ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE MICRORGANISMOSNa natureza encontramos várias espécies de microrganismos (bactérias, fungos,algas e protozoários) convivendo no mesmo ambiente. Para estudar as propriedades deum determinado microrganismo em particular, deve-se primeiramente isolá-lo emcultura pura, ou seja, uma cultura isenta de todos os demais tipos de organismos, ondetodas as células na população sejam idênticas (originárias de uma mesma célulaparental).CULTIVO DE CULTURAS PURAS

� MEIOS DE CULTURAOs ingredientes necessários para o crescimento de microrganismos podem sersupridos por um sistema vivo, como um hospedeiro animal ou vegetal, uma cultura decélulas, ou por uma mistura de todos os nutrientes requeridos juntos em um sistema artificial, denominado meio de cultura.Os meios de cultura contém os materiais nutrientes para o cultivos dosdiferentes microrganismos. Estes meios podem ser preparados no próprio laboratório com pós desidratados, ou adquiridos prontos no comércio em placas de Petri ou tubos de ensaio. Estes meios podem ser em caldo (líquido) ou ágar (sólido). Os meios líquidossão úteis para a obtenção de relativa grande biomassa de microrganismos e revelação de provas bioquímicas, mas não permitem a separação de dois ou mais microrganismos de espécies diferentes em uma população mista, não possibilitando a observação de algumas características específicas dos microrganismos, como a morfologia de suas colônias.Para se determinar as necessidades nutricionais de um microrganismo sãoutilizados meios quimicamente definidos, ou seja, se conhece a composição exata de tais meios. Meios de cultura mínimos ou basais são meios onde somente são fornecidos elementos químicos necessários ao microrganismo, na forma de moléculas ou fórmulas iônicas simples. Nesses meios somente são encontrados uma única fonte decarbono (geralmente glucose), de nitrogênio (sais de amônio ou nitratos), de fósforo,etc. e não são detectados fatores de crescimento, aminoácidos ou ácidos nucléicos.Meios com finalidades especiais são meios que fornecem informaçõesespeciais sobre os microrganismos:� Meios seletivos – são desenvolvidos para promover o crescimento dedeterminados microrganismos em detrimento de outros, que também seencontram na amostra em questão. A prática mais comum é a incorporaçãode substâncias tais como antibióticos ou inibidores que propiciam tal seleção.Ex.: Agar de Thayer-Martin seletivo para Neisseria gonorrhoeae e N.meningitidis onde os organismos contaminantes são inbidos pela colistina,nistatina, vancomicina e trimetroprim e MSB (sacarose e bacitracina) –

seletivos para Streptococcus mutans.� Meios diferenciais – são desenvolvidos para facilitar a separação presuntiva de espécies de microrganismos que porventura estejam colonizando um mesmo ecossistema. Esses meios, via de regra, permitem a obtenção de colônias com características fenotípicas diferenciadas (morfologia, coloração, etc), de acordo com o processamento de agentes cromogênicos ou açúcares e indicadores incorporados ao meio. Ex.: ágar-sangue (Porphyromonas e Prevotellas).� Meios de enriquecimento – são variações dos meios seletivos empregados para se estimular o crescimento de certos microrganismos exigentes e que encontram-se particularmente presentes em pequeno número numa amostra que inclui grande número de outros da microbiota normal.

� Meios para anaeróbios – são meios pré-reduzidos empregados na coleta e manutenção de bactérias anaeróbias, onde são adicionadas substâncias redutoras (ácido ascórbico 0,1%, cisteína 0,1%, tioglicolato de sódio 0,1%) que se combinam com o oxigênio e indicadores de oxi-redução (azul de metileno, resazurina).� Meios para o cultivo de bactérias – simulam o habitat natural das bactérias. Pode ser adicionado sangue, soro animal, glicose, etc. Ex.: Brain Heart Infusion Agar – BHI agar.� Meios para o cultivo de fungos – os fungos podem crescer em uma mistura simples contendo glicose, uma fonte de nitrogênio inorgânico ou orgânico e alguns minerais. Em geral esses meios têm uma concentração maior de açúcar (4%) e um pH menor (3,8 a 5,6) que o meio para cultivo bacteriano (pH 6,5 a 7,5). Ex.: Sabouraud Agar.

FATORES QUE INFLUENCIAM A ESCOLHA DO MEIO� A origem do material a ser analisado� A espécie que se imagina estar presente na amostra� As necessidades nutricionais dos organismos.MÉTODOS DE CULTIVOInoculaçãoQuando o inóculo (material colocado no meio de cultura), obtido de umasuspensão original da amostra, é colocado dentro ou sobre um meio geleificado (ágar), as células são imobilizadas e cada uma irá se multiplicar produzindo uma colônia isolada. Cada colônia nada mais é do que células individuais agrupadas, com ancestral único, visível a olho nu.4

� Técnica de esgotamento por estrias: através de uma alça ou agulha desemeadura esgota-se o material por meio de estrias na superfície do meio.� Técnica da semeadura em superfície: o inóculo é espalhado na superfície do ágar com o auxílio de uma alça de vidro (alça de Digralsky).

� Método de pour-plate: uma suspensão de células é misturada com ágarfundido a 45°C, que se verte em uma placa de Petri. Quando o ágar sesolidifica, as células são nele imobilizadas e crescem, formando colônias.Se a suspensão de células que será inoculada foi previamente diluída, ascolônias formadas estarão bem separadas, com alta probabilidade de ser derivada de uma única célula. Mas para se ter certeza disso é necessário repicar uma colônia do tipo desejado, suspendê-la em solução apropriada e replaqueá-la. Este procedimento deverá ser repetido quantas vezes for necessário, o que irá assegurar a obtenção de uma cultura pura.

ColôniasAparência das estrias5

Um outro método de obtenção de cultura pura é o de diluição com extinção. Asuspensão original da amostra é diluída seriadamente e semeiam-se amostras de cada diluição. Se apenas algumas amostras de uma diluição particular exibirem crescimento, presume-se que essas culturas se originaram a partir de células isoladas. Este método é utilizado somente quando não é possível o cultivo em placa por algum motivo e deveser empregado apenas para se isolar o tipo de organismo predominante em uma população mista.MANIPULAÇÃO DO CRESCIMENTO DOS MICRORGANISMOSPor vezes, é extremamente difícil reproduzir o crescimento microbiano emmeios artificiais, assim como este ocorre em ambiente natural. Para contornar este problema reproduz-se em laboratório as condições ideais para o crescimento do microrganismo que se deseja isolar, tais como:� diferentes meios de cultura que contenham os nutrientes exigidos peloMicrorganismo � temperatura de incubação� aeração� pHQuando se deseja identificar a maior parte das espécies presente em umaamostra de uma população mista de microrganismos deve ser realizada a semeadura em tantos meios e condições de incubação diferentes quantos sejam necessários para se obter o crescimento da maioria das espécies presentes na amostra.Para o isolamento de um tipo particular de microrganismo presente em umapopulação mista, alguns recursos podem ser empregados de acordo com ascaracterísticas do microrganismo desejado, tais como meios diferenciais, meios seletivos, meios enriquecidos, o aquecimento do material, ação de álcalis ou ácidos fortes, e inoculação em animal sensível.6

ISOLAMENTO DE AERÓBIOSEstes microrganismos requerem oxigênio para sua sobrevivência. Após asemeadura em placas ou tubos com meio de cultura, estes são mantidos em estufa a 37°C em presença de oxigênio do ar atmosférico. Existem grupos de microrganismos,como a Neisseria gonorrohoeae, que necessitam níveis elevados de dióxido de carbono(CO2), neste caso pode ser utilizado o método da jarra microaerófila. Após semeados, os meio são colocados dentro da jarra – juntamente com uma vela acesa que é entãofechada hermeticamente. Após a vela se apagar será obtida uma quantidade reduzida de oxigênio livre e um teor de dióxido de carbono de aproximadamente 10%.ISOLAMENTO DE ANAERÓBIOSDurante a preparação dos meios, estes são fervidos para que a maior parte do oxigênio dissolvido seja retirada. O gás nitrogênio livre de oxigênio é colocado nostubos contendo o meio, e então um agente redutor deve ser adicionado (normalmentecisteína), o qual remove os últimos traços de oxigênio. Os meio são esterilizados emautoclave na completa ausência de oxigênio.� Câmara de anaerobiose: a manipulação dos microrganismos é dentro da câmara que contém luvas especiais acopladas à parede da câmara.A atmosfera dentro da câmara é uma mistura de hidrogênio, dióxido decarbono e nitrogênio. O material é introduzido ou removido da câmara pormeio de um sistema fechado para o ar. Qualquer resíduo de oxigênio nacâmara é removido pela reação com o hidrogênio, na presença do catalisador paládio.� Jarras de anaerobiose: os meios inoculados são colocados em uma jarra juntamente com um envelope que contém substâncias químicas que geram hidrogênio e dióxido de carbono. Este sistema é inadeqüado para o cultivo de anaeróbios estritos.� Método de Veillon: o microrganismo é inoculado em meio sólido em coluna alta, crescendo no fundo do tubo de ensaio.Para os anaeróbios são utilizados meios reduzidos, que são meios de cultura com a adição de um agente redutor (ex.: tioglicolato de sódio), que são capazes de absorver o oxigênio ou gerar H2 e CO2.

MEDIDA DO CRESCIMENTO DA POPULAÇÃO MICROBIANAExiste uma variedade de técnicas para quantificar o crescimento bacteriano. Os dois métodos quantitativos mais comuns são aqueles que avaliam o número de células - UFC/mL – Unidade Formadora de Colônias por mL – ex.: Contagem celular microscópica ou eletrônica, contagem em placa ou através de membrana filtrante e aqueles que medem o peso celular ou ainda

através da estimativa de unidades de absorbância da massa de células em caldo ou outras suspensões (turbidez).IDENTIFICAÇÃO DOS MICRORGANISMOSAtravés das técnicas laboratoriais empregadas para caracterizar osmicrorganismos, que podem variar desde uma microscopia relativamente simples à análise do material genético encontrado na célula, procura-se enquadrar o microrganismo numa espécie. Uma coleção de dados é utilizada para caracterizar espécies diferentes:� Características CulturaisO primeiro passo para a identificação de uma colônia isolada é a observação da natureza do meio em que o organismo está crescendo.O estudo da morfologia das colônias crescidas em meio sólido (forma,dimensões, estrutura, brilho, etc) irá possibilitar uma identificação preliminar, mas não definitiva do organismo estudado, já que muitas espécies podem produzir colônias quenão diferem entre si. (ex.: algumas colônias de E. coli são indistingüíveis das de Shigella quando cultivadas em ágar- Hektoen).Morfologia Colonial� Características MorfológicasOs microrganismos podem ser observados ao microscópio óptico utilizando-sepreparações fixadas e coradas. Preparações a fresco (em gota pendente ou preparações entre lâmina e lamínula), são úteis quando a estrutura do microrganismo pode serdistorcida pelo calor ou agentes químicos utilizados na preparação do material seco e corado, podendo ser utilizadas também quando o microrganismo não se cora facilmenteou para observar motilidade ou ingestão de alimentos particulados. As técnicas de coloração servem para mostrar as várias estruturas dosmicrorganismos (flagelos, membranas, cápsulas), identificar suas estruturas internas e ajudar a identificar e separar microrganismos similares. As colorações podem ser feitas com um ou mais corantes.Coloração simples: realizada com uma única solução corante. As célulascoram-se uniformemente com esta técnica. (ex.: Violeta de genciana)Coloração diferencial: envolve mais de uma solução corante. Evidenciadiferenças entre as células microbianas ou parte das células. (ex.: Coloração de Gram, Coloração de Zihel-Nielsen)Coloração de GramO microbiologista pode utilizar a coloração de Gram do material obtido de colônias isoladas para obter, através de observação ao microscópio óptico, maiores informações sobre a morfologia celular. A maioria das bactérias pode ser dividida emdois grupos distintos de acordo com os resultados apresentados pelo Gram:� Bactérias Gram-positivas – coram-se em violeta escuro� Bactérias Gram-negativas – coram-se em vermelho

Essa diferença na coloração está relacionada com a espessura e estrutura das paredes celulares das bactérias.Microscopia ÓpticaOs microscópios de luz conseguem uma ampliação máxima útil de cerca de1000x o tamanho original do espécime. Com algumas modificações, incluindo ocularesde alta potência a ampliação máxima do microscópio luminoso pode chegar a aproximadamente 2000x. A imagem formada pelas objetivas é também ampliada pelas lentes oculares. Assim, a combinação do sistema de lentes da objetiva e o sistema de lentes oculares produz a ampliação. Existem diversos tipos de microscópio de luz: Microscópio de campo claro, de campo escuro, de fluorescência, de contraste de fase.O microscópio eletrônico produz uma ampliação máxima útil de cerca de200.000 – 400.000x o tamanho original do espécime, devido ao alto poder de resolução proporcionado pelo comprimento de onda muito curto dos feixes de elétrons utilizados,em vez da luz. Este microscópio permite o exame de vírus e das ultra estruturas dascélulas microbianas.Existem avanços mais recentes na microscopia, como aquelas que utilizamcomputadores, outras fontes de iluminação, ou novas técnicas de coloração� Características MetabólicasExistem vários testes laboratoriais que podem determinar a atividade metabólica (metabolismo oxidativo, metabolismo fermentativo, catabolismo protéico) de umorganismo. O registro das reações realizadas por uma espécie microbiana é útil e muitasvezes essencial para sua identificação� Características FisiológicasCondições físicas como a atmosfera gasosa, a temperatura, o pH, aluminosidade e os fatores de crescimento próprios de cada microrganismo tambémfornecem parâmetros para a identificação. Por exemplo, os microrganismos do corpo humano crescem a 35°C e os do oceano a temperaturas entre 4 e 20°C.� Características AntigênicasUma célula microbiana apresenta estruturas físicas em sua superfície que podem agir como antígeno e induzir, desta forma, a produção de anticorpos. Os anticorpos produzidos em animais de laboratório podem ser usados para detectar a presença de antígenos únicos em culturas bacterianas e são usados para caracterizar microrganismos.

� Características patogênicasA inoculação do microrganismo em hospedeiro sensível (animal, plantas ou

micróbios), com a finalidade de reproduzir a doença, poderá determinar se este é ou não um patógeno.� Características genéticasAtravés dos avanços na biologia molecular surgiram técnicas que permitemrealizar análises genéticas para classificar ou identificar os microrganismos ou compreender a sua atividade, através de métodos mais sensíveis e precisos.CONSERVAÇÃO DE CULTURAS PURASApós a obtenção de uma cultura pura deverá ser adotado um método deconservação destas culturas vivas por um período de tempo de acordo com o objetivo do estudo a ser realizado.Conservação por um curto período (dias a meses):� Armazenagem à temperatura de refrigeradores (4°C a 10°C)� Repiques freqüentesConservação por longos períodos:� Nitrogênio líquido a -196°C� Freezers a -70°C/ -120°C� Liofilização – congelamento a seco - as amostras são congeladas,desidratadas e fechadas à vácuo, o que possibilita a viabilidade das culturaspor muitos anos. Esta técnica permite a obtenção de uma coleção demicrorganismos como referência, por exemplo.Para o isolamento dos microrganismos em laboratório deve ser observada aatmosfera gasosa ideal para o crescimento de cada célula microbiana em particular:

CULTIVO DE VÍRUSPara isolar vírus em laboratório, é necessário fornecer células hospedeiras vivas, já que são parasitas intracelulares estritos.Vírus bacterianos – bacteriófagos – são facilmente isolados e cultivados em cultura de bactérias jovens em crescimento ativo em caldo ou meio solidificado em placa.Vírus animais:� Cultivo em animais vivos: seu uso é limitado, devido ao alto custo. Algunsvírus animais como o vírus da hepatite B podem ser cultivados somente emanimais vivos. Em laboratório são utilizados normalmente camundongos,coelhos e cobaias. São utilizados em estudo sobre a resposta imune dohospedeiro frente a uma infecção viral ou para determinar se um vírus écapaz de causar uma infecção.� Cultivo em ovos embrionados (de galinha ou pato): Ovos embrionados (embriões de 6-12 dias) podem ser inoculados assepticamente com vírus,

utilizando-se uma agulha e seringa, por meio de um orifício aberto na casca. A abertura é selada com parafina e os ovos são incubados a 36°C por 2 a 3 dias para permitir a multiplicação dos vírus. Diferentes tecidos do embriãosão inoculados, dependendo do tipo de vírus.� Cultura em tecidos: uma vez obtida uma cultura de células, esta pode serutilizada como um hospedeiro in vitro para um determinado vírus. Podem ser utilizadas células de cultura primária ou células de linhagem contínua.Identificação de vírus depende do ECP (efeito citopático): os vírus invadem ascélulas, geralmente causando algum tipo de alteração visível. O ECP pode ter diferentes aspectos, dependendo do vírus e do tipo de células na cultura. Um tipo de ECP é o corpúsculo de inclusão, que é uma estrutura intracelular anormal. Sua presença pode ajudar a identificar o vírus que esteja causando uma infecção, por exemplo, oscorpúsculos de Guarnieri são característicos em células infectadas com o vírus da varíola.Vírus de PlantasPodem ser cultivados pela inoculação de uma suspensão viral em plantas por meio de uma agulha hipodérmica ou de escarificações provocadas nas folhas da planta.QUESTIONÁRIO1. Defina o termo “cultura pura”.2. Descreva as principais características dos microrganismos usadas naidentificação das espécies.3. Cite os passos para o isolamento de um microrganismo anaeróbio.4. Quais as técnicas para conservação de culturas?5. Explique a finalidade dos principais meios de cultura.BIBLIOGRAFIABaron, E.J., Peterson, L.R., Finegold, S.M. Methods for identification ofetiological agents of infectious disease. In: Bailey & Scott’s DiagnosticMicrobiology. 9. ed. St. Louis: Mosby, 1994. Cap. 4. p. 474-504.Bier, O. Métodos gerais de estudo das bactérias. In: Microbiologia eImunologia. 23. ed. São Paulo: Melhoramentos, 1984. Cap. 25, p.477-499.Pelczar, M.J., Chan, E.C.S. & Krieg, N.R. Caracterização dosMicrorganismos. In: Microbiologia: Conceitos e Aplicações. 2.ed. vol.1. SãoPaulo: Mc Graw Hill do Brasil. 1996. Cap.3. p. 75-99