a necessidade de realização de biópsias

hepáticas e a falta de métodos quantitativos sensíveis e específicos para a sua

detecção (50). Apesar dessas limitações, alguns estudos foram realizados em

fígados de pacientes cronicamente infectados pelo VHB e permitiram a

detecção tanto da presença do cccDNA em tecido hepático, utilizando-se

técnica de Southern Blot (51), como de sua persistência apesar do tratamento

antiviral com interferon, utilizando-se técnica de hibridização molecular (52).

Com o desenvolvimento de tecnologia de PCR, algumas equipes

tentaram desenvolver metodologias para amplificar e quantificar

especificamente o cccDNA viral, escolhendo pares de primers que

amplificassem preferencialmente a forma ccc e não amplificasse as outras

formas, ou o fizesse em pequenas proporções (53, 54) Mais recentemente,

Werle-Lapostolle e colaboradores (35) relataram o desenvolvimento de nova

técnica de PCR em tempo real, que possibilitou a quantificação do cccDNA em

biópsias hepáticas de pacientes com infecção crônica pelo VHB. A

especificidade desse método baseia-se em dois passos principais: (i)

tratamento com DNase ATP-dependente para digerir os intermediários

replicativos não cccDNA; e (ii) utilização de primers localizados em ambos os

lados do intervalo das formas rcDNA, para amplificar preferencialmente a forma

cccDNA.

11

Na literatura, existem poucas informações sobre a presença do cccDNA

em células tumorais do CHC e poucos dados quantitativos sobre os níveis de

DNA do VHB em tecidos tumoral e não-tumoral.

Estudos que utilizaram métodos menos sensíveis do que os atualmente

disponíveis, mostraram resultados controversos quanto à possibilidade de

ocorrência de replicação viral em células neoplásicas do CHC (23, 24).

Raimondo e colaboradores realizaram estudo, utilizando técnica de

hibridização molecular, e detectaram apenas DNA do VHB integrado nos

tecidos de CHC, sugerindo que as células tumorais não mais permitiriam a

replicação viral (23). Loncarevic e colaboradores realizaram outro estudo,

utilizando técnica de Southern blot, e detectaram intermediários replicativos

indicando a ocorrência de replicação viral B em células do CHC em amostra de

um dentre oito pacientes estudados (24).

Estudo recente mostrou a presença de cccDNA em níveis

significativamente mais elevados em tecidos tumorais do que em tecidos não-

tumorais adjacentes em pacientes com CHC (34). No entanto, nesse estudo, foi

utilizada a tecnologia Invader®, cuja especificidade permanece questionável

(50). Pollicino e colaboradores (33) também detectaram a presença de cccDNA

em células de CHC, utilizando técnica de nested PCR.

2.2 Mecanismos da carcinogênese hepática relacionad a ao VHB

A patogênese do câncer na infecção pelo VHB foi amplamente

estudada, e, múltiplos fatores parecem estar envolvidos. Um importante fator é

a inflamação crônica e o efeito de citocinas sobre a proliferação de células

12

hepáticas e sobre a fibrose. A integração de segmentos do DNA do VHB ao

genoma da célula hospedeira também tem papel significativo e pode levar a

alterações na expressão de genes celulares que são importantes para o

crescimento e a diferenciação das células. Além disso, a expressão de

proteínas do VHB pode ter efeitos diretos em funções celulares e alguns

produtos desses genes poderiam favorecer a transformação maligna. Alguns

genes do VHB foram encontrados em tecido hepático de pacientes infectados

em maior freqüência do que outros, incluindo-se o pré-S2/S incompleto, o gene

X, e o gene que codifica uma proteína recentemente descoberta, hepatitis B

spliced protein (HBSP). As proteínas expressas a partir desses genes

integrados apresentam atividades intracelulares que poderiam contribuir para a

associação entre VHB e CHC, incluindo efeitos no crescimento celular e

apoptose (17).

2.2.1 Inflamação crônica

Um importante fator é a inflamação crônica e os efeitos de citocinas no

desenvolvimento de fibrose e na proliferação de células hepáticas. A hepatite

crônica ativa é reconhecida como fator de risco significativo para o

desenvolvimento do CHC. Os mecanismos envolvidos incluem necrose de

células hepáticas, inflamação, síntese de citocinas e fibrose (18). Ciclos de

morte celular, regeneração e reparo resultam em contexto de elevado turnover

celular, o que propiciaria o surgimento de clones de células com atividade da

telomerase reativada, que se tornariam imortalizadas. Essas células seriam

13

então susceptíveis ao desenvolvimento de alterações genéticas adicionais que

poderiam levar ao desenvolvimento de fenótipo maligno (19).

2.2.2 Integração do DNA do VHB ao genoma da célula hospedeira

O papel da integração do DNA do VHB ao DNA da célula hospedeira no

desenvolvimento do CHC ainda não foi completamente compreendido. Alguns

estudos mostraram que a integração de segmentos do DNA do VHB está

presente em 85% - 90% dos casos de CHC relacionados ao VHB (55 - 57). A

ocorrência de CHC em crianças e adultos jovens sem cirrose e cronicamente

infectados pelo VHB é um argumento a favor de um papel específico da

integração do DNA do VHB na carcinogênese hepática (58, 59). A presença de

seqüências do genoma do VHB integradas ao DNA celular pode ser

encontrada em tecido não-tumoral de pacientes com hepatite crônica (60, 61).

Observações prévias, baseadas em método de Southern blot, e recentemente

confirmadas por técnicas de PCR, mostraram que a integração do DNA viral

em células do hospedeiro pode ocorrer em fases precoces da infecção (62, 63).

A integração, portanto, precede o desenvolvimento do CHC e suas

conseqüências funcionais devem ser consideradas um processo dinâmico. A

inflamação crônica prolongada, associada à proliferação celular, induz

rearranjos das seqüências virais integradas. Deleções de parte do genoma

viral, assim como rearranjos mais complexos, são freqüentemente observados

(19, 64). A integração do DNA do VHB pode induzir deleções cromossômicas

no genoma da célula hospedeira nos sítios de integração e, mesmo,

transposições de um cromossoma a outro de seqüências virais, acompanhadas

14

de segmentos de DNA celular adjacentes (18, 64, 65). Portanto, o VHB

integrado ao genoma do hospedeiro pode gerar instabilidade cromossômica. A

integração do DNA do VHB em genes envolvidos na sinalização celular é

evento freqüente. Provavelmente, a integração do DNA do VHB em

determinados genes poderia conferir vantagens de proliferação levando à

seleção de clones celulares. O acúmulo contínuo, ao longo dos anos, dessas

alterações, levaria à progressão e à proliferação tumoral (66).

2.2.3 Expressão dos genes X, pré-S2/S incompleto e da spliced protein

do VHB podem modular a proliferação e a viabilidade celulares

O exame de seqüências do DNA viral presentes em células tumorais

mostrou, em grande proporção dos casos, presença de seqüências que

codificam as proteínas virais HBx, do envelope pré-S2/S incompleta, bem como

o gene que codifica a proteína HBSP (hepatitis B spliced protein) (17, 67).

Na maioria das seqüências de DNA do VHB integradas, o gene HBx é

mantido e transcrito. A proteína HBx tem 154 aminoácidos, é expressa em

baixos níveis durante as hepatites aguda e crônica e desempenha diversas

funções relacionadas à proliferação e à viabilidade celulares (17). Seqüências

de HBx foram identificadas em células tumorais de CHC que apresentam

deleção do segmento de DNA que codifica a porção COOH-terminal da

proteína X. Essa alteração poderia levar à perda de efeitos inibitórios na

proliferação e transformação celulares (68). A seleção dessas seqüências de

HBx em células hepáticas em expansão clonal poderiam favorecer a

proliferação celular e a transformação maligna.

15

Achados in vitro sugerem que a proteína HBSP (hepatitis B spliced

protein) possa induzir apoptose e modular a via de sinalização dependente do

fator transformador de crescimento-β (TGF-β) (17, 18, 67).

Em conclusão, as evidências atualmente disponíveis mostram que o

VHB pode alterar a proliferação, a diferenciação e a viabilidade das células

hepáticas, seja pela síntese de algumas de suas próprias proteínas (HBx, Pré-

S2/S HBSP), ou pela indução de alterações genéticas na célula hospedeira. A

combinação desses eventos e de outros, ainda não conhecidos, estaria

provavelmente envolvida na patogênese do CHC.

2.3 Transplante hepático para doenças hepáticas rel acionadas ao

VHB

Nos últimos anos, o TH tornou-se importante opção terapêutica para os

pacientes com cirrose hepática descompensada, hepatite fulminante e CHC

causados pela infecção pelo VHB. No entanto, durante alguns anos, as

doenças hepáticas causadas pelo VHB foram consideradas má indicação e até

mesmo contra-indicação ao TH, devido às elevadas taxas de reinfecção do

enxerto hepático pelo VHB. Na ausência de medidas de profilaxia, o risco de

reinfecção pelo VHB após o TH é de aproximadamente 80% e pode levar a

insuficiência hepática, necessidade de retransplante e óbito (4, 5). No passado,

a recidiva viral B pós-transplante era a principal causa de redução de sobrevida

do enxerto e de pacientes a mais de dois meses do TH (4, 5).

Atualmente, as doenças hepáticas associadas à infecção pelo VHB

16

correspondem a cerca de 4% a 9% das indicações de TH na Europa e nos

Estados Unidos (2, 3). A sobrevida a longo prazo depende da prevenção da

reinfecção do enxerto pelo VHB ou da redução da progressão do acometimento

do mesmo, naqueles pacientes que apresentaram recorrência da infecção.

Ao longo dos últimos 15 anos, avanços significativos foram alcançados

na prevenção da recorrência da infecção pelo VHB pós-transplante. O primeiro

grande avanço foi a utilização, por longo prazo, da globulina hiperimune anti-

HBs (HBIG) (6 - 8). Diversos estudos mostraram que, utilizando-se HBIG em

altas doses, por via intravenosa e por tempo prolongado, as taxas de

recorrência da infecção puderam ser reduzidas a 20%-36% (6, 7). No entanto,

mesmo utilizando-se essa profilaxia, as taxas de recorrência da hepatite B

permaneceram elevadas (em torno de 80%) no grupo de pacientes com maior

risco, ou seja, aqueles com cirrose viral B e replicação viral elevada antes do

transplante, definida pela detecção do DNA do VHB no soro, por técnicas de

hibridização molecular (6). A administração de HBIG é relativamente bem

tolerada e os efeitos colaterais são pouco comuns; mas, a necessidade de

monitorização freqüente dos níveis séricos dos anticorpos anti-HBs e de

administrações a cada um ou dois meses, de acordo com esses níveis, são

alguns dos seus inconvenientes. Um fator limitante à sua utilização em altas

doses é o custo elevado, principalmente em países com menores recursos

financeiros.

O segundo importante avanço no manejo de pacientes transplantados

por doenças hepáticas relacionadas ao VHB foi a disponibilidade de agentes

antivirais contra o VHB, eficazes e bem tolerados, como a lamivudina e o

adefovir dipivoxil. A utilização desses medicamentos permitiu melhora das

17

condições clínicas de pacientes com cirrose hepática descompensada em lista

de espera de TH (69 - 71) e também possibilitou o tratamento de pacientes

submetidos a transplante com recorrência da infecção pelo VHB (71, 72).

Finalmente, a utilização, por longo prazo, de HBIG em combinação com

lamivudina e/ou adefovir, iniciados antes do TH nos pacientes com replicação

viral e mantidos indefinidamente pós-TH, possibilitou a redução do risco de

reinfecção para cerca de 10%, mesmo nos pacientes com maior risco (9, 11 -

13).

Os fatores de risco para a reinfecção pelo VHB pós-transplante nos

pacientes que recebiam apenas HBIG são bem conhecidos. Pacientes com

cirrose viral B e replicação viral antes do transplante, definida pela presença do

DNA do VHB no soro, detectada por técnicas de hibridização, eram

considerados de elevado risco (6, 7, 9). Os pacientes cirróticos com infecção

pelo vírus da hepatite delta (VHD) e aqueles com hepatite fulminante

apresentam menor risco (6, 8). Mais recentemente, Marzanno e colaboradores

avaliaram um grupo de pacientes transplantados por cirrose viral B que

receberam monoprofilaxia com HBIG ou profilaxia combinada (HBIG +

lamivudina) e observaram que o único fator de risco independente para a

recidiva viral B pós-TH foram os níveis de DNA do VHB no soro acima de

100.000 cópias/mL no momento do TH (27).

Entre os pacientes transplantados por hepatite B, cerca de 20 a 30% têm

diagnóstico de CHC associado. O efeito do CHC sobre o risco de reinfecção do

enxerto pelo VHB é pouco conhecido. Diversos estudos não observaram

associação entre a presença do CHC no momento do TH e maior risco de

recorrência da infecção pelo VHB pós-TH (9, 25-28). Apenas um estudo

18

mostrou maior risco de recorrência da hepatite B em pacientes transplantados

com CHC (29).

19

3 – Objetivos

20

3 - Objetivos

Constituiram-se objetivos específicos do presente estudo:

• Investigar os fatores de risco para a recidiva viral B pós-transplante em

pacientes submetidos a transplante hepático por doenças hepáticas

relacionadas ao vírus da hepatite B e, especificamente, se o carcinoma

hepatocelular é fator de risco para a recidiva viral B pós-transplante.

• Detectar e quantificar o cccDNA e o DNA total do VHB em amostras de

tecido tumoral e não-tumoral provenientes do fígado nativo de pacientes

com infecção crônica pelo VHB e diagnóstico de carcinoma

hepatocelular, submetidos a transplante hepático.

• Detectar e quantificar o cccDNA e o DNA total do VHB em amostras de

tecido tumoral de pacientes que apresentaram recidiva do carcinoma

hepatocelular e da infecção pelo VHB após o transplante hepático.

21

4 - Pacientes e Métodos

22

4 - Pacientes e Métodos

4.1 Pacientes

Durante o período de dezembro de 1995 a dezembro de 2004, 113

pacientes AgHBs-positivo foram submetidos a TH no Centro Hépato-Biliar,

Hospital Paul Brousse, Villejuif, França. Oitenta e nove pacientes eram do sexo

masculino e a idade mediana foi de 49 (10 – 71) anos. Setenta e três dos 113

pacientes (64,6%) tinham o diagnóstico de cirrose viral B, 26 pacientes (23%)

apresentavam cirrose viral B e delta, 10 pacientes (8,8%) foram transplantados

por hepatite fulminante causada pelo VHB, dois (1,8%), por hepatite fulminante

causada pelos vírus B e delta e dois outros (1,8%), por CHC em fígado não-

cirrótico. Dezessete dos 113 pacientes (15%) apresentavam coinfecção pelo

vírus da hepatite C (VHC) e seis pacientes (5,3%) apresentavam coinfecção

pelo vírus da imunodeficiência humana (VIH). Trinta e três dos 113 pacientes

(29,2%) tinham o diagnóstico de CHC antes do TH, confirmado pelo exame

histológico do fígado nativo. Esses dados estão resumidos na Tabela 1.

Dezesseis dentre os 33 pacientes que apresentavam CHC no momento

do TH estavam fora dos critérios de Milão (73) pela análise do fígado

explantado.

23

Tabela 1: Características dos 113 pacientes AgHBs-positivo submetidos a

transplante hepático

Doença hepática

Característica

C-VHB

(n = 73)

C-VHD

(n = 26)

HFB

(n = 10)

HFD

(n = 2)

CHC em fígado não-

cirrótico

(n = 2)

Total

(n = 113)

Sexo masculino 66 18 2 2 1 89

Mediana da idade ao TH

51 41 38 31 33 49

DNA VHB ≥ 30.000 cópias/mL

(no momento do TH)

14

(ND-8 pts)

0

(ND-1 pt)

3

(ND-7 pts)

0

(ND-1 pt) 0

17

(ND- 17 pts)

Profilaxia antiviral: HBIG + LAM, ADV

ou tenofovir 45 6 4 0 1 56

Coinfecção VHC 10 7 0 0 0 17

Coinfecção VIH 4 2 0 0 0 6

CHC no momento do TH

25 6 0 0 2 33

Quimioterapia após o TH

11 2 0 0 2 15

Abreviações: AgHBs: antígeno de superfície do vírus da hepatite B; C-VHB: cirrose hepática pelo vírus da hepatite B; C-VHD: cirrose hepática pelos vírus da hepatite B e delta; HFB: hepatite fulminante pelo vírus B; HFD: hepatite fulminante pelo vírus delta; TH: transplante hepático; ND: não disponível; HBIG: globulina hiperimune anti-HBs; LAM: lamivudina; ADV: adefovir; VHC: vírus da hepatite C; VIH: vírus da imunodeficiência humana; CHC: carcinoma hepatocelular.

24

A terapia imunossupressora consistiu em combinação de

corticosteróides, azatioprina e ciclosporina (11 pacientes), corticosteróides,

azatioprina e tacrolimus (25 pacientes), corticosteróides e tacrolimus (34

pacientes), corticosteróides e ciclosporina (27 pacientes), tacrolimus,

corticosteróides e micofenolato mofetil (16 pacientes).

Quimioterapia anti-tumoral adjuvante pós-TH foi administrada, por via

sistêmica, nos primeiros seis meses após o TH de acordo com os achados

histopatológicos ao exame do fígado explantado. Os critérios utilizados se

fundamentaram no tamanho do tumor, na presença de invasão vascular e de

neoplasia multifocal.

Espécimes de tecido tumoral e não-tumoral do fígado nativo de 16

pacientes com o diagnóstico de CHC, armazenadas a -80°C, foram utilizadas

para o estudo quantitativo do cccDNA e do DNA total do VHB. As

características desses 16 pacientes são mostradas na Tabela 2.

25

Tabela 2. Características histológicas e virológicas dos 16 pacientes AgHBs-

positivo submetidos a transplante hepático com diagnóstico de carcinoma

hepatocelular, nos quais o DNA total do VHB e o cccDNA foram quantificados

em espécimes de tumor e não-tumor do fígado nativo

Paciente

Histologia (fígado

não tumoral)

AgHBe

Terapia antiviral antes do

TH

Níveis séricos do DNA VHB

antes da terapia antiviral

(cópias/mL)

Níveis séricos do DNA VHB

no momento do TH

(cópias/mL)

Coinfecções com outros

vírus

1 Cirrose Neg

0 VHD

2 Cirrose Neg LAM+ADV 5.78 x 108 6.07 x 103

3 Cirrose Neg ADV − 0 VHC, VHD

4 Cirrose Neg 0

5 Cirrose Pos 0 VHC

6 HCA Neg LAM 2.69 x 103 1.96 x 103

7 Cirrose Neg 0

8 Cirrose − 0 VHD

9 Cirrose Neg LAM 2.65 x 104 6.37 x 103

10 Cirrose Neg 0

11 Cirrose Neg 1.42 x 105

12 Cirrose Neg 0 VHD

13 Cirrose − LAM − 0

14 Normal − 2.7 x 104

15 Cirrose − LAM + Tenofovir − 0 VIH

16 Cirrose Pos LAM+ADV 1.47 x 109 6.3 x 105

Abreviações: AgHBs: antígeno de superfície do vírus da hepatite B; cccDNA: covalently closed circular DNA; AgHBe: antígeno e do vírus da hepatite B; TH: transplante hepático; HCA: hepatite crônica ativa; Neg: negativo; Pos: positivo; − : não disponível; LAM: lamivudina; ADV: adefovir; VHD: vírus da hepatite delta; VHC: vírus da hepatite C; VIH: vírus da imunodeficiência humana.

26

Esse estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética local (França), pelo

Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de Minas Gerais

(COEP) (ANEXO 1) e Comitê Nacional de Ética em Pesquisa (CONEP, Brasil)

e todos os indivíduos assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

para participar da investigação (ANEXO 2).

4.2 Profilaxia da recidiva da hepatite B

Todos os 113 pacientes receberam HBIG por via intravenosa. Durante a

fase anhepática, foram administradas 10.000 UI de HBIG (IVHEBEX LFB, Les

Ulis, França), seguidas por 10.000 UI por dia durante seis dias. Em seguida,

durante todo o período de seguimento, 10.000 UI de HBIG eram administradas

por via intravenosa sempre que os níveis circulantes de anticorpos anti-HBs

estivessem abaixo de 150 UI/L para os pacientes com níveis indetectáveis de

DNA do VHB no soro antes do transplante e abaixo de 500 UI/L para aqueles

com DNA do VHB positivo antes do TH. Como descrito abaixo, anticorpos anti-

HBs foram quantificados semanalmente após o TH. Os pacientes que

apresentavam DNA do VHB detectável no soro antes do TH também

receberam lamivudina 100 mg/dia (Zeffix, Glaxo Wellcome, Greenford, United

Kingdom) e/ou adefovir dipivoxil 10 mg/dia (Hepsera, Gilead Sciences, Inc.,

Foster City, CA, USA) antes e após o transplante.

Cinqüenta e sete (50,4%) pacientes não receberam lamivudina ou

adefovir dipivoxil profilaticamente após o transplante e a profilaxia da recidiva

viral foi feita apenas com HBIG indefinidamente após a cirurgia. Cinqüenta e

seis (49,6%) pacientes receberam profilaxia combinada de HBIG e um análogo

27

de nucleosídeo ou de nucleotídeo. Dentre esses 56 pacientes, lamivudina foi

iniciada antes do transplante em 50 (89,3%) pacientes e imediatamente após o

mesmo em seis (10,7%) indivíduos. Em oito (14,3%) desses 56 pacientes,

adefovir dipivoxil foi associado à lamivudina antes e após o TH, devido ao

desenvolvimento de mutações de resistência à lamivudina. Em outros dois

pacientes (3,6%), lamivudina foi substituída por adefovir pelo mesmo motivo.

Cinco pacientes com coinfecção pelo VIH receberam lamivudina e tenofovir

antes e após o TH. Após o TH, todos esses 56 pacientes receberam HBIG e a

terapia antiviral associada continuamente.

4.3 Exames virológicos

A pesquisa do AgHBs no soro (Diasorin, Sallugia, Itália) foi realizada

antes do TH e a cada três meses após o mesmo. As pesquisas do AgHBe e do

anticorpo anti-HBe (BioMérieux, Marcy l’Etoile, França) e dos anticorpos anti-

delta (Diasorin, Sallugia, Itália) foram realizadas antes do TH. Os níveis de

anticorpos anti-HBs (Dade Behring, Marburg, Alemanha) foram medidos

semanalmente após o TH, durante todo o seguimento.

O DNA do VHB foi pesquisado no soro a cada três a quatro meses antes

e depois do TH, pela técnica Digene Hybrid Capture System HBV DNA (Murex

Diagnostics, Chatillon França) entre janeiro de 1996 e agosto de 1997 e pelo

método de DNA ramificado (Quantiplex, Chiron, Emervylle, CA, USA) entre

setembro de 1997 e dezembro de 2000. Após janeiro de 2001, foi utilizada a

técnica de PCR Cobas HBV Monitor (Roche Diagnostics, Meylan, França).

28

A quantificação do DNA do VHB no momento do TH, por técnica de

PCR, foi realizada, retrospectivamente, em soro armazenado, nos pacientes

transplantados antes de 2001, utilizando-se o teste Cobas Taqman HBV

(Roche Diagnostics, França), que apresenta estrita correlação com a técnica

Cobas HBV Monitor (74). Entre os 113 pacientes deste estudo, a quantificação

do DNA do VHB por técnica de PCR no momento do TH foi realizada em 96

(85%) pacientes.

4.4 Definição de recidiva viral B

A recidiva viral B após o TH foi definida como o reaparecimento do

AgHBs no soro após o TH (6).

4.5 Quantificação do cccDNA e do DNA total do VHB e m espécimes

de tecido tumoral e não-tumoral do fígado nativo de pacientes

transplantados por CHC

Werlle-Lapostolle e colaboradores descreveram técnica de PCR em

tempo real (35) para a detecção específica e quantificação do cccDNA e do

DNA total do VHB em espécimes de biópsias hepáticas. Utilizando-se essa

técnica, foram analisados no presente estudo, espécimes de tecido tumoral e

não-tumoral provenientes do fígado nativo de 16 pacientes infectados pelo

VHB, que foram submetidos ao TH e que tiveram o diagnóstico de CHC,

confirmado por exame histopatológico. Amostras de tecido tumoral de CHC e

de tecido não-tumoral do fígado explantado de pacientes AgHBs-positivo

29

foram armazenadas a -80°C, até o momento da realizaçã o da análise

experimental. O diagnóstico foi confirmado por exame histológico de cada

amostra dos espécimes congelados, antes do início dos experimentos (Figuras

1 e 2). O DNA foi extraído de cada espécime utilizando-se o kit MasterPure

DNA purification (Epicentre, Madison, Wisconsin, USA). Antes da amplificação

do cccDNA, alíquotas do DNA foram tratadas com DNase ATP-dependente

(Epicentre, Madison, Wisconsin, USA). PCR em tempo real foi realizada em um

equipamento Light-Cycler (Roche, Grenoble, França) utilizando-se volume de

20 µL por reação, contendo 20 ng de DNA (para a quantificação do cccDNA,

volume equivalente a 20 ng antes do tratamento pela DNase), 3 mmol/L de

MgCl2, 0,5 µL de primers senso e anti-senso, 0,2 µL de sonda marcada com 3’-

fluoresceine (FL), e 0,4 µL de sonda marcada 5’Red640 (R640). Os primers

senso e anti-senso utilizados foram: 5’CTCCCCGTCTGTGCCTTCT-3’ (NCCC1

nt 1548-1566) e 5’GCCCCAAAGCCACCCAAG-3’ (CCCAS2 nt 1903-1886)

para amplificação do cccDNA, respectivamente, e 5’-

CTCGTGGTGGACTTCTCTC-3’ (2RC/CCS nt 256-274) e

5’CTGCAGGATGAAGAGGAA-3’ (2RC/CCAS nt 421-404) para amplificação

do DNA intra-hepático total do VHB, respectivamente. As sondas de

hibridização foram: 5’GTTCACGGTGGTCTCCATGCAACGT-FL-3’ e 5’-R640-

AGGTGAAGCGAAGTGCA- CACGGACC-p-3’ para quantificação do cccDNA e

5’CACTCACCAACCTCCTGTCCTC-CAA-FL-3’ e 5’- R640-

TGTCCTGGTTATCGCTGGATGTGTCT-3’ para quantificação do DNA intra-

hepático total do VHB, respectivamente. A amplificação do cccDNA foi

realizada como se segue: 95°C durante 10 minutos e, em seguida, 45 ciclos a

95°C por 10 segundos, 63°C por 10 segundos, e 72°C por 20 segundos. A

30

amplificação do DNA total do VHB foi realizada como se segue: 95°C durante

10 minutos e, em seguida, 45 ciclos de 95°C por 10 segund os, 57°C por 10

segundos, e 72°C por 15 segundos. O DNA na forma rc ( relaxed circular)

extraído do soro de pacientes com viremia sabidamente positiva pôde ser

amplificado por ambos os pares de primers; no entanto, os primers cccDNA

foram aproximadamente 100 vezes menos eficazes. O tratamento prévio do

DNA extraído do soro com DNase impediu a amplificação, confirmando que a

DNase degrada as formas rc do DNA do VHB. Água foi utilizada como controle

negativo. Diluições seriadas de um plasmídeo VHB (pHBVEcoRI) serviram

como padrões para a quantificação. O cccDNA e o DNA total do VHB foram

quantificados e normalizados a valores em cópias por célula, utilizando-se o

gene celular da β-globina. A amplificação da β-globina foi realizada utilizando-

se o kit LightCycler β-globin control (Roche), segundo as recomendações do

fabricante.

31

Figura 1: Exame histológico de tecido de congelação, corado por

hematoxilina-eosina, confirmando o diagnóstico de cirrose (fígado não-

tumoral)

32

Figura 2: Exame histológico de tecido de congelação, corado por

hematoxilina-eosina, confirmando o diagnóstico de carcinoma hepatocelular

33

4.6 Análise estatística

A análise estatística foi realizada utilizando-se o software estatístico SPSS

10.0 (SPSS Inc. and Microsoft Corp., Chicago, IL). As taxas de sobrevida e de

recorrência da infecção pelo VHB foram calculadas utilizando-se curvas de

sobrevida atuarial. A análise univariada para determinar os fatores preditivos de

recorrência da infecção pelo VHB foi feita utilizando-se o método de Kaplan-

Meier e o teste de log-rank. As variáveis analisadas foram: idade, sexo,

etiologia (cirrose relacionada ao VHB, cirrose relacionada ao VHD e hepatite

fulminante), coinfecção pelo VHC, AgHBe antes do TH, níveis de DNA do VHB

no soro no momento do TH, e profilaxia com análogos de nucleosídeos ou

nucleotídeos. Para a análise de variáveis categóricas, os pacientes foram

agrupados de acordo com a presença ou ausência de cada uma delas. Para a

análise dos níveis de DNA do VHB no soro no momento do TH, diversos

pontos de corte (10.000, 30.000, 50.000, 70.000 e 100.000 cópias/mL) foram

investigados e o menor valor estatisticamente significativo foi selecionado. A

análise multivariada foi realizada utilizando-se o modelo de regressão de Cox.

As variáveis para as quais os valores de P foram inferiores a 0,25 na análise

univariada foram incluídas no modelo de regressão de Cox para se identificar

os fatores preditivos independentes do risco de recorrência da infecção pelo

VHB após o TH. Valor de P inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente

significativo.

O teste do qui-quadrado ou o teste exato de Fisher foram utilizados para se

analisar as diferenças entre as freqüências de recorrência da infecção pelo

VHB em subgrupos de pacientes, quando apropriado.

34

Para a análise do DNA total do VHB e do cccDNA nas células tumorais e

não-tumorais, como as variáveis contínuas não apresentavam distribuição

Normal, foram utilizados os testes de Mann-Whitney ou de Wilcoxon, esse

último para a análise de amostras pareadas. As correlações entre variáveis

foram calculadas utilizando-se o coeficiente de correlação de Spearman.

35

5 - Resultados

36

5 - Resultados

5.1 Tempo de seguimento e freqüência global de reco rrência da

infecção pelo VHB

As características dos 113 pacientes estudados são mostradas na

Tabela 1. Após o TH, os pacientes foram acompanhados por período mediano

de 1.612 dias (53 meses), variando de sete a 3.804 dias (0,25 a 125 meses). O

AgHBs tornou-se positivo no soro em 14 (12,4%) pacientes, em um tempo

mediano de 15 meses (0,5 a 60 meses). No momento em que o AgHBs tornou-

se positivo, o DNA do VHB foi detectado no soro em 10 (71,4%) desses 14

pacientes (mediana: 6,21 x 106 cópias/mL; 929 a > 6,14 x 108 cópias/mL). As

taxas atuariais de recorrência do VHB em um, dois, cinco e oito anos foram

5,6%, 9,6%, 15,1% e 15,1% respectivamente (Tabela 3).

5.2 Fatores preditivos de maior risco de recorrênci a da infecção

pelo VHB

Na análise univariada, o diagnóstico de CHC, os níveis de DNA do VHB

no soro ≥ 30.000 cópias/mL no momento do TH e a monoprofilaxia com HBIG

(versus profilaxia combinada de HBIG com um análogo de nucleosídeo ou

nucleotídeo) foram as variáveis associadas a maior risco de recorrência da

infecção viral B pós-transplante (P < 0,0001, P = 0,0016 e P = 0,019; Figuras

3, 4 e 5, respectivamente; Tabela 3).

37

Tabela 3. Risco atuarial de recorrência da infecção pelo VHB em pacientes

AgHBs-positivo submetidos a transplante hepático, em relação às variáveis

analisadas

Taxas atuariais de recorrência do VHB após o TH Variável

Valor de P

AgHBs positivo

pós-TH (n) 1 ano 2 anos 5 anos 8 anos

Idade ≥ 50 years

0,06*

10/52

7,8%

11,9%

24%

24%

Sexo masculino

0,17*

3/89

7,1%

12,2%

16,6%

16,6%

C-VHB

0,078*

12/73

8,6%

13,3%

20,2%

20,2%

C-VHD

0,36*

2/26

0,0%

4,0%

8,8%

8,8%

HFB

0,21*

0/10

0,0%

0,0%

0,0%

0,0%

Coinfecção VHC

0,36*

1/17

0,0%

6,7%

6,7%

6,7%

CHC antes do TH

< 0,0001*

11/33

16,0%

26,7%

42,3%

42,3%

AgHBe positivo

0,73*

2/15

0,0%

7,1%

18,8%

18,8%

DNA VHB ≥ 30.000 cópias/mL no momento do

TH

0,0016*

6/17

24.7%

31,6%

48,7%

48,7%

Profilaxia antiviral (LAM,

ADV ou Tenofovir)

associada à HBIG

0,019* 3/56 1,8% 3,7% 6,4% 6,4%

Monoprofilaxia HBIG

0,019* 11/57 9,9% 16,3% 24,3% 24,3%

Global

14/113 5,6% 9,6% 15,1% 15,1%

*teste log-rank

Abreviações: AgHBs: antígeno de superfície do vírus da hepatite B; TH: transplante hepático; C-VHB:

cirrose hepática pelo vírus da hepatite B; C-VHD: cirrose hepática pelos vírus das hepatitis B e delta;

HFB: hepatite fulminante pelo vírus B; VHC: vírus da hepatite C; CHC: carcinoma hepatocelular; AgHBe:

antígeno e do vírus da hepatite B; LAM: lamivudina; ADV: adefovir HBIG: globulina hiperimune anti-HBs.

38

Figura 3: Risco atuarial de recorrência da hepatite B em 33 pacientes AgHBs-

positivo com carcinoma hepatocelular (CHC) associado, submetidos a

transplante hepático (TH), e em 80 pacientes AgHBs-positivo sem CHC

submetidos a TH (teste log rank).

39

Figura 4: Risco atuarial de recorrência da hepatite B pós-transplante hepático

em 17 pacientes com DNA do vírus da hepatite B (VHB) no soro ≥ 30.000

cópias/mL e em 79 pacientes com DNA do VHB < 30.000 cópias/mL no

momento do transplante (teste log rank).

40

Figura 5: Risco atuarial de recorrência da hepatite B pós-transplante hepático

(TH) em 57 pacientes que receberam apenas imunoglobulina anti-HBs (HBIG)

após o TH (grupo monoprofilaxia) e em 56 pacientes que receberam lamivudina

e/ou adefovir associado(s) à HBIG (grupo profilaxia combinada) (teste log

rank).

41

Na análise multivariada, os fatores independentes preditivos de maior

risco de recidiva viral B foram: diagnóstico de CHC no momento do TH (risco

relativo [RR], 8,2; intervalo de confiança a 95% [IC 95%], 2,2 - 30,3; P = 0,002),

DNA do VHB no soro ≥ 30.000 cópias/mL no momento do transplante (RR,

4,96; IC 95%, 1,6 - 15,6; P = 0,006) e ausência de profilaxia com análogo de

nucleosídeo ou nucleotídeo associado à HBIG (RR, 5,0; IC 95%, 1,2 - 20,0; P =

0,024). Os pacientes com CHC que receberam quimioterapia anti-tumoral pós-

TH apresentaram maior risco de recorrência da infecção pelo VHB (RR, 19,0;

IC 95%, 4,2 - 86,9; P < 0,0001) do que aqueles com CHC que não receberam

quimioterapia pós-TH (RR, 4,8; IC 95%, 1,07 - 21,6; P = 0,04).

A recidiva viral B foi mais freqüente nos pacientes com DNA do VHB ≥

30.000 cópias/mL no momento do TH que receberam monoprofilaxia com HBIG

(P = 0,003), mas não no subgrupo de pacientes que receberam profilaxia

combinada (HBIG + análogo nucleosídeo ou nucleotídeo) (P = 0,504) (Tabela

4). A recorrência da infecção viral B foi mais freqüente nos pacientes com CHC,

independentemente do uso de monoprofilaxia (P = 0,006) ou profilaxia

combinada (P = 0,010) (Tabela 4). Nenhum paciente que recebeu profilaxia

combinada e que não tinha o diagnóstico de CHC apresentou recorrência da

infecção viral B após o TH (Tabela 4).

42

Tabela 4: Taxas de recorrência da infecção pelo vírus da hepatite B em

pacientes com e sem carcinoma hepatocelular associado no momento do

transplante hepático (TH) e com DNA do VHB no soro ≥ e < 30.000 cópias/mL

no momento do TH, que receberam monoprofilaxia (HBIG) ou profilaxia

combinada (HBIG + lamivudina e/ou adefovir)

Monoprofilaxia com HBIG

Característica Total Recorrência do VHB após o

TH Valor de P

CHC 20 8 (40,0%)

Sem CHC 37 3 (8,1%) 0,006*

DNA VHB ≥ 30.000

cópias/mL 7 5 (71,4%)

DNA VHB < 30.000

cópias/mL 40 5 (12,5%)

0,003*

Profilaxia combinada (HBIG + lamivudina e/ou adefov ir)

Característica Total Recorrência do VHB após o

TH Valor de P

CHC 13 3 (23,1%)

Sem CHC 43 0 (0,0%) 0,010*

DNA VHB ≥ 30.000

cópias/mL 10 1 (10,0%)

DNA VHB < 30.000

cópias/mL 39 2 (5,1%)

0,504*

* Teste exato de Fisher

Abreviações: TH: transplante hepático; HBIG: globulina hiperimune anti-HBs; VHB:

vírus da hepatite B; CHC: carcinoma hepatocelular.

43

5.3 Evolução da reinfecção pelo VHB

Entre os 14 pacientes que apresentaram recidiva da hepatite B, nove

(64,3%), desenvolveram hepatite aguda. Insuficiência hepática aguda ocorreu

em três pacientes, entre os quais, um foi submetido a retransplante e faleceu

no pós-operatório devido a choque séptico; outro faleceu devido a insuficiência

hepática; e o terceiro evoluiu com recuperação da função hepática, mas

faleceu 10 meses depois devido à recorrência do CHC. Entre os 11 pacientes

restantes, cinco faleceram devido à recidiva do CHC e seis estão vivos, com

função hepática preservada (três pacientes com DNA do VHB no soro

indetectável por técnica de PCR e, nos outros três, DNA do VHB positivo em

baixos níveis).

5.4 Reinfecção pelo VHB nos pacientes transplantado s com CHC

Nos 33 pacientes com AgHBs positivo no soro que foram submetidos a

TH e apresentavam CHC associado, 11 (33.3%) apresentaram recorrência da

hepatite B. As taxas atuariais de recidiva da infecção pelo VHB nos pacientes

com CHC em um, dois, cinco e oito anos foram 16,0%, 26,7%, 42,3% e 42,3%,

respectivamente (Figura 3, Tabela 3). Sete dentre esses 11 pacientes também

apresentaram recidiva do CHC (Figura 6) e o diagnóstico de recidivas da

infecção viral B e do CHC foram feitos em intervalos de tempo variáveis

(Tabela 5).

44


hepatocelular (CHC), que apresentaram ou não recidiva tumoral e recorrência

da hepatite B após o transplante de fígado.

Ausência de recidiva do CHC (n = 23)

Ausência de recorrência

do VHB (n = 3)

Recorrência do VHB (n = 4)


do VHB (n = 19)

Recidiva CHC (n = 10)

Pacientes com CHC

AgHBs +

submetidos a TH

(n = 33)


45

Sete dentre os 10 pacientes que apresentaram recidiva do CHC não

estavam dentro dos critérios de Milão (73), no momento do TH.

Em um desses pacientes, a recidiva viral B ocorreu nove meses antes

do diagnóstico de recorrência do CHC na glândula supra-renal. O DNA do VHB

foi detectado, por técnica de PCR, na metástase supra-renal, mas não no

enxerto hepático no mesmo momento. O AgHBs no soro tornou-se negativo

após a ressecção da metástase supra-renal e voltou a ser detectado após uma

segunda recidiva tumoral na mandíbula (Figura 7).

A recorrência da infecção viral B foi mais freqüente nos pacientes que

apresentaram recidiva do CHC (7/10) após o transplante do que naqueles que

não apresentaram (4/23) (P= 0,0001) (Figura 8).

Quinze (45,5%) dos 33 pacientes que apresentavam CHC antes do TH

receberam quimioterapia após o transplante. Entre estes, nove (60%)

apresentaram recorrência do CHC e, entre esses nove, a recorrência viral B

ocorreu em seis pacientes. Seis (40%) dentre os 15 pacientes que receberam

quimioterapia não apresentaram recidiva do CHC. Apenas um desses seis

pacientes apresentou recidiva viral B, alguns dias após um ciclo de

quimioterapia (Figura 9).

46

Tabela 5: Características clínicas e virológicas, momento da recidiva do CHC e da

recorrência da infecção viral B após o TH e resultados da quantificação do DNA total

do VHB e do cccDNA no tecido do CHC recidivado pós-TH, em sete pacientes que

apresentaram recidiva do VHB e do CHC

Pts

DNA VHB no soro no momento

do TH

Profilaxia da recidiva

viral B

Recorrência do VHB após

o TH (meses)

Recidiva do CHC

após o TH (meses)

Local da recidiva do CHC

DNA VHB*

(cópias/ célula)

cccDNA* (cópias/ célula)

7 Neg HBIG 6,0 12,0 Anal 5.326,0 −

8 Neg HBIG 11,5 9,5 Hepática 147,6 7,0 x 10-4

11 Neg HBIG 15,0 13,5 Hepática 13,1 −

17 Neg HBIG 24,0 22,5 Óssea Neg −

18 Neg HBIG 2,5 1,5 Óssea − −

19 Neg após LAM

HBIG + LAM 27,0 36,0 Supra-

renal 1.970,0 Neg

20 21.600

cópias/mL após ADV

HBIG + ADV 27,0 31,0 Supra-

renal 0,27 0,52

*No tecido tumoral (recidiva do CHC pós-TH)

Abreviações: CHC: carcinoma hepatocelular; TH: transplante hepático; HBIG: globulina

hiperimune anti-HBs; LAM: lamivudina; ADV: adefovir; cccDNA: covalently closed circular DNA;

Neg: negativo; − : não disponível.

47

Figura 7: Paciente submetido a transplante hepático (TH) devido aos

diagnósticos de cirrose viral B e carcinoma hepatocelular (CHC). Antes do

transplante, a quantificação do DNA do VHB no soro era de 4,76 x 105 e

tornou-se negativa após o tratamento com lamivudina. Após o TH, como

profilaxia da recidiva viral B, ele recebeu globulina hiperimune anti-hepatite B

(HBIG) e lamivudina. Vinte e sete meses após o TH, ocorreu recorrência da

infecção pelo VHB. Nove meses mais tarde, foi diagnosticada recidiva do CHC

na glândula supra-renal. Após ressecção da metástase supra-renal, o AgHBs

no soro tornou-se negativo. Em seguida a uma nova recidiva do CHC

(mandibular), o AgHBs e o DNA do VHB no soro tornaram-se positivos. O

paciente evoluiu a óbito devido à recidiva do CHC seis anos após o TH.

0

2000

4000

6000

8000

10000

Tempo em meses

DN

A V

HB

(có

pias

/mL)

(s

oro)

DNA VHB

12 24 36 48 60 72

AgHBs − − − − − − − − − − + + + + + − − − − − − − − + + + + + + +

Rec

idiv

a C

HC

na

glân

dula

sup

ra-r

enal

Res

secç

ão d

a m

etás

tase

supr

a-re

nal

Rec

idiv

a C

HC

na

man

díbu

la

Óbi

to (

CH

C)

48

Figura 8: Risco atuarial de recorrência da hepatite B após o transplante

hepático (TH) em 10 pacientes que apresentaram recidiva do carcinoma

hepatocelular (CHC) após o TH e em 23 pacientes que não apresentaram

recidiva do CHC após o TH (total de 33 pacientes AgHBs-positivo

transplantados com CHC).

49


hepatocelular (CHC), que receberam quimioterapia, que apresentaram ou não

recidiva tumoral e recorrência da hepatite B após o transplante de fígado.

Ausência de recidiva do CHC (n = 6)


do VHB (n = 3)



do VHB (n = 5)

Recidiva CHC (n = 9)

Pacientes com CHC que

receberam quimioterapia (15/33)


50

5.5 Sobrevida global

A curva de sobrevida atuarial global dos 113 pacientes AgHBs-positivo

submetidos a TH é mostrada na Figura 10. Na análise univariada, os fatores

preditivos de menor sobrevida foram a presença de CHC (P = 0,025), níveis de

DNA do VHB no soro no momento do TH ≥ 30.000 cópias/mL (P = 0,016),

recorrência da infecção pelo VHB (P = 0,003) e recidiva do CHC (P < 0,0001).

Os fatores independentes preditivos de menor sobrevida foram a presença de

níveis séricos de DNA do VHB no momento do TH ≥ 30.000 cópias/mL (RR,

3,04; IC 95%, 1,27 - 7,24; P = 0,01) e a recidiva do CHC (RR, 7,6; IC 95%, 3,1 -

18,8; P < 0,001).

51

Figura 10: Sobrevida global dos 113 pacientes AgHBs-positivo transplantados

no período de dezembro de 1995 a dezembro de 2004.

52

5.6 Níveis de cccDNA e de DNA total do VHB no CHC e fígado não-

tumoral do fígado nativo

Os níveis de cccDNA e de DNA total do VHB nas células tumorais e

não-tumorais do fígado nativo são mostrados nas Figuras 11A e 11B,

respectivamente e na Tabela 6 (pág. 55). O cccDNA foi detectado em

espécimes de CHC do fígado explantado em 11 (68,8%) pacientes e em

espécimes de tecido hepático não-tumoral do fígado nativo em 12 (75%) dentre

os 16 pacientes testados. DNA total do VHB, em tecidos tumoral e não-tumoral

do fígado explantado, foi detectável em todos os 16 pacientes. Não foi

observada diferença significativa entre as medianas dos níveis de cccDNA

entre as amostras pareadas de tecido tumoral e não-tumoral (0,023 vs. 0,024

cópias/célula, respectivamente, P = 0,7) (Figura 11A) como também não foi

observada diferença significativa entre as medianas dos níveis de DNA total do

VHB entre as amostras pareadas de tecido tumoral e não-tumoral (49,3 versus

6,4 cópias/célula, respectivamente, P = 0,9) (Figura 11B). Nos pacientes que

receberam tratamento antiviral com lamivudina e/ou adefovir antes do

transplante, as medianas dos níveis de cccDNA nas células tumorais (0,41

cópias/célula) e nas células não-tumorais (4,87 cópias/célula) foram

significativamente maiores do que aquelas encontradas nos pacientes que não

necessitaram de tratamento antiviral antes do transplante (mediana = 0

cópias/célula nas células tumorais, P = 0,03 e mediana = 0,008 cópias/célula

nas células não-tumorais, P = 0,03).

Foram observadas correlações positivas significativas entre os níveis de

DNA total do VHB nas células tumorais e não-tumorais (r = 0,63, P = 0,009),

53

entre os níveis de cccDNA nas células tumorais e não-tumorais (r = 0,66, P =

0,006), e entre os níveis de DNA total do VHB e os níveis de cccDNA nas

células não-tumorais (r = 0,5, P = 0,04). No entanto, não foi observada

correlação significativa entre os níveis de DNA total do VHB e os níveis de

cccDNA nas células tumorais (r = 0,26, P = 0,33).

Observou-se correlação positiva entre o DNA do VHB no soro no

momento do TH e os níveis de DNA do VHB nas células tumorais (r = 0,627; P

= 0,009) e não-tumorais (r = 0,669; P = 0,005) e, também, com os níveis de

cccDNA nas células tumorais (r = 0,508; P = 0,045) e não-tumorais (r = 0,652;

P = 0,006).

5.7 Níveis de cccDNA e de DNA total do VHB no tecid o tumoral

após a recorrência do CHC

Nos sete pacientes que apresentaram recidiva do CHC e do VHB após o

TH, foi pesquisada a presença do cccDNA no tecido tumoral pós-recidiva em

três, sendo o cccDNA detectado em dois casos (recidiva hepática em um

paciente e supra-renal em outro). A presença do DNA do VHB foi investigada

no tecido tumoral pós-recidiva em seis pacientes e foi detectada em cinco.

Esses resultados são mostrados na Tabela 5.

54

11 A

11 B

Figura 11: (A) Níveis de cccDNA em células tumorais do carcinoma hepatocelular (CHC) e em células hepáticas não-tumorais do fígado nativo em pacientes AgHBs-positivo, submetidos a transplante hepático (TH). (B) Níveis de DNA total do VHB em células tumorais do CHC e em células hepáticas não-tumorais do fígado nativo em pacientes AgHBs-positivo, submetidos a TH. Cada ponto representa um paciente e as barras indicam os valores da mediana. LID: limite inferior de detecção.

0.001

0.01

0.1

1

10

100

1000

10000

DN

A to

tal d

o V

HB

(c

ópia

s/cé

lula

)

Células tumorais

Células não- tumorais

0.000001

0.00001

0.0001

0.001

0.1

10

100

1000

cccD

NA

(c

ópia

s/cé

lula

)

Células tumorais

Células não - tumorais

LID

1

0.01

55

Tabela 6: Resultados da quantificação do DNA do VHB e do cccDNA em

espécimes de tumor e não-tumor do fígado explantado de 16 pacientes AgHBs-

positivo com carcinoma hepatocelular submetidos a transplante hepático.

Abreviações: VHB: vírus da hepatite B; cccDNA: covalently closed circular DNA; T:

tumor; NT: não-tumor.

Pacientes DNA VHB/T

(cópias/célula)

DNA VHB/NT

(cópias/célula)

cccDNA/T

(cópias/célula

cccDNA/NT

(cópias/célula)

1 65,5 2,14 0,0 0,0077

2 61,3 266,0 0,053 7,33

3 39,0 4,26 0,68 0,03

4 0,02 0,022 0,0086 0,07

5 1,06 0,081 0,037 0,0

6 27,2 16,5 226,0 1,33

7 0,16 0,13 0,0 0,02

8 59,6 1,29 0,0 0,0

9 86,4 46,9 0,0023 20,2

10 0,006 0,17 0,0 0,0

11 530,0 1.576 3,78 8,5

12 0,06 137,0 0,0 0,0

13 0,43 7,23 9,8 5,01

14 99,0 5,57 0,042 0,01

15 545,0 66,2 0,00007 0,0016

16 106,0 1.007,0 0,41 4,87

56

6 - Discussão

57

6 - Discussão

Neste estudo, analisou-se o risco de recorrência da infecção pelo VHB

em 113 pacientes AgHBs-positivo, que foram submetidos a transplante de

fígado em um único centro francês, no período de dezembro de 1995 a

dezembro de 2004. Os resultados corroboram o fato de que as doenças

hepáticas relacionadas ao VHB tornaram-se uma boa indicação ao TH, desde a

segunda metade da década de 1990 – a sobrevida global em oito anos foi de

71,3% e o risco atuarial de recorrência da infecção viral B em oito anos foi de

15,1%. Evidenciou-se que, na presente era, com uma profilaxia anti-VHB eficaz

e técnicas sensíveis de quantificação do DNA do VHB, a carga viral no

momento do TH permanece sendo fator preditivo independente do risco de

recorrência da infecção viral B pós-TH, entretanto, com um ponto de corte

inferior àquele previamente descrito. Também foi observada, no presente

estudo, associação independente entre presença do CHC no momento do

transplante e risco de recorrência viral B pós-TH. Além disso, nos pacientes

com diagnóstico de CHC, a recidiva do CHC foi associada à recorrência da

infecção viral B.

Com o objetivo de identificar os fatores de risco para a recidiva viral B na

presente era, foi selecionada essa coorte de pacientes, submetidos ao TH,

após a disponibilidade do análogo de nucleosídeo, lamivudina, e da utilização

de estratégia mais eficaz de profilaxia da recorrência da infecção viral.

Os resultados encontrados reforçam os efeitos benéficos da profilaxia

combinada de um análogo de nucleosídeo ou nucleotídeo, iniciado antes do

58

TH, com HBIG, e mantidos indefinidamente após o TH. Tal conduta foi fator

preditivo independente de menor risco de recorrência da infecção viral B, em

relação à monoprofilaxia com HBIG. Os pacientes que receberam lamivudina,

adefovir e/ou tenofovir associado(s) a HBIG apresentaram taxas atuariais de

recorrência da hepatite B em dois, cinco e oito anos de 3,7%, 6,4% e 6,4%,

respectivamente. Esses resultados são comparáveis àqueles obtidos em outros

estudos nos quais a eficácia da profilaxia combinada foi avaliada (9, 75).

No presente estudo, os níveis séricos de DNA do VHB, no momento do

TH, foram fator preditivo independente do risco de recorrência da infecção pelo

VHB. Pacientes com níveis de DNA do VHB no momento do TH ≥ 30.000

cópias/mL apresentaram taxas de recorrência da infecção pelo VHB

significativamente maiores do que aqueles cuja carga viral encontrava-se em

níveis inferiores a 30.000 cópias/mL. Esse resultado confirma que níveis

elevados de DNA do VHB pré-TH representam fator preditivo de maior risco da

recorrência do VHB. No entanto, um ponto de corte inferior ao observado em

estudos anteriores (6, 8, 9, 14, 27, 76, 77) foi detectado, indicando a

importância de maior redução da carga viral antes do TH. Marzanno e

colaboradores (27) observaram correlação linear positiva entre a carga viral no

momento do TH, determinada por PCR, e o risco de recidiva viral B – a

presença no soro do DNA do VHB acima de 100.000 cópias/mL no momento

do TH foi significativamente associada ao risco de recorrência da hepatite B

(27). No entanto, analisando-se os resultados daquele estudo, é possível

observar que, no grupo de pacientes que recebeu apenas HBIG, não ocorreu

recidiva do VHB naqueles com carga viral menor que 10.000 cópias/mL;

entretanto, ela foi observada em 16% dos pacientes com DNA do VHB entre

59

10.000 e 99.999 cópias/mL, sugerindo que, provavelmente, o melhor valor do

ponto de corte esteja entre 10.000 e 100.000 cópias/mL, como observado no

nosso estudo.

Pela primeira vez, demonstrou-se que a presença do CHC no momento

do TH constitui fator de risco independente para a recorrência da infecção pelo

VHB. Entre os 14 pacientes que apresentaram recorrência da hepatite B após o

TH, 11 (78,6%) tiveram o diagnóstico de CHC confirmado por exame

histológico do fígado explantado e sete (50%), apresentaram recidiva do CHC

pós-TH. Diversos estudos não mostraram maior risco de recorrência da

infecção viral B em pacientes transplantados com CHC (9, 25-28). Em um

estudo prévio, a recorrência da infecção viral B ocorreu em maior freqüência

nos pacientes AgHBs-positivo transplantados com CHC no momento do TH e

os piores resultados nesse grupo de indivíduos foi atribuído principalmente à

reinfecção do enxerto pelo VHB e não à recidiva tumoral (29). No entanto,

neste último, grande parte dos pacientes não recebeu nenhuma profilaxia da

recorrência viral B. Em estudo de Anselmo e colaboradores (75), apesar do

CHC não ter sido fator de risco independente para a infecção viral B recorrente,

no grupo de pacientes com CHC, a causa predominante de óbito foi a

recorrência da hepatite B (64%), seguida pela recidiva do CHC (23%). No

presente estudo, onde o CHC foi um fator de risco independente para a

recorrência da infecção viral, a recidiva do CHC e não da hepatite B foi a

principal causa de óbito no grupo de pacientes transplantados que

apresentavam CHC. Essa diferença em relação ao estudo de Anselmo e

colaboradores (75) deve-se, provavelmente, ao fato de, na presente

investigação, ter sido estudada uma coorte mais recente de pacientes, em

60

época na qual os análogos de nucleosídeos/nucleotídeos estavam disponíveis

e foram utilizados no tratamento dos pacientes que apresentaram recorrência

da infecção pelo VHB.

No grupo de pacientes deste estudo que recebeu profilaxia combinada,

a recorrência do VHB não ocorreu em freqüência significativamente maior

naqueles indivíduos com DNA do VHB no soro ≥ 30.000 cópias/mL no

momento do TH; além disto, entre os pacientes que receberam profilaxia

combinada, nenhum paciente transplantado sem CHC apresentou recorrência

viral B, sugerindo que o CHC é o principal fator de risco para a recorrência viral

B em pacientes que recebem HBIG associada a um análogo de nucleosídeo

e/ou nucleotídeo como profilaxia da recorrência viral.

Diversos mecanismos podem estar envolvidos nas maiores taxas de

recorrência viral B em pacientes com CHC. É possível que a quimioterapia,

administrada durante os primeiros meses pós-transplante, contribua para

aumentar o risco da recidiva viral. A reativação da replicação do VHB é

complicação freqüente e reconhecida em pacientes com infecção crônica pelo

VHB que recebem quimioterapia para o tratamento de neoplasia (78 - 81).

Entretanto, de acordo com os nossos resultados, a maioria dos pacientes que

receberam quimioterapia pós-TH e apresentaram recorrência da infecção pelo

VHB, também apresentaram recidiva do CHC (seis recidivas do CHC em sete

pacientes que recidivaram a hepatite B). Somente um paciente que recebeu

quimioterapia pós-transplante apresentou recorrência apenas da infecção viral

B, sem recidiva do CHC. Esse dado sugere que a recidiva do CHC, e não a

quimioterapia, seja, provavelmente, o principal fator responsável pelo aumento

do risco da recorrência da infecção viral B nesse grupo de pacientes. O maior

61

risco relativo de recidiva viral B observado nos pacientes com CHC que

receberam quimioterapia é provavelmente devido à seleção de pacientes com

doença tumoral mais avançada e, portanto, com maior risco de recidiva do

CHC, para receber esse tratamento. Outra possível explicação para a maior

freqüência de recorrência do VHB pós-TH nos pacientes com CHC é a

ocorrência de defeitos na imunidade celular e na produção de citocinas que são

observados nesses indivíduos (82). No entanto, estas não são, provavelmente,

as únicas razões. De fato, a associação significativa entre a presença do CHC

no momento do TH e a recorrência da infecção viral B e entre as recorrências

do tumor e da hepatite B sugerem a possibilidade de replicação viral e

produção de vírions pelas células do CHC, que funcionaria, portanto, como

reservatório do VHB. O desaparecimento do AgHBs do soro de um paciente

que apresentou recorrências do VHB e do CHC após a ressecção de

metástase supra-renal, e o seu reaparecimento após uma segunda recidiva do

CHC também reforçam essa hipótese. Essa idéia é ainda reforçada pelo fato

de que, neste paciente, o DNA do VHB foi detectável na metástase supra-renal,

mas não no parênquima hepático do fígado transplantado, em biópsia hepática

realizada no mesmo momento da ressecção de tal metástase.

O cccDNA foi detectado em células do CHC do fígado nativo de 11 dos

16 pacientes testados e em 12 espécimes pareados de tecido hepático não-

tumoral. O cccDNA também foi detectado em tecido tumoral proveniente do

CHC recidivado após o TH em dois dentre três pacientes testados, que

apresentaram recidiva do CHC e do VHB. Esses resultados sugerem

fortemente a hipótese de que a replicação viral B pode ocorrer em células do

CHC. Micrometástases do CHC poderiam comportar-se como potenciais

62

reservatórios para a reinfecção do enxerto pelo VHB. Após a recidiva do CHC,

com o aumento da massa tumoral, a produção viral pelo tumor aumentaria o

consumo de HBIG o que, finalmente, acabaria por exceder a capacidade desta

de neutralizar todos os vírions produzidos.

Dois mecanismos principais foram propostos para explicar a reinfecção

do enxerto pelo VHB após o TH: (i) o enxerto poderia ser infectado por vírions

circulantes não neutralizados, devido à elevada carga viral, resultando em

baixo nível de replicação e seleção de variantes resistentes à HBIG, com

substituições na proteína de superfície – especialmente no determinante “a” (83

- 85); e (ii) a origem da reinfecção do enxerto poderia ser reservatórios extra-

hepáticos, como as células mononucleares do sangue periférico (85-87), ou

possivelmente, como demonstrado no presente estudo, metástases do CHC.

Existem poucos dados na literatura sobre a quantificação dos níveis de

DNA do VHB intra-hepático nos tecidos tumoral e não-tumoral em pacientes

com CHC. Zanella e colaboradores (32) quantificaram o DNA do VHB intra-

hepático em tecido hepático tumoral e não-tumoral, utilizando técnica de PCR

em tempo real. Entretanto, a técnica utilizada nesse estudo não permite a

distinção entre as formas cccDNA e rcDNA.

Wong e colaboradores (34) quantificaram o DNA total do VHB e os

níveis de cccDNA em tecido hepático tumoral e não-tumoral em pacientes com

CHC e detectaram níveis significativamente maiores de cccDNA em tecido

tumoral que em tecido não-tumoral adjacente. No entanto, nesse estudo, foi

utlizada a técnica Invader®, cuja especificidade pode ser questionada, uma vez

que, em alguns estudos onde ela foi utilizada, foram observados níveis de

cccDNA no soro entre 104 - 106 cópias/mL, o que sugere que a mesma possa

63

detectar também a forma rcDNA e não apenas cccDNA (50, 88). Pollicino e

colaboradores (33), utilizando técnica de nested PCR após digestão dos

extratos de DNA por nuclease, detectaram cccDNA em espécimes de tumor e

não-tumor em 46,7% de 30 pacientes com hepatite B oculta. Nesse estudo,

também foi realizada PCR com transcrição reversa em 10 espécimes de tumor

e não-tumor positivos para o cccDNA, sendo o RNA do VHB detectado em

todos eles, o que demonstra atividade de transcrição persistente.

No presente estudo, utilizou-se uma técnica de PCR em tempo real

recentemente desenvolvida (35), que permite quantificar os níveis de cccDNA

no tecido hepático, cuja especificidade baseia-se em duas etapas

fundamentais: tratamento com DNase ATP-dependente para digerir

intermediários replicativos não-cccDNA, e utilização de primers localizados em

ambos os lados do intervalo da forma rcDNA, para amplificar preferencialmente

o cccDNA.

Os níveis medianos detectados de cccDNA e de DNA total do VHB

foram comparáveis àqueles obtidos em pacientes AgHBs-positivo (AgHBe-

negativo, anticorpo anti-HBe-positivo) em um outro estudo em que a mesma

técnica foi utilizada (35). Nesse mesmo estudo, os níveis de cccDNA e do DNA

total do VHB foram positivamente correlacionados com a carga viral (DNA do

VHB) no soro dos pacientes (35). Da mesma forma, no presente estudo,

encontramos correlação positiva entre os níveis de DNA total do VHB e do

cccDNA nas células tumorais e não-tumorais do fígado explantado, com os

níveis séricos do DNA do VHB no momento do TH.

Os pacientes que receberam tratamento antiviral com lamivudina e/ou

adefovir antes do transplante apresentaram níveis mais elevados de cccDNA

64

nas células tumorais e não-tumorais, quando comparados àqueles que não

tiveram indicação de tratamento antiviral pré-TH. Esse resultado sugere que a

redução espontânea da viremia está associada a uma diminuição mais eficaz

dos níveis intra-hepáticos de cccDNA, do que aquela induzida por tratamento

antiviral. Tais dados também corroboram os achados de outros estudos que

mostraram a persistência do cccDNA apesar da terapia com análogos de

nucleosídeos ou nucleotídeos (35, 49).

No presente estudo, não se observou diferença significativa entre os

níveis de DNA do VHB e os níveis de cccDNA entre as células tumorais do

CHC e as células hepáticas não-tumorais. Nos estudos de Wong e

colaboradores (34) e Zanella e colaboradores (32), os níveis de DNA total do

VHB nos tecidos tumoral e não-tumoral também foram comparáveis.

Entretanto, no estudo de Wong e colaboradores (34), no qual a técnica

Invader® foi utilizada, a mediana dos níveis encontrados de cccDNA no tecido

tumoral foi significativamente superior àquela observada no tecido não-tumoral.

Os dados do presente estudo apontam para a possível replicação do

VHB nas células tumorais e podem parecer contraditórios em relação a estudos

prévios (23, 24). No entanto, previamente, a ausência de replicação em tecidos

tumorais foi sugerida utilizando-se técnicas de hibridização molecular e

Southern blot, muito menos sensíveis que as atuais técnicas de PCR. Nesse

sentido, os níveis encontrados de DNA total e cccDNA do VHB nos tecidos

tumorais não foram muito elevados, o que poderia explicar a necessidade das

técnicas atuais mais sensíveis para a sua detecção.

65

7 - Conclusões

66

7 – Conclusões • Os fatores de risco independentes para a recorrência da infecção viral B

nessa coorte de 113 pacientes AgHBs-positivo submetidos a transplante

hepático foram a existência de carcinoma hepatocelular no momento do

transplante, a presença de viremia ≥ 30.000 cópias/mL, detectada por

técnica de reação de polimerase em cadeia, no momento do transplante

e a monoprofilaxia com HBIG (vs. profilaxia combinada de HBIG e

análogo de nucelosídeo e/ou de nucleotídeo).

• O cccDNA e o DNA do VHB foram detectados em 69% e 100% das

amostras de tumor do fígado nativo. Não foram observadas diferenças

estatisticamente significativas dos níveis de cccDNA e de DNA total do

VHB entre espécimes de tumor e não-tumor do fígado nativo.

• A recorrência do CHC e da hepatite B em sete pacientes, o

desaparecimento do AgHBs após a ressecção de metástase supra-renal

do CHC em um desses pacientes e a presença do cccDNA no tecido

tumoral do fígado nativo e pós-recidiva do CHC sugerem a ocorrência de

replicação viral B em células do CHC e, também, um provável papel

dessa replicação na recorrência viral B nesse grupo de pacientes.

67

8 - Referências bibliográficas

68

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2007 carcinoma hepatocelular como fator de risco para recorrência da infecção pelo vírus da...

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