2019-11-04 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 1

7장. 아미노산 발효

경북대학교 미생물공학연구실KNUmbl

발효공학 7장 : 아미노산 발효

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7-0. 아미노산 발효의 종류

* 아미노산 발효의 종류

1. 직접발효법 : 미생물을 이용하여 기질로부터 발효에 의해 생산

1) 야생 균주에 의한 방법: Glu

2) 영양요구 변이주에 의한 방법: Lys, Thr

3) Analog 내성 변이주: Lys, Thr, Trp

4) 아미노산 감수성 변이주: Thr, Met

5) 대사의 bypass 이용: Ile

6) 전구체 첨가법: Ile

2. 효소법: 주로 미생물 효소를 이용하여 기질을 아미노산으로 전환

-Lys, Asp, Trp, Phe, Tyr -일부

3. 화학합성: Ala, Gly, Met -극히 일부

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- 아미노산의 생합성 경로1) 세린계열 (Ser, Gly, Cys)

Glycine3-Phosphoglycerate Serine

Cysteine

2) 방향족 아미노산 계열 (pepPTT)Phenylalanine

PEP + E-4-P Chorismate TyrosineAnthranilate Tryptophan

3) 피루브산 계열 (Ala, Val, Leu) Alanine

Pyruvate Valineα-Ketoisovaleric acid

Leucine4) 글루탐산 계열 (Glu, Gln, Pro, Orn, Arg)

Proline

α-KG Glutamate Ornithine Arginine

Glutamine

5) 아스파르트산 계열 (Asp, Asn, Lys, Met, Thr, Ile)Lysine

MethionineOAA Aspartate Homoserine

Threonine IsoleucineAsparagine

6) 히스티딘의 합성Ribose-5-phosphate Histidine

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7-1. Glutamate 계열의 아미노산

- 1 -

Glucose(mw 180) + NH3 + 1.5O2 ----- Glu(mw 147) + CO2 + 3H2O

Acetyl CoA Citrate Isocitrate Succinate Fumarate Malate OAA

Glyoxylate

CO2

Acetyl CoA

NADP+NADPH2

H2O NH3NADP+ NADPH2

Glu dehydrogenase

Glutamate α-Ketoglutarate Succinyl CoA TCA

Oxalosuccinate

a-KG dehydrogenaseO=C-COOHCH2CH2COOH

Lyase

Glyoxylate cycle

CoASH CO2NAD+ NADH2

* Glutamate 계열의 아미노산 : Glu, Pro, Arg, Orn

α

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1. Glu 발효(-CH2-CH2COOH)--야생균주에 의한 직접 발효법에 의해 생산

가. 생산균주: Corynebacterium glutamicum의 야생주

1) Glu dehydrogenase 활성 강, α-keto glutarate dehydrogenase 활성 약

: α-KG로부터 Glu 생산 - 탄수화물의 50%를 Glu로 전환

: Succinyl CoA로 전환능 약 - TCA cycle 약화

2) Biotin or glycerol 생육에 요구 : 세포막투과성 개량-합성 Glu 세포외분비

가) biotin 제한배지(5ppm 이하: 2-5ppm)

* biotin: acetyl CoA + CO2--malonyl CoA 생성반응의 조효소

: 결핍 시 oleic acid 등 지방산 합성 불량 - 포화, 불포화지방산 비 불균형

나) glycerol 제한배지 : glycerol 부족 - 인지질 즉 세포막 형성 불량

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나. Glu 발효 관리

1) 탄소원

가) 포도당, 전분 당화액 : Glu 세포외 분비 양호, biotin 결핍으로 증식 불량

- 배지에 소량의 biotin 첨가

나) 당밀: 값이 싸나 biotin 고농도 함유 - 적당한 시기에 생육저해 물질 첨가

* 생육저해물질

- 항생물질 첨가: Penicillin 또는 Cephalosporin C-세포벽 합성 불량

- biotin 길항제 첨가

고급포화지방산 : C16(palmitate), C17(margariate), C18(stearate)

계면활성제 : Tween40(palmitate), Tween60(stearate 함유)

2) 질소원 적당량 유지

- NH3 gas, NH4OH 등 산업적 주로 사용, 유안, 요소 첨가로 유가배양

- 과잉 시 : Gln 생산

- 결핍 시: α-ketoglutarate 생산

3) 산소

과잉 시: NADPH2가 부족하여α-ketoglutarate 축적

결핍 시: 혐기적 대사로 젖산, 호박산 생성

Glutamate Glutamine

NH3 H2ONH2-CH-COOHCH2CH2-COONH2

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다. Glu의 분리 및 정제: Glu 분리--Glu 정제--MSG 제조 – 등전점 침전법

1) Glu의 분리 : 등전점 침전법

발효액의 pH를 3.2로 조절(Glu의 석출)하여 원심분리

- HCl로 용해 (Glu-HCl) 후 농축

2) Glu의 정제 : 재침전

Glu-HCl 온탕 용해

- NaOH로 pH3.2 조절하여 Glu 재침전

- 원심분리로 Glu 결정 회수 - 냉수 세척 (NaCl 및 불순물 제거)

3) MSG의 제조

유리 Glu 용해 후 NaOH로 pH6.5 조절: Na-Glu 생성

(pH7.0 이상: Na2-Glu 생성)

- 탈철, 탈색 후 농축하여 결정화

탈철: Na2S + Fe+++ --- Fe2S3, Na2HPO4 + Fe+++ --- FePO4

탈색: 활성탄 처리

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2. Orn, Arg 발효--의약용으로 중요

가. Ornithine 발효: C. glutamicum의 Cit- - citrulline 영양요구성변이주

- Ornithine으로부터 citrulline 전환 불가

- Ornithine 분해 불가, arginine에 의한 조절해제

- 배지에 소량의 citruline 첨가하여 배양

나. Arginine 발효 : -(CH2)3-NH-C(=NH)-NH2

- 동물 단백질에 함량 고 -성장기 어린이에게 필요 –준필수 아미노산의 하나

- 최종산물로서 영양요구 변이주 이용 불가능(최종산물 조절)

* Analog 내성 변이주에 의한 발효가 주

AH(Arginine hydroxamate) 내성변이주- arginine에 의한 조절 해제

Glu N-Acetyl N-Acetyl Ornithine Citrulline Arginosuccinate Arginine glutamate ornithine

Urea

Carbamyl phosphate Asp

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7-2. Aspartate 계열(Asp 제외 모두 필수 아미노산)

1. Lys 발효: 곡류 단백질에 특히 결핍, 열에 불안정--한계 아미노산

가. 발효법 : C. glutamicum 변이주 이용

-Homoserine dehydrogenase 활성 약, Aspartokinase 조절 해제

* 변이주의 특성

1) Hom- – homoserine영양요구성 변이주 : Thr 합성 불가

: Thr+Lys 조절 해제, Lys 축적

2) Mets, Thrs - 감수성변이주 - Thr, Met 많으면 생육 저해

- Thr, Met 생산량 매우 적은 변이주

: Thr+Lys 조절해제, Lys 축적

3) AECr : 2-aminoethyl-cysteine 내성 변이주

: AEC 및 Lys에 의한 조절 해제

Glc OAA Asp β-aspartyl-P Aspartic-β-semialdehyde Homoserine Thr

Thr+Lys Lys

Homoserinedehydrogenase

Aspartokinase

IleMet

: inhibition, : repression

협조적조절

SHCH2

NH2-C-COOH(CH2)2NH2 AEC

NH2-CH-COOH(CH2)4NH2

Lys

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* 발효조건

1) 탄소원 : 사탕수수 당밀 주로 이용

2) 질소원 : 암모니아 가스 또는 암모늄염 - 부원료 : 탈지대두박 가수분해물 등

3) 영양요구물질 : 필요에 따라 homoserine, Thr, Met 소량 첨가

4) Biotin 30ppm 이상 유지 – 사탕수수 당밀에 충분히 함유

나. 효소법에 의한 Lys의 생산

: α-Amino-ε-caprolactam으로부터 효소반응으로 Lys 생산

(cyclohexane으로부터 화학합성 - D, L형 50% 함유)

-D형을 L형으로 전환 후 가수분해

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- 1 -

Racemase

Cryptococcus laurentii

-Hydrolase 강

Racemase 무

D--amino--caprolactam L--amino--caprolactam L-Lysine

NH2-CH-COOH(CH2)4NH2

HN O

NH2α

ε

lactamAchromobacter obae

-Racemase 강

Hydrolase 약

HydrolaseHN O

NH2

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2. Thr 발효

: 조절해제(Thr, Lys, Met), Thr의 분해 억제, 중간산물 타 물질로의 전환 방지

* E. coli와 C. glutamicum 변이주 사용한 직접발효법 : 포도당으로부터 생산

: E. coli - Thr 합성경로는 Corynebacterium sp.와 동일하나 조절현상 상이

***E. coli의 Asp 계열 조절현상 : ..\Asp 계열 조절현상.ppt

가) α-AHVr : Thr analog 내성 변이주

(α-amino-β-hydroxyvaleric acid)

나) DAP- : diaminopimelic acid 합성 불가

- Lys 합성 불가, ASA 분해방지 ***DAP 경로 : 라이신합성

다) Met- : homoserine으로부터 Met 합성 불가

- Met 조절해제, homoserine 분해방지

라) Ile- : Thr로부터 Ile 합성 불가 - Thr 분해방지

Glc OAA Asp β-aspartyl-P Aspartic-β-semialdehyde Homoserine Thr

Lys

Homoserinedehydrogenase

Aspartokinase

IleMet

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3. Ile 발효

1) S. marcescens, C. Glutamicum 변이주를 이용한 직접발효법 – 주

2) Serratia marcescens를 이용한 대사의 bypass 또는 전구체 첨가법

- 기질로서 D-Thr 또는 α-amino butyrate 사용

4. 효소법에 의한 Asp의 생산

: E. coli aspartase를 고정화하여 fumarate를 amination시켜 제조

L-Threonine α-ketobutyrate Ile

NH3

α-amino butyrate α-ketobutyrate Ile

H2O NH3NAD+ NADH2

HOOCHC HOOCHC

CHCOOH CHCOONH4∥ ∥

NH2-CH-COOHCH2-COOH

Fumarate+NH3 또는 ammonium fumarate Aspartate (거의 100% 전환가능)

E. coli의 aspartase

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7-3. Aromatic 계열 : Phe, Tyr, Trp

: 구조유사, 생합성 경로 공통, 조절기구 복잡 - 발효법 생산 곤란 - 효소적 생산

1. Trp의 생산 : Lys 다음으로 곡류(특히 옥수수)에 결핍되기 쉬운 필수 아미노산

1) 효소법 : E. coli Trp synthetase 또는Providencia rettgeri의 tryptophanase 사용

2) 발효법 : C. glutamicum의 Phe-, Tyr-, 5-FTr

- 1 -

5

1

4

36

CH3COCOOH + NH3 +

indoleN

NH2-CH-COOH

CH2

N

+ H2O

PhenylalaninePEP + E-4-P Chorismate Tyrosine

Anthranilate Tryptophan

1

3

2

4

5

6

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2. Phe, Tyr의 생산 - 생체내 생합성 경로 거의 유사

- C. glutamicum, B. subtilis의 변이주를 이용한 직접발효법

1) 영양요구성변이주 : Tyr 생산 시 Phe-, Phe 생산시 Tyr-

2) analog 내성변이주

: Phe - P(M)FP(p or m-fluorophenyl alanine), PAP(p-aminophenylalanine)

: Tyr - 3-amino tyrosine, tyrosine hydroxamate

* Phe : aspartame (설탕의 200배 감미)의 원료

- L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester

3. DOPA (3,4-dihydroxy phenylalanine)

: Parkinson씨 병 (P's syndrome) 등 노인성 뇌신경장해 치료약

- 미생물의 대사와 무관 : 직접발효에 의한 생산 불가

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L- or D-Serine(-CH2OH)or Pyruvate +NH3

OH

OH

pyrocatecholNH2-CH-COOH

CH2

+ H2OOH

OH DOPA

+β-tyrosinase

-Erwinia herbicola의효소 주로 사용

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7-4. 기타

1. Histidine(His 하나뿐): hemoglobin에 많이 함유

- 빈혈치료제, Arg와 함께 소아의 필수 아미노산

- C. glutamicum의 analog 내성 변이주 (2-TAr, 1,2,4-TAr 이용하여 생산)

(2-TA : 2-thiazole alanine,

1,2,4-TA : 1,2,4-triazole alanine)

2. Pyruvate 계열 : 산업적으로 중요한 것 없음

3. Serine 계열 : 생산 거의 무

N

SThiazolealanine

NN

N

Triazolealanine

12

3

N

N

His

NH2 - CH - COOHCH3

NH2 - CH - COOHCH2┃

Alanine