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Journal of Biological Chemistrywww.jbc.org

Publicado pela primeira vez em 13 de julho de 2006, doi: 10,1074 / jbc.M60536 720008 de setembro de 2006 do Journal of Biological Chemistry, 281, 26121-26128.

A formação de oligómeros solúveis eamilóide fibrilas com propriedades físicasdo tremor epizoótico isoforma da proteínapriónica do domínio C-terminal daproteína murina recombinante PrionmPrP- (121-231) *

Samantha M. Martins ‡, 1, Dóris J. Frosoni ‡, Ana M. Blanco Martinez §,

Fernanda G. De Felice ‡ ¶, 2 e Sérgio T. Ferreira ‡, 3

Autor Filiações

3 A Howard Hughes Medical Institute Internacional Scholar. Para quem acorrespondência deve ser endereçada. Tel .: 5521-2562-6790; E-mail:ferreira@bioqmed.ufrj.br.

Resumo

Doenças de priões, são desordens neurodegenerativas fatais associadas com aconversão conformacional da proteína prião celular, a PrP C, em um mal do brada,forma resistente à protease, PrP Sc. Aqui demonstramos pela primeira vez, aoligomerização e fibrillization do domínio C-terminal da PrP murino, mPrP- (121-231), ao qual falta a totalidade do domínio N-terminal da proteína não-estruturado s. Em particular, a construção foi utilizado não tem os resídu os deaminoácidos 106-12 0 do chamad o núcleo amiloidog�ica da PrP (resíduos 106-126). Formaçã o de amilóide foi acompanhada pela aquisição da resistê ncia àdigestão com proteinase K. Agregação de mPrP- (121-231) foi investigada u sandouma combinação de técnicas biofísicas e bioquímicas a pH 4.0, 5.5, e 7.0 e a 37 e65 ° C. Sob condições parcialmente desnaturante (65 ° C), os agregad os dediferentes morfologias que vão desde oligómeros solúveis para amad urecerfibrilas amilóides de mPrP- (121-231) foram formados. A análise por micro scopiaelectrónica de transmissão revelou que aproximadamente esférica agre gadosforam prontamente formado quando a proteína foi incubada a pH 5,5 e 6 5 ° Cdurante 1 h, enquanto que a incubação prolongada levou à formação de fibrilasamilóides maduros. As amostras foram incubadas a 65 ° C a um pH 4.0 ou 7.0apresenta uma mistura inicial de oligómeros e protofibrilas ou fibrilas. A análiseeletroforética das amostras incubadas a 65 ° C revelou a formação de oligómerosde dodecilsulfato de sódio-resistente (dímeros, trímeros, tetrâmeros e superiores)e agregados de peso molecular de mPrP- (121-231). Estes resultados demonstramque a formação de uma forma de amilóide com propriedades físicas de PrP Sc podeser alcançada na ausência do domínio do terminal N e flexível, em particular, dosresíduos 106-120 de PrP e não requer outros factores celulares ou uma PrP Sc

modelo.

A conversão conformacional da isoforma celular normal da proteína do prião, PrPC, 4 para uma isoforma patológico anormal, a PrP Sc, subjacente a um grupo dedoenças neurodegenerativas fatais conhecidas como encefalopatias espongiformestransmissíveis ou doenças provocadas por priões, o que inclui a doença deCreutzfeldt-Jakob no homem , scrapie em ovinos e caprinos, e encefalopatia

espongiforme bovina em bovinos (1). Neuropatologicamente, doenças provocadaspor priões são caracterizadas por perda neuronal e astrogliose e muitas vezes porespongiforme degeneração do cérebro e a deposição de placas amilóides (1). Aúnica característica destas doenças é que, além das formas esporádicos ehereditários, que pode ser adquirida através da transmissão de um agenteinfeccioso. A hipótese "proteinonly" de propagação prião postula que a isoformaanormal, a PrP Sc, actua como um agente transmissível da doença e auto-propaga a suaconformação patológica usando PrP C como um substrato (1).

PrP Sc é definido como uma forma agregada da PrP que é em larga medidaresistente à proteinase K (PK) a digestão sob condições nas quais a PrP C e amaioria das outras proteínas são facilmente degradados (2). Em adição às suasestabilidades diferentes à degradação proteolítica, as estruturas secundárias,terciárias, e quaternárias de PrP C e PrP Sc também diferem (3 - 7). PrP C émonomérico e altamente α-helicoidal (5), ao passo que a PrP Sc adopta um arranjomultimérica e contém uma grande quantidade de β-estrutura e menor estrutura

helicoidal. A transição entre a PrPC

e a PrPSc

ocorre por um mecanismo pós-translacional e parece ter lugar sem qualquer modificação covalente da proteínadetectável (8). Até à data, no entanto, os mecanismos moleculares subjacentes atransição conformacional entre as confórmeros normais e patogênicos da PrPpermanecem pouco conhecidos. De acordo com os modelos actuais, aconformação da proteína prião oscila entre um estado dominante nativa, a PrP C, euma série de confórmeros menores que a auto-associar-se de uma maneira

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ordenada para produzir uma estrutura supramolecular estável, a PrP Sc, compostode monómeros PrP misfolded (2, 9, 10). Uma vez que uma estrutura estável"semente" é formada, as moléculas de PrP adicionais podem então ser recrutados,conduzindo a uma formação autocatalítica, rápido de PrP Sc (2, 10, 11).

Agregação amilóide desempenha um papel importante em várias outras patologiashumanas, incluindo Alzheimer, Parkinson, Huntington e doenças.Independentemente das diferentes sequências de aminoácidos das proteínas oupéptidos a partir dos quais são formados, de proteínas amilóides mostram muitaspropriedades físicas e tintoriais comuns (12). Vários estudos recentes têmdemonstrado que as condições parcialmente desnaturantes são necessários para oin vitro de formação de amiloide, que podem ser atribuídos à necessidade de

desestabilizar a dobra nativa de uma proteína, sob condições em que asinteracções não covalentes que envolvem a cadeia polipeptídica mantêm favoráveis (por comentários, ver Ref. 12). Neste contexto, a utilização de desnaturantesparcialmente in vitro as condições devem ser vistos como uma ferramenta parapreencher conformações agregação propensas e para acelerar um processo quenormalmente pode levar muito mais tempo in vivo. Tais estudos podem conduzir auma melhor compreensão dos mecanismos da formação de amilóide e para odesenvolvimento de estratégias terapêuticas destinadas a prevenir a formação deamiloide e luta contra as doenças ami loides.

Evidência considerável indica agora que os principais espécies neurotóxicosenvolvidos em danos neuronais na doença de Alzheimer, Parkinson e doenças depriões, são oligómeros de amilóide solúvel em vez de as fibrilas maduras que sãoencontrados em depósitos amilóides in vivo (para revisões, ver, Refs. 13 - 15). Istoprovavelmente explica a falta de correlação directa entre a carga da placa amilóidee a neurodegeneração observada em doenças de priões (para uma revisão, ver ref.

16) e sugere que oligómeros solúveis neurotóxicos podem desempenhar um papelna disfunção neuronal induzida por prião.

As estruturas tridimensionais de proteínas recombinantes a partir de um priãonúmero de organismos diferentes, incluindo ratinho, hamster, e prp de sereshumanos, revelaram que o segmento N-terminal compreendendo os resíduos deaminoácidos 23-120 inteiras é flexível e desordenada que apenas o segmentocontendo O C-terminal de 111 resíduos, PrP- (121-231), possui uma estruturatridimensional definido (17 de - 20). A região N-terminal flexível parecedesempenhar um papel importante na transmissão da encefalopatia espongiformetransmissível e influencia a formação de conformações de proteinase-resistente dePRP(por exemplo, Ref. 21). O domínio do terminal N também contém sequênciasde aminoácidos que são geralmente considerados importantes para o controlo deagregação (por exemplo, os resíduos 94-113; Ref. 21) e o chamado núcleoamiloidogénico que consiste na sequência peptídica 106-126 neurotóxico. Aregião C-terminal é, um domínio de auto-estruturado e dobrar bem contém três

hélices a e uma folha β-antiparalela cadeia de dois (19, 20).

No presente trabalho, nós descrevemos a oligomerização e fibrillization dodomínio C-terminal da proteína prião de murino, mPrP- (121-231). Estaconstrução não tem toda a região flexível N-terminal e a maior parte dos resíduosde aminoácidos 106-126 do núcleo amiloidogénica de PrP. Mostra-se que váriostipos de agregados, incluindo oligómeros de SDS-resistentes e fibrilas amilóidesmaduros, são formadas por incubação das mPrP- (121-231) sob condiçõesdesnaturantes parcialmente diferentes. A formação de oligómeros foi óptima a pH5,5, e algumas das espécies formadas morfologia exibiu anelar. Curiosamente, aagregação de mPrP- (121-231) a um pH de 7.0 deu origem à formação de umagregado de amilóide que era resistente à digestão com proteinase K, o quesugere que exibe propriedades semelhantes a PrP Sc. São discutidas possíveisimplicações da formação de oligômeros PrP para a patogênese de doenças depríon.

PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

Materiais -Thioflavin T (ThT) e proteinase K foram de Sigma. Acetato de uranilo foide Electron Microscopy Sciences (Fort Washington, PA). Todos os outros reagentesforam do mais elevado grau analítico disponível comercialmente.

Expressão e purificação de proteínas -O plasmídeo para a expressão bacteriana davariante F175W de murino PrP- (121-231) foi uma oferta generosa do Dr. R.Glockshuber (Eidgenössische Technische Hochschule, Suíça). A proteínarecombinante foi expressa em Escherichia coli estirpe BL21 (DE3) e foi purificadocomo descrito anteriormente (25). Após o passo final de purificação, mPrP- (121-231) foi dialisada contra água MilliQ e concentrou-se utilizando uma célula deultraf iltração agitada Amicon (Amicon, Inc., Beverly, MA), e a sua concentração foideterminada usando ε 280 = 28.800 M - 1 cm -1 (22). Alíquotas de proteínas (1,0-2,0 mg / ml) foram armazenadas a -20 ° C até à sua utilização.

PrP Agregação concentração de mPrP- -O (121-231) em todas as amostras foi de0,8 mg / ml (60 μ M), E 0,02% DE NAN3 foi adicionada para prevenir o crescimentobacteriano durante longos períodos de incubação. As amostras foram incubadasdurante intervalos de tempo crescentes a diferentes temperaturas e valores de pH,tal como descrito em "Resultados". Quando foram utilizadas as soluçõestamponadas, o pH das amostras foi ajustado com 80 m M ácido acético · NaOH(pH 4,0), a 80 m M Mes · NaOH (pH 5,5), ou 80 m M de Tris-HCl (pH 7,0). Em

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experiências nas quais a agregação foi investigada em condições de força iónicabaixa (soluções não tamponadas), as amostras foram preparadas por adição deuma parte alíquota da solução de estoque mprp a água MilliQ, cujo pH tinha sidopreviamente ajustado para o valor desejado com HCl. Após 1 semana deincubação, o pH de tais soluções não tamponadas passou de 5,5 e 7,0 para 6,2 e7,4, respectivamente.

Turvação e medições de dispersão de luz -Protein agregação foi monitorizada a 25° C por turbidimetria (densidade óptica a 330 nm) num espectrofotómetroUltrospec 2000 Pharmacia (GE Healthcare) e em ângulo recto por medições dedispersão de luz a 500 nm sobre um espectrofluorómetro ISS (PC1 ISS Inc.,Champaign, IL). Amostras pré-agregados foram diluídas 10 × antes das medições.

Medições de fluorescência ThT amostras -PrP foram incubadas com umaconcentração equimolar de ThT durante 30 min à temperatura ambiente antes dasmedições. ThT espectros de emissão de fluorescência (excitação a 440 nm,emissão a partir de 460 e 600 nm, 5 nm para ambos bandpasses excitação e deemissão) foram medidos a 25 ° C num espectros luorómetro Hitachi F4500 (HitachiInstruments Co., Tóquio, Japão). ThT apresenta muito pouca fluorescência emtampão aquoso, e a sua fluorescência é grandemente aumentada após ligação afibrilas amilóides (23). O aumento da fluorescência após a ligação podem assimser utilizados para seguir a cinética da formação de fibrilas amiloides.Intensidades de fluorescência relativas THT em diferentes tampões de pH sãonormalizados por os valores de medição para controlo mPrP- (121-231) amostrasque foram mantidas a 4 ° C durante 1 semana para os valores de pHcorrespondentes.

Medições de fluorescência intrínseca -Fluorescence espectros de emissão forammedidos a 25 ° C num espectrofluorómetro ISS PC1 com excitação a 280 nm,emissão a partir de 300 para 420 nm, usando um filtro de 320 Schott GT sobre ocanal de emissão e 4 bandpasses nm para excitação e de emissão.

Electroforese em Gel -Samples retiradas a diferentes pontos de tempo durante aagregação de mPrP- (121-231) foram analisadas por PAGE em ambos nativa (12%acrilamida) e desnaturante (18% de acrilamida) condições. Para PAGE nativa, asamostras foram diluídas em tampão de carga não desnaturante. Antes da SDS-PAGE, as amostras foram fervidas durante 2 min em tampão de carga contendo 2%de SDS e 140 m M ditiotreitol. Anidrase carbónica (29 kDa), ovalbumina (45 kDa),albumina (66 kDa), e Na, K-ATPase (α-subunidade, 100 kDa) ou um molecularconjunto de marcadores de peso pré-corados (Pierce) foram utilizadas comopadrões para determinar a massas moleculares dos oligómeros de PrP e agregadosde ordem superior.

Microscopia Eletrônica de Transmissão -Samples foram absorvidas por 2 min pararedes formwar-revestido de carbono que tinha sido pré-tratadas com 0,01% poli-aquosa L-LISINA.As amostras foram coradas com 5 mL de acetato de uranilo a 2%,e observadas num microscópio electrónico Zeiss 902 com uma voltagem deaceleração de 80 kV seco ao ar.

Proteinase K Digestão -Samples de qualquer monomérica ou agregada mPrP-(121-231) (formado após agregação de 0,8 mg / ml mPrP- (121-231) a pH 7,0 e65 ° C durante 1 semana) foram 4 vezes e diluída incubou-se durante 1 h a 37 ° Cem 100 m M de tampão Tris-HCl, pH 7,2, com a proteinase K em que a protease:PrP proporções indicadas na digestão foi parada pela adição de 5 × -concentratedamostra de SDS-PAGE de carga "Resultados". tampão contendo 2% de SDS e 140 mM ditiotreitol. As amostras foram aquecidas a 95 ° C durante 5 minutos eresolvidas em géis de 18% SDS-PAGE.

RESULTADOS

Temperatura e pH Efeitos sobre a agregação de mPrP- (121-231) -Para identificarcondições experimentais que levam à oligomerização ou fibrillization de mPrP-(121-231), inicialmente acompanhou a agregação da proteína, tanto pH 5,5 e 7,0e a 37 e 65 ° C. As experiências a pH 5,5 foram realizados para aproximar o pHnas vesículas endocíticas, que têm sido implicados como um possívelcompartimento intracelular em que a transição conformacional de PrP c para PrP Sc

pode ter lugar (4, 24). Por outro lado, a comparação entre a agregação a 37 e 65 °C foi motivada pelo facto de o T m para a desnaturação térmica de mPrP- (121-231) é ~ 65 ° C (25-27), que deve preencher uma parcialmente estado desnaturadoda proteína que pode ser mais propensos a agregação.

As experiências iniciais com amostras incubadas a 37 ° C em meio sem bufferenquanto 1 semana em qualquer pH mostrou nenhuma agregação significativa. Emcontraste, a agregação foi marcadamente aumentada a 65 ° C (Fig suplementar.S1). Curiosamente, enquanto que as medições da turvação indicou que a formaçãode agregados mprp estava essencialmente completa dentro de algumas horas a 65

° C (suplementar Fig. S1, A e B), ensaios de ligação de THT mostrou quequantidades substanciais de material amilóide só foram formados após muitotempo de incubação vezes (isto é, vários dias;. suplementar Fig S1, C e D). Istoindica que os agregados formados inicialmente lentamente convertidos emestruturas amilóides com tempos de incubação mais longos.

mPrP- (121-231) tem sido relatado para adoptar uma conformação de folha-β

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alternativa abaixo de pH 5, na presença de ureia (28). Isto levou-nos a investigar aagregação a um pH de 4 na ausência de desnaturantes químicos utilizandosoluções tamponadas. A investigação inicial da dependência da temperatura deagregação em meios tamponados a um pH de 5,5 e 7 mostram que a agregaçãoaumentou ligeiramente de 37 para 59 ° C, seguido por um aumento acentuado a65 ° C (Fig suplementar. S2). Com base nestes resultados, o próximo realizou umainvestigação detalhada da agregação de mPrP- (121-231), tanto a 37 e 65 ° C.

Figo. 1 (A-C) mostra a agregação de mPrP- (121-231) monitorizada porturbidimetria. Agregação em ambos pH 5,5 e 7,0 foi aumentada a 65 ° C, com aagregação máxima obtida em menos de 2 min. Notamos que a incubação a 65 ° Cnão estimular a agregação de mPrP- (121-231) a pH 4,0 (A). Isto está em

contradição aparente com trabalhos anteriores que mostraram que o baixo pH émais eficaz quando utilizado em conjunto com a desnaturação parcial por ureia(por exemplo, Ref. 28). É bem conhecido, no entanto, que diferentes produtosquímicos (por exemplo, agentes desnaturantes (ureia físicas, guanidina) ou porexemplo, temperatura, pressão) pode levar a diferentes conjuntos desnaturado ouparcialmente desnaturado. É provável, portanto, que os estados parcialmentedesnaturada de mprp estabilizadas por ureia ou por temperaturas elevadas sãodiferentes nas suas estruturas residuais e nas suas propensões para formaragregados amilóides. É também possível que a conformação parcialmentedesnaturada de mprp estabilizado a um pH de 4 e 65 ° C exibe uma cinética deagregação mais lenta (como confirmado por resultados de ligação THT descritoabaixo).

A 37 ° C, a incubação de mPrP- (121-231) durante até 1 semana a qualquer pH 4,0(Fig. 1 D) ou pH 7,0 (Fig. 1 F) não resultou em fibrillization como medido pelaligação ThT. Por outro lado, as amostras foram incubadas durante 1 semana, a pH

5,5 a 37 ° C (E) apresentaram um aumento de ~ 4 vezes na ligação de TT,indicando a formação de uma estrutura de amilóide sob estas condições. A 65 ° C,as amostras incubadas a pH 4,0 (D) exibiram aumento ThT ligação como umafunção do tempo. A pH 7,0 e 65 ° C, as medições de fluorescência THT sugeridoque os agregados amilóides de mPrP- (121-231) foram prontamente formada naprimeira hora de incubação (Fig. 1 F).

Medições de dispersão de luz indicou que a incubação de mPrP- (121-231) a pH4,0 e 65 ° C durante 1 semana (Fig. 1 L) resultou em agregação visível (compatívelcom resultados THT). As amostras incubadas a pH 5,5, a 65 ° C (H) apresentaramaumento de agregação como uma função do tempo, tal como monitorizado pordispersão da luz. De acordo com as medições de turvação, a um pH de 7 mediçõesde dispersão de luz mostraram que a incubação a 65 ° C levou a agregação muitorápida de mprp (I).

Agregação de mprp também foi monitorizada pela sua emissão de fluorescência

intrínseca. A construção mprp nós utilizamos exibe um aumento de 2,5 vezes nafluorescência intrínseca mediante desdobramento (29). A 37 ° C, a incubação demPrP- (121-231) durante até 1 semana a todos os valores de pH investigados nãorevelou alterações significativas na fluorescência intrínseca, indicando preservaçãoda dobra nativa da proteína. Em contraste, as amostras foram incubadas a 65 ° Capresentaram um aumento significativo de fluorescência, indicandodesdobramento da proteína dentro das primeiras horas de incubação (Fig. 1, J-L).As intensidades de fluorescência intrínseca de mPrP- (121-231) foram maiselevadas nas primeiras horas de incubação a 65 ° C e diminuiu progressivamenteao longo do tempo para valores próximos aos das amostras de controlo. Istosugere que a incubação de mprp a 65 ° C conduz ao inicial (parcial)desdobramento da proteína e que, após a formação de agregados amilóides, mprpassume uma conformação mais compacta novamente e / ou torna-se parte deuma estrutura organizada em que Trp-175 torna-se protegido contra o solvente.

FIGURA 1.

Influência do pH e datemperatura na agregação demPrP- (121-231), em soluçõestamponadas. O pH dasamostras foi ajustado com osseguintes tampões: 80 m Mácido acético · NaOH, pH 4,0;80 m M Mes · NaOH, pH 5,5;80 m M de Tris-HCl, pH 7,0. Asamostras foram incubadas a pH4,0 (A, D, G, e J), pH 5,5 (B, E,H, e K) ou pH 7,0 (C, F, I, e L), a37 ou 65 ° C durante osperíodos de tempo indicados

(em horas). A concentração de mPrP- (121-231) foi de 0,8 mg / ml. Aagregação foi monitorizada por densidade óptica, dispersão de luz,tioflavina T, ou medições de fluorescência in trínseca. As inserções em Be C mostram a cinética iniciais de agregação mprp (horas mostradas emminutos na abscissa) medida por turbidimetria. Bares nas inserçõescorrespondem a médias ± SD de três determinações. Para ThTmedições de fluorescência (D-F), de Student t teste de análise (single-tailed) revelou que os valores medidos em todos os pontos de tempo a

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65 ° C foi significativamente diferente (0,003 <P <0,04) a partir do valorde controlo, não- amostras de agregados. Diferenças individuais entreos valores medidos adicionais em diferentes pontos de tempo sãoindicados por * (p = 0,03) e ** (p = 0,01). As barras representam asmédias ± DP de três a quatro experiências independentes.

Oligômeros e ordem superior mprp Agregados revelado pelo Native edesnaturação Eletroforese em Gel NATIVO PAGE mostraram que as amostrasincubadas a 65 ° C foram totalmente convertido dentro das primeiras horas emagregados de alto peso molecular que não entram no gel em execução(suplementar Fig. S3) , ao passo que as amostras incubadas a 37 ° C manteve-se

monomérica durante até 1 semana de incubação.

A formação de agregados de mPrP- (121-231), foi investigada por SDS-PAGE (Fig.2). As amostras foram incubadas a 65 ° C mostrou a acumulação progressiva deoligómeros-resistentes SDS (dímeros, trímeros, tetrâmeros e) e agregados de pesomolecular mais elevado em todos os valores de pH investigados. Incubaçãoprolongada a 65 ° C também conduziu ao aparecimento de bandas de baixo pesomolecular (<13 kDa), o que provavelmente correspondem a produtos de proteólisede mPrP- (121-231). É interessante notar que mesmo estes fragmentos de menormassa molecular de mprp apareceu a sofrer agregação a 65 ° C, dando origem abandas de desmaiar entre o monómero / dímero e bandas dímero / trímero.

Ultrastructural Análise de mprp Agregados morfologias -As de agregadosformados em diferentes condições experimentais foram examinadas pormicroscopia eletrônica de transmissão (Fig. 3). Inspecção de um grande número deamostras de controlo coradas negativamente (ou seja, amostras mantidas a 4 ° C

durante até 1 semana a diferentes valores de pH) mostrou ausência de oligoméricoou estruturas poliméricas (dados não mostrados). As amostras foram incubadasdurante até 1 semana a 37 ° C também mostrou a ausência de material agregado(dados não mostrados).

As amostras foram incubadas durante tão pouco quanto 1 hora a pH 5,5 e 65 ° Cem solução não tamponada exibiu um grande número de agregadosaproximadamente esférica com um diâmetro médio de -12 nm (com partículas demaiores dimensões com diâmetros atingindo até ~ 30 nm; A Fig. 3 A) . É tambéminteressante notar que alguns dos agregados exibiu estruturas anulares distintos(Fig. 3 A, inserir), reminiscente das morfologias exibidas pelos agregados de α-sinucleína, amilina, e soro amilóide A (30). Tempos de incubação mais longos a pH5,5 provocou o desaparecimento dos agregados esféricos e ao aparecimento defibrilas amilóides maduros com diâmetros de ~15-30 nm (Fig. 3 B).

mPrP- (121-231) amostras incubadas durante 1 h a 65 ° C e pH 7,0 em solução

não tamponada mostrou oligómeros abundantes e algumas estruturasprotofibrillar curtas (Fig. 3 C). Tempos de incubação mais longos, nestascondições levou a uma diminuição do número de oligómeros e ao aparecimento defibrilas amilóides maduros com diâmetros de ~10-20 nm (Fig. 3 D).

FIGURA 2.

A análise de SDS-PAGE deoligómeros e agregados depeso molecular mais elevadosde mPrP- (121-231). Asamostras foram incubadas a 37ou 65 ° C a diferentes valoresde pH como indicado. Asalíquotas foram retiradas adiferentes tempos, diluiu-se emtampão de carga contendo 2%de SDS e 140 m M ditiotreitol,fervida durante 2 min, e

resolvido em 18% SDS-PAGE como descrito em "ProcedimentosExperimentais." Peso molecular (MW) marcadores são indicados porpontas de seta. 7 ug de mPrP- (121-231) foram aplicadas em cadapista, e o gel foi corado com Azul de Coomassie. A banda principalmais próxima do fundo do gel corresponde ao monomérica mPrP-(121-231) (13,3 kDa). A e B correspondem às amostras incubadas a pH5,5 ou 7,0, respectivamente, em solução não tamponada. C-Ecorrespondem às amostras incubado a pH 4.0, 5.5, ou 7.0 em meiostamponados, respectivamente. Em todos os painéis, pistas marcadas decontrolo correspondem a amostras mprp incubada durante 1 semana a4 ° C com os valores de pH correspondentes. Note-se a acumulação dedímero de SDS-resistentes, trímero, tetrâmero e bandas de agregados

de ordem superior e visto como uma mancha, no topo dos géis defuncionamento.

A incubação durante 1 h a 65 ° C e pH 4,0 em meio tamponado produzidorelativamente poucos oligómeros e pequenas estruturas protofibrillar raras (Fig. 3E), embora em alguns imagens adquiridas sob esta condição também foi possível

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ver ocasionais protofibrilas maiores (dados não mostrando). Curiosamente, maistempo de incubação (1 semana) a 65 ° C e pH 4,0 não conduzir à formação defibrilas amilóides maduros, mas sim para a acumulação de agregadosaglomerados que assemelham-se os grânulos sobre uma cadeia (Fig. 3 F). Emboraestes agregados são morfologicamente diferentes das fibrilas amilóides maduros,que pareceu ligar-se alguns TT, bem como (Fig. 1 D). As amostras foramincubadas durante 1 h a 65 ° C e pH 5,5 em meio tamponado exibiram umamistura de agregados abundantes aproximadamente esférica (com diâmetros de ~25 nM) e as estruturas protofibrillar (3 Fig. G). Tempos de incubação mais longosprovocou o desaparecimento dos agregados globulares e o aparecimento degrande número de fibrilas amilóides que engrenadas em conjunto (Fig. 3 H).

Finalmente, a incubação para tão pouco quanto 1 hora a 65 ° C e pH 7,0 em feixesproduzida médias tamponadas de fibrilas amilóides torcidos (fig. 3 I). Tempos deincubação mais longos conduziu à acumulação de fibrilas amilóides maduras, comum diâmetro médio de 10-20 nm, juntamente com as estruturas esféricasaproximadamente ~ 30 nm de diâmetro (fig. 3 J).

Protease Resistência de agregado mprp proteinase K de digestão tem sidoamplamente utilizado para distinguir entre resistente às proteases PrP Sc e PrPprotease-lábil C conformações da proteína prião, bem como para testar diferençasentre a PrP Sc estirpes (31, 32). Tratamento de mPrP- nativa (121-231) comproteinase K resultou em degradação completa da proteína mesmo em muitobaixo de protease: rácios PrP (Fig. 4, painel superior). Em contraste, a agregaçãodurante 1 semana a 65 ° C e pH 7,0 foi acompanhado por um aumentosignificativo na resistência à proteinase K de digestão (Fig. 4, painel inferior).

DISCUSSÃO

A construção utilizada no presente trabalho corresponde ao domínio C-terminalde 111 resíduos estruturado de murino da proteína do prião celular e não temtoda a região N-terminal flexível, que tem sido implicada na transmissão deencefalopatia espongiforme transmissível e na formação de protease- agregadosresistentes (21). Além disso, o segmento que compreende os resíduos deaminoácidos 106-126 de comprimento completo em PrP representa a região maisconservada e hidrófobo, é conhecido para formar agregados neurotóxicos in vitro,e é geralmente considerado para formar o núcleo da proteína amiloidogénica (33).Embora mPrP- recombinante (121-231) contém somente seis resíduos da regiãohidrófoba que, mostra-se que ele tem a capacidade de montar em agregadossolúveis, aproximadamente esférica anelar e protofibrilas lineares, e fibrilasamilóides em condições experimentais apropriadas, na ausência de qualqueroutros factores celulares. mPrP- (121-231) tem sido demonstrado para formaragregados amilóides na presença de ADN (25), mas os presentes resultadosmostram que o ácido nucleico não é necessário para a agregação de amilóidedesta construção PrP. Tomados em conjunto, os presentes resultados suportam anoção de que o domínio C-terminal estruturada de PrP podem desempenharpapéis importantes na agregação amilóide e a formação de espécies deproteinase-resistente.

Agregação de mPrP- (121-231) foi marcadamente aumentada a 65 ° C(correspondendo ao T m para a desnaturação térmica deste construto) com aaparência da linha de agregados dentro dos primeiros minutos de incubação a pH5,5 e ambos 7.0. A localização subcelular da transição conformacional da PrP C emPrP Sc ainda é motivo de controvérsia. Existe evidência indicando que ocorre tantona superfície celular (a um pH aproximado de 7,3 que corresponde ao meiointersticial do cérebro; refs. 34 e 35) e, após internalização de PrP em endossomas(4, 24), em que o pH Os valores variam entre 4,7 e 5,8 (36). In vitro, a conversãoda PrP humana C a uma PrP Sc -like forma é aumentada a pH ácido (37). Estudosbiofísicos têm mostrado que a energia livre de desdobramento de PrP- humana(90-231) é menor do que a pH ácido com um pH neutro (26) e que, em solução decloridrato de guanidina PrP- ácida humana (90-231) adopta uma parcialmentedobrado conformação que contém uma grande quantidade de estruturassecundárias de folha-β. Um β-rico folha de dobragem intermédia, também temsido observada para mPrP- rato (121-231) em soluções de ureia a um pH baixo,mas não a pH neutro (28). Além disso, demonstrou-se que um pH baixo induz umaumento na exposição de manchas hidrofóbicas na superfície das mPrP- (121-231) (38). No entanto, a pH baixo sozinho não é suficiente para provocar atransição conformacional de PrP. Por exemplo, a incubação de hamster PrP- (90-231) a pH 4,0 a 4 ° C durante 50 h, conduz à formação de agregados amorfos enão de estruturas amilóides (39). Factores destabilizadores adicionais, tais comosubdenaturing concentrações de cloridrato de guanidina ou ureia, na presença decloreto de sódio, demonstraram ser necessária para promover a transiçãoconformacional da proteína prião. Os nossos resultados mostram que a incubaçãode mPrP- (121-231) a pH 4,0 e 65 ° C durante 1 semana não conduzir à formaçãode fibrilas amilóides proeminente. Em vez disso, sob estas condições e estruturas

globulares agregados protofibrillar, bem como alguns agregados amorfos, foramformadas (Fig. 3 F). Assim, estes resultados sugerem que a pH <5 e parcialmentedesnaturante temperatura favorece a formação de oligómeros e protofibrilas PrP.

FIGURA 3.

A análise por microscopia electrónica de transmissão de agregado

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mPrP- (121-231). Osdiferentes painéis mostram aformação de agregadosglobulares, protofibrilas, efibrilas amilóides maduros demPrP- (121-231) apósincubação a 65 ° C a diferentesvalores de pH. Esquerda epainéis da direita representamas imagens obtidas a partir deamostras incubadas durante 1 hou 7 dias, respectivamente, os

seguintes valores de pH: A e B,pH 5,5 (soluções nãotamponadas). Um número deagregados PrP anulares pode

ser visto em cima de uma inspeção da imagem em A, e um exemplorepresentativo é mostrado em maior ampliação como uma inserção, C eD, pH 7.0 (soluções sem buffer); E e F, pH 4.0 (tamponada médio); G eH, pH 5,5 (meio tamponado). A inserção em H ilustra um campo deampliação elevada mostrando um conjunto de fibrilas amilóidesengrenadas em conjunto; I e J., PH 7,0 (meio tamponado) Barras deescala correspondem a 0,2 um.

FIGURA 4.

Proteinase K de digestãolimitada com a forma deamilóide mPrP- (121-231).MPrP- monomérica nativa (121-231) (painel superior) oufibrilas amilóides formadas porincubação de mPrP- (121-231)durante 1 semana a 65 ° C e pH7 (painel inferior) foramtratados com proteinase Kdurante 1 hora a 37 ° C no PK:mprp proporções indicadas nafigura. As amostras foramanalisadas por SDS-PAGE

seguida por coloração com prata. 3 g de mPrP- (121-231) foramaplicados em cada pista. MW, massa molecular.

Curiosamente, as amostras foram incubadas durante 1 h a única pH 5,5 e 65 ° Cem meio não tamponado, exibiu um grande número de oligómeros deaglomerados morfologia formando aproximadamente esférico que seassemelhavam contas num fio (Fig. 3 A). Além disso, agregados anularesassemelhando-se aqueles que são formados por incubação de hamster PrP- (90-232) a pH 4,2 e 1 M DE cloridrato de guanidina durante 25 dias (40) também foramobservadas (Fig. 3 A, inserção). Tais estruturas anulares têm sido propostos paraconsistem de um anel de oito monómeros de PRP (40).

Considerando o aumento da evidência de que os oligómeros não fibrilares solúveispodem desempenhar papéis importantes na neurotoxicidade em várias outrasdoenças neurodegenerativas (41), um procedimento experimental eficiente paraproduzir oligómeros da proteína prião pode ajudar a identificar o papeldesempenhado por essas espécies de encefalopatias espongiformes transmissíveis. A este respeito, vários grupos estudaram a transição conformacional dediferentes construções de proteína prião recombinantes em agregados rico-p (40,42 - 48). Alguns estudos apontam para a formação de oligómeros rica em betadurante a transição conformacional de PrP (40, 48). Tem sido sugerido que a p-oligómeros não estão na via para a formação de amiloide (42, 46) e que apreferência para formar quer uma β-oligómero ou de um agregado de amilóidepode ser ditada pelas condições experimentais com pH <5 e parcialmentedesnaturante As concentrações de ureia (4-5 M) favorecendo a β-oligómero e pH>5 e baixas concentrações de ureia (1-2 M) a favor da amilóide (42). Os nossosresultados actuais indicam que a combinação de temperatura elevada e pH 5,5 emmeio não tamponado, é mais eficaz na promoção da formação de mPrP- (121-231) Os oligómeros. Além disso, sob estas condições experimentais, verifica-seque os oligómeros sejam progressivamente consumido enquanto protofibrilassurgir, com tempos de incubação mais longos que conduz ao desaparecimento deoligómeros e o aparecimento de fibrilas amilóides maduras (Fig. 3, A e B).

A acumulação de oligómeros de SDS-resistentes mPrP- (121-231) é umareminiscência da formação de oligómeros de SDS-resistentes do péptido β-amilóide (49) e indica a elevada estabilidade das referidas espécies. Tem sidosugerido que a oligomerização de PrP pode ocorrer através da formação deligações dissulfureto intermoleculares (50, 51). No entanto, os oligómeros demPrP- (121-231) não foram ainda desmontado por ebulição na presença de 140 mM ditiotreitol e SDS (Fig. 2). Isto sugere que a oligomerização de mPrP- (121-231)

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não envolve a formação de ligações dissulfureto intermoleculares.

Tratamento da PrP Sc com PK gera um núcleo PK-resistente que engloba osresíduos 90-231, referidos como PrP27-30. O construto temos utilizado nãocontém o domínio N-terminal da proteína prião que é clivada por PK, e, portanto,qualquer alteração no peso molecular da proteína seria esperado por digestão PK.No entanto, a incubação de mPrP- (121-231) a pH 7,0 a 65 ° C durante 1 semana,levou à formação de um agregado anormal caracterizada por uma maiorresistência à digestão PK comparação com PrP nativo (Fig. 4). Estes resultadossugerem que, sob estas condições experimentais, mPrP- (121-231) agrega emuma amilóide que tem propriedades físicas de PrP Sc.

Em um estudo recente, Norstrom e Mastrianni (52) investigaram a agregação deuma PrP construção em que uma sequência palindrome correspondente aosresíduos de aminoácidos 112-119 no núcleo hidrofóbico da proteína prião foisuprimido. O facto de que este mutante de delecção formou agregados quandoexpressa em levedura está de acordo com os nossos resultados actuais e apoia anoção de que a região C-terminal da PrP pode ser suficiente para a agregação.

Priões sintéticos gerados in vitro têm sido mostrados para ser semelhante a umasubpopulação recentemente identificado da PrP Sc de doença de Creutzfeldt-Jakobesporádica (53). De interesse significativo, a forma amilóide desta subpopulaçãocontém um núcleo K-resistente proteinase composto apenas de resíduos 152 /153-230 e 162-230. Além disso, um importante estudo recente mostrou que aconversão da PrP C a PrP Sc e amplificação do último pode ser conseguida in vitro(54). Inoculação do tipo selvagem com hamsters, tais in vitro -produced PrP Sc

levou a uma doença scrapie bastante semelhante ao da doença produzida porinoculação de material infeccioso derivado do cérebro (54).

Em conclusão, o presente trabalho demonstra que uma forma de amilóide compropriedades físicas de PrP Sc pode ser obtida in vitro utilizando o domínio C-terminal da PrP, que não possui a totalidade do domínio N-terminal flexível da PrPe a maior parte do chamado amiloidog�ica (hidrofóbico) do núcleo da proteína.Compreendendo a conversão da PrP para, uma conformação resistente à proteaseespecífica-amilóide podem fornecer discernimento sobre os mecanismos deneurodegeneração e pode levar ao desenvolvimento de novas estratégias paracombater doenças provocadas por priões.

Agradecimentos

Agradecemos ao Dr. R. Glockshuber (Eidgenössische Technische Hochschule,Suíça) para o dom do plasmídeo contendo a variante de gene que codifica F175WmPrP- (121-231).

Notas de Rodapé

4 As abreviaturas utilizadas são: a PrP C, isoforma celular da proteína prião; PrPSc, isoforma patogénica ou tremor epizoótico da proteína prião; PK, proteinase K; mPrP-(121-231), a PrP murino recombinante compreendendo os resíduos 121-231;ThT, tioflavina T; Mes, ácido 4-morpholineethanesulfonic.

* Este trabalho foi parcialmente financiado por doações do Instituto MédicoHoward Hughes (para STF) e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científicoe Tecnológico (CNPq) e pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Riode Janeiro (FAPERJ) (ao STF e FGF ). As despesas de publicação deste artigoforam custeados em parte pelo pagamento de encargos de página. Este artigodeve ser marcada por este meio "anúncio" de acordo com 18 USC Seção 1734exclusivamente para indicar este fato.

A versão on-line deste artigo (disponível em http://www.jbc.org) contémfiguras suplementares. S1-S3.

1 O beneficiário de bolsas do CNPq / FAPERJ.

2 Um companheiro da Organização Human Frontier Science Program.

Recebido 05 de junho de 2006.Revisão recebeu 12 de julho de 2006.

A Sociedade Americana de Bioquímica e Biologia Molecular, Inc.

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