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UNIVERSIDADE DO ALGARVE

Faculdade de Ciências e Tecnologia

2011/2012

Bioquímica III – aula P4

MEDIÇÃO DA ACTIVIDADE DE LIPASES E ESTERASES

Sumário

Medição da actividade de lipases e esterases num extracto enzimático de pâncreas porcino.

Introdução

As lipases e esterases têm funções variadas como digestão, formação de membranas,

armazenamento e mobilização de lípidos de reserva, sinalização e destoxicação, e apresentam

distribuição generalizada em todos os grupos de seres vivos. Estes enzimas possuem especificidade

alargada para substratos, podendo hidrolisar ligações éster ou amida. As esterases com capacidade

de hidrolisar ligações éster envolvendo ácidos gordos de cadeia longa têm a designação de lipases

(EC 3.1.1.3). A utilização destes enzimas é cada vez mais intensa nas indústrias química,

farmacêutica e alimentar. A medição da actividade de lipases no soro é importante na avaliação de

patologias como dislipidémias ou pancreatite.

A monitorização da actividade de lipases pode fazer-se de acordo com vários princípios. É possível

tirar partido da capacidade que as lipases têm de catalisar reacções em interfaces lípido-água e

seguir alterações das propriedades físicas da interface. A actividade de lipases pode também ser

monitorizada quantificando a libertação de glicerol ou de ácidos gordos. Um método tradicional de

medir a actividade de lipases é quantificar o aumento de acidez do meio resultante da libertação de

ácidos gordos, por titulação com hidróxido de sódio. A quantificação dos ácidos gordos libertados

pode também ser feita por cromatografia ou turbidimetria (alteração do grau de turbidez da

solução). Os ensaios turbidimétricos são cerca de 40 vezes mais sensíveis que os ensaios

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titulimétricos e 4 vezes mais sensíveis que ensaios espectrofotométricos com substratos

cromogénicos, descritos abaixo. Geralmente os ensaios com lipases requerem a utilização de

moléculas anfifílicas, como detergentes, outros lípidos, proteínas ou ácidos biliares, para permitir a

emulsionação de substratos e ácidos gordos libertados.

Em ensaios espectrofotométricos são usados substratos sintéticos cromogénicos, como ésteres de

p-nitrofenil com cadeias alifáticas acil de comprimento variável. A libertação de p-nitrofenol

resultante da hidrólise do substrato por acção da lipase/esterase pode ser seguida a 400-410 nm.

Ésteres de cadeia curta, como acetato ou butirato, são usados para medir a actividade de esterases,

enquanto ésteres de cadeia longa, como laurato, palmitato ou oleato, são usados para investigar a

actividade de lipases. Os ésters de cadeia longa são insolúveis em meio aquoso e requerem a

utilização de agentes emusionantes, como já foi mencionado atrás.

Neste trabalho vamos medir a actividade de lipases e de esterases/proteases num extracto

enzimático de pâncreas porcino, através de um ensaio espectrofotométrico, usando os substratos

cromogénicos laurato de p-nitrofenil e acetato de p-nitrofenil. Será seguido o aparecimento de p-

nitrofenol no meio de ensaio, continuamente, a 410 nm.

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Realização experimental

Procedimento

A. Preparação dos meios de ensaio com ésteres de p-nitrofenil

1. Adicione 20 l da solução mãe de laurato de p-nitrofenil 200 mM em CH2Cl2, a 10 ml de

solução tampão. Misture bem no vortex. Proceda de modo idêntico para a solução mãe de

acetato de p-nitrofenil.

2. Pipete directamente para cuvettes de plástico de 1,5 ml:

Cuvette

Solução

tampão com

laurato de

p-nitofenil

Solução

tampão com

acetato de p-

nitofenil

Extracto

enzimático

Solução

tampão

Lipases 950 l 50 l

Esterases 950 l 50 l

Controlo 1 950 l 50 l

Controlo 2 950 l 50 l

ATENÇÃO: ADICIONAR O EXTRACTO ENZIMÁTICO APENAS ANTES DO INÍCIO

DE CADA ENSAIO.

B. Ensaio cinético

1. Escolha um programa de cinética apropriado no espectrofotómetro ( = 410 nm).

2. A cada cuvette, separadamente, adicione o extracto enzimático (ou água) imediatamente antes

do início de cada ensaio. Misture bem com um pedaço de parafilm e coloque a cuvette no

espectrofotómetro. Registe a absorvância, continuamente, durante 2 minutos.

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Materiais e reagentes

Reagentes:

Diclorometano (CH2Cl2)

Base Tris

HCL

NaCl

Triton X-100

Acetato de p-nitrofenil

Laurato de p-nitrofenil

p-nitrofenol

Extracto enzimático (Kontron)

Soluções:

Tris-HCl 20 mM com NaCl 150 mM e Triton X-100 0,01%; pH 8,0

Acetato de p-nitrofenil 100 mM em CH2Cl2

Laurato de p-nitrofenil 100 mM em CH2Cl2

Material:

Eppendorfs

Tubos de ensaio

Pipetas automáticas

Cuvettes de plástico de 1,5 ml

Espectrofotómetro

Microcentrífuga

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Cálculos

1. Expresse a actividade das lipases ou esterases em Abs410nm /min.

2. Determine a actividade de lipases e estereases, em termos de U/ml de extracto enzimático,

sabendo que 1 U de actividade enzimática corresponde à quantidade de enzima

necessário para a libertação de 1 mole de p-nitrofenol por minuto e que o coeficiente

de extinção molar do p-nitrofenol, , nas condições do ensaio, é 18000 M-1

cm-1

:

Abs410nm/min . 109 . volume ensaio (ml)

U/ml = ──────────────────────────

. 103 . volume de amostra (ml)

109 – conversão de moles para nmoles

103 – conversão de litros para mililitros

Bibliografia

Gilham, D. and Lehner, R.: Techniques to measure lipase and esterase activity, Molecular and Cell

Biology of Lipids 36 (2005), pp. 139-147.