ELETROFORESE

1. Características básicas;

2. O fluxo determinante;

3. Fatores envolvidos;

4. O ponto isoelétrico;

5. Tipos de eletroforese:

Eletroforese livre,

Eletroforese em suporte semi-sólido,

Eletroforese em suporte sólido,

Eletroforese capilar,

Focalização isoelétrica,

Eletroforese com SDS,

Eletroforese bidimensional,

Eletroforese de alta voltagem,

Immunobloting,

Iontoforese.

6. Revelação;

7. Analise qualitativa e quantitativa;

8. Aplicações e procedimentos experimentais

2

OBJETIVOS:

ELETROFORESE

DEFINIÇÃO:

Processo de separação e/ou caracterização dos componentes de

um sistema, baseado na carga elétrica livre das partículas, onde

ocorre a migração diferencial das mesmas quando submetidas a

um campo elétrico.

PRINCÍPIO:

Para que uma partícula se mova no campo elétrico é necessário

que possua carga, isto é, excesso ou deficiência de elétrons,

resultando em carga elétrica livre.

3

ELETROFORESE

A eletroforese é especialmente útil como método analítico. Sua

vantagem é que as proteínas podem ser separadas e visualizadas,

permitindo determinar rapidamente o número de proteínas presentes

em uma mistura ou o grau de pureza de uma preparação particular de

proteínas.

A eletroforese permite também a determinação de propriedades

cruciais de uma proteína, tais como o seu ponto isoelétrico e sua massa

relativa podem ser estimados.

Técnicas especializadas de eletroforese como Western blotting,

eletroforese bi-dimensional e mapeamento peptidico podem ser usadas

para detectar produtos gênicos extremamente escassos, encontrar

similaridades entre eles e detectar e separar isoenzimas.

4

ELETROFORESE

5

Fracionamento e caracterização Aminoácidos

Peptídeos

Proteínas (lipo e glico)

Nucleotídeos

Ácidos carboxílicos

Adoçantes

Vitaminas

Corticoides

Pesticidas

Outras partículas que apresentem cargas

em função do pH do meio.

ELETROFORESE

Componentes que possuem carga elétrica livre migram para pólo de

carga oposta a sua. Portanto, partículas carregadas positivamente

migram para o pólo negativo (cátodo) e partículas carregadas

negativamente migram para o pólo positivo (ânodo).

Na eletroforese a força elétrica, Fel , que move a macromolécula (os

ácidos nucléicos, e as proteínas também podem ser separados deste modo) é

o potencial elétrico, , vezes a carga líquida da molécula, q.

A força que pára a migração da macromolécula é a fricção, Ff, que é

proporcional a velocidade da partícula, V, vezes o coeficiente de fricção, ffr:

No caso do campo elétrico constante, as duas forças se balanceiam e a

molécula migra com a velocidade constante.

6

ELETROFORESE

Eletroforese é o fluxo de partículas carregadas = o fluxo migracional.

A forca que atua sobre as moléculas com cargas elétricas é proporcional

ao valor da carga e o gradiente do potencial elétrico.

O fluxo, J, é proporcional a:

a carga (q),

a Concentração das moléculas (C),

a Área que o fluxo atravessa (A),

a Mobilidade das moléculas (u)

o Gradiente do potencial elétrico

xqCAuJ

7

ELETROFORESE

A velocidade com que uma partícula se movimenta no campo elétrico

depende de vários fatores:

densidade de carga elétrica livre:

principal fator, diretamente proporcional.

potencial elétrico aplicado:

diretamente proporcional. A voltagem aplicada deve ser adequada para

separar o mais rapidamente possível, antes que a difusão espalhe os

componentes. Voltagem muito alta, porém, aquece o sistema e prejudica

a separação

raio da partícula: inversamente proporcional

viscosidade do meio: inversamente proporcional

FATORES QUE CONDICIONAM A VELOCIDADE DA MIGRAÇÃO

ELETROFORÉTICA:

8

ELETROFORESE

Outros fatores também influenciam na velocidade de migração:

pH do meio (tampão);

força iônica do tampão;

interação com a fase fixa;

tipo de suporte;

grau de embebição (absorção) do suporte;

temperatura;

FATORES QUE CONDICIONAM A VELOCIDADE DA MIGRAÇÃO

ELETROFORÉTICA:

9

ELETROFORESE

PONTO ISOELÉTRICO de uma proteína é o valor do pH no qual

as cargas positivas e negativas (da proteína) se equivalem. Não

tendo carga elétrica efetiva, e portando, não migrando na presença

do campo elétrico.

Existem aminoácidos que além da carboxila e do grupo amina possuem

outros grupos dissociáveis:

Histidina (grupo imidazol, pK=8,3), Cisteína (grupo sulfidrila, pK=8,3),

Tirosina (grupo hidroxifenol, pK=10,1) e Arginina (grupo guanidil,

pK=12,5).

As proteínas são poliaminoácidos e, portanto, possuem o comportamento

múltiplo dos aminoácidos componentes.

10

ELETROFORESE

Proteínas pI

Pepsina

Ovalbumina

Soroalbumina

Urease

-Lactoglobulina

Hemoglobina

Mioglobina

Quimotripsinogênio

Citocromo C

Lisozima

-1.0

4.6

4.9

5.0

5.2

6.8

7.0

9.5

10.7

11.0

PONTO ISOELÉTRICO

Quase todas as proteínas possuíram o ponto isoelétrico exato,

por exemplo:

O ponto isoelétrico da pepsina que está apresentado na tabela é -1.

Há alguma coisa errada?

11

ELETROFORESE

As imunoglobulinas não possuem ponto isoelétrico fixo.

Faça uma pesquisa e descubra o porquê.

ESQUEMA DA DISTRIBUIÇÃO DAS PROTEINAS SÉRICAS PELOS

PONTOS ISOELETRICOS

pI 4,7-5.4 pI 5,4-5,8 pI 6,3-8,3

Albumina

Alfa 1- globulina Beta - globulina Gama-globulina

Alfa 2- globulina Beta - lipoproteína

Alfa – lipoproteína

Memorize os pontos isoelétricos das proteínas séricas.

Para qual pólo elétrico elas vão migrar em pH 9?, pH 4? e pH 6?

O ponto isoelétrico da Gama-globulina está na faixa de 6.3-8.3.

Há alguma coisa errada? As imunoglobulinas todas não possuem o ponto isoelétrico fixo.

Fazer pesquisa e descobrir porque. 12

ELETROFORESE

MÉTODOS ELETROFORÉTICOS:

ELETROFORESE SEM SUPORTE: denominada eletroforese livre.

Nesse sistema as substâncias são separadas em meio totalmente líquido, em tubo em

forma de “U”. Para se obter um quadro completo da mistura, escolhe-se um pH onde a

maioria das proteínas tenha a mesma carga, porém com densidade de carga e

mobilidade diversa. O índice de refração nessa fronteira muda pela passagem das

proteínas. Os movimentos de convecção provocados pela dissipação do calor exigem

aparelhos e instalações especiais. É um método em desuso.

Diagrama esquemático da célula de Tiselius

para medir a mobilidade eletroforética pelo

método do movimento de fronteiras.

No exemplo é mostrada duas diferentes espécies

de proteínas carregadas negativamente, com

diferentes mobilidades eletroforéticas, dissolvidas

em solução tampão. Neste caso todas as

proteínas migram para o ânodo. As mais rápidas

assumem as fronteiras (1) tanto ascendente

quanto descendente, ultrapassando, as mais

lentas (2). Como resultado forma-se duas

fronteiras em movimento ascendente e duas

fronteiras em movimento descendente.

13

ELETROFORESE

ELETROFORESE EM SUPORTE SÓLIDO

ELETROFORESE EM SUPORTE:

A solução aquosa de proteínas é imobilizada em uma matriz solida ou semi-

sólida (material poroso e hidratado que apresenta rigidez mecânica) eliminando

a convecção e os distúrbios de vibração. Diminui a difusão das substâncias, o

que facilita a sua completa separação. Metodologia mais simples, de maior

resolução e que necessita de menores quantidades de amostra em relação a

eletroforese livre.

ELETROFORESE EM SUPORTE SÓLIDO:

Os suportes sólidos mais usados são papel de filtro (EPF) e acetato de

celulose (EAC), por serem materiais relativamente inertes que não interagem

com as proteínas migrantes nem ocasionam o seu retardamento. O acetato de

celulose tem a vantagem sobre o papel de filtro proporcionando melhor

fracionamento, inclusive na separação de beta-globulina e beta-lipoproteína, o

que não é possível em papel, e maior rapidez na separação. O processo de

eletroforese é mantido até que os componentes tenham sido separados em

zonas nítidas. A posição e quantidade das proteínas, pode ser avaliada por um

densitômetro.

14

ELETROFORESE

ELETROFORESE EM SUPORTE SÓLIDO

(a). Diagrama esquemático do instrumental utilizado. A amostra é aplicada

no centro do papel previamente umedecida pela própria solução tampão. As

extremidades do papel são mergulhadas na solução tampão, na qual os

eletrodos estão imersos e aonde será aplicado o campo elétrico.

(b) Representação esquemática do eletroforetograma completo. Veja que

os íons positivos (cations) migram em direção ao cátodo e os íons negativos

em direção ao ânodo. Moléculas com carga resultante nula, permanecem no

ponto de aplicação da amostra.

15

ELETROFORESE

ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI SÓLIDO

Os suportes semi-sólidos mais usados são os géis de agar, agarose e poliacrilamida. É

possível maior resolução eletroforética quando o suporte ou material da matriz pode

retardar ou excluir moléculas protéicas em função dos seus tamanhos moleculares.

ELETROFORESE EM GEL ÁGAR OU AGAROSE (EA): o processo é semelhante ao

descrito para eletroforese em acetato de celulose. Uma variação dessa técnica, bastante

utilizada é a IMUNOELETROFORESE. Nessa técnica após a separação eletroforética da

amostra, faz-se uma reação antígeno-anticorpo (Ag-Ac), lava-se a preparação para

retirar as proteínas solúveis, restando os complexos Ag-Ac insolúveis (precipitados no

gel), que são visualizados através de coloração específica. A analise imunoeletroforética

permite definir ou caracterizar uma substância através de suas propriedades

eletroforéticas (mobilidade), diferenças na velocidade de difusão (coeficiente de difusão)

e pelas propriedades imunológicas (especificidade).

ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA (EGPA). A eletroforese é realizada

em géis feitos de polímeros entrecruzados de poliacrilamida. O gel de poliacrilamida é

um suporte que funciona com uma peneira molecular, promovendo a filtração da amostra

pela rede do gel, reduzindo a velocidade de migração das proteínas em proporção

aproximada à massa de cada uma delas. Nesse caso há associação da separação por

carga e por massa relativa. Nesse sistema, proteínas com mesmas cargas são

separadas por suas massas relativas.

s16

ELETROFORESE

ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI SÓLIDO

Aparelhos e peças para eletroforese vertical

17

ELETROFORESE

ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI SÓLIDO

FORMAÇÃO DO GEL DE POLIACRILAMIDA – polimerização

Gel de poliacrilamida

18

ELETROFORESE

ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI SÓLIDO

Procedimento esquemático

As amostras (misturas das

proteínas a ser analisadas

estão colocadas com ajuda

das micropipetas, nos

poços do gel (1-3). O

campo elétrico está

aplicado (4) e as proteínas

migram com velocidades

diferente (5, 6) dependendo

das cargas elétricas livres e

tamanhos.

19

ELETROFORESE

ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI SÓLIDO

EM GEL ÁGAR OU AGAROSE ou POLIACRILAMIDA

Slab-eletroforese – eletroforese em camada fina do gel

Há dois tipos de géis: no topo o gel é com

poros grandes e serve para concentrar as

amostras; no baixo o gel é com poros

menores e serve para separação as proteínas

ou outros componentes do analise.

Esquema do gel em camada fina

entre duasplacas de vidro. Aplicação

das amostras e resolução das

proteínas após revelação.

20

ELETROFORESE

ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI-SÓLIDO

Revelação

A) corante Coomassie blue; B) coloração por prata

21

ELETROFORESE

A) brometo de etídio; B) nitrato de prata; C) marcação radioativa;

D) quimiluminescência; E) Coomasie Blue; F) fast blue BB salt.

ELETROFORESE

ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI SÓLIDO

Revelação

ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI SÓLIDO

Revelação

Com Luz UV Com corantes fluorescentes

Visualização dos ácidos nucléicos

23

ELETROFORESE

ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI SÓLIDO

Revelação

Em Laboratorio

24

ELETROFORESE

ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI SÓLIDO

Revelação

25

ELETROFORESE

Eletroforese ácidos nucléicos

26

ELETROFORESE

Eletroforese na presença do SDS

Um método eletroforético comumente utilizado para a determinação da pureza e do peso

molecular de proteínas faz uso de detergente dodecilsulfato de sódio (SDS). O SDS liga-se

à maioria das proteínas, provavelmente por interações hidrofóbicas em quantidades

grosseiramente proporcionais ao peso molecular de cada proteína e, em geral, na

proporção de uma molécula de SDS para cada dois resíduos de aminoácidos. O SDS ligado

adiciona uma grande carga negativa à molécula de proteína, tornando insignificantes as

cargas intrínsecas da mesma.

[CH3-(CH2)n-CH2-O-SO3-] Na+

Dodecilsulfato de sódio (SDS)

A conformação nativa das proteínas é alterada quando o SDS liga-se a elas e a maioria

adquire, então, uma mesma forma geométrica, isto as tornam muito semelhantes entre si e,

por esta razão, passam a ter uma mesma relação entre a carga elétrica e a massa. Assim, a

eletroforese na presença de SDS separa as proteínas quase exclusivamente com base na

sua massa, com os polipeptídios menores migrando mais rapidamente. Proteínas tratadas

com SDS, perdem a carga intrínseca e adquirem carga negativa constante em relação a

massa relativa. Sendo negativas, são atraídas para o ânodo e a separação ocorre segundo

a massa relativa. As proteínas menores migram na frente, o inverso da cromatografica por

gel-filtração. 27

ELETROFORESE

ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA

NA PRESENÇA DE DODECIL SULFATO DE SODIO (EGPA-SDS).

Exemplo do gráfico padrão para

determinação da massa relativa

Eletroforetograma

Etapas:

1. medida das distancias percorridas (todas as proteínas e corante Lider);

2. Calculo de Rf (migração relativa = Dp/DL);

3. construção do gráfico Padrão, onde eixo Y – migração relativa e eixo X – Logaritmo da

massa relativa das proteínas padrão;

4. Utilizando valor do Rf da proteína desconhecida, determine o Logaritmo da massa

molecular .

Descubra a massa relativa da

proteína desconhecida, no

Eletroforetograma ao lado.

28

Lo

g d

a M

as

sa

Re

lati

va

Migração Relativa

ELETROFORESE

FOCALIZAÇÃO ISOELÉTRICA OU ELETROFOCALIZAÇÃO

A focalização isoelétrica é um procedimento usado para determinar o ponto

isoelétrico (pI) de uma proteína. Talvez seja o método mais eficiente de

eletroforese.

Nesse método, inicialmente, os anfólitos (uma mistura de ácidos e bases

orgânicos, de pequena massa) são aplicados no suporte (um gel), após

aplicarmos um campo elétrico num tempo curto (pré-corrida) para distribuir os

anfólitos ao longo do gel e estabelecer um gradiente linear de pH no gel de

poliacrilamida ou agarose.

Uma mistura de moléculas com

pontos isoelétricos diferentes é

aplicada (1). As moléculas

migram (2) até cada uma delas

chegar ao local com o valor do

pH igual ao seu pI (3).

1

2

3

3

Separação das moléculas em acordo com pontos isoelétricos

29

ELETROFORESE

FOCALIZAÇÃO ISOELÉTRICA OU ELETROFOCALIZAÇÃO

Resultado

Quando uma mistura protéica é colocada no

gel de poliacrilamida ou agarose cada

proteína migra para o cátodo ou anodo até

atingir o pH, que é igual ao seu pI (pH

isoelétrico), formado uma área estacionária.

Assim, proteínas com diferentes pontos

isoelétricos distribuem-se de forma diferente

ao longo do gel, formado uma área

estacionária.

O processo da revelação é similar ao

processo utilizado na nossa aula pratica com

papel da celulose como suporte sólido:

corante revelador e solução descorante.

A separação das moléculas

de acordo com seus

pontos isoelétricos.

30

ELETROFORESE

Combinando dois métodos

eletroforéticos :

a focalização isoelétrica (IEF) e

a eletroforese na presença de SDS)

em géis bidimensionais consegue-se

a resolução de misturas mais

complexas de proteínas. Este método

composto é mais sensível do que a

focalização isoelétrica ou a eletroforese

em SDS sozinhos. A eletroforese

bidimensional separa as proteínas de

peso molecular idêntico, que diferem

em ponto isoelétrico, ou proteínas com

pI similar, porém massas relativas

diferentes.

Eletroforese bidimensional. O principio

31

ELETROFORESE

Combinando os dois métodos:

1. focalização isoelétrica (IEF) e

2. eletroforese na presença de SDS

A eletroforese bidimensional separa as

proteínas de mesma massa relativa que

diferem em pontos isoelétricos, ou

proteínas com pI similares, porém massas

diferentes.

Revelado com o corante Coomassie.

Eletroforese bidimensional

32

ELETROFORESE

Coloração por prata Corantes fluorescentes

Eletroforese bidimensional - Revelação

Cada pontinho representa um proteína diferente. A intensidade da

coloração indica a quantidade da proteína.

33

ELETROFORESE

ELETROFORESE DE ALTA VOLTAGEM

Aplica-se alta voltagem (ate 10 mil volts) ao sistema para

separação de pequenas moléculas com rapidez, antes que elas

possam se difundir. Utilizada para aminoácidos e pequenos

polipeptídios.

Fonte externo para eletroforese

34

ELETROFORESE

“ IMMUNOBLOTING” é um poderoso método de diagnostico.

35

ELETROFORESE

“ IMMUNOBLOTING” é um poderoso método do diagnostico.

36

ELETROFORESE

Analise dos eletroforetogramas. Densitometros são fotocolorímetros específicos.

37

ELETROFORESE

Eletroforese das proteínas séricas: correlações clínico-patológicas.

Densitogramas = curvas de absorbância

38

ELETROFORESE

Eletroforese das proteínas séricas: correlações clínico-patológicas.

Densitogramas = curvas de absorbância

39

ELETROFORESE

Determinação as quantidades relativas de cada proteína nas analises

eletroforeticos

Como podemos calcular as quantidades relativas de cada proteína na amostra analisada, baseados

apenas nos densitogramas ? Isto pode ser resolvido de duas formas.

Baseado na área do gráfico. Primeiro tem que traçar uma linha na base do gráfico ligando os pontos

iniciais e finais. Depois, podemos utilizar o conceito de integral e derivação de funções, mas podemos

utilizar um artifício geométrico para resolver nosso problema: basta traçarmos retas paralelas aos eixos x

e y, cobrindo todo o gráfico (formando uma malha). Feito isto, passaremos a trabalhar como se

usássemos um papel milimetrado (quanto mais próximas essas linhas umas das outras, mais exata será

a medida obtida). Para descobrir as áreas aproximadas das curvas do gráfico, devemos então contar o

número de quadrados contidos no gráfico. Quando o quadrado estiver apenas parcialmente contido no

gráfico, a ele será atribuído valor 0,5. Quando o quadrado estiver totalmente contido no gráfico, a ele

será atribuído valor 1. Após a contagem, soma-se os valores, obtendo as áreas relativas das curvas.

Outra possibilidade é aproxima o cada curva (pico) com uma ou mais figuras geométricas e calcula as

áreas delas. Área somatória assumida como 100%. Área de cada pico – X%.

Com uma balança analítica. Primeiro traçamos uma linha na base do gráfico e com uma tesoura,

podemos simplesmente recortar o gráfico e obter um pedaço de papel na forma dele. Em seguida pesa-

se esse recorte e anota-se a o peso obtido (PG =peso total), referente a todo gráfico. Depois, recorta-se

cada Gaussiana (picos) do gráfico e pesa-se separadamente. Para se saber a quantidade relativa das

proteínas, basta estabelecer relações matemáticas entre os pesos anotados e o peso total, PG.

Usar esse noção para analisar a fração relativa das proteínas séricas a partir dos densitogramas

de eletroforese apresentados na pagina anterior.

40

ELETROFORESE

Uma imunoeletroforese cruzada bidimensional.

41

ELETROFORESE

A eletroforese das proteínas do soro, dentro de certos limites, tem importante

papel na investigação clínica. A análise do diagrama eletroforético poderá ser

feita por uma simples inspeção visual da fita, após coloração, ou através dos

dados quantitativos obtidos por eluição da fita e leitura em fotocolorímetro ou

pela leitura da fita no densitômetro.

A eletroforese do soro do adulto normal, usando tampão pH 8,6 de força

iônica 0,05, resulta na separação de 5 componentes protéicos:

fração albumina, alfa-1, alfa-2, beta e gama globulina.

A fração albumina é a que mais se distancia do ponto de aplicação no sentido

do pólo positivo. As frações globulinas são designadas pela ordem de

mobilidade decrescente. Uma vez que a densidade da coloração das

diferentes frações é proporcional as suas concentrações, a fração albumina é

que se mostra mais densa.

Eletroforese das proteínas séricas:

correlações clínico-patológicas

42

ELETROFORESE

FRAÇÕES PROTEICAS - VALORES NORMAIS:

Albumina 3,5 a 5,3 g/100 ml ou 52% a 68%

Globulinas: Alfa 1 0,2 a 0,2 g/100 ml ou 3,4% a 5,3%

Alfa 2 0,4 a 0,7 g/100 ml ou 6% a 10%

Beta 0,7 a 0,9 g/100 ml ou 10% a 13%

Gama 1,0 a 1,7 g/100 ml ou 14% a 21%

Eletroforese das proteínas séricas:

correlações clínico-patológicas

43

ELETROFORESE

GLOBULINA ALFA-1 AUMENTADA: Enfermidades agudas, crônicas de

qualquer natureza (por exemplo, resfriados, furunculose); síndrome

nefrótica; processos inflamatórios agudos. Neoplasias e outros;

síndrome com destruição tissular; efermidade de Hodgkin; úlcera

péptica; gastroenterites agudas; colites ulcerosas e carcinoma gástrico.

GLOBULINA ALFA-1 DIMINUÍDA: Cirrose hepática, periarterites

crônicas, hepatites por vírus, má absorção e má nutrição.

CLOBULINA ALFA-2 AUMENTADA: Síndrome nefrótica, icterícia

obstrutiva, tuberculose pulmonar e extrapulmonar, mieloma múltiplo,

enfermidade de Hodgkin, nefrose e glomerilonefrite, enfermidades do

colágeno, diabete melitus, úlcera péptica, gastroenterites agudas,

colites ulcerosas e carcinoma gástrico

Eletroforese das proteínas séricas:

correlações clínico-patológicas

44

ELETROFORESE

GLOBULINA ALFA-2 DIMINUÍDA: Hepatites por vírus, cirrose hepática,

síndrome de má absorção e má nutrição.

BETA CLOBULINA AUMENTADA: Especialmente em todos os processos em

que há hiperlipemia como: síndrome nefrótica, mixedema, icterícia obstrutiva e

mieloma múltiplo.

BETA GLOBULINA DIMINUÍDA: Leucemias mielogênicas e momocíticas,

colites ulcerosas, nefrose e glomerulonefrites.

GAMA CLOBULINA AUMENTADA: Inflamações crônicas (entre elas

endocardites bacterianas e hepatites crônicas), necroses hepáticas,

enfermidades do colágeno com excessão da perioarterite nodosa, calazar

(leishmaniose), linfogranuloma venéreo, cirrose crônica (ê característica a

quase ausência de demarcação entre os picos beta e gama), sarcoidoses,

artrite reumatóide, plasmocitoma e macroglobulinemia.

GAMA GLOBULINA DIMINUÍDA: Baixa resistência por infecções, leucemias

linfáticas, úlceras gástricas, colites ulcerosas, enterites agudas, câncer do

estômago, nefroses, glomerulonefrites e enfermidades de má absorção e

nutrição.

Eletroforese das proteínas séricas:

correlações clínico-patológicas

45

ELETROFORESE

Eletroforese em capilar: apresentação esquemática

46

ELETROFORESE

Eletroforese em capilar

47

ELETROFORESE

Tipos de eletroforese em capilar:

Eletroforese zonal em capilar (EZC): é a forma mais simples de eletroforese em

capilar e também é conhecida como em eletroforese em solução. A separação se

baseia na diferença da razão massa/carga das substâncias. O fundamental na EZC é a

homogeneidade da solução tampão e a uniformidade na intensidade do campo elétrico

ao longo do capilar. O controle do pH do meio é muito importante uma vez que ele

interfere na dissociação dos grupamentos acídicos e protonação dos grupamentos

básicos do soluto.

Eletroforese em gel no capilar (EGC): é uma adaptação da eletroforese em gel

tradicional só que ocorrendo no interior do capilar, que é preenchido com uma solução

de polímeros criando uma peneira molecular. Deste modo é possível separar pelo

tamanho substâncias que apresentam a razão massa/carga similar. Está técnica é

comumente empregada na determinação do peso molecular de proteínas e na análise

de seqüenciamento de DNA.

Focalização isoelétrica em capilar (FIC): possibilita que moléculas anfóteras como

proteínas sejam separadas em um gradiente de pH estabelecido entre o cátodo e o

anodo. As moléculas irão migrar até onde sua carga resultante seja zero. No ponto

isoelétrico as moléculas estacionam em uma zona focada, que pode ser localizada

utilizando um detetor de pressão ou por meios químicos. A FIC é muito utilizada para

caracterização de proteínas.

48

ELETROFORESE

Estudo clínico do plasma e outros líquido do organismo de

mamíferos (EAC ou EPF);

Resolução de misturas complexas de proteína, ácidos nucléicos

e aminoácidos (EGPA, EGPA-SDS, FI);

Determinação da pureza e homogeneidade molecular (EGPA,

EGPA-SDS, FI);

Determinação do pI das proteínas (FI);

Determinação da massa relativa (EGPA-SDS).

APLICAÇÕES:

49

ELETROFORESE

Determinação de alterações em amostras submetidas a ação de

agentes químicos (drogas) ou físicos (radiações) - (EGPA, EGPA-SDS,

FI);

Genética molecular (EGPA** ou EGPA-SDS)- testes de paternidade

entre outros;

Testes mais refinados para diagnóstico (“immunoblotting” - teste

para HIV) - (EGPA ou EGOA-SDS);

Veterinária (EGPA, EGPA-SDS, FI) - usado para avaliar alterações

patológicas em animais;

Taxonomia** (EGPA, EGPA-SDS, FI) - Classificação de espécies.

APLICAÇÕES:

50

ELETROFORESE

Obstáculos para penetração da pele: A resistência do estrato córneo (camada mais

extrema da pele) impede a entrada de medicamentos: moléculas grandes têm muita

dificuldade em atravessar a epiderme para os vasos sangüíneos da derme.

Soluções: Os equipamentos utilizados nesse caso denominam-se os aparelhos

para iontoforese e estão apresentados na figura seguinte. O aparelho utiliza pulsos

de eletricidade praticamente indolores que tornam a pele permeável.

Iontoforese

A eletroforese pode ser utilizada para “injeção” de

medicamentos através da pele.

51

ELETROFORESE

http://webanatomy.net/anatomy/skin.jpg

Estrutura da pele

52

ELETROFORESE

Estrutura da pele

53

ELETROFORESE

Iontoforese

54

ELETROFORESE

Iontoforese é um processo de facilitação da penetração dos tecidos

biológicos para substâncias ionizadas (com cargas elétricas livres)

quando submetidas a aplicação do potencial elétrico adequado.

As substâncias são geralmente os fármacos (antiinflamatórios,

esteróides e anestésicos locais). Iontoforese é usada para

transportar quantidades clinicamente significativas dos fármacos

para região cutânea e subcutânea do tecido.

A análise experimental e clínica demonstram a importância deste

método na clínica, fisioterapia, dermatologia, otorrinolaringologia,

oftalmologia, odontologia, e neurologia.

Iontoforese

55

ELETROFORESE

Mecanismos: Ionização e Eletroosmose

As drogas colocadas em meio aquoso são compostos iônicos que se dissociam em partículas carregadas positivamente e negativamente, portanto serão atraídos por eletrodos de sinal contrário.

Ionização -> ex. (fosfato de dexametasona sódica)

(-) íon fosfato de dexametasona e (+) íon sódio.

Iontoforese

A identificação da droga prediz a polaridade do eletrodo que será usados

para mover ou entregar a droga ao tecido.

Drogas positivas são colocadas sob o eletrodo positivo (anodo) e drogas

negativas, sob o cátodo (eletrodo negativo)

O eletrodo ativo contém a droga e o eletrodo oposto é chamado de

eletrodo dispersivo.

56

ELETROFORESE

1. Eletroforese;

2. Electroosmose com cargas

elétricas fixas negativas. Os

poros seletivamente

preenchidas com cátions que

faz acontece o fluxo da água

(junto com os cátions) na

direção do pólo negativo =

catodo.

3. Eletroosmose com cargas

elétricas fixas positivas. Os

poros seletivamente

preenchidas com anions que

faz acontece o fluxo da água

(junto com os anions na

direção do pólo positivo =

anodo.

Esse fluxo leva as moléculas

neutras e, também influi na

migração das moléculas com

cargas elétricas livres:

freando aquelas que se

movimenta contra fluxo da

água e acelerando a

migração outras que se

movimenta na mesma

direção do que a água.

Eletroosmose

1.

2.

3.

57

Então na eletroosmose o fluxo do solvente acontece enquanto o campo

elétrico é aplicado sobre um meio poroso (membrana, pele....) com cargas

elétricas fixas nas paredes dos poros.

Por isso razão os suportes (solido ou semi-solido) para o eletroforese

sempre estão feitos dos materiais sem as cargas elétricas fixas nos poros.

Eletroosmose

Em pH fisiológico (~7), a pele apresenta excesso de cargas negativas que

facilita migração dos cátions e o fluxo do solvente/água (junto com as

substâncias dissolvidas) para o catodo.

Fluxo: de anodo para catodo.

A pele é isoelétrica (número das cargas positivas igual ao número das cargas

negativas) em pH entre 3 e 4 (Costello, et al 1995).

Por isso o fluxo da água se reverte em pH <3, porque nessas condições a

pele apresenta excesso de cargas positivas que facilita migração dos

anions e o solvente (junto com as substâncias dissolvidas) para o anodo.

Fluxo: de catodo para anodo. Fonte da energia elétrica

58

ELETROFORESE

Iontoforese:

Eletroforese + Eletroosmose

59

ELETROFORESE

Princípios da Iontoforese

A taxa de penetração da droga aumenta com:

Aumento da carga da droga

Aumento da corrente iônica

Decréscimo da massa molecular do íon

(íons pequenos e leves apresentam maior

mobilidade)

www.dexrx.com

60

ELETROFORESE

Curdy, C., Kalia, Y.N., & Guy, R.H

A resistência oferecida pela pele reside na camada

superficial da epiderme, ou seja, estrato córneo, que

limita a perda de água do corpo.

O estrato córneo é o maior obstáculo para a entrega

de drogas transdérmica.

Princípios da Iontoforese

61

ELETROFORESE

• Banga, 1998

A espessura da pele é de aproximadamente 2 a 3 mm e o

estrato córneo tem 10-15 μm.

Os espaços intercelulares estão completamente cheios de

lamelas que são compostas por lipideos, ceramidas,

colesterol e ácidos graxos em quantidades praticamente

iguais.

A morfologia dos lipídeos é importante para a função de

barreira do estrato córneo.

Princípios da Iontoforese

62

ELETROFORESE

• Robinson, A.J & Snyder-Mackler, L., 1995

Muitos compostos são carregados positivamente ou negativamente. Quando estes compostos são colocados em soluções apropriadas, dissociam-se em componentes que se comportam como íons. Estes íons podem ser influenciados pelo campo elétrico aplicado a solução, onde eles podem ser atraídos pelos pólos de sinais contrários. A força elétrica de repulsão destas cargas é a força motriz para a iontoforese.

Princípios da Iontoforese

63

ELETROFORESE

Teoria da Iontoforese

A densidade de corrente é medida pela corrente aplicada dividido pela área em centímetros quadrado do eletrodo.

A quantidade de drogas entregue depende da corrente total aplicada multiplicada pelo tempo.

A corrente contínua unidirecional causa irritação na pele, sendo tolerada em no máximo 1 mA/cm quadrado.

64

ELETROFORESE

Iontoforese vs Injeção

A iontoforese é um tratamento não invasivo é o

risco para a pele é baixo.

A iontoforese permite um tratamento sem dor para

pacientes que não suportam injeções.

A iontoforese minimiza os traumas que ocorrem

nas injeções.

65

ELETROFORESE

Iontoforese vs Via Oral

A iontoforese permite a aplicação de drogas sem que elas sejam absorvidas pelo trato gastrointestinal A iontoforese é permite a aplicação de drogas transpondo o metabolismo hepático.

A iontoforese diminui os riscos de superdosagem.

66

ELETROFORESE

Área de Aplicação Precauções e Contra-indicações

Os riscos para o paciente é baixo, mas, ela não pode ser empregada

no tratamento nas seguintes condições:

67

Marcapasso cardíacos

Estimulação na área torácica

Estimuladores implantados

Sobre as carótidas no pescoço

Área faríngea

Sangramentos

Diminuição ou ausência de sensação.

Câncer

Hiper ou hipotensão não controlada

Doenças vasculares periféricas

Tromboflebites

Gestação

Osteoporose

Obesidade morbida

Desordens epiléticas

ELETROFORESE

Fatores de Absorção Fatores fisiológicos

As condições do leito vascular é importante, pois a

vasoconstricção leva a uma diminuição do fluxo, enquanto

a vasodilatação, aumenta-o.

Existem pequenas diferenças no fluxo de drogas por

iontoforese em mulheres e homens.

A quantidade e o tipo de pêlos também afeta o fluxo de

drogas na iontoforese.

68

ELETROFORESE

Penetração e Distribuição

A penetração dos íons

A penetração dos íons depende do tipo de tecido.

A profundidade é de aproximadamente 1 centimetro.

Alguns íons penetram até nos capilares subcutâneos.

69

ELETROFORESE

Aplicações Clínicas

Inflamação com dor constante

Fosfato sódico de Dexametasona a 0.4% (polaridade negativa)

entregue via cátodo em 3 aplicações semanais durante 4 semanas

Diclofenaco a 5% (polaridade negativa) entregue via cátodo em 3 aplicações semanais durante 4 semanas

Cetoprofeno a 10% (polaridade negativa) entregue via cátodo em 3 aplicações semanais durante 5 semanas

Hidrocloreto de Lidocaína a 4% (polaridade negativa) entregue via cátodo em 3 aplicações semanais durante 3 semanas

70

ELETROFORESE

Aplicações Clínicas

Artrite Reumatóide Salicilato de Sódio a 2% (polaridade negativa) entregue via

ânodo em 3 aplicações semanais durante 4 semanas.

Metacolina a (polaridade negativa) entregue via ânodo em 3 aplicações semanais durante 4 semanas.

Citrato de Potássio a 2% polaridade negativa) entregue via ânodo em 3 aplicações semanais durante 4 semanas

71

ELETROFORESE

Aplicações Clínicas

Espasmos Musculares

Sulfato de Magnésio a 2% (polaridade positiva) entregue via cátodo em 3 aplicações semanais

durante 4 semanas

Baclofeno a 0.5% polaridade negativa) entregue via ânodo em 3 aplicações semanais durante 8 semanas

Cloreto de cálcio a 2% (polaridade positiva) entregue via cátodo em 3 aplicações semanais durante 4 semanas

72

ELETROFORESE

Aplicações Clínicas

Cicatrização

Iodeto de Potássio a 10% (polaridade positiva) entregue via

cátodo em 3 aplicações semanais durante 4 semanas.

Cloreto de Sódio 3% (polaridade negativa) entregue via cátodo

em aplicações por 4 semanas

73

ELETROFORESE

Aplicações Clínicas Depósitos de Cálcio

Ácido Acético a 4% (polaridade negativa) entregue via cátodo

em 3 aplicações semanais em 4 a 8 semanas

Neuropatias Gabapentina a 6% (polaridade negativa) entregue via cátodo

em 3 aplicações semanais em 2 a 8 semanas

74

ELETROFORESE

Aplicações Clínicas Verrugas

Salicilato de sódio a 2% (polaridade negativa) entregue

via cátodo a cada 6 a 9 dias em 3 seções de

tratamento.

Gôta Citrato de lítio a 3% (polaridade positiva) entregue via

ânodo em 3 a 5 aplicações por uma semana

75

ELETROFORESE

Concentração da Droga pH da solução da droga Preservativos Fonte de corrente elétrica e intensidade de corrente Intensidade de corrente

IMPORTANTE RELEMBRAR QUE NA IONTOFORESE AS SOLUÇÕES NÃO DEVEM TER ÍONS COMPETIDORES.

Variáveis da Iontoforese

76

ELETROFORESE

Variáveis da Iontoforese

Concentração da droga

O movimento de íons aumenta com a concentração do soluto no eletrodo doador.

pH da Droga

O pH é essencial para entrega da droga e comforto do paciente. A soluções ótimas que predominam na forma ionizada.

77

ELETROFORESE

Variáveis da Iontoforese Preservativos

Os Preservativos na formulação podem ser transferidos para

a pele durante a iontoforese. Isto pode causar eritemas

localizados.

Os Preservativos criam competição iônica que resulta na

redução de entrega da droga.

78

ELETROFORESE

Variáveis da Iontoforese

Tipo de fonte de corrente elétrica

Sistemas de corrente constante são mais confiáveis que os de voltagem constante.

Intensidade de corrente

A intensidade de corrente aumenta o fluxo de íons.

79

ELETROFORESE

Efeitos colaterais do Iontoforese Reação Alcalina

Queimaduras químicas podem ser induzidas sob os

eletrodos. Este tipo de queimadura pode ser causada por

reações ácidas ou básicas.

Reações Alcalinas são mais comuns e resulta da

acumulação de hidróxido de sódio sob o cátodo.

80

ELETROFORESE

Efeitos colaterais da Iontoforese

Queimaduras na pele

A corrente elétrica através da pele cria o movimento de

íons. Este movimento de íons conduz a alteração do pH da

pele.

As queimaduras podem ser causadas pela corrente e não

pela medicação.

81

ELETROFORESE

Reduzindo os riscos de queimar a pele

Para reduzir a incidência de irritação a pele:

1) Limpeza com sabão, água ou álcool antes da aplicação.

2) SATURAR OS ELETRODOS garantindo que não haja áreas secas. Preencha os eletrodos adequadamente.

3) Fazer as apliçações iontoforéticas somente em pele íntegra.

4) Reduzir a densidade de corrente por aumento no tamanho do eletrodo e decréscimo de corrente.

82

ELETROFORESE

Indicações

• Inflamação

• Dores

• Depósitos do Cálcio

• Cicatriz e aderências

• Edemas

• Ferimentos e infecções

• Hiperidrose

Indicação Meios Elétrodo Tempo

(minuto)

Corrente

(miliampère)

Hiperidrose

Edema

Vasodilatação

Úlcera de Varicose

Bater a água

Hialuronidase

Histamina

Metacolina

Ânodo (+)

Ânodo (+)

Ânodo (+)

Ânodo (+)

15

20

3-5

20

15-20

20

2-10

5-30

http://www.beauty-cosmetic-guide.com/lang/pt/skin-surgery/iontophoresis.htm

83

ELETROFORESE

(Robinson & Snyder-Mackler, 1995)

• Pele danificada

• Diminuição de sensação na pele

• Sensibilidade a droga administrada

• Sensibilidade a corrente direta

• Marcapassos cardíacos e outros implantes

• Arritmias Cardíacas

Contra-indicações

84

ELETROFORESE

O aparelho para iontoforese

85

ELETROFORESE

1 Concentração da substancia

2 Densidade do corrente elétrico

3 Duração do processo

4 Impedância da pele

5 Lipofilicidade/hidrofilitidade e o peso molecular do fármaco

6 Mobilidade do fármaco e a condutividade da solução

7 Valencia (numero maximo/densidade das cargas elétricas)

8 Valor de pH

9 Estado de ionização (depende do pK e pH)

10 Efeito do Iontoforese na metabolização e degradação do

fármaco na pele

Fatores quais influenciaram na penetração

iontoforetica dos fármacos

86

Descreva o princípio da técnica de eletroforese e o procedimento detalhado

de análise eletroforetica de uma amostra de proteínas.

Como determinar a quantidade relativa das proteínas num eletroforetograma?

Como a eletroforese pode ser utilizada em exames que auxiliam no processo

de diagnóstico?

Qual é o significado de cada um dos parâmetros que compõem a equação de

fluxo migracional?

Qual é o fator mais relevante que determina a movimentação das proteínas

do soro na eletroforese da aula pratica?

Quais fatores influenciam na velocidade de migração da partícula durante a

eletroforese?

Lista de exercícios

87

ELETROFORESE

1. Defina ponto isoelétrico. Como determiná-lo experimentalmente de maneira

rápida e com maior precisão? Qual é o tipo de substância que torna isto

possível?

2. Descreva resumidamente os tipos de eletroforese. Em que situações se

aplicam?

3. Em que tipo de eletroforese a massa relativa das proteínas tem maior

importância? Explique como e que tipo de substância torna esse fator o mais

relevante?

4. Como revelar a localização das proteínas num eletroforetograma?

5. Como determinar a quantidade relativa das proteínas reveladas numa

eletroforetograma?

6. Que é e como funciona o densitômetro?

7. Os corantes utilizados numa eletroforese (Lider e Revelador) possuem quais

propriedades?

Lista de exercícios

88

ELETROFORESE

Analise eletroforetica das proteinas do plasma de um paciente

89

ELETROFORESE

PROCEDIMENTO

MATERIAL NECESSÁRIO:

Cuba de acrílico para eletroforese, c/ponte de 11cm de largura,

ajustável a 8,5 cm;

Fonte de corrente continua (200-300 V);

Densitômetro (O densitômetro é um aparelho baseado na propriedade das

moléculas de absorver a luz diretamente proporcional à concentração das

moléculas numa solução (espectrofotômetro específico));

Estufa, Fita de acetato de celulose 2,5x14 cm (Cellogel), Papéis de

filtro, Pipeta automática, Tesoura, Pinça

Placas de Petri, Amostra (soro)

Corante líder (marcador da mobilidade máxima de qualquer partícula

(molécula) numa eletroforese).

90

ELETROFORESE

PROCEDIMENTO

MATERIAL NECESSÁRIO:

Tampão de corrida: - veronal sódico: 5,15g +EDTA 2,6g por 1 litro

de água - pH=8,6, força iônica= 0,075

Solução corante revelador: Amido negro 0,5g+metanol 45%+

ácido acético 10% em água.

Solução descorante: metanol 47,5% + ácido acético 5% em água

Solução desidratante: metanol

Solução transparentizante: Metanol 85%+ ácido acético 14%

+glicerol 1%

91

ELETROFORESE

PROTOCOLO

1 – Observar o sinal do polo elétrico marcado na canaletas da cuba. Colocar tampão

de corrida nos dois lados da cuba, até a metade aproximadamente.

2 - Retirar com auxílio de pinça, a fita de acetato de celulose do pacote em que a

mesma é acondicionada, mergulhá-la no tampão de corrida e agitar (movimento de

vai-vem) durante 3-5 minutos.

3 – Retirar a fita da solução tampão com uma pinça (prendedo por uma

extremidade), segurando-a na posição vertical em cima da cuba; remover o excesso

de tampão da fita, tocando-a levemente na outra extremidade com uma folha de

papel de filtro. Escolher o lado permeável da fita.

Obs: somente uma das faces da fita é permeável - a opaca.

92

ELETROFORESE

PROTOCOLO

4 - Sempre com o auxílio de pinça, esticar muita bem a fita na ponte.

Observar que ambas as extremidades estejam em contato com a

solução tampão e que o lado permeável da fita estar situado para

cima.

5 - Fechar a cuba e ligar a fonte por 3-5 minutos, para equilibrar

ainda mais os poros da fita com a solução tampão.

6 - Desligar a fonte. Pipetar a amostra do soro com a pipeta

automática e com a mesma colocar numa placa de Petri, misturando

com o corante Líder. (O corante Líder é um corante que não tem

afinidade por proteínas, mas migra com maior velocidade do que as

proteínas. A distância percorrida pelo corante serve como uma distância

padrão.) Aplicar uma pequena (5 microlitros) amostra, distante 1-2

cm do pólo negativo (POR QUE? Explicar!). Marcar a posição da

aplicação da amostra picotando com a tesoura os dois lados laterais

da fita (ponto de partida).

93

ELETROFORESE

PROTOCOLO

7 - Fechar a cuba e ligar a fonte por 30 minutos. Observar acorrida

pelo movimento do corante lider.

8 - Desligar a fonte, marcar a posição do corante líder picotando

com a tesoura de um lado lateral da fita (chegada). Segurar a fita

com a pinça no meio da fita e cortá-la em ambas as extremidades (~1

cm acima do ponto de partida e ~1 cm abaixo do de chegada).

Coloque a fita na placa de Petri e aplicar a solução corante revelador

(no nosso caso é Amido negro), por 2 minutos!

9 – Devolver o corante revelador para o recipiente e aplicar a

solução descorante agitando. Fazer várias lavagens à temperatura

ambiente e duas com solução descorante quente, com finalidade de

remover o excesso do corante revelador. A fita deve ficar novamente

branca, exceto os locais onde tem proteína. OBS: O corante líder

também é removido.

94

ELETROFORESE

PROTOCOLO

Analise do Eletroforetograma

Medidas necessarios para identificação das proteinas.

Distancia percorrida e Migração Relativa,

Rf = DP/DL

95

ELETROFORESE

PROTOCOLO

10. Retirar a fita do descorante e estendê-la na parte de cima de uma

placa de Petri.

Medir a migração das proteínas com régua e calcula a migração relativa

(Rf), definida como Rf= DP /DL , onde DP é distancia percorrida por

proteína, mm, e DL é distancia percorrida por corante líder, mm.

Compare seus dados com o padrão de migração relativa das proteínas

nas nossas condições, as quais são:

1. Gama-globulina- ~0.320.07; 2. Beta- globulina~0.600.07;

3. Alfa2-globulina~ 0.730.06; 4. Alfa1-globulina~ 0.840.04;

5. Albumina-~ 0.940.03

A partir da comparação indicar a localização das frações básicas às

proteínas do soro no seu eletroforetograma.

96

ELETROFORESE

PROTOCOLO

11 – Na preparação da fita para leitura no densitômetro, antes devemos colocá-

la por 30 segundos em metanol puro e logo em seguida, por 1 minuto na

solução transparentizante.

12 - Retirar a fita do solução transparentizante, estendê-la na parte de cima de

uma placa de Petri e deixar na estufa

13 - Retirar da estufa, esperar esfriar, colocar na mesa de um densitômetro

para realização da leitura e determinação da quantidade (relativa ou absoluta)

de cada proteína.

até que a fita fique transparente (aproximadamente 1 minuto).

97

ELETROFORESE

PROTOCOLO

O densitômetro é um aparelho

baseado na propriedade das

moléculas de absorver a luz

diretamente proporcional à

concentração das moléculas numa

solução (espectrofotômetro

específico).

98

ELETROFORESE

O resultado da leitura da fita está apresentado

como um gráfico (chamada “densitograma” que

soma de várias Gaussianas “picos”) onde as

áreas sombreadas por cada Gaussiana (pico)

representam a quantidade de proteína (ou

qualquer outra substância que absorva a luz).

Soma todas as áreas = 100% das proteinas

analisadas;

Área de qualque um - X

PROTOCOLO

O densitômetro é construído para medidas da absorbância ao

longo da fita com as proteínas coradas.

FRAÇÕES PROTEICAS - VALORES NORMAIS:

Albumina 3,5 a 5,3 g/100 ml ou 52% a 68%

Globulinas: Alfa 1 0,2 a 0,2 g/100 ml ou 3,4% a 5,3%

Alfa 2 0,4 a 0,7 g/100 ml ou 6% a 10%

Beta 0,7 a 0,9 g/100 ml ou 10% a 13%

Gama 1,0 a 1,7 g/100 ml ou 14% a 21%

99

ELETROFORESE

Agora que temos o gráfico obtido com a análise

densitométrica das corridas eletroforéticas, um

pequeno problema se apresenta: Como podemos

calcular as quantidades relativas de cada proteína na

solução da corrida, baseados apenas no gráfico? Isto

pode ser resolvido de duas formas:

1. Primeiro traçamos uma linha na base do gráfico

(azul) e separamos os picos (vermelho). Depois as

áreas de cada pico podem ser obtidas através da

aproximação por uma ou mais figuras geométricas.

Para saber a quantidade relativa das proteínas, basta

estabelecer relações matemáticas entre as áreas de

cada pico e a área total.

2. Outra possibilidade é utilizar uma balança analítica

e uma tesoura. Podemos simplesmente recortar o

gráfico e obter um pedaço de papel na fodo gráfaico.

Em seguida pesamos esse recorte e anotamos o

peso obtido (PG=peso total), referente a todo gráfico.

Depois recorta-se cada Gaussiana (picos) do gráfico

(as linhas vermelhas) e pesa-se separadamente.

Para saber a quantidade relativa das proteínas, basta

estabelecer relações matemáticas entre os pesos

anotados e o peso total.

PROTOCOLO

100

ELETROFORESE

1. Laboratório para o clínico. Livraria Atheneu Editora, 1991

2. Diagnósticos clínicos e conduta terapêutica para examines laboratoriais. Todd,

Sanford, Davidsohn, Editora Monole Ltda, 1982.

3. Eletroforese. Peulo Cesar Nahum

4. Diagnóstico clínico e tratamento para métodos laboratoriais. J.B.Henry, Editora

Mamole Ltda, 1999.

5. Na Bancada. Manual de iniciação cientifica em laboratórios de pesquisas

biomédicas. Kathy Barker, Editora ArtMed, 2002

6. http://www.piercenet.com/Proteomics/browse.cfm?fldID=21518847-2D72-475F-A5B9-

B236EC5B641E

7. http://www.biocompare.com/tutorials/2DE_tutorial/html/background.asp

8. http://en.wikipedia.org/wiki/Electroosmosis

9. http://www.beauty-cosmetic-guide.com/lang/pt/skin-surgery/iontophoresis.htm

10. http://chsfpc5.chem.ncsu.edu/~franzen/CH795I/lectures/transdermalPC/tsld002.htm

Bibliografia

101

ELETROFORESE