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Sumário Página

1. Introdução 22. Espectrometria no Ultravioleta

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3. Espectrometria no Infravermelho 3

4. Espectrometria de Massa4

5. Espectrometria de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) 4

6. Espectrofotômetro5

7. Instrumentação 6

7.1. Fontes de radiação UV-VIS 7

7.2. Monocromadores 7

7.3. Cubetas 8

7.4. Detectores 9

8. Espectrofotômetro de absorção atômica 13

8.1. Lâmpada de catodo oco 13

8.2. Lâmpada de descarga EDL 14

8.3. Chopper 14

9. Conclusão 15

10.Bibliografia 16

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1. Introdução

A espectrofotometria é o método de análises óptico mais usado nas investigações biológicas e físico-químicas. O espectrofotômetro é um instrumento que permite comparar a radiação absorvida ou transmitida por uma solução que contém uma quantidade desconhecida de soluto, e uma quantidade conhecida da mesma substância.Todas as substâncias podem absorver energia radiante, mesmo o vidro que parece completamente transparente absorve comprimentos de ondas que pertencem ao espectro visível. A água absorve fortemente na região do infravermelho.A absorção das radiações ultravioletas, visíveis e infravermelhas dependem das estruturas das moléculas, e é característica para cada substância química.Quando a luz atravessa uma substância, parte da energia é absorvida: a energia radiante não pode produzir nenhum efeito sem ser absorvida.A cor das substâncias se deve a absorção de certos comprimentos de ondas da luz branca que incide sobre elas, deixando transmitir aos nossos olhos apenas aqueles comprimentos de ondas não absorvidos.Espectrofotometria de absorção atômica é o método de análise usado para determinar qualitativamente e quantitativamente a presença de metais. O método consiste em determinar a presença e quantidade de um determinado metal em uma solução qualquer, usando como princípio a absorção de radiação ultravioleta por parte dos elétrons que, ao sofrerem um salto quântico depois de devidamente excitados por uma chama de gás acetileno a 3000 graus Celsius, esses devolvem a energia recebida para o meio, voltando assim para a sua camada orbital de origem. A energia devolvida na forma de um fóton de luz, por sua vez, absorve a radiação ultravioleta emitida pela fonte específica (cátodo oco) do elemento químico em questão. Dessa forma, elétrons que estão contidos na solução, e que sofrem também um salto quântico e que não pertencem ao mesmo elemento que constitui o cátodo oco que está sendo usado no momento, não serão capazes de causar uma interferência, isso porque eles absorverão apenas radiação com comprimento de onda referente ao elemento químico do qual fazem parte.

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Alguns termos básicos devem ser conhecidos:

Comprimento de onda (l) - Distância medida ao longo a linha de propagação entre dois pontos equivalentes que estão em fases adjacentes da onda.

Freqüência (u) - Número de ciclos por unidade de tempo.

Transmitância (T) - Razão entre a energia radiante transmitida por uma substância e a energia radiante incidente nessa substância: T = Et/Ei

Absorbância (A) - log (1/T)

Absortividade molar (a) - Relação descrita pela absorbância dividida pelo produto da concentração C da substância (amostra) e o comprimento óptico (c) percorrido pela radiação: a = A/(C . c )

2. Espectrometria no Ultravioleta

Quando a radiação eletromagnética da região do UV passa através de um composto que têm ligações múltiplas (duplas e triplas), uma parcela da radiação é, usualmente absorvida pelo composto. A quantidade de radiação absorvida depende do comprimento de onda da radiação e da estrutura do composto. A absorção ocorre pela subtração de energia do feixe de radiação provocada pela excitação dos elétrons de orbitais de baixa energia para orbitais de energia mais elevada. A espectrometria no UV, portanto, provocam transições eletrônicas. Logo, para que um composto possa ser detectado com radiações na região do UV, é necessário que esse composto possua elétrons capazes de serem excitados, ou seja, elétrons pi ou elétrons livres (não-ligantes). Os elétrons sigma não podem ser excitados, porque a transição de elétrons de uma ligação sigma acarretaria a quebra da ligação e, conseqüentemente, a perda da estrutura característica do composto.

3. Espectrometria no Infravermelho

Os compostos orgânicos também absorvem radiações na região do infravermelho (IV) do espectro. A radiação infravermelha não tem energia suficiente para excitar os elétrons e provocar transições eletrônicas, mas ela faz com que os átomos ou grupos de átomos vibrem com maior rapidez e com maior amplitude em torno das ligações covalentes que os unem. Estas vibrações são quantizadas e, quando ocorrem, os compostos absorvem energia IV em certas regiões do espectro. Nas vibrações, as ligações covalentes comportam-se como se fossem pequenas molas unindo os átomos. Quando os átomos vibram, só podem oscilar com certas freqüências, e as ligações sofrem várias deformações. Quando a ligação absorve energia, ela sofre alterações e, ao retornar ao estado original, libera essa energia, que então é detectada pelo espectrômetro.

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As moléculas podem vibrar de muitos modos. Dois átomos unidos por uma ligação covalente podem efetuar vibrações de estiramento dessa ligação, como se fosse uma mola que estica e retorna ao tamanho original. Três átomos também podem efetuar diferentes vibrações de estiramento e alteração dos ângulos de ligação, em vários planos do espaço. No entanto, as vibrações de estiramento são as mais importantes.

4. Espectrometria de Massa

 Simplificadamente, o espectro de massa funciona da seguinte maneira: Um feixe de elétrons de alta energia bombardeia a amostra, em fase gasosa, e o aparelho detecta e registra os fragmentos gerados pelo impacto dos elétrons. Daí, a partir do valor da massa molecular de cada um dos fragmentos, montamos a molécula, como um quebra-cabeça. Os fragmentos gerados podem ser íons, radicais ou moléculas neutras. No aparelho são detectados apenas os fragmentos catiônicos (íons positivos), chamados íons moleculares, de carga unitária. Estes íons possuem alta energia e são capazes de romper ligações covalentes, fragmentando-se em pedaços menores. A partir de um fragmento, portanto, podem surgir vários outros fragmentos menores.

5. Espectrometria de Ressonância Magnética Nuclear (RMN)

 O núcleo de certos elementos e isótopos comporta-se como se fossem ímãs girando em torno de um eixo. Tem esta propriedade alguns núcleos como o do hidrogênio comum e o do carbono 13. Quando se coloca um composto contendo átomos de 1H ou de 13C num campo magnético muito forte e simultaneamente se irradia o composto com energia eletromagnética, os núcleos podem absorver energia num processo denominado ressonância magnética. A radiação utilizada no espectrômetro de RMN é a radiofreqüência (rf), de comprimento de onda altíssimo (da ordem de metros) e baixa energia (da ordem de 10-6 kcal/mol). A absorção desta radiação pelos núcleos desses elementos é quantizada e produz um espectro característico. Esta absorção não ocorre a menos que a freqüência da radiação e a intensidade do campo magnético tenham valores bem definidos. Os espectrômetros permitem aos químicos medir a absorção de energia pelos núcleos de 1H e de 13C, além do núcleo de outros elementos. Estes instrumentos trabalham com um campo magnético muito forte, capaz

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de provocar até a morte de uma pessoa que tenha uma ponte de safena e trabalhe muito perto do aparelho de RMN.

Embora o 13C corresponda a apenas 1,1% do carbono natural, o fato do núcleo desse isótopo do carbono provocar um sinal de RMN tem grande importância para a análise de compostos orgânicos. O principal isótopo do carbono, o 12C, com abundância natural de cerca de 89,9% não tem spin magnético, e por isso não gera sinais de RMN. De certa maneira, os espectros de RMN 13C são, usualmente, menos complicados que os espectros de RMN 1H e mais fáceis de interpretar. Devido ao fato de o 13C existir naturalmente em porcentagem tão baixa, os sinais de RMN gerados pelos seus núcleos não poderiam ser visualizados no espectro. Porém, a técnica utilizada nos aparelhos de RMN 13C consiste em irradiar um pulso curto e potente de radiofreqüência, que excita todos os núcleos de 13C existentes na amostra. Os dados são digitalizados automaticamente e guardados em computador e uma série de pulsos repetidos, que acumula os pulsos, construindo os sinais.

Ao contrário do espectro de RMN 1H, que necessita apenas algumas miligramas de amostra, na RMN de 13C é preciso de 10 a 200 mg em 0,4 ml de solvente deuterado. Essa grande diferença é necessária para compensar a baixa porcentagem de 13C, e permitir o acúmulo de sinais. Além disso, enquanto no espectro de RMN 1H a faixa de absorção magnética dos prótons varia de 0 a 14 ppm, no espectro de RMN 13C a faixa varia de 0 a 240 ppm.

6. Espectrofotômetro

Um espectrofotômetro é um aparelho que faz passar um feixe de luz monocromática através de uma solução, e mede a quantidade de luz que foi absorvida por essa solução. Usando um prisma o aparelho separa a luz em feixes com diferentes comprimentos de onda (tal como acontece no arco-íris com a separação das cores da luz branca). Pode-se assim fazer passar através da amostra um feixe de luz monocromática (de um único comprimento de onda, ou quase). O espectrofotômetro permite-nos saber que quantidade de luz é absorvida a cada comprimento de onda.

Determinar a concentração de uma espécie em solução a partir do gráfico da variação de absorvância (ou transmitância) em função da concentração de várias soluções-padrão.

A precisão dos comprimentos de onda para análise são chamados de bandas de passagem, mais comum na ordem de 10nm. O espectro da análise mais comum é de 360nm à 1000nm para a faixa visível.

A operação de um espectrofotômetro é basicamente de iluminar a amostra com luz branca e calcular o montante de luz que é refletido pela amostra em cada intervalo do comprimento de onda. Tipicamente os dados são medidos para 31 intervalos de comprimento de onda centrados em 400 nm, 410 nm, 420 nm,.....,

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700 nm. Isto é feito passando-se a luz refletida através de filtros de interferência ou de grade de difração que dividem a luz em intervalos separados de comprimentos de onda. O instrumento é calibrado usando-se uma cerâmica branca cuja refletância em cada comprimento de onda seja conhecida e comparada a uma superfície que permita uma perfeita difusão. A refletância de uma amostra é expressa entre 0 e 1 (como uma fração) ou entre 0 e 100 (como uma percentagem). É importante compreender que os valores de refletância obtidos são valores relativos e, para amostras não fluorescentes, são independentes da qualidade e quantidade de luz usada para iluminar a amostra.

Existem três tipos: o ultravioleta, o infravermelho e o visível. Um bom espectrofotômetro tem sempre dois feixes de luz: o de referencia e o que passa através da solução, colocada em um tubo especial para espectrofotometria. No final da análise, estuda-se a faixa de comprimentos de onda onde a absorção foi maior. Fazendo-se um gráfico com soluções de concentração conhecida, pode-se interpolar a concentração da sua solução.O ultravioleta é mais absorvido por ligações duplas e triplas; o infravermelho é absorvido de qualquer jeito (e, dependendo da região de maiores ou menores absorbâncias, você pode definir a estrutura da molécula (ele é mais usado para análises qualitativas. Normalmente, os químicos orgânicos se utilizam dos Espectrofotômetros IV, UV, de massa e o RNM, para elucidar a estruturas das moléculas que eles retiraram de alguma planta.

7. Instrumentação

Um espectrofotômetro é constituído por uma fonte de luz (lâmpada), um porta-amostra, um monocromador (separa a luz, pode ser um prisma ou grade de difração, sendo este último mais comum nos aparelhos modernos) e um detector (fotocélula, fotodiodo ou válvula fotomultiplicadora). As figuras abaixo representam o esquema de instrumentação de um espectrofotômetro de feixe simples e feixe duplo.

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Figura 1: Esquema Básico de um Instrumento para Medir a Absorção Sistema de feixe simples

Figura 2: Sistema de Feixe Duplo

7.1 Fontes de radiação UV-VIS

7.1.1. Lâmpada de Tungstênio e Tungstênio-Halogênio

Incandescente, produz emissão continua na faixa e 320 a 2500nm. O invólucro

de vidro absorve toda radiação abaixo de 320nm, limitando o uso da lâmpada

para o visível e infravermelho.

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7.1.2. Lâmpada de Deutério

É a mais usada para emissão de radiação ultravioleta. Consiste em um par de

eletrodos fechados em um tubo de quartzo ou vidro, com janela de quartzo,

preenchido com gás hidrogênio ou deutério. Aplicando alta voltagem, produz-se

uma descarga de elétrons que excitam outros elétrons gasosos a altos níveis

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energéticos. Quando os elétrons voltam a seus estados fundamentais, emitem

radiação contínua de 180 a 370nm.

7.1.3. Laser

Pelo processo de emissão estimulada, os lasers produzem uma enxurrada de

feixes muito estreitos e intensos de radiação. Todas as ondas procedentes ao

material emissor estão em fase entre si, e, por isso, praticamente não

apresenta dispersão quando se propaga.

Isso permite uma concentração de energia num ponto muito pequeno, mesmo

que esteja numa distância considerável.

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7.2. Monocromadores

São dispositivos essenciais dos espectrofotômetros e tem como função a seleção do comprimento de onda e que se tem interesse para a análise. È constituído de uma fenda de entrada de um elemento de dispersão de radiação e de uma fenda de saída. O elemento de dispersão pode ser um prisma ou uma rede de difração.

7.2.1. Monocromador prismático

A radiação policromática procedente da fonte de radiação passa pela fenda de entrada e incide sobre a face de um prisma, sofrendo desvio. Os prismas de quartzo são indicados para trabalhar na região ultravioleta, embora tenham mais dispersão que o vidro. Na região do visível são empregados primas de vidro. Os prismas de quartzo apresentam desvantagem de serem altamente refringentes e oticamente ativos.

7.2.2. Monocromador reticular

O principal elemento de dispersão dos monocromadores reticulares é a rede de

difração, que consiste em uma placa transparente com inúmeras ranhuras

paralelas e de mesma distância. As redes de difração dispersam a radiação

policromática baseadas no fenômeno da interferência, e a dispersão resultante

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desta rede é linear. As redes de difração possuem resolução melhor que os

prismas e podem ser utilizadas em todas as regiões espectrais.

7.3. Cubetas

São usados como recipientes cubas ou cubetas retangulares de vidro ou

quartzo. As cubetas de vidro são usadas quando se trabalha na região do

visível. Para a região do ultravioleta, devem-se usar as cubetas de quartzo, que

são transparentes à radiação ultravioleta, pois o vidro absorve a mesma.

Uma cubeta ideal deve ser de 1 cm, para simplificar os cálculos da expressão

da Lei de Beer. As cubetas também podem ter dimensões diferentes, e esse

dado deve ser considerado na hora do cálculo.

Para aplicações industriais, como, por exemplo, no controle de qualidade de

lotes de produção, utiliza-se um sistema automatizado em que as amostras

circulam em série em cubetas adequadas. Esse sistema é chamado de análise

por injeção de fluxo ou FIA (do inglês Flow Injection Analysis)

Figura 3: Cubetas descartáveis

7.4. Detectores

Os detectores em um espectrofotômetro são dispositivos capazes de fornecer informações físicas de um sistema quanto à intensidade de radiação incidida

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no mesmo, ou de modo indireto, a intensidade absorvida por uma amostra, convertendo esta intensidade de radiação em um sinal elétrico.Em princípio, um detector consiste de três componentes: uma parte receptora sensitiva à determinada característica do sistema, um transdutor para converter a informação obtida em um sinal elétrico e um amplificador de sinal. Levando-se em conta o tipo de medida a que se destinam, podem-se classificar os detectores como detectores diretos ou indiretos. Os detectores diretos são aqueles que captam diretamente a incidência da radiação transmitida a partir da amostra, já os indiretos são aqueles que captam um segundo ou terceiro sinal sem ser diretamente a radiação incidida na amostra, como temperatura ou sinal sonoro.Os detectores podem ser das mais variadas formas, variando de acordo com sua finalidade e esquema de montagem do espectrofotômetro.

7.4.1. Detector Piroelétrico

Certos cristais dielétricos apresentam polarização dielétrica espontânea. Quando o momento de dipolo elétrico for dependente da temperatura, o material pode ser usado como um sensor. Este detector é construído na forma de um capacitor e as cargas induzidas nas duas faces do cristal pelos dipolos internos estabelecem uma corrente ou diferença de potencial que pode ser medida por um circuito externo. A Figura 4 ilustra, esquematicamente, um detector piroelétrico.

Figura 4: Representação esquemática de um sensor piroelétrico.

7.4.2. Bolômetro

Bolômetros compreendem basicamente de um termistor, isto é, de um dispositivo cuja resistência elétrica varia com a temperatura. Pode ser construído tanto a partir de metais quanto com semicondutores que apresentem dependência significativa da resistência elétrica com a temperatura. A utilização dos bolômetros se dá geralmente na região do infravermelho, na qual o detector pode facilmente interpretar a variação de radiação incidente como uma variação de temperatura na superfície do mesmo, que conseqüentemente ocasiona uma variação na sua resistência. A Figura 5 ilustra, qualitativamente, essa dependência entre dois tipos de bolômetros.

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Figura 5:Comparativo resistência em função da temperatura

7.4.3. Fotodiodo

Consiste basicamente em uma junção p-n, onde ocorre a formação de uma zona de transição entre uma região de material semicondutor, cuja condutividade elétrica é dominada por portadores de carga tipo n (elétrons), e uma região cuja condutividade é dominada por portadores de carga tipo p (buracos). A largura w e a simetria dessa região dependem dos processos de fabricação e dos materiais envolvidos. Se a concentração de portadores, elétrons, por exemplo, varia lentamente ao longo da distância w relativamente ampla, entre o valor máximo do lado n e o mínimo do lado p, a junção é chamada gradual.A luz incidente no fotodiodo interage diretamente na região p onde os fótons desta radiação, de acordo com sua intensidade, “preenchem” os buracos que não permitiam a passagem da corrente elétrica. Conectando as extremidades do fotodiodo a um sistema com um voltímetro observa-se a variação da intensidade da radiação de acordo com a variação da tensão a qual o foto diodo é submetido.

7.4.4 Fotomultiplicadoras

As fotomultiplicadoras, ou tubos fotomultiplicadores, são tubos de vidro sob vácuo, contendo um foto-catodo (negativo), recoberto por material que absorve a luz e emite elétrons, que são acelerados em direção a um ânodo (positivo), baseados no princípio do efeito fotoelétrico. No caminho, estes elétrons se chocam com dinodos que estão progressivamente com potenciais mais altos (Fig. 6), e em cada um destes um elétron desloca de 3 a 4 novos elétrons, que são acelerados até o próximo dinodo. Esse processo pode ser repetido de dez a quinze vezes. A multiplicação por etapas depende também da voltagem aplicada, o que ocasiona uma amplificação de até 300 vezes. Desta maneira, a luz incidente permite a passagem de uma corrente elétrica que pode ser medida eletronicamente. O fator de amplificação é extremamente sensível á mudanças na voltagem (cerca de 1kV), que precisa ser altamente estabilizada.

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Figura 6:Esquema de um tubo fotomultiplicador

7.4.5– Microfones

Utilizados na técnica PAS (Photo Acustic Spetroscopy) os microfones captam um sinal sonoro emitidos pela amostra contida na célula fotoacústica (fig. 7), a qual absorve a radiação incidente, transformando em um sinal elétrico através de indução eletromagnética. A vantagem dos microfones em ralação a outros detectores, Bolômetro, por exemplo, é o tempo de resposta, além de poder receber um sinal em diversas freqüências,

Figura 7: Esquema de uma célula fotoacústica

7.4.6- CCD’s

Iniciais do termo em inglês Charge Coupled Device (dispositivo de carga acoplada), os CCD’s (Fig. 8) criados inicialmente para atuarem como um chip de memória (1969) mostrando ser um excelente sensor óptico, sendo utilizado como detector em algumas técnicas de espectroscopia.O funcionamento dos sensores CCD´s baseia-se no efeito fotoelétrico. Algumas substâncias têm a propriedade de absorver fótons e libertar no processo um elétron. O silício constitui a matéria prima para a construção de um CCD. Um CCD típico consiste numa placa quadrada ou retangular de silício com 125 a 500 micrômetros de espessura e alguns milímetros de comprimento. Nesse, é implantada uma rede de eletrodos que capturam e analisam os elétrons gerados pelo efeito fotoelétrico. Cada trio de eletrodos atua como uma ratoeira eletrostática, acumulando em seu redor os elétrons gerados na placa de silício. O eletrodo central de cada trio mantém uma carga positiva, enquanto

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que os restantes mantêm um potencial nulo. Deste modo os elétrons, cuja carga é negativa, se acumulam em volta do eletrodo central à medida que a luz incide no detector. Os trios de eletrodo são dispostos em colunas que cobrem a totalidade do sensor CCD. As diferentes colunas são isoladas entre si por um material que gera um potencial negativo permanente ao entrar em contacto com a placa de silício, o que evita a contaminação entre colunas. As linhas de eletrodos consideradas perpendicularmente às colunas são designadas como filas. Cada trio de eletrodos é uma peça fundamental do detector CCD e corresponde a um elemento da imagem digital final, e é designado pixel ou elemento de imagem. O tamanho físico do pixel é variável. Existem pixels retangulares e pixels quadrados.As suas dimensões variam habitualmente entre 6 e 27 micrômetros.

Figura 8:Exemplo de um CCD

8. Espectrofotômetro de Absorção Atômica

Em espectrofotômetro de Absorção atômica são utilizados, além do monocromador e do detector, lâmpadas de catodo oco HC ou lâmpada de descarga EDL e um Chopper. Ilustrado na figura 4.

Figura 9: Espectrofotômetro AA

8.1. Lâmpada de catodo oco

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Este de tipo de fonte deverá produzir a emissão de linhas do elemento do catodo.

Lâmpadas multielementares estão disponíveis, mas limitadas.

Nem todos os metais são adequados para catodo e devem ter as seguintes características: ser um bom condutor, ser relativamente volátil e deve ser capaz de produzir um catodo. A figura 5 mostra um exemplo de lâmpada de catodo oco.

Figura 10: Lâmpada de catodo oco

8.2. Lâmpada de descarga EDL

É uma alternativa a lâmpada de catodo oco. Ela contém um sal do metal de interesse em um tubo selado de quartzo enchido com gás inerte. Um campo RF é usado para excitar o gás e faz com que o metal seja ionizado. Luz intensa é emitida na proporção de 10 a 100 vezes mais que a HCs, mas não são tão estáveis como as HCs. Ela está representada na figura abaixo.

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Figura 11: Lâmpada de descarga

8.3. Chopper

Um chopper é usado para prover um sinal modulado em conjunto com um módulo amplificador

Ele reduz ruídos da fonte de atomização e corrige variações instrumentais

Auxilia a divisão do feixe de luz evitando com isso a necessidade de duas células ou fontes de atomizações. Figura abaixo mostra um esquema de modulação de sinal pelo chopper.

Figura 12: Modulação de sinal

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9. Conclusão

Espectrofotômetros são instrumentos capazes de registrar dados de

absorbância ou transmitância em função do comprimento de onda. O espectro

de absorção é característico para cada espécie química, sendo possível a

identificação de uma espécie química por seu “espectro de absorção”.

10. Bibliografia

SILVERSTEIN, R. M.BASSLER, G.C.MORRILL,T. C., Identificação espectrométrica

de compostos orgânicos 5ª ed., LTC.

VINADÉ, M. E. C; VINADÉ, E. R.C, Métodos espectroscópicos de análise quantitativa, editora UFSM.

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