Cascavel, 2010

MICROBIOLOGIA

ALEXANDRE CARVALHO DE MOURA

(AULAS PRTICAS PARA O CURSO DE FARMCIA)

Faculdade Assis Gurgacz

AULA PRTICA : 01

1- Equipamentos e materiais utilizados na prtica microbiolgica Equipamentos Os equipamentos utilizados no trabalho microbiolgico variam de conformidade com a complexidade das atividades desenvolvidas no laboratrio. Sero apresentados , nesta relao, aqueles equipamentos que so indispensveis ao trabalho microbiolgico. Os equipamentos assinalados com o sinal * so necessrios mas no indispensveis. A) Autoclave de Chamberland : utilizada para esterilizao de meios de cultura, esterilizao de materiais contaminados e esterilizao de vidrarias . B) Balana semi- analtica (10 mg -1200 g) e analtica* ( 100 g e 210 g) : pesagem de corantes e reagente para preparo de meios de cultura e solues. C) Banho-Maria (37C) : utilizado para incubao de culturas, de microrganismos, em meios lquidos. D) Banho - Maria (45-50C)* : utilizado para preparo de meios de cultura e para a incubao de culturas, de microrganismos, em meios lquidos. E) Bico de Bunsen: manipulao assptica de microrganismos; flambagem de alas, pinas, tesouras, etc.. F) Cmara assptica (fluxo laminar) : manipulao de microrganismos. G) Centrfuga (3000 rpm) :utilizada para sedimentar partculas slidas de meio lquido. H) Contador de colnias*: utilizada para contar a colnias que crescem em meios slidos contidos em placas de Petri. I) Destilador de gua : fornecer gua mais pura para o preparo de meios de cultura, corantes e reagentes. J) Estufa bacteriolgica (35-37C) : incubao de culturas de microrganismos o que favorece o seu crescimento. Existem microrganismos que requerem temperaturas diferentes, como: 4, 25, 42 e 45C. L) Estufa de secagem (80-100C) :secagem de vidrarias. M) Estufa de esterilizao (100 a 300 C)*: conhecido como Forno Pasteur e utilizado para esterilizar , seco, materiais como vidrarias, pinas, tesouras, glicerina,etc.. N) Freezer (-20 ou -70C) : utilizado para guardar culturas de microrganismos, antibiticos, reagentes,etc.. O) Potencimetro ou pHmetro : medir pH de meios de cultura e de reagentes. P) Microscpico estereoscpico (lupa) : estudo da morfologia de colnias microbianas. Q) Microscpio tico comum de campo claro: observao de preparaes em lminas coradas ou a fresco. R) Placa aquecedora com agitao magntica * : dissoluo de meios de cultura ou solues. S) Forno de microndas : usado para aquecimento e dissoluo de meios de culturas. T) Refrigerador ( 4C a 8C ) : armazenamento de meios de cultivo e de cultura de microrganismos. Materiais a) Meios de cultura desidratados ou prontos para uso: cultivo de microrganismos. b) Corantes em p ou preparados : usados para colorao de lminas contendo microrganismos ou materiais biolgicos. c) Sais e acares : preparo de meios de cultura e solues reagentes.

d) Ala de agulhas de nquel cromo (ala de platina) : usada para isolamento e semeadura de microrganismos. Para uso em rotina, as alas e agulhas devem ser de fio n24 (Brown & Sharp 24 ou BS 24) e o comprimentodeve ser de 45-50 mm. As alas devem ter um dimetro interno de 3 mm. e) Algodo hidrfilo ou hidrfobo : usado para confeco de buchas para tubos de ensaio e para proteo do bocal de pipetas. f) Barbante : usado para acondicionamento de materiais. g) Estante : suporte para tubos de ensaio. h) Tesoura : acondicionamento de materiais. Vidraria a) Balo de fundo chato e Erlenmeyer de 250, 500 e 1000 ml : preparo de meio de cultura e solues reagentes. b) Bquer 100, 250 ml : uso diverso c) Frasco conta - gotas de 250 ml : colorao de lminas. d) Frascos de cor mbar com rolha esmerilhada: estoque de solues corantes. e) Lmina escavada ( lmina de Koch) : usada para reaes de aglutinao e para observao de microrganismos pela tcnica da gota pendente . f) Lminas ( 26 X 76 mm) e lamnulas ( 20 X 20) : preparaes coradas e fresco. g) Provetas de 100, 250, 500 e 1000 ml : serve para medida de lquidos que sero usados para preparo de meios de cultura, reagentes e solues corantes. h) Tubos de ensaio : so apresentados nos tamanhos 13 X 100 mm, 16 X 150 mm, 18 X 180 mm que serviro para distribuio de volumes de 3, 5 e 10 ml respectivamente. Os tubos podem possuir tampa de rosca ou no. i) Pipetas de Mohr : medida e transferncia de lquidos. j) Placas de Petri : acondicionamento de meios de cultivo. As mais usadas so as de tamanho 10 X 100 mm e 10 X 80 mm. 2) Normas preconizadas em laboratrio de microbiologia * obrigatrio o uso de avental, sendo que este nunca deve ser intercambiado com os colegas depois de ser usado. Este avental somente dever ser usado no interior do laboratrio e em corredores de reas tcnicas comuns, devendo ser retirado quando sair do ambiente. * Deixar em local apropriado casacos, bolsas, livros e outros pertences ( coloc-los em local indicado pelo professor). * No colocar objetos de uso pessoal sobre as bancadas. * Lavar as mos ao entrar e antes de sair do laboratrio ( lavagem higinica) com sabo lquidos e aps friccionar com lcool 70%. Secar ao ar. * No fumar, comer ou ingerir lquidos dentro do laboratrio. * No tocar nos olhos, boca ou nariz com as mos. * No umidecer etiquetas com a lngua. * No fazer uso de lenos ou avental para limpar objetos ou instrumentos de trabalho. * Manter nas proximidades do local de trabalho um desinfetante (lcool 70%). * Cuidado ao acender o bico de gs. Verifique se no existe substncia inflamvel por perto. * Utilizar somente calados fechados e de solado que d aderncia ao solo. No permitido o uso de sandlias dentro da rea laboratorial.

* No utilizar jias e bijuterias que dificultem o trabalho e favoream a ocorrncia de acidentes e contaminao. * Usar luvas quando as atividades a serem desenvolvidas exigirem contato com fluidos corpreos. * Usar mscara sempre que manipular substncias qumicas com alto teor de evaporao , e em rea de alta contaminao com produtos biolgicos. * Usar protetor facial, como culos de segurana, principalmente quando houver possibilidade de espirros de fluidos. * proibido o manuseio de maanetas, telefones, puxadores de armrios , ou outros objetos de uso comum por pessoas usando luvas durante a execuo de atividades em que, agentes patognicos ou material correlato ( qumico e/ou biolgico) esteja sendo manipulado. * No permitida a presena de animais e plantas que no estejam relacionados com as atividades do laboratrio. * O acesso ao laboratrio limitado ou restrito ao pessoal tcnico e alunos. No permitida a circulao de pessoas estranhas . * Minimizar a formao de aerosis durante as manipulaes laboratoriais. * No levar luvas para reas externas do laboratrio. * Comunicar ao professor se possuir algum ferimento nas mos. * Em caso de acidente, comunicar imediatamente o professor e\ou o tcnico responsvel. * Tratar os cortes, perfuraes ou abrases imediatamente, limpando com soluo antissptica e cobrindo com curativo. * Comunicar imediatamente qualquer suspeita de haver contrado uma enfermidade, como consequncia de uma infeco no laboratrio. 03 - NORMAS DE TRABALHO MICROBIOLGICO * Cada aluno responsvel pelo material que receber. * No incio de cada anlise traar um plano de trabalho, considerando o tempo necessrio para uma anlise e a sua leitura. * Trabalhar sempre de maneira ordenada, tranqila, constante e metdica, evitando movimentos desnecessrios como trocas de lugar , assento, etc.. * Limpar e desinfetar a superfcie de mesas e balces antes e depois do trabalho de cada dia, com lcool 70%. * Efetuar o registro de anlise, anotando o tipo de produto, procedncia, dia e hora de entrada no laboratrio e qualquer outra observao prvia anlise. Na anlise propriamente dita anotar: data, mtodo, meio de cultura empregado e os resultados obtidos. * Identificar as amostras antes de iniciar a anlise e, em geral, no descartar at obter os resultados. * O material a ser analisado deve ser tocado exclusivamente com instrumentos estreis e nunca com as mos. * Flambar alas, agulhas e pinas antes e aps o uso ( limpar a ala de semeadura, com exceo da ala calibrada , em areia e lcool antes de flamb-la) . * Nunca colocar pipetas contaminadas na bancada de trabalho. * Colocar todo material usado, tais como lminas, pipetas, lamnulas, etc. em recipientes adequados com soluo desinfetante. * Os cultivos, antes de terminada a anlise, devem ser conservados na geladeira de material contaminado.

* Os cultivos, aps terminada a anlise, devem ser descartados no cemitrio de materiais contaminados. * Nunca desprezar o material contaminado no cesto de lixo. * Nunca desprezar lquidos contaminados na pia do laboratrio. * Colocar todo o material contaminado em recipiente apropriado e autoclavar a 121C durante 15 a 20 minutos para posterior lavagem. * O material utilizado em microbiologia deve receber a seguinte seqncia de tratamento: esterilizao, lavagem, secagem, acondicionamento, esterilizao, armazenamento. * No retirar qualquer cultivo do laboratrio. * Evitar salpicar mesas e pisos com gua ou solues corantes. * No caso de derramar material infectado em bancadas ou pisos cobrir com fenol 5 a 10%, recobrir com papel toalha e embeber novamente com fenol. No esquea de comunicar ao professor ou tcnico. * Seguir as normas de uso de aparelhos. * Ao final dos trabalhos prticos fazer a desinfeco da bancada com lcool 70%. * Ao final dos trabalhos prticos fazer antissepsia das mos com lcool 70% e a seguir lavar as mos e secar com papel toalha. Este procedimento poder ser alterado para: lavar as mos com gua e sabo, enxaguar, friccionar com lcool 70% ou soluo de lcool-iodado. 04) Atividade prtica a) Trabalho demonstrativo em grupo : 1- Apresentao do laboratrio de microbiologia (instalao e pessoal) 2- Equipamentos, materiais e vidraria utilizados na prtica microbiolgica e suas respectivas funes. 3- Leitura e discusso das normas adotadas no laboratrio de microbiologia. 4- Preparo artesanal de alas e agulhas de nquel-cromo . b) Trabalho individual: 1- Identificao da bancada de trabalho. 2- Fazer a desinfeco da bancada de trabalho, conforme demonstrao do instrutor. Usar lcool 70%. 3- Lavagem das mos: Molhar a mo com gua, gotejar sabo lquido, esfregar as palmas das mos, dorso da mo , inter dedos, polegar e pulso. Enxaguar com gua. Friccionar por 15 segundos com lcool 70% adicionado de 2% de glicerina. Secar ao ar. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS 01-BIER,O.- Microbiologia e Imunologia. 24 ed.,So Paulo, Melhoramentos, p. 919-998, 1985. 02-CARDOSO, C.L.-Microbiologia: aulas prticas para o curso de odontologia. Maring: UEM,1996. 03-CETESB.- Normalizao Tcnica L5.009. Segurana e Higiene do Trabalho em Laboratrio de Microbiologia. 1 ed., So Paulo, Companhia de Saneamento Ambiental,11p., 1975. 04-SALLE,A.J.- Laboratory Manual on Fundamental Principles of Bacteriology. 6th ed.,New York, McGraw-Hill Book Company, p. 2-7,1967.

04-CETESB.- Normalizao Tcnica L5.009. Segurana e Higiene do Trabalho em Laboratrio de Microbiologia. 1 ed., So Paulo, Companhia de Saneamento Ambiental,11p., 1975. 05-LARPENT,J.P. & LARPENT-GOURGAUD, M.- Microbiologia Prtica. So Paulo.Ed.Edgard Blcher Ltda. Traduo: M.C.de M.Amorozc e E.Kirchner p.115, 1975. Objetivos da aula prtica n 01 Espera-se que o aluno seja capaz de : 1) Citar a principal funo dos seguintes equipamentos e materiais usados na rotina de um laboratrio de microbiologia: a) autoclave; b) Bico de Bunsen; c)estufa bacteriolgica; d) microscpio tico de campo claro; e) Fluxo Laminar; f) alas e agulhas bacteriolgica; algodo hidrfilo ou hidrfobo; g) Placas de Petri; h) Lminas e lamnulas de vidro; i) tubos de ensaio 13 X 100 mm. 2) Por que as normas de trabalho microbiolgico e higiene so necessrias de serem adotadas em um laboratrio de microbiologia? 3) Justificar o uso de 10 normas adotadas no laboratrio de microbiologia, descritas na apostila de aula prtica? 4) Quando so usadas as alas calibradas e quais os seus volumes?

AULA PRTICA : 0201-TCNICAS DE LAVAGEM E ACONDICIONAMENTO DE MATERIAL A lavagem e esterilizao de materiais so atividades de apoio aos vrios processos de anlises de laboratrio , sendo definida como a eliminao de resduos orgnicos de protenas e de seus produtos de metabolizao dos componentes do meio de cultura, aps o seu costume. de fundamental importncia a escolha dos detergentes, equipamentos e mtodos empregados. Com a lavagem inadequada de vidrarias podero ficar restos de meios de cultura e metablitos que iro interferir nos constituintes das solues e meios de cultura, e conseqentemente, nos resultados dos exames. Com o enxague inadequado poder permanecer resduos de detergentes nas vidrarias o que poder influenciar no crescimento dos microrganismos.

LAVAGEM MANUAL DE VIDRARIAS a) Tubos de Ensaio * Colocar os tubos, com as tampas de rosca afrouxadas, em caixa de ao inoxidvel e autoclavar a 121C durante 20 a 30 minutos para a descontaminao. Esta descontaminao prvia uma regra de segurana que deve ser realizada em todo laboratrio de microbiologia . Este procedimento independe se o material est ou no contaminado com microrganismos patognicos. * Descartar os contedos dos tubos.Os meios de cultura contendo gar-gar devem ser retirados ainda quentes (liquefeitos) da autoclave, desprezando-se em recipientes apropriados e nunca na pia de laboratrio para evitar o entupimento dos canos devido a solidificao do meio de cultivo aps o resfriamento a temperatura ambiente. * Se necessrio ferver os tubos com soluo de detergente a 0,5% para eliminar os resduos do meios de cultivo. * Caso persistam resduos, aps a fervura, escovar a parte interna de cada tubo com o auxlio de um gaspilho ( escovinha). * Enxague 10 vezes em gua corrente enchendo e esvaziando totalmente os tubos. * Enxague uma vez em gua destilada e deionizada b) Placas de Petri * Aps a descontaminao , por autoclavagem, lavar individualmente cada uma das partes da placa (tampa e fundo, com o auxlio de uma esponja, para retirar marcas de lpis dermatogrfico e resduos do meio de cultura. No caso de uso de canetas de reprografia, usar lcool para retirar as marcas. * Enxaguar 10 vezes em gua corrente, esfregando com as mos, as superfcies internas e externas de cada uma das partes das placas. Verificar se todos os resduos foram eliminados. * Enxaguar uma vez cada uma das partes da placa em gua destilada ou deionizada. c) Pipetas * Aps a descontaminao , por autoclavagem, tomando cuidado para no quebrar o bocal, retirar o tampo de algodo (bucha) de cada pipeta atravs de vcuo ou estilete de ponta fina ( palitos, agulha). * Colocar as pipetas em caixas contendo soluo de detergente a 0,5% e ferver para eliminar os resduos da parede. * Enxaguar 10 vezes em gua corrente enchendo e esvaziando totalmente as pipetas. * Enxaguar uma vez em gua destilada ou deionizada. d) Lminas e lamnulas * 1,0%. * * * * * Colocar o material em recipiente adequado e cobrir com soluo de detergente 0,5Aquecer at a ebulio e manter a fervura por 5-10 minutos. Enxaguar em gua corrente at a retirada do detergente. Enxaguar com gua destilada. Secar com o auxlio de um pano limpo e macio (gaze). Desprezar as lminas e lamnulas que estiverem muito riscadas ou foscas.

e) Lavagem de vidraria nova - Tcnica geral : colocar a vidraria ( tubos de ensaio, placas de Petri e frascos) em um recipiente adequado e cobrir com soluo detergente a 05-1,0%. Aquecer at a ebulio. Retirar a vidraria da soluo detergente, enxaguar por 5 a 10 vezes com gua corrente ( se possvel morna) e por ltimo com gua destilada. Escorrer o excesso de gua e secar o material na estufa a 80-100C. - Tnicas especiais : pipetas : colocar as pipetas em cubas rasas, cobrir com soluo de detergente a 0,51,0% e aquecer at a ebulio. Retirar as pipetas da soluo detergente; enxaguar por 5 a 10 vezes em gua corrente e por ltimo em gua destilada. Escorrer o excesso e colocar para secar em estufa a 80-100C. lminas e lamnulas : colocar as lminas em lcool etlico a 95% contendo 3% de cido clordrico.Deixar de molho durante algumas horas.Retirar as lminas da mistura lcool-cido, enxaguar por 5 a 10 vezes em gua corrente e por ltimo em gua destilada.Secar as lminas com pano limpo e macio. Segurar as lminas pelas bordas para evitar a impregnao das mesmas com gordura das mos. Guard-las em recipiente fechado. f) Lavagem com "soluo"sulfo-crmica Esta lavagem se faz necessria quando a vidraria apresenta resduos que resistiram lavagem com detergente. O procedimento a seguir : * Aps a descontaminao esvaziar os contedos de cada frasco ( tubos, pipetas, placas, etc.). * Adicionar 50 mL de "soluo"sulfo-crmica no frasco a ser lavado. * Agitar, com os devidos cuidados, de cinco a seis vezes. * com o auxlio de um funil transferir a "soluo"sulfo-crmica usada apara o prximo frasco a ser lavado. * Este procedimento poder ser repetido, sem descarte da "soluo", para a lavagem de, no mximo, 10 frascos. * Enxaguar 10 vezes em gua corrente, enchendo e esvaziando totalmente os frascos. * Enxaguar uma vez em gua destilada ou deionizada, realizando medidas de pH da gua destilada ou deionizada antes e depois do enxague (de preferncia deixar o frasco em teste com gua destilada durante a noite e logo aps realizar a medida de pH em potencimetro (pHmetro). SECAGEM Deixar escorrer toda a gua e colocar a vidraria na posio emborcada na estufa de secagem a 100 C por 1 hora. ACONDICIONAMENTO Todo material utilizado no trabalho microbiolgico deve ser perfeitamente limpo e tambm estril. Para ser esterilizado , o material deve ser acondicionado.

As tcnicas de acondicionamento consistem em envolver com papel, total ou parcialmente, o material a ser esterilizado com finalidade de preservar sua esterilidade. O papel usado deve ser de boa qualidade, permevel ao ar, resistente ao calor, permitir a passagem de vapor, resistir umidade e trao, no conter resduos txicos e ser impermevel para os micorganismos. O material utilizado deve ser compatvel com o material a ser esterilizado e ao processo a ser usado. Na prtica usado papel ( Kraft) , algodo hidrfobo ( cardado) ou hidrfilo ( absorvente) e barbante. A vidraria, aps cuidadosa lavagem e secagem, acondicionada com papel (Kraft, Tigre, Jornal , Lista telefnica, etc.) e esterilizada em autoclave a 121C por 15 - 20) minutos ou em Forno de Pasteur a 170 - 180 C por 2 horas. Os materiais devem ser acondicionados utilizando-se os mtodos: * A boca de toda a vidraria como tubos, garrafas, bales e erlenmeyer fechada com tampes de algodo (buchas), que no devem ser folgados ou demasiadamente apertados. * Nas garrafas, erlenmeyer, bales de fundo chato, etc.a bucha de algodo deve ser recoberta com gaze (boneca). Levam, tambm, um envlucro de papel, o qual amarrado com barbante. * Os tubos de ensaio, depois de fechados com as buchas de algodo, so empacotados. O nmero de tubos depende da necessidade de uso do laboratrio. * As placas de Petri so embrulhadas individualmente ou em nmero de 2, 5, 10, etc, conforme a demanda de uso. os pacotes so fixados com barbante ou fita crepe. * Pipetas so embuchadas na extremidade destinada a aspirao, com pequena bucha de algodo colocada com o auxlio de uma agulha ou estilete, sendo ento, totalmente envolta em papel de embrulho. Elas tambm podem ser acondicionadas em pacotes de papel ( conjunto de 5, 10, 20) ou em cilindros de ao inoxidvel especialmente fabricado para este propsito. A bucha no permite a penetrao de germes que podem contaminar os lquidos e protegem o operador contra a ingesto de lquidos contaminados. * Os swabs ( cotonetes ou zaragatoa ) devem ser recobertos com papel alumnio e embaladas em pacotes de papel( com marcas que identifiquem o local onde est o cabo do swab) ou colocados em frascos autoclavveis que devem ser embuchados e envolvidos parcialmente em papel.

MOVIMENTAO DA VIDRARIA NO LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA LAVAGEM DESCONTAMI NAO USO SECAGEM ACONDICIONAM ENTO ESTERILIZAO

02- ATIVIDADE PRTICA Trabalho individual : - Fazer a desinfeco da bancada com lcool 70%. - Lavar as mos conforme instruo da aula anterior. - Embuchar, conforme a orientao do professor, 3 tubos de ensaio 13 x100 mm e 3 tubos 16x150 mm. - Acondicionar 4 pipetas sorolgicas ( 1, 2, 5 e 10 ml) utilizando o seguinte procedimento: Com o auxlio de um estilete ( clips para papel), colocar uma pequena bucha de algodo no bocal da pipeta. Verificar, assoprando suavemente na pipeta, se a bucha est adequada. No deve estar frouxa, nem muito apertada o que dificultaria a passagem de ar. Acondicionar individualmente cada pipeta utilizando papel kraft 50x10 cm. Amarrar com barbante ou fita crepe; anotar o volume da pipeta. - Produzir 05 zaragatoa ( swabs) utilizando palito para churrasco , algodo e papel alumnio. Trabalho em grupo : - Dever ser feita por grupo composto por dois alunos: - Acondicionar os tubos embuchados em pacotes , utilizando papel kraft e barbante ou fita crepe. Identifique o material, coloque a data. - Montar feixes de pipetas, com mesmo volume, conforme orientao do professor. - Acondicionar 1 erlenmeyer de 250 ml, conforme instruo do professor. - Acondicionar 07 placas de Petri, utilizando papel kraft e fita crepe. Um pacote deve conter 02 placas e o outro 05 placas. - Acondicionar as zaragatoas utilizando papel kraft e barbante. - Acondicionar 5 tubos em latas para serem autoclavados.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS 01-BIER,O.- Microbiologia e Imunologia. 24 ed.,So Paulo, Melhoramentos, p. 919-998, 1985. 02-CARDOSO, C.L.-Microbiologia: aulas prticas para o curso de odontologia. Maring: UEM,1996. 03-SALLE,A.J.- Laboratory Manual on Fundamental Principles of Bacteriology. 6th ed.,New York, McGraw-Hill Book Company, p. 2-7,1967. 04-CETESB.- Normalizao Tcnica L5.009. Segurana e Higiene do Trabalho em Laboratrio de Microbiologia. 1 ed., So Paulo, Companhia de Saneamento Ambiental,11p., 1975. 05-ZANON,U.-Esterilizao, p. 831-858 In: U. Zanon & J.Neves (ed.). Infeces Hospitalares, Preveno, Diagnstico e Tratamento. 1 ed..Rio de Janeiro, MEDSI, 1987. Objetivos da aula prtica n 02 Espera-se que o aluno seja capaz de : 1) Conceituar e indicar a importncia da lavagem do material a ser utilizado emm microbiologia.Descrever a tcnica de lavagem de vidraria em uso ( tcnica geral, pipetas, lamnulas e lminas.

2) Qual a indicao da lavagem de vidraria com soluo sulfo-crmica? 3) Qual a finalidade do acondicionamento do material no laboratrio de microbiologia? 4) Qual a finalidade da colocao de algodo no bocal de pipetas? 5) Citar 5 propriedades que deve apresentar o papel utilizado no acondicionamento do material na prtica microbiolgica.

AULA PRTICA : 031- ESTERILIZAO PELO CALOR MIDO A esterilizao definida como sendo o processo de destruio de todos os microrganismos presentes em um determinado material. Ela obtida pela utilizao de agentes fsicos, agentes qumicos e , no caso de lquidos termolbeis, pelo processo da filtrao. Um objeto considerado esterilizado quando a probabilidade de se detectar um microrganismo vivo, aps a esterilizao deste material, infinitamente pequena, ou seja, menor do que um para um milho. O calor mido sob a forma de vapor de gua saturado sob presso, o mais prtico e eficiente agente de esterilizao. O equipamento que produz estas condies chamado de autoclave. O funcionamento da autoclave baseado no princpio da marmita de Papin, em que a gua aquecida em recipiente fechado onde o vapor fica retido sobre presso, pode atingir temperaturas superiores a 100C sem ferver. A autoclave de Chamberland consiste essencialmente em uma caldeira cilndrica de paredes resistentes, fechada na parte superior por uma tampa, que veda perfeitamente, dotada de uma guarnio de borracha e parafusos (manipuladores) de fixao. No interior da caldeira existe um suporte (cruzeta) sobre a qual se coloca uma cesta metlica de superfcie perfurada, contendo o material ser esterilizado. Entre a cruzeta e o fundo da autoclave existe um espao onde esto localizadas resistncias eltricas protegidas por material isolantes. Neste espao colocado a gua que ser aquecida. A tampa da autoclave possui um orifcio de escapamento, uma vlvula de segurana e um manmetro que indica a presso e a temperatura correspondente. Tcnica de esterilizao na autoclave - Abrir a tampa da autoclave e colocar gua na caldeira at quase atingir a cruzeta( um dedo abaixo);

- Introduzir o cesto metlico contendo o material a ser esterilizado; - Fechar a tampa, apertando por igual os manipuladores; - Ligar a chave eltrica no mximo da intensidade; - Abrir o registro do orifcio do escapamento. A princpio, h expulso do ar contido na caldeira. Quando a gua comea a ferver, sai um jato intermitente de ar misturado com vapor de gua. Quando todo o ar residual expulso do aparelho, comea a sair um jato contnuo de vapor de gua. Fechar o registro do orifcio de escapamento. O manmetro comea a acusar o aumento de presso: - Ao atingir a temperatura de 121C ( 1 atmosfera de presso), diminuir a intensidade de calor girando a chave eltrica para a posio mdia ou mnima, de forma que a presso permanea estvel; - Marcar o tempo de esterilizao de 15 minutos; - Desligar a chave eltrica girando-a para a posio desligado; - Aguardar que a presso retorne a zero atmosfera; - Abrir o registro do orifcio de escapamento para equalizar a presso da autoclave com a do ambiente; - Com auxlio de luvas de amianto, de cano longo, afrouxar os manipuladores; - Abrir a tampa da autoclave com cuidado. Proteger o rosto contra a projeo de vapor; - Retirar o cesto com o material esterilizado. Obs: Para regular a vlvula de segurana, deslocar o contra-peso para frente ou para trs, de maneira a estabilizar a presso desejada, observando-se o limite de at 1,5 atmosferas. A gua da caldeira aps a esterilizao de material contaminado deve ser drenado atravs da vlvula de drenagem. Controle do processo de esterilizao Pode ser feito por: 1) Fita indicadora (Indicador qumico) : Fixar, sob a superfcie dos objetos a serem esterilizados, um pedao de aproximadamente 3 a 5 cm da fita indicadora. Observar que a fita possui cor creme uniforme. Aps a esterilizao verificar se a fita apresenta faixas pretas paralelas, indicando que a temperatura do processo de esterilizao atingiu 121C. 2) Anidrido succnico( indicador qumico) : colocar em um bquer de 100 ml um tubo de ensaio 13x100 mm, com tampa de algodo, acondicionado em envlucro de papel , contendo 1 g de anidrido succnico. Esta substncia tem ponto de fuso de 119,6C e se apresenta temperatura ambiente no estado slido. Aps a esterilizao, observar se o anidrido est fundido ( lquido) indicando que a temperatura do processo de esterilizao ficou prximo de 120C. 3) Indicador biolgico (Sterikon, Esterilitest): este bioindicador consiste em uma ampola que contm caldo nutriente, acar, um indicador de pH e esporos de uma bactria Bacillus stearothermophilus (ATCC 7953). A resistncia trmica destes esporos tal que o microrganismo no sobrevive aps autoclavao a 121C durante 15 minutos ( D121= 3 1 minuto). Em temperatura ou tempos de exposio menores, os esporos sobrevivem . As ampolas so colocadas junto com o material a ser esterilizado. Aps a autoclavao, a eficcia do processo de esterilizao, verificada pela incubao das ampolas para evidenciao da germinao dos esporos. A ausncia de crescimento indica esterilizao adequada. Neste caso, o bioindicador apresenta colorao violeta clara. Se a esterilizao for inadequada, os esporos do B. Stearothermophilus sobrevivem ao tratamento trmico e germinam. O contedo da ampola apresentar colorao amarela dentro de 24 horas, devido formao de cidos decorrentes da fermentao do acar e tambm apresenta turbidez devido ao crescimento bacteriano. Tcnica de realizao do controle biolgico: colocar em um bquer de 100 ml de capacidade uma ampola de Sterikon ou Esterilitest ( teste - ampola 1) juntamente com o

material a ser esterilizado na autoclave. Em paralelo, deixar outra ampola do bioindicador temperatura ambiente ( controle positivo- ampola 2) . Aps a esterilizao, retirar a ampola teste da autoclave e incub-la, juntamente com ao controle positivo, em Banho-Maria a 5660C durante 24-48 horas. Os resultados podem ser analisados observando a Tabela 01. Tabela 01- Interpretao do controle de esterilizao da autoclave de Chamberland pelo emprego de bioindicadores ( B. stearothermophilus). Ampola 1 (teste) Turbidez e colorao amarela Lmpido e colorao violeta Lmpido e colorao violeta Ampola 2 ( Controle positivo) turbidez e colorao amarela turbidez e colorao amarela+ lmpido e colorao violeta Processo de esterilizao Inadequado Adequado Bioindicador inativo, substitu-lo

2- ESTERILIZAO PELO CALOR SECO A esterilizao pelo calor seco realizada em estufas especiais denominadas de Forno Pasteur. Basicamente, o forno de Pasteur consiste de uma cmara dotada de um elemento aquecedor eltrico ( resistncia) que aquece a cmara e seu contedo; alm disso, existe um termostato que regula a temperatura desejada e um orifcio na parte superior que permite a colocao de termmetro. Devido o calor seco apresentar menor poder de penetrao do que o calor mido, a esterilizao pelo calor seco requer temperaturas mais elevadas ( 140-180C) e tempo de exposio mais prolongado ( 1- 3 horas). Seu uso indicado para esterilizao de vidraria, instrumentos de corte ou de pontas passveis de serem oxidadas pelo vapor, ps e produtos impermeveis como ceras, pomadas e leos. Os materiais so efetivamente esterilizados quando tratados por uma das vrias combinaes de temperatura-tempo de eficcia comprovada. Tabela 02- Combinaes de tempo e temperatura para esterilizao em Forno Pasteur. Temperatura ( C ) 121 160 * 170 Tempo ( horas) 12 02 * 01

* Mais utilizado Outras formas de esterilizao pelo calor seco utilizadas no laboratrio de microbiologia incluem a incinerao de materiais descartveis e flambagem. A flambagem o mtodo empregado para a esterilizao de alas e agulhas de nquel-cromo que so aquecidas ao rubro, diretamente na chama do bico de Bunsen. Tcnica de esterilizao no Forno Pasteur - Ligar o forno e ajustar a temperatura para 160C com auxlio do boto do termostato e do termmetro graduado; - Aps o forno atingir a temperatura de 160C, utilizando luvas de amianto, abrir a porta do forno e colocar o material limpo , seco e devidamente acondicionado no interior

do forno, de forma adequada para permitir a circulao do ar quente no interior da cmara. Alguns tipos de forno so dotados de ventilador interno para uniformizar a circulao do ar; - Fechar a porta do forno e aguardar a temperatura subir e estabilizar em 160C; - A partir desse momento, marcar o tempo de esterilizao de 2 horas. Nunca abrir a porta do forno durante o ciclo de esterilizao; - Desligar o forno e deixar esfriar naturalmente, com a porta fechada; - Com auxlio de luvas de amianto de cano longo, abrir a porta do forno para a retirada do material quando o termmetro acusar temperatura de 60-80C. 3- ESTERILIZAO POR FILTRAO A esterilizao de lquidos e gases pode ser efetuada por meio de filtrao atravs de materiais capazes de reter microrganismos. Atualmente, dois tipos de filtros so amplamente utilizados em laboratrios de microbiologia : discos filtrantes (Seitz) e membranas filtrantes (Millipore, Sartorius). Os discos Seitz so discos de amianto, extremamente absorventes, que retm os microrganismos principalmente por diferenas de cargas eltricas. As membranas filtrantes so constitudas de steres de celulose e contm milhes de poros microscpicos com dimetros uniformes variando de 0,01 a 14 m. Essas membranas retm, em sua superfcie, todas as partculas que excedem ao tamanho dos seus poros. Na prtica bacteriolgica, geralmente so utilizadas membranas com poros de 0,45 a 0,22 m. Os discos e membranas filtrantes so muito utilizados no laboratrio de microbiologia para a esterilizao de solues termolbeis, como por exemplo: soro, plasma, aucares, antibiticos, vitaminas que so adicionadas assepticamente em meios de cultivo. Tcnica de esterilizao por filtrao: Para a filtrao de solues , em discos ou membranas, necessrio forar o lquido atravs do filtro, aplicando uma presso negativa ao frasco de filtrao, por meio de uma bomba de vcuo ou de uma trompa de gua, ou impondo uma presso positiva acima do lquido de filtrao. Normalmente , o disco Seitz acoplado a um suporte que por sua vez adaptado a um frasco de kitasato, sendo que este conjunto acondicionado esterilizado em autoclave.As membranas filtrantes podem ser montadas em suportes de diferentes tamanhos , que variam de acordo com o dimetro da membrana. Para a filtrao de um pequeno volume de lquido, o suporte previamente esterilizado e com membrana adaptado a uma seringa,sendo que o lquido filtrado coletado em frasco estril. Para grandes volumes so mais usados os filtros Seitz. O controle de esterilidade da soluo filtrada feito atravs de semeadura em meios de cultura na forma lquida. A ausncia de turvao do meio de cultivo, aps incubao a 37C por 24 - 48 horas, comprova a eficcia do processo de esterilizao. 4- ATIVIDADE PRTICA Trabalho individual : - Fazer a desinfeco da bancada de trabalho com lcool 70%; - Lavar as mos com gua e sabo ( lavagem higinica).

Trabalho em grupo : - Verificar o funcionamento de uma autoclave conforme orientao do professor; - Proceder a autoclavagem do material fornecido pelo professor. - Proceder o controle do processo de autoclavagem atravs da fita indicadora e indicador biolgico. - Proceder a flambagem de agulhas e alas de semeadura bacteriolgica. - Fazer a desinfeco da bancada de trabalho com lcool 70%; - Lavar as mos com gua e sabo ( lavagem higinica). Objetivos da aula prtica n 06 Espera-se que o aluno seja capaz de : 1) Descrever a tcnica geral de esterilizao no Forno Pasteur e na autoclave de Chamberland. 2) Quais materiais hospitalares devem ser esterilizados atravs da autoclave? 3) Quais materiais hospitalares podem ser esterilizados pelo Forno Pasteur? 4) Como realizado e interpretado o controle do processo de esterilizao na autoclave utilizando o indicador biolgico? 5) Quantos frascos ,e em que posies ,de indicadores biolgicos devem ser colocados em autoclaves pequenas , mdia e grandes? 6) Qual a periodicidade de se fazer o controle do processo de esterilizao em um hospital?

AULA PRTICA : 04CONTEDO :1- Segurana e Higiene no trabalho microbiolgico ( Manipulao assptica) 2- Atividade prtica : Tcnicas de manipulao assptica 1- SEGURANA E HIGIENE NO TRABALHO MICROBIOLGICO Cada laboratorista responsvel pela sua segurana e a de seus companheiros de trabalho. O acidente mais comum no laboratrio de microbiologia a infeco por microrganismo patognico, estando sujeito a este tipo de acidente todo pessoal que trabalha ou circula pelo laboratrio. A via mais importante de infeco a respiratria, por inalao do ar contaminado de trabalho. Alm desta, outras vias de infeco devem ser consideradas, como por exemplo: - Pele ( escoriaes, acidentes com materiais prfuro-cortantes, mordida de animais inoculados;

- Mucosa bucal e vias digestivas: ingesto de lquidos contaminados, insuficiente anti-sepsia das mos antes de comer e fumar, maquilagem durante o trabalho; - Olhos e ouvidos : projeo de cultura microbiana, mos contaminadas. Com o objetivo de evitar qualquer tipo de infeco acidental durante a jornada de trabalho no laboratrio de microbiologia, observar as seguintes normas: - No correr riscos desnecessrios; - Usar equipamentos de segurana apropriados; - Estar preparado para agir rapidamente em casos de acidentes; - Proibido fumar e comer no laboratrio. Cada laboratrio trabalha em condies diferentes e os riscos de infeces a que est exposto o pessoal varia de segundo a organizao da instituio, sua equipe, mtodos de trabalho, assim como as operaes que ali se realizam. As pessoas que trabalham em laboratrio de microbiologia devem possuir boa capacidade mental e habilidade manual. Devem ter conhecimentos bsicos em higiene, epidemiologia e desinfeco. Cada indivduo deve ser conscientizado dos riscos que tem seu trabalho e ser de forma sistemtica informado dos mtodos, procedimentos e comportamento pessoal para prevenir qualquer infeco ou a eventual propagao de uma epidemia fora do laboratrio. rea contaminada Esta denominao dada ao local onde se manipulam materiais que contenham ou possam conter microrganismos patognicos ou potencialmente patognicos. Como o risco principal nesta rea a inalao de aerossis, cuidados especiais devem ser observados nas seguintes manipulaes microbiolgicas: - Ao abrir os recipientes com amostras, sobretudo quando em meios lquidos; - Ao preparar esfregaos; - Ao pipetar suspenses microbianas, o que deve ser feito com bulbo de borracha e nunca com a boca; - Ao homogeneizar suspenses microbianas manualmente, com auxlio de pipetas ou em agitador de tubo tipo mixer ; - Ao desprezar lquidos sobrenadantes aps centrifugao; - Ao abrir tubos ou frascos aps centrifugar; - Ao flambar ala ou agulha de semeadura bacteriolgica. O trabalho nesta rea deve ser realizado levando-se em conta as seguintes recomendaes: - Evitar a entrada e o trnsito de pessoas estranhas; - Trabalhar sempre com o avental de proteo; - Evitar entrada e sada contnua das pessoas que estejam trabalhando nesta rea; - Manter sempre mo um frasco com desinfetante ( lcool 70% ou fenol 5%). Equipamentos de segurana : So instrumentos que tem por finalidade evitar ou amenizar um acidente. Os equipamentos de segurana que se pode dispor na maioria dos laboratrios so limitados devido ao alto custo., Poucos contam com cmaras ou cabines asspticas dotadas de filtros esterilizantes, sistema de exausto e de luz ultravioleta. Em laboratrios que possuem cmara assptica alguns cuidados devem ser tomados: - Usar lmpada de ultravioleta com emisso de raios de comprimento de onda em torno de 250-260 nm;

- No operar com luz ultravioleta ligada, os raios ultravioleta causam srios danos aos olhos e pele; - Antes de iniciar o trabalho, fazer a desinfeco da cmara assptica e ligar a luz ultravioleta pelo perodo de 1 a 2 horas; - Limpar os bulbos das lmpadas, a cada duas semanas, com lcool etlico para remover o p. Existem , no entanto, equipamentos de segurana simples e de baixo custo, de uso indispensvel na prtica microbiolgica, como por exemplo: - Recipiente metlico ( ou de vidro) para receber lquidos contaminados; - Frasco contendo areia e lcool para limpar agulha e ala bacteriolgica antes de flamb-la, para evitar a produo de aerossis; - Estantes de arame estveis; - Recipiente metlico, com tampa, para receber o material a ser autoclavado ( cemitrio); - Pipetadores com bulbos de borracha para aspirar e vazar lquidos com pipetas; - Pipetas contendo buchas de algodo, para proteger a parte destinada a aspirao; - Recipiente para depositar pipetas contaminadas; - Equipamentos de proteo individual- avental, luvas, mscaras, culos, gorros, botas. Higiene Pessoal: indispensvel no laboratrio de microbiologia uma rigorosa limpeza. Cada aluno responsvel pela sua bancada de trabalho e pelos instrumentos que utilizar. As seguintes normas de limpeza devem ser observadas durante o trabalho; - Antes de iniciar o trabalho o aluno dever colocar o avental, de uso exclusivo, lavar as mos com gua e sabo e efetuar a desinfeco da bancada de trabalho; - Aps cada contato com material infeccioso, fazer a anti-sepsia com lcool 70%, a seguir lav-las com gua e sabo; - Para qualquer trabalho que apresente risco maior de contaminao, utilizar instrumentos e equipamentos de proteo individual. Usar mscara quando da manipulao de microrganismos transmissveis pelo ar; - No fumar, comer ou beber no laboratrio; - No roer unhas, esfregar os olhos ou ouvido durante as manipulaes; - Usar somente panos estreis para limpeza; - No colocar cadernos ou livros no setor contaminado; - Ao trmino do trabalho na rea contaminada, proceder a desinfeco da bancada, fazer a anti-sepsia e a lavagem das mos com gua e sabo. Em caso de acidentes Um dos acidentes mais freqentes a queda e a quebra de tubos, pipetas, frascos ou recipientes contendo microrganismos patognicos ou potencialmente patognicos. Nestes casos proceder da seguinte forma; - Despejar sobre o material quebrado e seus arredores, soluo de fenol a 5% ou outro desinfetante apropriado; - Cobrir a rea com papel toalha ou jornal para demarc-la e recobrir novamente com fenol a 5%. Aps 30 minutos, usando luvas e com auxlio de pina, recolher os cacos de vidro e o papel toalha e coloc-los no cemitrio. Se o material cair no piso, os alunos devem deixar o ambiente por 30 minutos e aps proceder como no tem anterior.

Causas de acidentes de trabalho: As causas de acidentes de trabalho podem ocorrer devido aos atos inseguros ou condies inseguras. O ato inseguro a maneira pela qual as pessoas se expem a riscos de acidentes, freqentemente representados pelas seguintes situaes: - Desconhecimento dos riscos de acidentes; - Treinamento inadequado; - Falta de interesse ou de aptido para o trabalho; - Excesso de confiana; - Atitudes imprprias tais como revolta, violncia, mau humor, etc.; - Incapacidade fsica para o trabalho; - fadiga. As condies inseguras do local de trabalho so aquelas que pem em risco a integridade fsica ou a sade dos trabalhadores ou a prpria segurana das instalaes. 4- ATIVIDADE PRTICA Trabalho individual : - Fazer a desinfeco da bancada de trabalho com lcool 70%; - Lavar as mos com gua e sabo ( lavagem higinica). - Manipulao da Placa de Petri : Treinar repetidas vezes a tcnica de abrir e fechar placas de Petri 100X15. Utilizar apenas uma das mos, conforme demonstrao do instrutor. Manipulao assptica : Teste de manipulao assptica: Lavar as mos com gua e sabo e fazer a desinfeco da bancada de trabalho; Identificar 3 tubos de ensaio 13X100, previamente esterilizados, com nmeros de 1 a 3; A partir de um tubo de 20 ml de capacidade contendo 10 ml de TSB (caldo tripticaseina de soja) previamente esterilizado, transferir assepticamente 5,0 ml para um tubo de ensaio de13X100, com auxlio de pipeta de 2,0 ml (tubo 1). A partir do tubo 1, transferir assepticamente 3ml, para o tubo 2, com auxlio de uma pipeta de 1 ou 2 ml A partir do tubo 2, transferir assepticamente 1ml, para o tubo 3, com auxlio de uma pipeta de 1 ou 2 ml. Incubar os 4 tubos em estufa 35-37C/24hs Fazer a leitura de turbidez e preencher o relatrio Fazer a desinfeco da bancada de trabalho com lcool 70%; Lavar as mos com gua e sabo ( lavagem higinica).

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Quadro 1- Resultados do teste de manipulao assptica TUBOS A 1 2 LMPIDO TURVO

3 Quadro 2-Interpretar os resultados obtidos no teste de manipulao assptica

Objetivos da aula prtica n 07 Espera-se que o aluno seja capaz de : 1) Qual a via mais importante de infeco acidental no laboratrio de microbiologia? Que procedimentos tcnicos devem ser utilizados para evitar o risco destas infeces? 2) Explicar por que a manipulao assptica no laboratrio de microbiologia deve, obrigatoriamente, ser feita atrs da chama do bico de Bunsen ? 3) Qual o resultado que voc obteve no experimento de manipulao assptica realizado na aula prtica ? Justifique a resposta. ANOTAES

AULA PRTICA : 51) CULTURA PURA DE MICRORGANISMOSA) Introduo

Um pr-requisito para a caracterizao de uma espcie microbiana no laboratrio de microbiologia que ela esteja disponvel para estudo como uma cultura pura. O termo cultura pura quer dizer que todas as clulas da cultura tem uma origem comum, isto , so descendentes da mesma clula. possvel obter uma cultura pura atravs da transferncia de uma clula para um meio de cultura adequado, atravs do uso de micromanipulador acoplado a um microscpio. Entretanto, na prtica microbiolgica so empregados mtodos indiretos para a obteno de culturas puras, baseados em tcnicas de isolamento de colnias, como por exemplo: (1) Tcnicas de esgotamento por estrias contnuas ou descontnuas, na superfcie do agar nutriente; (2) Diluio e semeadura por tcnica de pour plate ou de semeadura em superfcie de agar nutriente. Em termos prticos, considera-se que a populao microbiana de uma colnia proveniente de uma nica clula e portanto representa uma cultura pura. Na realidade, neste caso, o termo cultura axnica pode ser mais apropriado do que cultura pura porque cultura axnica significa o crescimento de um microrganismo em um ambiente livre de outros organismos. Essencialmente, o termo cultura pura implica em pureza gentica enquanto que cultura axnica no. b) Formao e crescimento de colnias Quando uma clula bacteriana isolada se reproduz dentro de um meio solidificado ou na sua superfcie, sua prognie vai se acumulando na forma de uma massa de clulas conhecida como colnia. Inicialmente o crescimento da colnia exponencial em relao ao tempo. Aps algumas divises, entretanto, a ordem de crescimento se torna mais complexa devido grande proximidade das clulas acumuladas. Esta proximidade cria uma situao, que pode ser chamada de aglomerao fisiolgica, na qual as clulas individuais competem entre si pelos nutrientes disponveis e afetam-se mutuamente pelo acmulo localizado de produtos residuais. Como os nutrientes precisam se difundir do meio circundante para as clulas, enquanto os produtos residuais do metabolismo devem se difundir das clulas para o ambiente, os membros individuais das colnias ficam sujeitos a uma variedade de condies ambiente, segundo sua localizao da colnia. O crescimento de colnias bacterianas afetado , no s pelas interaes de colnias vizinhas. Se as colnias estiverem muito prximas, elas interferem com o crescimento uma das outras pela depleo de nutrientes do meio ou pela excreo de produtos residuais txicos. O fenmeno comumente observado em placas semeadas por estrias em agar nutriente, para isolamento de bactrias. Nestas placas, as colnias que esto juntas so pequenas, enquanto aquelas que se encontram bem isoladas atingem tamanhos maiores. c) Estoque de culturas puras essencial que o mtodo de conservao e manuteno preserve todas as caractersticas da espcie, tais como foram evidenciadas no momento de seu isolamento. No laboratrio, so utilizadas as seguintes tcnicas com esta finalidade: (1) transferncia peridica para meios de cultura recm preparados: (2) conservao das culturas em agar inclinado, sob camada de leo mineral; (3) conservao das culturas pela dessecao rpida em estado congelado (liofilizao); (4) estocagem em temperaturas muito baixas, como por exemplo: freezer 70C; nitrognio lquido a 196C. Existem organizaes cuja principal funo manter em estoque de culturas puras autnticas de bactrias, fungos, algas, protozorios e de clulas animais. Como exemplos destas instituies, podemos citar:

(1) American Type Culture Collection ( ATCC) , localizada em Rockville, Maryland, USA; (2) Instituto Pasteur de Paris, em Paris, Frana; (3) National Collection of Type Culture (NCTC) em Londres , Inglaterra; (4) Japanese Type Culture Collection em Nagao, Tquio, Japo. Estas culturas puras de amostras padres so utilizadas em trabalhos de pesquisa e no controle de qualidade da rotina microbiolgica. Geralmente estas amostras so enviadas em ampolas ( liofilizadas) , mediante a compra ou doao. 2)TCNICA DE SEMEADURA EM TUBOS E PLACAS Trabalho individual: a) Identificar 2 placas contendo meio de cultura , com o nome do aluno ; b) A partir de um cultivo de 24 horas em meio lquido efetuar o isolamento de colnias, atravs da tcnica de esgotamento por estrias contnuas, em uma das placas. c) A partir de um cultivo de 24 horas em meio lquido efetuar o isolamento de colnias, atravs da tcnica de esgotamento por estrias descontnuas, na placa restante. d) Identificar 3 tubos de ensaio com os nmeros 1, 2 e 3. e) Transferir, de um cultivo de 24 horas em meio lquido, com uma agulha bacteriolgica um inculo para os tubos : (1) em picada (2) em picada e estria (3) em estria f) Incubar a 35-37C / 24 horas g) Fazer a leitura das placas verificando as caractersticas de crescimento e o isolamento das colnias.

Avaliao do crescimento bacteriano Crescimento em meio slido Forte: mais de 10 colnias na estria final (4 estria) Moderado: 0 a 5 colnias na estria final (4 estria) Crescimento em agar Crescimento em meio inclinado lquido Forte: estria com Forte: acentuada turvao , crescimento abundante pelcula superficial Moderado: estria com Moderado: turvao regular contorno definido

Escasso: 0 a 5 colnias na 2 Escasso: estria com falhas Escasso: leve turvao estria podendo Ter colnias isoladas Muito escasso: 1 a 5 Nulo: ausncia de Muito escasso: turvao colnias na 1 estria crescimento quase imperceptvel Obs: tcnica de esgotamento Obs: Tcnica de semeadura Obs: Tcnica de semeadura por estria descontnua por estria superficial por disperso Objetivos da aula 08:

O aluno dever ser capaz de : 1) Definir cultura pura de microrganismos e indicar sua importncia na prtica microbiolgica. Quais tcnicas utilizadas para a obteno de culturas puras? 2) Quais os mtodos de conservao de culturas puras no laboratrio de microbiologia? 3) Como feita a avaliao macroscpica do crescimento bacteriano em: (a) Placa semeada por tcnica de esgotamento por estrias descontnuas (b) Tubos contendo agar simples inclinado (c) Meios de cultura lquidos 4) Fazer o esquema da semeadura por esgotamento por : (a) estrias contnuas (b) estrias descontnuas

AULA PRTICA : 6PREPARAES MICROSCPICAS CORADAS As preparaes coradas so os exames microscpicos mais comumente empregados em microbiologia pois proporcionam uma melhor visualizao dos microrganismos, permitindo diferenciar vrios tipos morfolgicos, assim como, o estudo de suas estruturas, quando da utilizao de tcnicas especficas de coloraes. COLORAO DE GRAM O mtodo de Gram se baseia no fato de que o complexo formado entre o iodo (lugol) e a violeta de genciana (complexo iodo-pararosa-anilina) permanece retido dentro da clula de algumas bactrias mesmo aps o tratamento subseqente com o lcool (agente descorante). Estas bactrias so denominadas Gram positivas ou que tomam o Gram. Outras bactrias chamadas Gram negativas ou que no tomam o Gram descoram facilmente pelo lcool. Entretanto, se aps a ao do lcool se efetuar uma colorao de fundo utilizando-se a fucsina bsica, as bactrias Gram negativas aparecero coradas em vermelho, ao passo que as Gram positivas se apresentaro roxas, isto , conservaro a cor violeta do complexo iodo-violeta de genciana. O mecanismo da colorao de Gram no est ainda bem definido porm, se relaciona indubitavelmente s diferenas de permeabilidade da parede celular. Nas bactrias Gram positivas a parede constituda essencialmente por um componente mucopeptdico e o tratamento com lcool resulta uma desidratao e conseqente diminuio da permeabilidade,o que impede ou dificulta a eluio do complexo iodo-corante. O mesmo no acontece nas bactrias Gram negativas, nas quais o solvente orgnico atua em sentido contrrio determinando aumento de permeabilidae celular. A colorao de Gram de elevada importncia para a sistemtica em bacteriologia pois divide as bactrias em dois grandes grupos: GRAM POSITIVAS e GRAM NEGATIVAS, que reagem diferentemente frente a muitos agentes fsicos e qumicos. PREPARO DOS CORANTES DA COLORAO DE GRAM 1.- CRISTAL VIOLETA FENICADO (seg. Nicolle): 1.1 - Frmula: Cristal violeta lcool a 95GL Fenol fundido gua destilada 1,0 10,0 2,0 100 g ml g ml

1.2 - Fenol fundido: para manter o fenol fundido dissolver em Banho-Maria a 5060C e adicionar 10% de gua destilada.

1.3 -. Preparo: triturar o cristal violeta em um gral. Adicionar o lcool, homogeneizar. Juntar o fenol fundido. Acrescentar aproximadamente 50 ml de gua destilada, misturar e transferir para um frasco mbar de rolha eesmerilhada. Lavar o gral 2 a 3 vezes com o restante de gua destilada. Deixar em repouso durante 24 horas. Filtrar em papel ou algodo para outro frasco mbar de rolha esmerilhada. Estocar. NOTA: Quando da transferncia do corante em estoque para frascos conta-gotas filtrar novamente com papel de filtro ou algodo. 2 - MORDENTE (sol. de lugol) 2.1 -Frmula: Iodo Iodeto de potssio gua destilada 1,0 2,0 300 G G Ml

2.2 - Preparo: triturar o iodo com iodeto de potssio em um gral. Adicionar aos poucos a gua destilada. Misturar bem. Filtrar e estocar em frasco mbar de rolha esmerilhada. 2.3 - AGENTE DESCORANTE (lcool) Usar apenas solventes P.A. podendo-se empregar o lcool etlico 95 mistura de lcool-cetona (1:1); ou a de ter-cetona na proporo de (1:3). 2.4 - CORANTE DE FUNDO (FUCSINA BSICA)a.

Preparo: diluir a fucsina de Ziehl (ver mtodo de colorao de Ziehl) 1:10 em gua destilada. Filtrar em papel ou algodo e estocar em frasco mbar de rolha esmerilhada.

Atividade prtica -

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Fazer a desinfeco da bancada de trabalho com lcool 70%; Lavar as mos com gua e sabo ( lavagem higinica). Em uma lmina desengordurada e seca faa um esfregao utilizando uma suspenso bacteriana ( no esquecer de passar a ala bacteriolgica no lcool areia antes de flamb-la). Fixar o esfregao passando-o trs vezes pela chama Cobrir o esfregao por 1 minuto com cristal violeta. Escorrer o corante, cobrir 1 minuto com lugol. Lavar em gua corrente de baixa presso. Descorar com lcool-cetona (tempo delicado 5-10 segundos). Lavar em gua corrente de baixa presso. Corar com fucsina de Ziehl 1:10 durante 30 segundos. Lavar em gua corrente de baixa presso. Deixar secar espontaneamente ao ar. Leitura ao microscpio com objetiva de imerso. Fazer o desenho das observaes ao microscpio

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Classificar as bactrias observadas em relao morfologia e colorao Fazer a desinfeco da bancada de trabalho com lcool 70%; Lavar as mos com gua e sabo ( lavagem higinica

AULA PRTICA: 7ANTIBIOGRAMA: TCNICA DE DIFUSO EM GAR. INTRODUO A sensibilidade dos microrganismos a drogas pode ser investigada em rotina pelos mtodos de diluio (tcnicas de microdiluio em caldo, tcnica de diluio em gar), de difuso em gar e de diluio do disco em caldo (bactrias anaerbias). Nos mtodos de diluio, concentraes previamente determinadas da droga so incorporadas ao meio de cultura, o microrganismo semeado e o sistema incubado em temperatura e atmosfra adequadas. Depois de um perodo de tempo definido, verifica-se a menor concentrao da droga que foi capaz de impedir o crescimento do microrganismo. O meio pode ser lquido ou slido. Nos mtodos de difuso, deixa-se a droga difundir no meio de cultura slido a partir de um reservatrio, que pode ser um orifcio no meio de cultura, uma tira ou um disco de papel de filtro ou mesmo uma pastilha. Depois que o microrganismo uniformemente semeado, coloca-se a droga no meio de cultura, incuba-se o sistema e verifica-se depois de 18-24 horas, se o crescimento do microrganismo foi inibido. O significado da inibio interpretado de acordo com a tcnica usada. Considerando-se que na prtica bacteriolgica a tcnica mais utilizada a de difuso em gar pelo sistema de discos proposta por KirbyBauer, descrevemos abaixo os principais aspctos tcnicos deste procedimento com base nas recomendaes de especialistas nacionais e internacionais. MEIO DE CULTURA Entre os vrios meios de cultura disponveis, o gar de Mueller-Hinton considerado o melhor para a realizao dos testes de susceptibilidade de rotina, devido os seguintes fatores: 1) Boa reprodutibilidade em diferentes partidas do meio; 2) Apresenta baixa concentrao de inibidores para sufonamidas, trimetropim e tetraciclinas; 3) Proporciona crescimento satisfatrio da maioria dos patgenos; 4) Devido a tradio de uso encontra-se diponvel, na literatura para estudos comparativos, uma grande quantidade de resultados do antibiograna obtidos com este meio de cultura. O meio de Mueller-Hinton deve ser de sangue de carneiro ou coelho quando as necessidades do microrganismo o exigirem. Para as espcies do gnero Haemophilus o meio deve ser preparado sob a forma de gar chocolate. Preparo do Meio de Mueller-Hinton - Preparar o gar de Mueller-Hinton desidratado (frmula: Infuso de carne 2g; hidrolisado cido de casena 17,5g; amido 1,5g; gar-gar 17g; gua destilada 1000ml) conforme as instrues do fabricante. Imediatamente aps a autoclavao, resfriar o meio em Banho-Maria 45-50oC. Distribuir o meio para placas de Petri de forma a obter uma camada de

aproximadamente 4 mm de espessura. Isto corresponde a 60-70ml de meio para placas de 140mm de dimetro interno e 25-30ml para placas com 90mm de dimetro interno, podendo ser utilizadas placas de vidro ou de plstico. Deixar o meio solidificar a temperatura ambiente. A no ser que as placas sejam usadas no mesmo dia, estoc-las em refrierador (2 a 8oC). Utilizar as placas at sete dias aps o preparo. Fazer o controle de esterilidade de algumas placas do total de placas preparadas. Incubar estas placas na estufa a 30-37oC durante 24-48 horas. Descartar as placas usadas como controle. Estocagem dos Discos - Os cartuchos ou frascos contendo os discos de papel de filtro impregnados com os agentes antimicrobianos geralmente so fornecidos em recipientes individualizados apropiados. Os mtodos de acondicionamnto devem assegurar as condies anidras adequadas. Para estocagem dos discos por longo perodo de tempo, necesrio obter os seguintes cuidados: 1) Manter os discos refrigerados (< 8oC ) ou congelados a -14 oC, dependendo da droga; 2) Para preservar a potncia, congelar os discos centendo drogas da famlia dos lactmicos. Estes discos, quando refrigerados (2-8 oC), aprentam validade de uma semana; 3) Retirar os frascos de dicos do refrigerador ou freezer uma ou duas horas antes do uso. Antes de abr-los, mant-los fechados at ocorrer o equilbrio com a temperatura ambiente. Este procedimento reduz ao mnimo a formao de gua de condensao devido ao choque trmico; 4) No caso do uso de dispositivo mecnico para aplicao dos discos, ele deve estar acondicionado em recipiente fechado e rgido, contendo um agente desecante. Antes de abr-lo, observar os cuidados descritos anteriormente para evitar o choque trmico; 5) Evitar excesso de umidade nos recipientes que contm os discos, subsituir o agente dessecante quando o indicador mudar de cor; 6) Quando fora do uso, manter o dispositivo para aplicao de discos em refrigerador (2-8oC); 7) Utilizar os discos contendo agentes antimicrobianos dentro do prazo de validade. Suspenso Padro de Sulfato de Brio - usada para padronizar a densidade do inculo em aproximadamente 1,5 x 108 UFC/ml, que corresponde a uma tubidez equivalente ao tubo 1/2 da escalade McFarland. Tcnica de Preparo: 1) Adicionar 0,5ml de uma soluo 0,048M de cloreto de Brio (11,7g de BaCl2 2H2O para 1000ml de gua destilada), 99,5ml de uma soluo 0,36N (1% v/v ) de cido sulfrico (1ml de H2SO4 para 99ml de gua destilada); 2) Verificara a densidade da turbidez desta suspenso padro em espectofotmetro a 625 nm. A absorbncia encontrada deve estar entre 0,08 a 0,1; 3) Distriibuir volumes de 4-6 ml para tubos de ensaio com tampa de rosca de tamanho identico aqueles usados para o preparo do inculo; 4) Apertar bem as tampas de rosca dos tubos. Selar com parafina. Estocar os tubos a temperatura ambiente, ao abrigo da luz 5) Antes do uso, agitar vigorosamente a suspenso padro de Sulfato de Brio em agitador de tubos; 6) Aps trs meses do preparo, substituir a supenso ou verificar sua densidade em espectofotmetro

Preparo de Inculo 1) Mtodo padro: a) A partir de um cultivo em placa de gar nutriente, selecionar 4 a 5 colnias b) Assepticamente, com auxilio de ala bactriolgica, tocar a parte superior do centro de cada colnia e transfer-las para um tubo de ensaio contendo 4-5ml de caldo tripticasena soja; c) Incubar na estufa em aerobiose a 35-37 oC at obter ou exceder a turbidez da suspenso padro de Sulfatode Brio; d) Ajustar aturbidez da cultura em crescimento ativo em caldo com soluo salina esterilizada (NaCl 0,85%) ou caldo nutriente at obter uma turbidez visualmente comparvel com aquela da suspenso padro. Para executar esta etapa de forma apropriada usar iluminao adequada, observar os tubos (teste padro) contra um fundo branco com linhas pretas contrastantes, ou sobre um texto de jornal. 2) Procedimento Alternativo Padronizado: Para os testes de susceptibilidade de rotina o preparo do inculo pode ser feito diretamente a partir de um cultivo bacteriano de 18-24 horas em placa de gar nutriente no seletivo, comoo gar sangue. Assepticamente, com auxlio de ala bacteriolgica, transferir vrias colnias (mais de 5 ) identicas para um tubo de ensaio contendo um pequeno volume de soluo salina e preparar uma suspenso bacteriana fortemente turva. Imediatamente, diluir com soluo salina e ajustar a turbidez desta suspenso com aquela suspenso padro de Sulfato de Brio. Este o procedimento de escolha para testar espcies de bactrias que no crescem bem em caldo nutriente. Semeadura em Placa - Dentro de 15 min. da padronizao da turbidez da suspenso do inculo, assepticamente, introduzir um cotonete e homogenizar. Ao retirar o cotonete precionar firmemente contra a parede do tubo, para remover o excsso da suspenso. A seguir semear a superfcie do gar de Mueller-Hinton de maneira uniforme. Efetuar a semeadura trs vezes, sem recarregar o cotonete, inoculando por estrias nos planos paralelo, perpenicular e diagonal ao dimetro da placa. Deixar a placa secar a temperatura ambiente por 3-5 min. Apliao do Disco - Os discos podem ser aplicados com dispoitivos mecnicos mltiplos ou individuais, ou manualmente com auxlio de uma pina. Os discos devem ser precionados levemente contra a superfcie do meio. Devem ser colocados pelo menos 20mm da borda da placa e devem distar um do outro de pelo menos 30mm. Considerandose que algumas drogas se difundem quase que instantaneamente, o disco no pode ser movido de posio aps o contato com a superfcie do gar de Mueller-Hinton. Colocar no centro da placa os discos dos antibiticos que se difunde com menos intensidade, EX: polimixina, bacitracina e vancomicina. Incubao das Placas - Inverter as placas e coloc-las na estufa, em aerobiose, a 35 oC dentro de 15min. aps aplicao dos discos. Quando testar Hamophilus spp ou N. gonorrhoeae, as placas devem ser incubadas em atmosfera de microaerofilia, utilizando 5 a 7% de CO2. Leitura das Placas - Aps 16 a 18 horas de incubao examinar cada placa e medir, com auxilio de uma rgua, o dimetro da zona de completa inibio incluindo o dimetro do disco. O halo de inibio do gar Mueller-Hinton medido macroscopicamente, em milmitros, pelo lado externo do fundo da placa, utilizando-se luz refletida sobre um fundo escuro. No caso do Mueller-Hinton ser adicionado de sangue, medir as zonas de inibio na superfcie do meio de cultura, com a tampa da placa removida.

Interpretao - A categoria que a bactria colocada, isto , resistente, intermediria ou sensvel, obtida pelo tamanho do halo de inibio Controle de Qualidade - Com finalidade de avaliar a preciso e a exatido dos testes, utilizam-se amostras padres de Staphylococcus aureus (ATCC 25923), E.coli (ATCC25922) e Pseudomonas aeroginosa (ATCC 27853), que devem ser testadas quando do preparo ou aquisio de cada lote de discos contendo os agentes antimicrobianos. Para testar as culturas das amostras padres de controle, elas devem ser ativadas pela semeadura em TSB, incubadas em a 35-37oC por 18-24 horas para a obteno de colnias isoladas. Preparar o inculo e fazer o antibiograma descrito anteriormente. AMOSTRA: Agente antimicrobiano Concentrao Dimetro Interpretao

AULA PRTICA : 8IDENTIFICAO DE BACILOS DA FAMLIA Enterobacteriaceae

INTRODUO Os bacilos Gram negativos pertencentes famlia Enterobacteriaceae so microrganismos freqentemente isolados de amostras clnicas enviadas aos laboratrios de Microbiologia. Antes do advento dos antibiticos, quimioterpicos e imunosupressores, as doenas infecciosas causadas pelas enterobactrias estavam essencialmente limitadas aos tratos gastrointestinal, pulmonar e urinrio. Atualmente estas podem ser isoladas de infeces de praticamente todos os stios anatmicos e o microbiologista deve estar

preparado para isolar estes microrganismos a partir de qualquer material biolgico enviado ao laboratrio. Embora seja possvel uma identificao preliminar das enterobactrias baseada nas caractersticas das colnias e nas reaes bioqumicas em meios de isolamento primrio, a identificao dos diferentes gneros e espcies exige muitas vezes uma srie de testes bioqumicos. Atualmente dispomos de vrios esquemas para a identificao das enterobactrias podendo estes serem fonecidos aos laboratrios clnicos em kits comerciais. Isto vem facilitar a identificao adequada das enterobactrias, j que, muitos laboratrios tm dificuldade em preparar e manter os diversos meios necessrioos realizao da identificao definitiva convencional. Anteriormente a identificao das espcies de Enterobacteriaceae era realizada utilizando-se fluxogramas. Atualmente, estes no esto sendo utilizados com freqncia em vista do uso bastante difundido de sistemas compactos numricos de perfis e dados de referncia computadorizados. O emprego dos sistemas de identificao tornou possvel definir biotipos ou impresses digitais bioqumicos mediante os quais muitas espcies bacterianas conhecidas podem ser sub-agrupadas. Foram desenvolvidas frmulas matemticas pelas quais os resultados das provas bioqumicas so convertidos em nmeros de biotipos, possibilitando o uso de computadores para auxiliar na identificao definitiva das enterobactrias. Alguns fabricantes dispem de guias ou registros de perfis que fornecem uma lista dos nmeros de biotipos das vrias espcies bacterianas. Os nmeros de biotipos esto baseados em dados obtidos a partir da anlise de milhares de reaes bioqumicas. A biotipificao uma valiosa ajuda para reconhecer grupos bacterianos. Isto necessrio durante uma investigao epidemiolgica ou quando se estuda a fonte de infeces cruzadas nos hospitais. A anlise dos biotipos de algumas espcies bacterianas pode levar a uma melhor interpretao a cerca de como a variao das caractersticas de identificao pode estar relacionada com diferenas conhecidas quanto a virulncia de diferentes cepas. No comrcio brasileiro existem sistemas computadorizados de identificao baseados em combinaes de provas bioqumicas organizadas em kits compactos de utilizao direta de substrato (BAC-TRAY, API-20, ENTEROTUBE), como tambm, kits que empregam meios de cultura (LABORCLIN, BIOPROV, PROBAC, NEWPROV). Em ambos os casos os parmetros usados so muito semelhantes. Assim sendo, a escolha de um deles uma questo de preferncia pessoal. importante lembrar que um bom diagnstico microbiolgico no depende somente de uma srie de carctersticas diferenciais e que o sistema de identificao no um dispositivo infalvel. O microbiologista deve integrar os dados bioqumicos s caractersticas coloniais (cor, tamanho, textura, odor, reaes hemolticas), colorao de Gram, aos caracteres morfolgicos e, se disponveis, s reaes sorolgicas, para ento efetuar uma identificao final de forma confivel. O microbiologista deve conhecer os princpios das provas bioqumicas empregadas no laboratrio a fim de que qualquer inconsistncia bioqumica, problemas com culturas mistas ou tcnicas errneas possam ser rapidamente conhecidas e corrigidas. Nesta unidade esto apresentadas as provas bioqumicas bsicas do sistema R/b (no disponvel no comrcio brasileiro para a identificao de bacilos Gram negativos pertencentes famlia Enterobacteriaceae. O mecanismo bioqumico aqui apresentado ser sempre o mesmo, independente do sistema utilizado.

TRIPLICE AUCAR FERRO (TSI) 1.Finalidade: Determinar a habilidade de um microrganismo em utilizar, incorporados a um meio basal, glicose e ou lactose e sacarose com ou sem a produo de gs; evidenciar ainda a produo de gs sulfdrico (H2S). O meio de TSI empregado comumente em bacteriologia para a identificao preliminar (triagem) das enterobactrias. 2. Frmula:Extrato de carne Extrato de levedura Peptona Lactose Sacarose Glicose Sulfato ferroso Tiossulfato de sdio Cloreto de sdio Vermelho de fenol Agar-agar gua destilada 3,0 3,0 20,0 10,0 10,0 1,0 0,2 0,3 5,0 0,024 12,0 1000 g g g g g g g g g g g ml

3. Mecanismo: A utilizao dos acares presentes no meio de TSI pode ocorrer aerobicamente na superfcie ou anaerobicamente em profundidade, ou simultaneamente, dependendo do potencial enzimtico do microrganismo em questo. Basicamente encontramos no meio de TSI os 3 modelos de fermentao abaixo apresentados: * (1) Apenas a fermentao da glicose (K/A). A superfcie alcalina (vermelha) indica a ocorrncia da degradao oxidativa da glicose. Aps aproximadamente 18 horas de incubao, a glicose totalmente consumida devido a sua baixa concentrao (0,1%) e o microrganismo comea ento a utilizar as peptonas, presentes no meio, para o seu crescimento. O catabolismo das peptonas resulta na liberao da amnia (NH3) responsvel pela alcalinizao da superfcie do meio de cultura. A profundidade do meio permanece amarela devido a prvia fermentao da glicose com produo de cidos relativamente estveis. Portanto, o pH da base se torna mais cido que o da superfcie do meio onde ocorreu a oxidao do acar. * (2) Fermentao da lactose, sacarose e glicose (A/A). Alguns microrganismos tem a capacidade de usar todos os acares presentes, resultando na acidificao da superfcie e da base. Tanto a lactose como a sacarose esto presentes em concentraes 10 vezes maiores do que a glicose; portanto, aps 18 horas de incubao a glicose consumida mas existe ainda grandes quantidades dos outros dois acares. Dependendo do tempo de incubao, a superfcie pode se apresentar alcalina devido a depleo da lactose e sacarose com conseqente utilizao das peptonas presentes no meio. * (3) No fermentao da lactose, sacarose ou glicose (k/K) ou (K/NC). Certas bactrias, principalmente bacilos Gram negativos no entricos, so incapazes de fermentar os acares presentes no TSI. O desenvolvimento destes microrganismos ocorre devido a degradao das peptonas. A reao K/K resultado da degradao tanto aerbica quanto

anaerbica das peptonas, enquanto que o modelo K/NC devido ao catabolismo somente aerbico destas substncias. Os gases produzidos no meio de TSI so CO2 e H2 e as bactrias produtoras so chamadas aerognicas. No caso da no formao de gases so ditas anaerognicas. O meio de TSI evidencia ainda a presena de bactrias produtoras de gs sulfrdrico (H2S), resultante da reao em duas etapas: - A bactria num ambiente cido degrada o tiossulfato de sdio (substrato) com a produo de gs sulfdrico que um gs incolor e invisvel. - Numa segunda etapa, o H2S reage com o sulfato ferroso existente no meio (revelador) formando o sulfeto ferroso que um composto insolvel, responsvel pela colorao negra que aparece no meio de TSI. Observar que a produo de H 2S implica na produo de cido mesmo que a colorao amarela no possa ser observada. 4. Tcnica de semeadura: picada profunda e estria superficial 5. Tcnica de preparo: Meio encontrado comercialmente desidratado. Portanto, para o preparo do meio seguir as instrues do fabricante. 6. Leitura e Interpretao: Reao na superfcie ou pice / reao na profundidade ou base: K: alcalino A: cido AG: cido e gs H2S: gs sulfdrico

INDOL 1. Finalidade: Determinar a habilidade de um determinado microrganismo em produzir indol a partir da molcula de triptofano. 2. Mecanismo: O triptofano um aminocido que quando degradado por certas bactrias levam formao principalmente dos seguintes produtos metablicos intermedirios: indol, escatol (metil indol) e cido indol-actico. As vrias enzimas intracelulares envolvidas neste processo fisiolgico so coletivamente denominadas de triptofanases. Os produtos intermedirios formados em maior quantidade na degradao do triptofano so o cido indol pirvico, que produz indol por desaminao-deaminao, e o escatol formado pela descarboxilao do cido indol-actico. A presena do indol no meio de cultivo revelada pela adio do reativo de Kovacs, ocorrendo ento a seguinte reao qumica:

O p-dimetil-amino-benzaldedo se liga molcula do indol produzindo um composto quinoidal de colorao vermelha, evidenciado pela formao de um anel na camada alcolica superficial do meio. A reao de cor na realidade devido a reao dos grupos CH2 do anel pirrlico da molcula do indol com o aldedo, que num meio cido forma uma quinona. 4. Tcnica de preparo: A prova do indol pode ser realizada utilizando-se um meio especfico para esta prova. Entretanto, nos laboratrios de rotina de microbiologia clnica, geralmente, empregam-se meios que fornecem leitura de outras provas bioqumicas alm do indol, como por exemplo o MIO (motilidade, indol e ornitina). Os meios so encontrados comercialmente desidratados. Portanto, para o preparo seguir as instrues do fabricante. 5. Leitura e Interpretao: Adicionar 5 gotas de Reativo de Kovacs na superfcie do meio inoculado: - Positivo: desenvolvimento de anel vermelho na superfcie do meio de cultivo. - Negativo: sem desenvolvimento de cor na camada alcolica. Obs. Pode ocorrer o desenvolvimento de uma colorao laranja na superfcie do meio devido a presena de escatol, que pode ser um dos precursores para a formao do indol.

CITRATO DE SIMMONS 1. Finalidade: Determinar se um microrganismo capaz de utilizar o citrato como nica fonte de carbono para o seu crescimento com conseqente alcalinizao. 2. Mecanismo: Normalmente, o metabolismo do citrato envolve a condensao de uma molcula acetil com a coenzima A mais o oxalacetato para iniciar o ciclo de Krebs. A grande maioria das bactrias utilizam o citrato pelo ciclo dos cidos tri-carboxlicos ou atravs da via fermentativa. A clivagem do citrato envolve a participao da citratase. O citrato transformado em acetato e oxalacetato sendo este ltimo transformado em piruvato e CO2. O meio de cultivo utilizado para a fermentao do citrato tambm contm um sal inorgnico de amnia. O microrganismo que usa o citrato como nica fonte de carbono tambm utiliza o sal de amnia como nica fonte de nitrognio. A degradao destes sais produz amnia (NH3) com a conseqente alcalinizao. 4. Tcnica de semeadura: estria superficial (risco). Utilizar um inculo pequeno. 5. Tcnica de preparo: Meio encontrado comercialmente desidratado. Portanto, para o preparo do meio seguir as instrues do fabricante. 6. Leitura e Interpretao: - Positivo: crescimento bacteriano com ou sem alterao da cor do meio para azul. - Negativo: ausncia de crescimento bacteriano. No ocorre alterao da cor do meio.

MOTILIDADE (agar semi-slido pH 7,2) 1. Finalidade: Determinar se um microrganismo mvel ou imvel., ou seja se tem ou no flagelo. 2. Tcnica de preparo: A prova da motilidade pode ser realizada utilizando-se um meio especfico para esta prova. Entretanto, nos laboratrios de rotina de microbiologia clnica, geralmente, empregam-se meios que fornecem leitura de outras provas bioqumicas alm do indol, como por exemplo o MIO (motilidade, indol e ornitina). Os meios so encontrados comercialmente desidratados. Portanto, para o preparo seguir as instrues do fabricante. 4. Tcnica de semeadura: por picada profunda. 5. Leitura e Interpretao: - Positivo: o microrganismo mvel se difunde ao redor da linha da picada, apresentando o aspecto de uma nuvem difusa. - Negativo: o microrganismo imvel cresce apenas ao longo da linha de semedura.

LISINA DESCARBOXILASE 1. Finalidade: Determinar a habilidade enzimtica de um determinado microrganismo em descarboxilar o aminocido lisina com a conseqente alcalinizao do meio de cultivo pela formao da amina correspondente. 2. Mecanismo: A descarboxilao um processo no qual as bactrias que possuem enzimas descarboxilases especficas, so capazes de atuar nos grupos carboxila-terminal (COOH) dos aminocidos produzindo uma amina ou diamina e dixido de carbono. As enzimas descaboxilases so numerosas, porm especficas para um determinado substrato (aminocido). Estas enzimas so adaptativas porque so formadas pelos microrganismos somente quando estes so cultivados em ambiente cido, na presena do substrato especfico. Os produtos de descarboxilao por sua vez, determinam uma alcalinidade no pH do meio de cultura. A descarboxilao restrita queles aminocidos que possuem pelo menos um grupo quimicamente ativo alm da amina (-NH2) ou do grupo carboxlico (COOH) e a quebra do aminocido ocorre anaerobicamente. A descarboxilao um processo irreversvel no oxidativo e requer uma coenzima comum. o piridoxal fosfato. O aminocido lisina, sob a ao da lisina descarboxilase forma uma diamina (cadaverina) e dixido de carbono. NH2-CH2-(CH2)3-CH-NH2-COOH (L-lisina) lisina descarboxilase - CO2 NH2-CH2-(CH2)3-CH2-NH2 + CO2 (cadaverina) 4. Tcnica de semeadura: por disperso. 5. Leitura e Interpretao: - Positivo: desenvolvimento de uma colorao prpura. - Negativo: desenvolvimento de uma colorao amarela. OBSERVAO O princpio bioqumico da descarboxilao da ORNITINA E ARGININA semelhante ao descrito acima, mudando na frmula simplesmente o amincido a ser descarboxilado como tambm a diamina formada pela ao do microrganismo no substrato (ornitina e arginina), originando a putrescina. NH2-CH2-(CH2)3-CH-NH2-COOH (L-ornitina)

CO2

ornitina descarboxilase +

NH2-CH2-(CH2)3-CH2-NH2 + CO2 (putrescina)

NH=CNH2-NH-(CH2)3-CH-NH2-COOH (L-arginina) arginina descarboxilase + CO2 NH2-CH2-(CH2)3-CH2-NH2 + CO2 (putrescina)

FERMENTAO DE CARBOIDRATOS 1. Finalidade: Determinar a habilidade de um microrganismo em fermentar um carbohidrato especfico incorporado num meio basal com a produo de cido ou cido e gs. Obs. Uma nica base pode ser empregada para a observao da capacidade do microrganismo de fermentar diferentes acares. O carbohidrato dever ser incorporado ao meio base na hora do uso. Nos laboratrios de rotina de microbiologia clnica so utilizados meios que fornecem leitura de outras provas bioqumicas alm da fermentao de acares (glicose, lactose, sacarose), como por exemplo o TSI, Rugai, KIA, etc... 2. Mecanismo: A fermentao um processo metablico anaerbico de xido-reduo no qual um substrato orgnico serve como aceptor final de hidrognio. Na fermentao de substratos orgnicos como os carbohidratos ocorre a formao de produtos oxidados e reduzidos, que dependem de alguns fatores tais como: (1) o tipo de microrganismo (2) a natureza do substrato a ser fermentado (3) as condies ambientais de cultivo com temperatura, acidez, etc... Os produtos de fermentao dos carbohidratos e lcoois, genericamente denominados de acares, so poucos: dois gases (H2 e CO2), poucos cidos e lcoois e uma cetona. 4. Tcnica de semeadura: por disperso. 5. Leitura e Interpretao: - Fermentao do acar: meio cido - colorao amarela. - No fermentao do acar: meio alcalino - colorao vermelha.

FENILALANINA DESAMINASE 1. Finalidade: Determinar a habilidade de um microrganismo em desaminar a fenilalanina com a conseqente modificao de meio de cultivo pela formao de cido fenilpirvico. 2. Mecanismo: O aminocido aromtico fenilalanina sofre desaminao oxidativa, catalizada por uma flavoprotena, para produzir o cido fenilpirvico. A desaminao oxidativa resulta na liberao de um grupo amina (NH2) do aminocido para formar um alfa cetocido de ligao dupla e amnia (NH3). Este processo ocorre em duas etapas: inicialmente o hidrognio retirado do aminocido formando um iminocido. Este hidrognio livre se combina com o oxignio para formar gua e consequentemente o iminocido hidrolizado em um cetocido. A fenilalanina desaminada em cido fenilpirvico e este durante a incubao reduzido a cido fenilactico. O cido fenilactico pode ser convertido em fenilalanina, com isso, iniciando novamente o ciclo. Uma pequena quantidade de cido fenilpirvico susceptvel a ser descarboxilado a cido fenil actico, o qual tambm pode se reconvertido em fenilalanina. A evidenciao da desaminao da fenilalanina no meio de cultivo revelada pela adio do reativo cloreto frrico, ocorrendo a seguinte reao qumica: o cloreto frrico um agente oxidante e os ons frrico (Fe +++) em soluo cida com hidrazina formar como produto final nitrognio e amonaco. O cloreto frrico atua como agente quelante fazendo com que o cido fenilpirvico desenvolva uma colorao verde. 3. Tcnica de semeadura: estria superficial 4. Leitura e interpretao: Aps 18 24 horas de incubao adicionar 4 a 5 gotas da soluo de cloreto frrico diretamente no tubo inoculado. - Positivo: desenvolvimento de uma colorao verde escura. - Negativo: sem desenvolvimento de cor. PROVA DA OXIDASE 1. Finalidade: Determinar a presena da enzima oxidase (citocromo oxidase). 2. Mecanismo: Os citocromos so hemeprotenas que atuam com aceptores intermedirios de eltrons no processo de respirao aerbia, envolvendo no estgio final desta cadeia a participao da enzima oxidase (citocromo oxidase). O sistema citocromo ocorre em organismos aerbios ou anaerbios facultativos, podendo estar associado nestes casos enzima oxidase. A prova da oxidase empregada para investigar aqueles microrganismos que apresentam ou no esta enzima ou que so anaerbios obrigatrios. O teste utiliza certos reagentes (corantes) tais como o dicloridrato de tetrametil-fenilenodiamino, que substituindo o oxignio atua como aceptor artificial de eltrons. O corante no estado reduzido incolor, contudo na presena da citocromo oxidase e do oxignio atmosfrico oxidado tomando uma colorao escura. 3. Execuo do teste:

Atritar em um pedao de papel de filtro uma poro da colnia bacteriana a ser testada. Adicionar uma gota do reativo sobre o inculo. 4. Leitura e Interpretao: - Positivo: desenvolvimento de uma colorao prpura imediatamente aps a adio de reativo - Negativo: sem o desenvolvimento de cor. OBS: Existem no mercado brasileiro fitas ou discos impregnados com o reativo.

PROVA DO KCN 1. Finalidade: Determinar a capacidade de um microrganismo em reproduzir-se em um meio que contenha cianeto de potssio. 2. Mecanismo: A respirao aerbia um processo de xido-reduo que produz energia. A maioria dos organismo aerbicos possuem a enzima citocromo-oxidase que as tornam capazes de utilizar o oxignio como aceptor de hidrognio. O Cianeto um inibidor no competitivo do sistema citocromo-oxidase. No entanto, alguns microrganismos aerbicos no so sensveis ao cianeto. Esta resistncia se deve provavelmente, a um sistema de respirao flavoproteica. 3. Tcnica de semeadura: Semear por disperso inculo pouco denso. 4. Leitura e interpretao: Aps 24 - 48 horas de incubao a 35 C, alguns podem precisar at 4 dias de incubao, observar a presena ou ausncia de crescimento bacteriano. - Positivo Crescimento (meio turvo) - Negativo Ausncia de crescimento (meio inalterado). OBS: O cianeto extremamente txico e deve ser destrudo pela adio de sulfato ferroso e 0,1 ml de KOH a 40 % para inativao do cianeto. Aps autoclavar os tubos.

AULA PRTICA: 9VISUALIZAO DE FUNGOS INTRODUO Os fungos possuem dois tipos morfolgicos: as leveduras, que so inicelulares, e os bolores ou fungos filamentosos, que so multicelulares.

Os fungos filamentosos possuem como elemento constituinte a hifa; o conjunto de hifas denominado como miclio. Quanto funo, o miclio classifica-se em vegetativo e reprodutor. Para se observar a morfologia microcpica dos bolores, deve-se analisar os miclios vegetativo e reprodutor. No miclio vegetativo, deve-se analisar a hifa, varificando-se o seu dimetro, a presena ou ausncia de septos e pigmento. Deve-se tambm observar a existncia de estruturas diferenciadas na hifa, como por exemplo: rizides (estruturas semelhantes raiz), gavinhas ( hifas enroladas), esporos formados por mutiplicao vegetativa ( clamidocondio e artrocondio). No miclio reprodutor, deve-se analisar se os esporos so endgenos formados em esporangiforos, ou se so exgenos (condios) formados em conidiforo. Deve-se ainda analisar a forma, tamanho, e cor desses esporos. Com relao s leveduras, deve-se observar as caractersticas da clula vegetativa, verificando a forma, o tamanho (2-5 a 15-50 m), presena ou ausncia de cpsula e pseudo hifas. E, tambm, as caractersticas de reproduo vagetativa: formao, brotamento (blastocondio), clamidocondio e artrocondio. MTODO Observar a morfologia microscpica de bolores e laveduras coradas com lacrofenol azul-algodo, tintura da china (cpsula), ou sem colorao ( prova de filamentao). As lminas preparadas so realizadas com esfregaos fixados (colorao de Gram) montagem mida, semelhante a um exame a fresco ou com cultivo em lmina. RUSULTADO E INTERPRETAO Esquematizar a estrutura e morfologia dos fungos Lmina 1 Lmina 2

OBS: Apesar dos fungos serem todos Gam-positivos, esta colorao no utilizada para bolores, pois a montagem atravs de esfregaos fixados destruiria a estrutura de continuidade que existe entre o miclio vegetativo e o reprodutor e tambm impediria, pela cor da violeta-genciana, a visualizao dos septos. A colorao de Gram para visualizar a morfologia das leveduras pode ser utilizada, pois esta um fungo unicelular, e quando h necessidade de visualizar outras estruturas utilizam-se os mtodos como a colorao com tintura-da-china para cpsula e a prova da filamentao, que um cultivo em lmina para visualizar a pseudo-hifa e os esporos formados por multiplicao vegetativa . OBJETIVOS:

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visualizar estruturas vegetativas de fungos filamentosos. visualizar estruturas de reproduo dos fungos filamentosos. visualizar a formadas leveduras. visualizar os esporos formados por multiplicao vegetativa das leveduras e bolores. visualizar cpsulas das leveduras. Citar algumas coloraes utilizadas para exame microscpico de fungos.

AULA PRTICA : 10CONTROLE DA MICROBIOTA DAS MOSINTRODUO: As mos constituem um dos elos mais importantes na cadeia da infeco cruzada. A quantidade de microrganismos constituintes da microbiota normal da pele do cirurgio deve ser reduzida, assim como possveis microrganismos patognicos presentes devem ser eliminados. OBJETIVOS verificar o grande nmero de microrganismos que existe na pele. Observar a eficcia da lavagem das mos e do uso de um antissptico na reduo dos microrganismos da pele.

MATERIAL NECESSRIO: -

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Uma placa de agar sangue; Ala de platina; Trs swabs esterilizados; Um tubo contendo 10 ml de soluo salina esterilizada; Frasco contendo detergente; Frasco contendo lcool 70%

PROCEDIMENTO -

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Dividir o fundo da placa de Petri contendo gar-sangue em trs partes. Identificar a placa. Retirar um swabs do tubo, com assepsia, umidec-lo em salina estril e esfregar sobre a pele da palma da mo. A seguir semear 1/3 da placa de gar-sangue com swabs, identificando mos sem lavar. Lavar as mos com detergente (sabo),vigorosamente, em todas as superfcies, durante 5 min. (deve-se utilizar escovas). A seguir pegar outro swabs

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esterilizado, umidecer em salina esterilizada e esfregar na pele das mos lavadas. A seguir semear o segundo 1/3 da placa. Identificar: mos lavadas. Desinfetar as mos pr-lavadas ( 5 min. Com sabo) com lcool 70% (durante1 min.). A seguir utilizando-se outro swabs estril, umidecido em salina tambm esterilizada, esfregar nas palmas das mos lavadas e desinfetadas e semear na terceira parte do meio de cultura. Identificar: mos desinfetadas. Seguir o esquema da figura 1

FIGURA 1

Mos sem lavar (I) Mos lavadas 5'com sabo (II)

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Salina estril

-"SWAB" estril

Mos lavadas + lcool 70% (III)

SEGUNDA FASE : MATERIAL NECESSRIO Placa de gar-sangue; Lminas de microscopia; Bateria de colorao de Gram; Ala de platina Microscpio.

INTERPRETAO Observar o crescimento de colnias nas trs partes da placa. Fazer esfregao de 3 a 4 colnias diferentes, corar pelo Gram e observar em imerso.

LAVAGEM DAS MOS Remover todas as jias e adornos; Molhar completamente as mos e antebraos, ensaboando-os em seguida, com sabo lquido;

Escovar, em toda sua exteno mos, unhas e antebraos, com uma escova adequada acionada em movimentos rotatrios durante 3 minutos; escovar tanto a face palmar como dorsal de cada mo, bem como todas as quatro superfcies de cada um dos dedos, nas reas interdigitais, os pulsos e e antebraos; - Lavar profundamente em gua; - Repetir o ensaboamento e a lavagem por mais duas vezes, sem usar escova; - Enxugar com toalha de papel branca, primeiro as mos e depois os antebraos Com as mos lavadas e enxutas, no tocar em mais nada que no seja esterilizado. Calar luvas estreis. OBS: sempre que houver suspeita de contaminao das luvas durante o atendimento, lavar as mos caladas com lcool iodado a 2%. -

RESULTADOS

Relatar os resultados obtidos . 1 tero da placa :

2 tero da placa :

3 tero da placa :

Resultado da colorao de Gram

Justificar estes achados

AULA PRTICA : 11IDENTIFICAO DE COCOS GRAM POSITIVOS PROVA DA CATALASE Teste rpido em lmina a temperatura ambiente

PRINCPIO:Verificar a presena da enzima catalase. BIOQUMICA ENVOLVIDA: A enzima catalase est presente na grande maioria das bactrias aerbias ou anaerbias facultativas, que contm o complexo citocromo. Usualmente, os microrganismos que no contm citocromos tambm no possuem catalase . Grande parte das bactrias anaerbias possuem peroxidases em vez de catalase. Na decomposio da molcula de gua oxigenada in vitro, uma molcula atua como substrato reduzido e a outra como um doador. O substrato reduzido pelos tomos de hidrognio cedidos pelo doador d como resultado um substrato reduzido (H20) e um doador oxidado (gs). H2O2 + H2O2 2 H2O2 + O2

REATIVO EMPREGADO: Perxido de hidrognio 30% (Superoxol) Conservar em congelador a 4C. TCNICA: Com a ala ou agulha de semeadura bacteriolgica depositar uma poro de um cultivo bacteriano puro no centro de uma lmina limpa e desengordurada. Adicionar uma gota de gua oxigenada a 30%. No inverter a ordem e no agitar. LEITURA: POSITIVO : Formao imediata de bolhas de gs. NEGATIVO : Ausncia de bolhas de gs. NOTA: No utilizar cultivos provenientes de agar sangue

CRESCIMENTO EM CHAPMAN (7,5% DE NaCl) PRINCIPIO: Verificar se a bactria capaz de crescer em meio contendo alta concentrao de NaCl (7,5 %). O gnero Staphylococcus cresce neste meio, enquanto os gneros Micrococcus, Planococcus e Stomatococcus no o fazem.

TCNICA DE SEMEADURA: Fazer semeadura por estrias superficiais com auxilio de uma agulha de semeadura bacteriolgica. Incubar 35C por 24 horas. LEITURA: POSITIVO: Presena de crescimento. NEGATIVO: Ausncia de crescimento.

DNasePRINCPIO:

Determinar a atividade de um microrganismo em p