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Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical XIX Reunio Anual de Pesquisa Aplicada em doena de Chagas

Vol. 36 (Suplemento II), 2003 VII Reunio Anual de Pesquisa Aplicada em Leishmanioses

Avaliao do Teste Rpido Utilizando o Antgeno Recombinantek39 no Diagnstico da Leishmaniose Visceral no brasil

Elenice Moreira Lemos, Silvio F. Guimares Carvalho, Ralph Corey and Reynaldo Dietze

Ncleo de Doenas Infecciosas, Universidade Federal do Esprito Santo, Vitria, Esprito Santo, Brazil; Universidade Estadual de Montes Claros, Montes Claros,Minas Gerais, Brazil;Duke University Medical Center, Durham, North Carolina, USA.

RESUMO

Este estudo avaliou o desempenho teste rpido deimunocromatografia utilizando o antgeno rK39 (KalazarDetected InBios International, Seattle, WA, USA) e um testede ELISA utilizando antgeno total, para o diagnstico daleishmaniose visceral (LV) em 128 pacientes com diagnsticoparasitolgico da doena. Como controle foram includossoros de 10 indivduos saudveis e de 50 pacientes portadoresde outras infeces como: malria (10), hansenase (9),doena de Chagas (10), tuberculose (10) e leishmaniosecutnea (11). A sensibilidade do teste rpido com antgenorK39 e ELISA foram 90% e 89% respectivamente, enquanto aespecificidade foi 100% e 98% respectivamente. Nossos dadosportanto, confirmam a eficincia do teste rpido com rK39no diagnstico da LV.

INTRODUO

A leishmaniose compreende um grupo de infeces da pele,mucosa e vsceras, causada por um protozorio intracellular etransmitida por flebotomneos. A leishmaniose visceral (LV,calazar) mundialmente distribuda afetando cerca de meiomilho de crianas e adultos .1 Apresentando-se com febre,perda de peso gradual, esplenomegalia, hipergamaglobulinemiae pancitopenia, esta doena fatal se no diagnosticada etratada.2 Portanto, um mtodo simples de diagnstico essencial.De mesma importncia a validade do diagnstico, uma vezque, a terapia anti-leishmania frequentemente resulta emsignificante mortalidade e morbidade.3

O diagnstico definitivo da LV requer demonstrao doparasita em esfregaos ou cultura de tecido, principalmente demedula ssea ou bao. Entretanto, esses procedimentos soinvasivos necessitando de pessoal especializado para prevenir ador e hemorragia. Alm disso, a sensibilidade destes testes baixa, variando entre 70% para os aspirado de medulla ssea a90% para aspirados de bao.4

Muito esforo tem sido feito no sentido de desenvolver testesmenos invasivos para o diagnstico da LV.5-8 O teste de fixaode complemento, o teste de imunofluorescncia indireta, o ensaioimunoadsorvente ligado a enzima (ELISA) e os testes baseadosem PCR para amplificao de DNA de leishmania so alguns dos

exemplos destes esforos. Infelizmente, todos estes testesapresentam um dos dois inconvenientes: significante reatividadecruzada e dilficuldade para ser realizado em laboratrio compouco recursos.

Uma recente descoberta, tem sido a identificao do antgenoK39 de leishmania, membro da famlia das kinesinas. A detecode anticorpos IgG anti-K39 tem se mostrado bastante sensvel eespecfica para VL. A clonagem do antgeno K39 tem resultado naproduo do antgeno recombinante K39 (rK39), o qual foiadsorvido em fitas de nitrocelulose para serem usadas no diagnsticode leishmaniose visceral. Neste estudo ns comparamos osresultados do rK39 (Kalazar Detect) com ELISA usando antgenosolvel total do parasita, em 128 pacientes portadores de LVresidentes no estados de Minas Gerais e Esprito Santo.

MATERIAIS AND MTODOS

Pacientes. As amostras de soro foram coletadas de 128pacientes com aspirado de medula ssea positivo paraamastigotas. Os pacientes foram avaliados no HospitalUniversitrio de Montes Claros, Minas Gerais e em Vitria,Esprito Santo. Todos os pacientes foram submetidos a examefsico completo e obtida a histria clnica dos mesmos. Comocontrole foram utilizados amostras de soro de 60 pacientesportadores de malria (10), lepra (9), Doena de Chagas (10),tuberculose (10), leishmaniose cutanea (11) e de 10indivduos saudveis. O consentimento para a realizao doestudo foi obtido atravs do Comit de tica da UniversidadeFederal do Esprito Santo e da Universidade Estadual de MontesClaros. Consentimento para a participao no estudo foi obtidode todos os pacientes, parentes ou representante legal.

Teste imunocromtografico Kalazar Detect. O KalazarDetect um teste rpido de imunocromatografia fabricado pelaInBios International, Seattle, WA, USA, destinado a determinaoqualitativa de anticorpos no soro, contra o antgenorecombinante K39 L.(L.) chagasi. Vinte microlitros de soroforam adicionados parte inferior do fita e incubados durante10 minutos em um tubo contendo 2 gotas de tampo de corrida.De acordo com as instrues do fabricante , o teste consideradopositivo quando duas bandas, uma controle e uma do testeaparecem aps 10 minutos de incubao. O teste consideradonegativo se apenas a banda do controle aparecer.

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ELISA. Leishmania chagasi (MHON/BR/74/PP75) foi cultivadaem meio Schneider suplementado com 25% de soro fetal bovinoa 260C. As promastigotas foram coletadas por centrifugao,lavada 3 vezes com tampo salina fosfato (PBS) e lisada porcongelamento e descongelmento. A suspenso de parasitas foihomogeneizada usando um triturador de tecidos em banho degelo. O homogeneizado foi centrifugado a 10,000 g durante 20min a 4 0C. O sobrenadante foi coletado e usado como antgenosolvel total. O contedo de protena foi estimado atravs domtodo de Bradford. 10

Brevemente, placas Immulon # 4 (Dynatech, Chantilly, VA,USA) foram sensibilizadas com 2 mg de antgeno solvel deLeishmania chagasi por poo e incubado a 40C. As placas foramaspiradas, bloqueadas com PBS contendo 0.05% de Tween 20(PBS-T) e 2% de leite Molico desnatadodurante 1 h at 37 0C elavadas 4 vezes com PBS-T. Soro diludo 1/200 em PBS-Tcontendo 1% de leite Molico desnatado foi adicionado em cadapoo e incubado durante 45 minutos a 37 0C. As placas foramlavadas 4 vezes e os anticorpos ligados foram detectados usandoanti-IgG marcado com peroxidase, diludo 1/5000 (Kirkegaardand Perry, Gaithersburg, MD). Aps incubao durante 45minutos a 37 0C as placas foram lavadas novamente e incubadascom 0.005 g de O-fenilenediamino (OPD) e 3 ul de H

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2 em

tampo citrato, durante 15 minutos. A densidade tica foi lida a492 nm. Soros controles positivos e negativos foram avaliadosem cada placa para padronizar as leituras e variaes das placas.O ponto de corte entre as leituras dos pacientes positivos enegativos foi calculado atravs da mdia das densidades ticasdos negativos mais 3 desvios padres.

RESULTADOS

Soros de 128 pacientes com LV confirmada por exameparasitolgico, foram testados com o teste rpido deimunocromatografia Kalazar Detect e ELISA. Dos 128 pacientes,123 tambm apresentaram culturas positivas, cujos parasitasforam identificados como L. (L.) chagasi atravs da anlise deisoenzimas e anticorpos monoclonais. Como controle foramavaliados soros de 60 indivduos (10 individuos saudveis e 50pacientes com outras doenas endmicas que no LV). A idadedos pacientes variou entre 2 meses a 48 anos e o tempo dedoena antes do diagnstico variou entre 6 e 365 dias.

A sensibilidade do teste rpido com o rK39 e ELISA foram90% e 89% respectivamente, enquanto a especificidade foi100% e 98 % respectivamente (Tabela 1).

Dos 13 pacientes com LV que apresentaram resultadosnegativos no teste com rK39, o tempo de doena variou entre14 a 300 dias (mdia 86.5/mediana 30); os nveis degamaglobulina variou entre 1.0 a 4.8 mg/dl (mdia 2.3/mediana2.2) e 31% (4/13) tambm apresentaram teste de ELISA negativo.

O seguimento dos pacientes durante 12 meses aps otratamento revelou 100% de cura em todos os pacientes. Oteste com rK39 foi desenvolvido em uma amostra de 30pacientes, antes, 2 meses e 6 meses aps o tratamento. Dos30 pacientes estudados, 19 mantiveram o teste positivo (63%)

2 meses aps o tratamento e 14 (46%) ainda eram positivos 6meses aps o tratamento. No foi possvel avaliar soros de 12meses de seguimento.

DISCUSSO

Nossos resultados confirmam a utilidade do teste rpidocom o rK39 no diagnstico da LV. Com uma especificidadede 100% para pacientes com leishmaniose visceral, estediagnstico simples pode substituir mtodos diagnsticosmais invasivos para a avaliao inicial de pacientes comsuspeita de LV. Infelizmente, pacientes com resultadosnegativos para o teste rpido ainda representam uma fraosignificante da LV(10%).

Comparando nossos resultados com os achados de 5 estudosprvios, foi verificada uma grande variao entre eles. Asensibilidade do teste com o rK39 variou entre 67% a 100%. Amais alta sensibilidade (100%) ocorreu em pacientes da Indiaand Nepal.9-11 Pacientes da Venezuela tiveram menor porcentagemde resultados verdadeiros positivos (88%), e o teste com o rk39foi menos sensveis em pacientes do Sudo e outras reas.12-14 ATabela 2 resume os dados da literatura usando soro ou sanguetotal como amostra para o teste rpido.

Tabela 1 - Desempenho do rK39 e ELISA no diagnstico da LVcausada pela L. (L.) chagasi.

LV positivos Saudveis #Outras infeces *Sen/specif %

(n=128) (n=10) (n=50)

Teste rK39

Positivo 115 0 0 90/100

Negativo 13 10 50

ELISA

Positivo 114 0 1 89/98

Negativo 14 10 49# malria (10), hansensase (9), doena de Chagas (10), tuberculose (10), leishmaniosecutnea (11)*Sen = sensibilidadee specif = specificidade

Tabela 2 - Desempenho do antgeno rK39 no diagnstico da LV.Resumo dos dados publicados utilizando soro ou sangue totalcomo amostra.

Regio Total de Pacientes LV rK39 positivos Sens Spec

Nepal 11 127 14 14 100% 100%

Sudo 13 116 55 37 67% 98%

Venezuela12 117 41 36 88% 100%

Vrios* 14 96 14 10 71% 100%

ndia# 9 348 127 12 100% 98%

Estudo atual 188 128 115 90% 100%

* Pases do Mediterrneo e ndia .

# Sangue total ao invs de soro foi utilizado neste estudo.

H vrias hipteses que poderiam contribuir na explicaodesta variao geogrfica do teste rpido. Primeiro, poder existirdiferenas entre sub-espcies do complexo Leishmania donovani,resultando na variao do antgeno rK39 ou diferenas genticasindividuais entre os pacientes ou entre sub-grupos raciais.

Finalmente, outros fatores capazes de afetar o nvel deresposta do hospedeiro poderiam explicar as diferenas

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regionais. Zijlstra et al mostraram que pacientes com testepositivos para rK39 tinham significativamente maior nvel deanticorpos IgG anti-rK39 determinado pelo teste de ELISA doque pacientes com testes negativos (p