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INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS

INSTRUMENTAIS DE ANÁLISE

MÉTODOS DE SEPARAÇÃO

Prof. Wendell Coltro

CROMATOGRAFIA

Tipos de Métodos de Separação

1) CLÁSSICOS: precipitação, destilação e extração

2) INSTRUMENTAIS: cromatografia e eletroforese

- Tiveram uso intenso até a metade do século XX;

- Técnicas úteis para amostras com poucos componentes

(em altas concentrações) e relativamente puras;

- Porém são pouco seletivas e apresentam baixa sensibilidade.

- Técnicas “imbatíveis” na separação de amostras multicomponentes;

- Apresentam alta seletividade e sensibilidade;

- Sistema “integrado” (análise é feita de modo completo).

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Introdução a Métodos Cromatográficos

CROMATOGRAFIA (Definição): técnica analítica (clássica ou

instrumental) que permite a separação de misturas por interação

diferencial dos seus componentes entre uma FASE ESTACIONÁRIA

(líquido ou sólido) e uma FASE MÓVEL (líquido ou gás).

A Cromatografia foi inventada (e assim denominada) no início do

século 20 (1903) pelo botânico russo Mikhail Tswett. Ele empregou a

técnica para separar vários pigmentos de plantas (como a clorofila e a

xantofila) passando soluções desses componentes através de uma

coluna de vidro empacotada com carbonato de cálcio (CaCO3).

As espécies separadas apareciam como bandas coloridas na coluna,

daí originando o nome da técnica:

CROMATOGRAFIA: do grego CHROMA (COR) + GRAPHEIN (ESCREVER)

EXPERIMENTO DE TSWETT

PRINCÍPIO BÁSICO DE UMA

SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA

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CLASSIFICAÇÃO DOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS EM COLUNA

Classificação Geral Método Específico F.E. Tipo Equil.

Cromatografia Líquida (CL)

(F.M.: líquido)

Líquido-líquido ou

partição

Líquido ads. sólido Partição

Fase líquido-ligado Esp. org. ligadas sólido Partição

Líquido-sólido ou

adsorção

sólido Adsorção

Troca iônica Resina de troca iônica Troca iônica

Exclusão por tamanho Líquido interstícios sólido

Cromatografia Gasosa (CG)

(F.M.: gás)

Gás-líquido Líquido ads. sólido Partição

Fase gás-ligado Esp. org. ligadas sólido Partição

Gás-sólido sólido Adsorção

Cromatografia c/ fluido

supercrítico (CFS)

(F.M.: fluido supercrítico)

Esp. org. ligadas sólido Partição

CARACTERÍSTICAS DE UM PICO GAUSSIANO

- A eficiência de uma coluna (medida do alargamento da banda de

um pico) pode ser medida quantitativamente através de duas

grandezas:

Quanto maior tR e menor s (ou wb ou wh ), maior será N.

N é adimensional. F

(1) NÚMERO DE PRATOS TEÓRICOS (N)

- N mede a relação entre o tempo de retenção de um pico e a sua

variância (σ)

Nt

Nt

wN

t

w

R R

b

R

h

s

2

2

2

2

2

2

16 5 54, [7]

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PRATO TEÓRICO: equivalente a uma etapa

de equilíbrio entre as duas fases

PRATO TEÓRICO: equivalente a uma etapa

de equilíbrio entre as duas fases

IMPORTÂNCIA DO NÚMERO DE PRATOS TEÓRICOS

N1 > N2 > N3

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N=2500 N=1500

IMPORTÂNCIA DE N NA SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA

EXEMPLO DE CÁLCULO DE N

- Assumindo que tR= 5 minutos e wb= 0,5 min (atenção: tR e wb devem

estar na mesma unidade; N é adimensional!!!)

- Substituindo-se esses valores na equação de N = ?????

(2) ALTURA EQUIVALENTE A UM PRATO TEÓRICO (H): compara

eficiência de colunas de diferentes comprimentos

L= comprimento da coluna

N= número de pratos teóricos da coluna

- H nos dá o comprimento da coluna que corresponde ao valor de

um prato.

HL

N [8]

- No exemplo anterior de cálculo de N, se considerarmos que a

análise foi realizada em uma coluna de 30 cm, e sabendo-se que

N=1600, substituindo-se na equação [8], temos:

H = 30 cm / 1600

H = 0,01875 cm

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INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS

INSTRUMENTAIS DE ANÁLISE

MÉTODOS DE SEPARAÇÃO

CROMATOGRAFIA GASOSA

CROMATOGRAFIA À GÁS (ou GASOSA): CG (“GC”)

Fase móvel: gás

Fase estacionária: sólido ou líquido

X

CROMATOGRAFIA À GÁS (CG)

1) Cromatografia gás-sólido: F.M. é um gás; F.E. é um sólido.

- Retenção dos analitos ocorre por adsorção física;

- Não tem ampla aplicação (retenção irreversível de analitos);

- Aplicada a analitos de baixo P.M. e pouco polares (isômeros).

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CROMATOGRAFIA À GÁS (CG)

1) Cromatografia gás-sólido: F.M. é um gás; F.E. é um sólido.

2) Cromatografia gás-líquido: F.M. é um gás; F.E. é um líquido

adsorvido ou quimicamente ligado a um suporte sólido.

- Retenção dos analitos ocorre por adsorção física;

- Não tem ampla aplicação (retenção irreversível de analitos);

- Aplicada a analitos de baixo P.M. e pouco polares (isômeros).

- Técnica denominada simplesmente de cromatografia gasosa;

- Separação dos analitos baseada no fenômeno de partição;

- Ampla aplicação em todas as áreas da ciência.

CROMATOGRAFIA GÁS-LÍQUIDO (CGL) ou apenas (CG)

- F.M. é um gás (não interage com analito);

- F.E. é um líquido de alto ponto de ebulição adsorvido física ou

quimicamente a um suporte sólido.

suporte

fase líquida

Gás

- O fenômeno físico-químico responsável pela interação do analito

+ F.E. líquida é a ABSORÇÃO. O equilíbrio envolvido no processo

de eluição do analito da coluna é a PARTIÇÃO do analito entre a

F.M. (gás) e a F.E. (líquido).

- A absorção ocorre no INTERIOR da F.E. líquida (fenômeno

INTRAfacial).

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1 2 3

4

5 6

7

1. Pressurização da fase móvel 2. Controle de fluxo

3. Introdução da amostra 4. Forno

5. Coluna 6. Detector

7. Aquisição e tratamento dos dados

COMPONENTES DE UM SISTEMA DE CG

Estação de gases

Integrador

Forno e

Coluna

Painel de

controle

Injetor

FOTOGRAFIA DE UM SISTEMA DE CG

Gás de arraste

Injetor

Forno com coluna

Coluna capilar

Detector FID

Integrador

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Gás de

arraste Injetor Coluna

Detector

Registrador

Tratamento

de dados

Aquecido para vaporizar amostra Aquecida

para

controlar tR

Aquecido para manter limpo

COMPONENTES AQUECIDOS EM UM

SISTEMA DE CG

AMOSTRAS TÍPICAS ANALISADAS POR CG

⇒ Gases, líquidos ou sólidos (introduzidos na vapor de vapor);

⇒ A amostra necessita ser VOLÁTIL;

⇒ Massa molecular entre 2 e 1000 daltons;

⇒ Compostos orgânicos ou inorgânicos.

CROMATOGRAMA TÍPICO

tempo de retenção

resp

osta

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SISTEMA DE INTRODUÇÃO DE AMOSTRA: MICROSERINGAS

Gás arraste

P/ coluna P/ coluna

Posição de injeção

da amostra

Posição de envio da

amostra para coluna amostra

“loop”

injeção

SISTEMA DE INTRODUÇÃO DE AMOSTRA:

VÁLVULAS DE INJEÇÃO

INTRODUÇÃO DE AMOSTRA EM CG: DEVE-SE EVITAR

INTRODUZIR AMOSTRAS NA FORMA DE “BANDAS LARGAS”!!!

t = 0

t = x

Banda Estreita Banda Larga

t=0

t=x

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Seringa

Coluna

Gás de arraste

Septo Bloco aquecido

Lã de vidro

INJETOR TÍPICO DE UM SISTEMA DE CG

MODOS DE INJEÇÃO DA AMOSTRA: “SPLIT” (divisão da amostra)

p/ coluna

1 mL/min

descarte: 100 mL/min

descarte: 1 mL/min

Fluxo total: 102 mL/min

MODOS DE INJEÇÃO DA AMOSTRA: “SPLITLESS” (sem divisão da amostra)

p/ coluna

1 mL/min

descarte: 0 mL/min

descarte: 1 mL/min

Fluxo total: 2 mL/min

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MODOS DE INJEÇÃO DA AMOSTRA: “ON COLUMN” (inj. direta na coluna)

p/ coluna

1 mL/min

descarte: 0 mL/min

descarte: 0 mL/min

Fluxo total: 1 mL/min

MANIPULAÇÃO CORRETA DA SERINGA DE INJEÇÃO

SISTEMA DE INTRODUÇÃO DE AMOSTRA:

MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)

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SPME: INTRODUÇÃO DA FIBRA NO SISTEMA DE CG

SISTEMAS DE DETECÇÃO PARA CG

- CARACTERÍSTICAS DO DETECTOR IDEAL PARA CG:

1. Sensibilidade adequada;

2. Boa estabilidade e reprodutibilidade;

3. Resposta linear por várias ordens de grandeza;

4. Suportar altas temperaturas;

5. Resposta rápida;

6. Seletivo;

7. Não destrutivo.

Nenhum detector apresenta todas as características citadas,

sendo que sua escolha deve basear-se na finalidade

analítica, bem como no tipo de amostra a ser analisada.

Análise Qualitativa usando CG

- A CG é um excelente método para a confirmar a presença ou

ausência de um determinado analito em uma amostra (após a

adição do padrão do composto de interesse, nenhum novo pico

deve aparecer no cromatograma).

- Existem basicamente três meios de ser realizar uma análise

qualitativa utilizando a técnica de CG:

1. Tempo de Retenção

2. Métodos Gráficos (Índices)

3. Métodos Analíticos Auxiliares

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Tempo de Retenção

Tempo de Retenção

Vantagens da CG

Elevada resolução

Alta velocidade de análise

Alta sensibilidade

Ótima exatidão

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OTIMIZAÇÃO DE UMA SEPARAÇÃO POR CG

- Comprimento da coluna;

- Diâmetro interno da coluna;

- Tubulação da coluna;

- Fase líquida presente na F.E.;

- Tamanho da amostra (quantidade injetada).

INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS

INSTRUMENTAIS DE ANÁLISE

MÉTODOS DE SEPARAÇÃO

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA (ou a LÍQUIDO)

(CLAE OU “HPLC”)

Fase móvel: líquido

Fase estacionária: sólido ou líquido

X

CLAE: Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

HPLC: High Performance Liquid Chromatography

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EFICIÊNCIA DE UMA COLUNA DE CLAE

Efeito do diâmetro da partícula

3 µm

5 µm

10 µm

Tamanho da partícula

Dp (µm)

tR

(min)

No pratos

(N)

Pressão

(bar)

5,0 30 25000 19

3,0 18 42000 87

1,5 9 83000 700

1,0 6 125000 2300

Eficiência como função do Dp

Cromatograma mostrando o efeito da eficiência

como função do Dp

- CLAE não pode ser realizada em colunas capilares abertas : problema da

baixa difusão do soluto na fase móvel líquida.

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Em quais casos deve-ser usar a CLAE?

MODOS DE CROMATOGRAFIA LÍQUIDA

1) CROMATOGRAFIA DE PARTIÇÃO (LÍQUIDO-LÍQUIDO)

2) CROMATOGRAFIA DE ADSORÇÃO (LÍQUIDO-SÓLIDO)

3) CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA

4) CROMATOGRAFIA DE EXCLUSÃO POR TAMANHO (OU

CROMATOGRAFIA EM GEL)

APLICAÇÕES DA TÉCNICA DE CLAE

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Componentes de um sistema de CLAE

Fotografia de uma sistema de CLAE (1)

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Fotografia de uma sistema de CLAE (2)

Componentes de um sistema de CLAE

Reservatórios de F.M.

a) Eluição com gradiente

b) Eluição isocrática

F.M.: 50:50 (v/v) de

metanol/H2O durante

toda a análise.

F.M.: início 40:60 (v/v) de

metanol/H2O ; aumento do

metanol numa razão de

8%/min.

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Sistemas de Bombeamento

- Requisitos para um eficiente sistema de bombeamento:

1. Geração de pressões de até 6000 psi;

2. Saída com ausência de pulsos;

3. Velocidades de fluxo (vazão) variando de 0,1 a 10 mL/min;

4. Controle e reprodutibilidade relativa de fluxo de 0,5%;

5. Componentes resistentes a corrosão (aço inox ou teflon).

Existem 3 tipos de bombas para CLAE: 1) bombas

recíprocas, 2) bombas do tipo seringa e

3) bombas pneumáticas

Sistemas de Injeção de Amostras

- O método mais utilizado para introdução de amostras em

CLAE está baseado em alças (em inglês, loop) de

amostragem que podem ser trocadas de acordo com a

necessidade analítica (volumes de 5 a 500 µL).

- Alças de amostragem permitem a introdução de amostras a

pressões de até 7000 psi com excelente precisão.

Sistema de alça de amostragem para CLAE

Posição de Carregamento

da Amostra (load) Posição de Injeção

(Inject)

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Colunas para CLAE

- As colunas para CLAE geralmente são construídas em tubos

de aço inox. Os custos variam em torno de 200 a 1000

doláres (ou mais), dependendo do tipo de F.E.

Coluna típica para CLAE

Colunas analíticas usadas em CLAE

Detectores utilizados em CLAE

- Diferente do que ocorre em CG, em CLAE não existe um

detector universalmente aplicável, como o FID.

- O detector ideal em CLAE deve ter as mesmas propriedades

listadas para os detectores de CG, com exceção do

fornecimento de resposta em grande intervalo de temperatura.

- Os detectores usados em CLAE são de dois tipos básicos:

1) Detectores de propriedades universais: respondem a

propriedades da F.M. como um todo (ex: índice de refração)

2) Detectores de propriedades do soluto: respondem a certas

propriedades do soluto, como absorbância no UV ou

fluorescência.

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Principais detectores utilizados em CLAE

Detectores de Absorbância

> Volume cela pequeno: 1 a 10 µL

> L da cela: 2 a 10 mm

> Cela em “Z”: aumento do

caminho óptico

Detectores de Absorbância UV

1) UV com Filtros

- São fotômetros, com uma lâmpada de mercúrio como fonte. A linha em

254 nm (mais intensa) é isolada por filtros.

- Outras linhas podem ser isoladas: 250, 313, 334 e 365 nm.

- Esse tipo de detector é restrito a compostos que absorvem radiação

em tais comprimentos de onda.

- Fontes de filamento de deutério e de tungstênio com filtros

apropriados também podem ser úteis para algumas aplicações.

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1) UV com Monocromadores

- A maioria dos equipamentos de CLAE vem equipados com um

espectrofotômetro de varredura com redes ópticas, incluindo a

radiação UV e Visível.

- Com esses equipamentos pode-se utilizar-se de diferentes

comprimentos de ondas (aquele apropriado para cada pico sendo

eluído da coluna) se os compostos são suficientemente separados

um do outro.

- Os detectores espectrofotométricos UV mais poderosos são aqueles

equipados com arranjo de diodos, que permitem a coleta de dados de

um espectro inteiro em cerca de 1 segundo.

Detector de UV com arranjo de diodos para CLAE

Detectores de Fluorescência

- O esquema desse tipo de detector é similar aos fluorímetros e

espectrofluorímetros, com a fluorescencia sendo observada

perpendicularmente ao eixo de excitação.

- Os detectores mais simples usam uma fonte de mercúrio com um ou

mais filtros para isolar a bande de emissão de radiação.

- A grande vantagem dos detectores de fluorescência está na sua alta

sensibilidade.

- Detectores de fluorescência são utilizados em CLAE na análise de

compostos farmacêuticos, produtos naturais e produtos do petróleo.

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Detectores de Índice de Refração

- Esse tipo de detector tem a vantagem de responder a quase todos os

analitos. As desvantagens incluem sua alta sensibilidade a mudanças

de temperatura e a sua baixa sensibilidade de detecção.

Esquema de um detector de índice de refração diferencial

Detectores Eletroquímicos

- São baseados nos fenômenos de amperometria, polarografia,

coulometria e condutometria. Sendo que o mais utilizado baseia-se

na amperometria (simplicidade).

Grupos funcionais detectáveis por amperometria

Cela de um detector amperométrico para CLAE

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MODOS DE OPERAÇÃO EM CLAE

MODOS DE OPERAÇÃO EM CLAE

Cromatografia de Partição

- Pode ser subdividida em: cromatografia líquido-líquido e cromatografia

de fase ligada.

- Cromatografia líquido-líquido: a F.E. líquida é adsorvida fisicamente

sobre a superfície de um suporte sólido.

- Cromatografia fase ligada: a F.E. é quimicamente ligada sobre a

superfície de um suporte.

Colunas para Cromatografia de Fase Ligada

- A grande maioria dos suportes para F.E. utilizados em CLAE são

preparados à base de sílica.

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- Os recobrimentos mais utilizados como fase ligada são siloxanos

formados por reação da superfície hidrolisada da sílica com um

organoclorossilano:

- A cobertura por silanização está limitada a 4 µmol/m2 devido a efeitos

estéricos. Para desativar os grupos SiOH restantes faz-se umareação

com trimetilcloro-silano (processo chamado endcapping).

Cromatografia de Fase Ligada: Fase Normal e Fase Reversa

- A subdivisão da cromatografia de fase ligada em fase normal e fase

reversa está baseada na polaridade relativa das fases móvel e

estacionária.

CROMATOGRAFIA DE FASE NORMAL

- Nesse modo de cromatografia, a F.E. é polar e a F.M. é não-polar.

- Em cromatografia de fase normal, a F.E. tem caráter polar

(sintetizada a partir da sílica com grupos funcionais polares):

Fase estacionária polar (sílica, NH2, CN)

Fase móvel apolar

(Hexano, diclorometano)

Analito mais apolar Analito mais polar

amostra

- Em cromatografia de fase normal, os analitos polares tem maior

afinidade pela F.E. (polar) e, portanto, ficam mais retidos na coluna e

são os últimos a serem eluídos da coluna:

- A F.M. não contém água. Os solventes mais comumente utilizados

são: hexano e diclorometano. Um solvente e característica polar

(como metanol) pode ser usado em pequenas proporções para dar

seletividade a F.M. na eluição de analitos mais polares.

- A cromatografia de fase normal é mais utilizada na análise de

compostos lipofílicos: óleos, gorduras, lípidios.

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CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA

- Nesse modo de cromatografia, a F.E. é não-polar e a F.M. é polar.

- Em cromatografia de fase reversa, a F.E. tem caráter apolar

(sintetizada a partir da sílica com grupos funcionais apolares):

Octadecil (C18)

Octil (C8)

- Em cromatografia de fase reversa, os analitos apolares tem maior

afinidade pela F.E. (apolar) e, portanto, ficam mais retidos na coluna

e são os últimos a serem eluídos:

Área intersticial (F.M.) Suporte da partícula Fase ligada

(A) – analito mais polar

(B) – analito menos polar

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Fase estacionária apolar (C8, C18)

Fase móvel polar

(metanol, acetonitrila, água)

amostra

Analito mais apolar Analito mais polar

- A F.M. contém água. Os solventes mais comumente utilizados são:

metanol e acetonitrila. A força de eluição para os analitos é dada pela

proporção do solvente orgânico. A proporção de água na F.M. é utilizada

para controlar o processo de retenção dos analitos.

- Fase Reversa é o modo de CLAE mais utilizado (em cerca de 75% dos

métodos). Pode ser utilizado na separaç ão de compostos não iônicos,

polares, até a compostos de polaridade intermediária.

separação rápida

separação lenta

separação muito

lenta

Efeito do Solvente em Fase Reversa

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Efeito do Tamanho do Cadeia sobre a Eficiência

de Separação

Fase Normal x Fase Reversa: tempos de eluição

para uma mistura de compostos

Desenvolvimento de Métodos em Cromatografia de

Partição (Fase Normal e Fase Reversa)

Seleção da Coluna

- A polaridade da F.E. da coluna deve ser combinada de maneira próxima

com a polaridade dos analitos a serem separados. A F.M. (de polaridade

diferente) é usada para eluição.

- Polaridade dos analitos: hidrocarbonetos < éteres < ésteres < cetonas <

aldeídos < amidas < aminas < alcoóis < água.

- Uma vez feita a escolha da F.M. e da F.E., o analista deve realizar uma

série de experimentos (tentativa e erro) até conseguir a separação dos

analitos de interesse. Caso a separação não seja ideal, deve-se escolher

outro sistema F.M./F.E.

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Seleção da Fase Móvel

- A F.M. em cromatografia de partição deve ser escolhida de modo a se

obter uma resolução adequada para todos os compostos em estudo.

- Em CLAE a maneira mais fácil de se obter uma boa resolução é através

da manipulação do fator de retenção (k), que é muito dependente da F.M.

utilizada.

- Caso os ajustes dos valores de k não dêem os resultados esperados na

resolução, a variação nos fatores de retenção (α) devem ser realizados.

> Isso pode ser feito variando-se a proporção dos solventes

utilizados na F.M.

> Isso pode ser feito mudando-se a composição dos solventes

usados na F.M.

APLICAÇÕES DA CROMATOGRAFIA DE PARTIÇÃO

- A cromatografia de partição, mais especificamente a cromatografia em

fase reversa, aproxima-se de um sistema universal ideal para a

cromatografia líquida devido à sua ampla aplicabilidade e facilidade de

manipulação dos fatores k e α quando se utiliza uma fase móvel aquosa.