Directement dansle noyau: les cellules en

phase de division dans le poumon de la souris deviennent vertes lorsqu’ellesproduisent la protéine fluorescente dont le gène a transporté la crotamine

PHARMACOLOGIE

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La protéine du venin du crotalecascavelle pénètre dans les cellules en multiplication et se révèle capablede transporter des médicaments et des substances anti-tumorales

Le facteur des cellules

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Expert dans la découverte de personnes ta-lentueuses qu’il laisse travailler en toute li-berté, le chimiste Tetsuo Yamane a formé auBrésil un groupe de recherche qui a déjà desramifications dans d’autres pays et qui, enquelques années, a identifié les propriétéstrès rares d’une protéine du venin du crota-

le cascavelle – un serpent typique des régions ari-des où prédomine une végétation xérophyle, la Caa-tinga et le Cerrado. Appelée crotamine, cette pro-téine traverse la membrane cellulaire et transportedes gènes ou d’autres molécules, y compris vers lecentre des cellules. Mais pas n’importe quelle cellu-le, seulement celles qui sont en train de se multipli-er. C’est la raison pour laquelle cette protéine peutêtre utilisée pour diagnostiquer des maladies, pourtransporter des médicaments et, à en juger par lesexpérimentations les plus récentes, pour détruiredes tumeurs.

Aujourd’hui âgé de 76 ans, Yamane est à la têted’un laboratoire de biotechnologie à l’Institut de Re-cherches Énergétiques et Nucléaires (Ipen) et au Cen-tre de Biotechnologie de l’Amazonie (CBA). Il a com-mencé à mettre en place de nouvelles possibilitésd’études de la crotamine vers 1993, au moment oùil songeait à rentrer au Brésil après quarante annéespassées aux États-Unis. Isolée dans les années 1950par le biochimiste José Moura Gonçalves, la crota-mine avait déjà été très étudiée en raison de sa capa-cité à paralyser les muscles des rongeurs. Quaranteans plus tard, elle ne semblait plus receler de grandsmystères. Mais c’était sans compter sur un chimiste,fils de Japonais, dont la hardiesse s’était forgée aucontact quotidien de scientifiques renommés tels queRichard Feyman et Linus Pauling pendant ses étu-des de 2e et 3e cycles à l’Institut de Technologie deCalifornie (Caltech). Sa capacité à formuler de nou-velles interrogations devint encore plus forte durantses quasi dix années de travail aux côtés des physici-ens du Laboratoire Bell, là même où furent inventésle transistor, le laser, le circuit intégré et la commu-nication par satellite. Lorsqu’il fit la connaissance dela crotamine, Yamane intrigué par les doutes surles mécanismes alors encore obscurs de l’action dela protéine dans l’organisme et sur les interactionspossibles de cette molécule dont la structure fait pen-ser à un dragon en laine.

La crotamine pourrait-elle interférer sur la divi-sion des cellules? C’est cette question de Yamane, enposte depuis 1994 à l’Institut Butantan et ne travail-lant alors qu’avec les biochimistes Gandhi Rádis-Baptista et Álvaro Prieto da Silva, qui suscita l’in-térêt du biologiste cellulaire Alexandre Kerkis et deson épouse Irina, biologiste. Tous deux sont Rus-ses et avaient travaillé dans l’un des plus grands cen-tres de recherche russe, en Sibérie, avant que la pe-

Publié en septembre 2007

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dérale de l’État de São Paulo (Unifesp) etde l’Université de Mogi das Cruzes(UMC),“le moment où les cellules pro-duisent le plus d’héparane sulfate se dé-roule durant le cycle reproductif ”. Legroupe de chercheurs a démontré dansun article publié dans le Journal of Biolo-gical Chemistry que l’affinité entre lesmolécules de crotamine et le protéogly-cane d’héparane sulfate est essentielle-ment le fruit de forces électrostatiques: lacrotamine est une molécule dont la char-ge électrique est positive, tandis que cel-le des héparanes est négative.

En fait, la crotamine n’est pas totale-ment positive: l’un de ses côtés est élec-triquement neutre. Cette particularité aaugmenté les perspectives de relier d’au-tres molécules, aussi bien du côté positifque du côté neutre. Mais cela n’était en-core qu’une théorie, tout comme l’hypo-thèse que la crotamine, positive, puisse selier à l’ADN, négatif. Certains indicesmontraient que cela était possible. Tou-tefois la crotamine ne pourrait pas s’unirdirectement à l’ADN, sauf au moyend’une autre protéine conjuguée à l’ADN.

Pour lever le doute, Mirian Hayashiconversa avec Vitor Oliveira. Chimiste di-plômé de l’Université Fédérale de São Car-los (UFSCar), Oliveira travaillait sur desprojets d’analyse de structure de protéi-nes dans une université privée. Il utilisaità l’Unifesp un équipement capabled’analyser la manière dont les moléculesabsorbent les composantes d’un type par-ticulier de lumière. La réponse apparut encinq minutes, par l’intermédiaire d’undessin: oui, la crotamine s’unissait direc-tement à l’ADN. Peu de temps plus tard,une expérimentation du groupe démon-tra que la crotamine pourrait de fait trans-former une forme d’ADN circulaire, à sa-voir le plasmide dans le noyau des cellu-les du foie, du poumon et de la moelle os-seuse qui se trouvent en multiplicationcontinue. L’ADN étranger fonctionnanormalement, comme s’il était originairede là, dans une cellule sur quatre: un ré-sultat tout à fait notable.

D’autres résultats montrent que lacrotamine paraît être liée à la défense del’organisme – et non uniquement le com-posant d’un venin. Sa structure tridimen-sionnelle ressemble à celle de la béta-dé-fensine, une protéine que l’on trouve dansla salive et dans le mucus (du nez parexemple) des êtres humains et d’autresanimaux.“Des molécules comme celles-

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les tests sur les cellules et sur les souris,les fractions les plus actives étaient lagyrotoxine et la crotamine.

Composant majoritaire du venin ducrotale cascavelle, la crotamine est une pe-tite protéine. Elle ne possède que 42 aci-des aminés, soit presque autant que l’in-suline – l’hormone comprenant 51 acidesaminés et qui contrôle la quantité de su-cre dans le sang. Mais elle est minuscule sion la compare, par exemple, à l’hémoglo-bine, prodigieuse molécule comprenantquatre chaînes de 140 acides aminés quitransportent l’oxygène à toutes les cellu-les du corps. Sa petite taille explique sa ca-pacité à traverser facilement la membra-ne des cellules. Mais comment fait-elle?

La réponse est la suivante: en s’unis-sant aux molécules de la surface cellulai-re, connues comme protéoglycanes d’hé-parane sulfate et qui transitent à l’intéri-eur de la cellule. Il ne s’agit pas d’une uni-on fortuite. Pour Ivarne Tersariol, biochi-miste et professeur de l’Université Fé-

restroïka ne fragmente la structure de pro-duction de la connaissance scientifique.Après un temps passé à l’Université d’É-tat du Norte Fluminense (Rio de Janei-ro), le couple Kerkis vint à São Paulo en1999. Ils entrèrent à l’Institut de SciencesBiomédicales (ICB) de l’Université de SãoPaulo (USP) et commencèrent à étudierles cellules souches embryonnaires dessouris. C’est alors qu’ils rencontrèrent Ya-mane, et ensemble ils découvrirent denouvelles propriétés de la toxine qui pa-raissait pourtant ne plus rien avoir à ca-cher. Ils vérifièrent que la crotamine, àtrès petites doses, atteignait en à peinecinq minutes le noyau des cellules souchesembryonnaires des souris mais aussi ce-lui d’autres types de cellules.

C’était la première fois que l’on dé-montrait qu’une protéine jusqu’alors per-çue seulement comme une toxine jou-ait également le rôle de facteur cellulai-re: elle traverse la membrane des cellulesen phase de division et atteint le noyau,siège des chromosomes. Là, cette petiteprotéine adhère aux centromères, où leschromosomes dupliqués se maintiennentunis pendant la division cellulaire. Puis,dès que les chromosomes se séparent encellules indépendantes la crotamine sortde la cellule et reste dans l’espace inter-cellulaire, comme si elle attendait un au-tre moment pour entrer à nouveau en ac-tion. Publiés en juin 2004 dans le FASEBJournal, ces résultats ont ouvert de nou-velles perspectives de recherche et d’uti-lisation de cette protéine. “Nous com-mençons à voir la toxine différemment”,confia Mirian Hayashi, une pharmaco-logiste qui travailla avec Yamane au Bu-tantan pendant trois ans après avoir par-ticipé à trois autres recherches sur le dé-veloppement de médicaments au Japon.

Contre la douleur et les parasites –C’est également au sein du Butantanqu’une autre équipe découvrit chez lecrotale cascavelle une substance au pou-voir analgésique six cent fois supérieur àcelui de la morphine, et apparemmentsans effets secondaires significatifs. Aucours d’une expérimentation réalisée àl’USP, le venin du Crotalus durissus terri-ficus – qui vit sur les terres du sud et del’ouest du Brésil – s’est montré plus ef-ficace contre le parasite de la leishma-niose que celui d’autres sous-espèces: unetypique de la Caatinga et une autre desrégions Sud-Est et Centre-Ouest. Dans

Étude du système de transporteffectué par des peptides cationiques

MODALITÉ

Ligne Régulière d’Aide à laRecherche

COORDONNATEUR

TETSUO YAMANE – IPEN

INVESTISSEMENT

65 649,56 réaux (FAPESP)

LE PROJET

Structure de la crotamine:composant majoritaire duvenin du crotale cascavelle.

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ficile que la production d’une versionsynthétique de la crotamine, qui éviteraitde dépendre de la purification du venin.

Même s’il reste encore beaucoup detravail à faire, les chercheurs négocientdéjà avec des entreprises intéressées parl’utilisation d’extraits de crotamine com-me vecteur de gènes. En 2004, ils ont sol-licité le brevet sur les utilisations potenti-elles de cette molécule, afin de ne pas ré-péter l’histoire d’autres molécules décou-vertes par des Brésiliens mais qui, n’ayantpas été brevetées ni soutenues par des en-treprises, ont été récupérées par d’autresgroupes de recherche. Ils savent que pos-séder un brevet n’est qu’un des prérequispour s’aventurer sur le long chemin dudéveloppement d’un médicament.

Plus tard, si les prochains tests en la-boratoire confirment le potentiel de lacrotamine, le groupe devra relever un au-tre défi: produire la molécule en plus

grande quantité – à une échelle pilote,puis à une échelle industrielle – de façonà faciliter les négociations avec des entre-prises ou des institutions prêtes à faire lestests finals, avant que la molécule ne de-vienne un médicament ou un indicateurpour des diagnostics sur le cancer.Yama-ne conclut:“Ceux qui ont de bonnes idé-es peuvent nous contacter. Nous sommesun groupe ouvert”. Il a d’ailleurs réussià attirer d’autres groupes – d’Allemagne,de Pologne, des États-Unis et du Japon –pour travailler sur la crotamine. Etd’ajouter, fidèle à la hardiesse qui a mar-qué sa carrière scientifique: “Tous peu-vent contribuer ; ce n’est qu’ainsi que lascience avance. [...]. Linus Pauling rap-pelait toujours qu’en commençant untravail nous devons penser à la manièred’y contribuer de façon originale”. ■

Le Crotalus: un espoir aussi contre des parasites tel que celui de la leishmaniose

là font partie des premières défenses desorganismes”, note Irina Kerkis. De lamême manière que les béta-défensines,la crotamine pourrait intégrer le systèmeimmunitaire inné, qui fonctionne inten-sément durant la gestation et au cours despremiers mois qui suivent la naissance,lorsque l’organisme ne produit pas enco-re d’anticorps contre les microorganis-mes. C’est pour cela que les serpents uti-lisent aussi quelque chose d’eux-mêmes– comme le venin – mais en grande quan-tité pour se défendre: la glande du veninest une glande salivaire modifiée, rappel-le M. Hayashi. Néanmoins, tous les Cro-talus durissus terrificus ne produisent pasde crotamine. Gandhi Rádis-Baptista avérifié que tous ont un gène responsa-ble de la production de crotamine ; cer-tains des représentants de cette espèce –jusqu’à 1,5 mètres de longueur et aisé-ment identifiables de par leur sorte de gre-lot au bout de la queue – produisent uneprotéine à la structure similaire. Cette der-nière s’appelle crotazine, et ses effets sontencore méconnus.

Rádis-Baptista travaille actuellementà l’Université Fédérale de l’État du Per-nambouc. Son parcours paraît ressemblerà celui des autres participants de cetteaventure, dont le destin semble se décli-ner ainsi: ne pas créer de racines, ou dumoins changer de travail pour un autreau challenge encore plus élevé. MirianHayashi a quitté le Butantan il y a un an,peu après Yamane ; désormais elle travail-le à l’Unifesp comme professeur de phar-macologie.Vitor Oliveira a laissé l’univer-sité privée pour revenir à l’Unifesp où ilenseigne la biophysique. Irina Kerkis aquitté l’USP au profit du Butantan, tan-dis qu’Alexandre Kerkis travaille mainte-nant dans une clinique médicale. FábioNascimento, le biochimiste qui a effectuéles expérimentations sur les héparanessulfates, est aujourd’hui dans une entre-prise de biotechnologie en Suisse.

Incertitudes futures – Même distantsl’un de l’autre, les chercheurs souhaitentcontinuer à travailler ensemble sur desproblèmes qu’ils ne parviendraient peut-être pas à résoudre seuls. Extraite etadroitement purifiée par Eduardo Oli-veira à l’USP de Ribeirão Preto, la cro-tamine forme des ensembles de deux outrois unités qui réduisent sa capacité detransport de molécules. Éviter la forma-tion de ces agrégats peut s’avérer plus dif-

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