Quim. Nova, Vol. XY, No. 00, 1-5, 200_

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*e-mail: cristianebarata@hotmail.com

ADAPTAO DA METODOLOGIA DE ANLISE DE METEMOGLOBINA COMO BIOMARCADOR DE EFEITO DA EXPOSIO AO AGROTXICO DIFLUBENZURON

Cristiane Barata-Silvaa,*, Tatyane P. dos Santosa, Adherlene V. Gouvab, Ariane L. Larentisa, Josino C. Moreiraa e Paula N. SarcinelliaaCentro de Estudos da Sade do Trabalhador e Ecologia Humana, Escola Nacional de Sade Pblica, Fundao Oswaldo Cruz, Av. Leopoldo Bulhes, 1480, 214041-210 Rio de Janeiro RJ, BrasilbLaboratrio de Alimentos e Contaminantes, Instituto Nacional de Controle da Qualidade em Sade, Fundao Oswaldo Cruz, Av. Brasil, 4365, 21040-900 Rio de Janeiro RJ, Brasil

Recebido em 25/09/2014; aceito em 16/01/2015; publicado na web em 23/03/2015

ADAPTATION OF METHOD OF ANALYSIS OF METHEMOGLOBIN AS A BIOMARKER OF EFFECT OF EXPOSURE TO THE PESTICIDE DIFLUBENZURON. This work aimed to adapt the analysis of methemoglobin recommended by Evelyn Malloy (visible spectrophotometry), in order to facilitate its application in the field, or to analysis in clinical laboratory, of existing sites of diflubenzuron application. The parameters changed included: centrifuge rotation speed; time between the collection of biological sample and analysis, and storage temperature of the samples; and the volume of reagents. The comparison of the rotation speed (rpm) of the reference methodology with the rpm of a clinical centrifuge did not reveal a statistically significant difference in the levels of methemoglobin. The time between the collection of biological sample and analysis was extended for a period of up to 48 hours for both conservation by refrigeration and ambient temperature, producing no statistically significant difference when compared to the standard duration of 2 hours. Regarding the reagents, the reference methodology already uses the volume necessary to ensure complete reaction, whereas a wider range from the recommended volume to a 5-fold reduction in comparison to the reference methodology could be used. It was concluded that the proposed changes to the methodology for adapting the analysis are applicable to studies of field / workplace exposure and ensure the reliability of results. The adapted methodology was inter-laboratory validated and the parameters changed can be selected according to the requirements of the laboratory at which the methemoglobin is to be measured.

Keywords: diflubenzuron; methemoglobin; UV-VIS spectrophotometry.

INTRODUO

O diflubenzuron caracterizado como um agrotxico per-tencente ao grupo qumico das benzoilureias e sua nomenclatura IUPAC N-[[(4-clorofenil)amino]carbonil]-2,6-difluorobenzamida ou 1-(4-clorofenil)-3-(2,6-difluorobenzoil) ureia.1 A formulao utilizada sob a forma de p na concentrao de 25% e aplicada em containers ou pequenos recipientes residenciais que armazenam gua. Na agricultura, a aplicao realizada sob a forma de pequenas gotculas geradas por meio de sprays.2,3

Diflubenzuron ou Dimilin, como comercialmente conhecido, obteve o registro em 1985 com a finalidade de agir como inseticida e acaricida em plantaes de algodo, cogumelos, florestas e em plantas ornamentais.4 A partir desta data, este agrotxico vem sendo utilizado amplamente e novos estudos toxicolgicos vm sendo realizados para definir o perigo e o risco que tal substncia pode causar para a populao exposta.4

Atualmente, no Brasil, o diflubenzuron amplamente utilizado em campanhas de sade pblica para o controle de vetores de doena, principalmente do mosquito transmissor do vrus da dengue, o Aedes aegypti. Esta substncia qumica veio a ser utilizada em substituio do larvicida Temephos e do adulticida Cipermetrina, que possuem uma toxicidade maior em exposies crnicas para os trabalhadores que os manipulam quando comparado ao diflubenzuron.5

Segundo estudos, a toxicidade aguda pela via oral, drmica ou inalatria do diflubenzuron baixa, logo, sua classificao toxico-lgica classe IV, isto , substncia pouco ou muito pouco txica.3

Porm, no existe relato de classificao pela Agncia Internacional para Pesquisa sobre Cncer (IARC). Com o atual uso intenso deste composto, somente possvel observar os possveis efeitos carcino-gnicos e mutagnicos aps uma exposio ocorrida por um longo perodo a baixas doses, denominada de exposio crnica.6

O principal efeito txico do diflubenzuron em animais de expe-rimentao relatado na literatura a formao de sulfemoglobina e metemoglobina, efeitos pelos quais estes metablitos so utilizados como indicativos de alterao da homeostasia do organismo exposto. Estudos sugerem que a formao de metemoglobina ocorre devido presena do metablito p-cloroanilina (PCA), principalmente quando a exposio ocorre pela via inalatria e oral.7 E, desta forma, tal metabtito sanguneo pode ser utilizado como um biomarcador de exposio, visto que a metemoglobina um pigmento endgeno resultante do contato com o xenobitico.

A metemoglobina (MHb) um pigmento da hemoglobina re-sultante da ao de substncias que induzem oxidao de um dos tomos de ferro que est na composio da hemoglobina, do estado ferroso (Fe+2) para o frrico (Fe+3). Sob esta forma, o transporte gasoso no sangue fica comprometido, pois a MHb no consegue se ligar ao oxignio, ao gs carbnico ou ao monxido de carbono devido ao estado de oxidao +3. Alm disso, h a formao de um subprodu-to, o superxido (O2.), que uma espcie reativa de oxignio, tendo grande importncia em diversos processos fisiopatolgicos.8

A metemoglobina produzida naturalmente no organismo durante o processo de auto-oxidao de forma lenta e consistente, presente em quantidades iguais ou inferiores a 2% de hemoglobina total.6 Desta forma, a Norma Regulamentadora No 7 preconiza que o percentual de metemoglobina deve ser inferior a 2 %.9 Com os nveis basais

Barata-Silva et al.2 Quim. Nova

elevados, o sistema de reduo presente no organismo no capaz de reduzir metemoglobina a hemoglobina, levando a desfechos relacio-nados com a porcentagem de metemoglobina formada: concentraes de metemoglobina entre 10-20% so geralmente bem toleradas em seres humanos, mas j ocorre colorao ciantica visvel; concen-traes entre 20-25% podem causar cefalia, dispnia, fotofobia, cansao, confuso mental, taquicardia, palpitaes e dor torcica; valores maiores que 55% provocam deteriorao acentuada do estado de conscincia, arritmias cardacas, acidose, isquemia neurolgica e choque cardiognico, enquanto concentraes superiores a 70% so geralmente fatais.10 Existem diversas substncias exgenas que promovem o aumento da porcentagem de metemoglobina no organis-mo humano, como analgsicos, quimioterpicos, nitratos e nitritos, anilinas, naftaleno, nitrobenzenos, nitroglicerinas, entre outros,11 que devem ser considerados quando se quer utilizar a metemoglobina como biomarcador de efeito da exposio ao diflubenzuron. Desta forma, a anlise da metemoglobina se torna essencial para ser utilizada como um biomarcador de efeito da exposio ao diflubenzuron. A sua adaptao uma etapa importante na eliminao dos fatores limitantes na implementao desta metodologia em laboratrios de referncias, assim como sua aplicao em campo ou em laboratrio de anlises clnicas existentes nas localidades de aplicao do diflubenzuron.

METODOLOGIA

A metodologia empregada para anlise de metemoglobina foi descrita primeiramente por Evelyn-Malloy (1938),12 posteriormente foi modificada por J. Meunier (1972) e atualizada por Carrazza (1998),13 na qual a dosagem de metemoglobina no sangue venoso realizada por meio de espectrofotmetro UV-visvel. Essa tc-nica se fundamenta no princpio de que os pigmentos sanguneos oxiemoglobina, deoxiemoglobina, metemoglobina e cianomete-moglobina possuem absoro mxima em comprimentos de ondas semelhantes, mas cada pigmento tem picos de absoro menores, porm significativos, em diferentes comprimentos de onda, confor-me representado na Figura 1.

Como mostrado na Figura 1, a metemoglobina possui uma absor-o pequena, porm exclusiva, no comprimento de onda de 630 nm, obtendo-se neste uma absorbncia proporcional concentrao de metemoglobina na amostra.14

Na tentativa de anular a ao de outros pigmentos interferentes presentes no sangue, como por exemplo, carboxiemoglobina e sulfemoglobina, quatro leituras so realizadas. A primeira leitura (A1) a ser efetuada na amostra tratada (Soluo de Triton-X 1% v/v e Soluo de Tampo Fosfato Dibsico de Sdio 0,01 mol L-1 pH 6,80 com posterior centrifugao) feita sem alterao da composio dos pigmentos sanguneos presentes na amostra. A segunda leitura (A2) realizada na amostra anteriormente descrita com adio de cianeto de potssio, que levar a transformao da metemoglobina em cianometemoglobina, que nesse comprimento de onda possui uma absorbncia mnima. Desta forma, o valor observado resultante dos pigmentos residuais da hemoglobi-na, e a diferena da primeira leitura com a segunda fornecer a real proporo da concentrao de metemoglobina presente na amostra.

A terceira leitura (A3) realizada em uma alquota da amostra tratada com uma soluo de ferricianeto de potssio, que, ao contato com a hemoglobina, promove a oxidao do ferro levando forma-o de metemoglobina, que fornecer um valor de absorbncia. A esta amostra acrescida uma soluo de cianeto de potssio para novamente promover a leitura residual de outros pigmentos da he-moglobina, que denominada como quarta leitura (A4). A diferena entre a terceira e quarta leitura proporcional concentrao da metemoglobina gerada in vitro.

Assim, com a obteno desses valores, possvel aplicar a equa-o abaixo para estimar o percentual de metemoglobina presente na amostra de cada trabalhador e concluir se tais nveis esto conformes ou no com o preconizado pela NR-07 (< 2%):9

1 1

3 4

A APercentual de Metemoglobina = 100

A A

Na etapa de adaptao da metodologia realizada neste trabalho, diversas condies de armazenamento e anlise foram testadas a fim de facilitar a execuo do processo, empregando espectrofotmetro UV-visvel modelo UV-1601 da Schimadzu utilizando microcubeta de vidro com 1 cm de caminho tico.

As solues utilizadas nos experimentos na avaliao da mete-moglobina foram preparadas a partir de reagentes fabricados pela Sigma-Aldrich com grau de pureza superior a 90%.

Figura 1. Representao da absoro dos pigmentos sanguneos nos diferentes comprimentos de onda (adaptado da Ref. 14)

Adaptao da metodologia de anlise de metemoglobina 3Vol. XY, No. 00

Adaptao da rotao, tempo e temperatura de armazenamento das amostras

A primeira condio testada foi na etapa de hemlise dos eritrci-tos e sedimentao de fragmentos que interferem na leitura, realizada atravs da centrifugao durante o preparo da amostra. A rotao por minuto (rpm) preconizada na metodologia12,14 de 10.000 rpm, mas nesta etapa foi testada uma rotao de 6.000 rpm, que pode ser atingida em uma centrfuga clnica. Foi mantido o tempo de rotao de 15 minutos para as trs condies analisadas.

Outra condio a ser adaptada o tempo entre a coleta de sangue e a leitura da amostra para a determinao de metemoglobina, que segundo a metodologia utilizada como referncia12,14 no poderia exceder 2 horas. Porm, outro estudo15 descrito na literatura possi-bilitou a anlise em at 24 horas aps a coleta, quando a amostra conservada em condies especficas. Assim, alteraes nas condies de armazenamento e no tempo entre a coleta e a anlise foram testadas e comparadas estatisticamente com as condies da metodologia preconizada. Foram testados armazenamentos do sangue sob forma coletada, ou seja, com apenas heparina, e do sangue processado na centrfuga com a soluo hemolisante (Soluo de Triton-X 1% v/v e Soluo de Tampo Fosfato Dibsico de Sdio 0,01mol L-1 pH 6,80) em temperatura ambiente (mdia de 20 C) e sob refrigerao (mdia de 4 C). Para as amostras descritas acima foram testados os tempos de 0, 2, 4, 6, 24, 48 horas entre a coleta e a leitura no espectrofotmetro.

Para a comparao dos resultados obtidos nos experimentos aci-ma descritos foi utilizado ANOVA: fator nico e teste t de Student, com nvel de significncia de 0,05 (95% de confiana). Foi tambm avaliada a normalidade na distribuio dos resultados.

Avaliao dos volumes dos reagentes por planejamento experimental

Para avaliar a influncia de outros parmetros sobre a aplicabili-dade da metodologia, foi mantida a rotao da centrfuga a 6.000 rpm por 15 minutos e planejada uma sequncia de experimentos alterando duas variveis ao mesmo tempo, a partir de uma anlise multivariada empregando uma matriz experimental do tipo DCCR (Delineamento Composto Central Rotacional)16 em cinco nveis, sendo elas os volumes das solues entre 5 L e o preconizado pela metodologia oficial, 25 L, de cianeto de potssio a 5% e ferricianeto de potssio a 5%, que so utilizadas no momento das leituras para a formao de cianometemoglobina e 100% de metemoglobina, respectivamente.

Para a construo do plano fatorial do tipo DCCR, todas as combinaes experimentais foram implementadas pela va-riao entre as condies definidas pelos valores normalizados de cada uma das duas variveis, entre -1 e +1, que permitem identificar efeitos lineares e interao das variveis sobre a resposta, incluindo repeties na condio do ponto central (0), que corresponde ao valor intermedirio entre os nveis -1 e +1. Alm disso, foi feita a adio de condies nos pontos -1,41 e +1,41, que permitem avaliar efeitos quadrticos das variveis sobre a resposta.16 Por meio da utilizao de variveis normalizadas, seus efeitos podem ser comparados sem que sofram influncia da am-plitude dos valores reais de cada varivel, permitindo, desta forma, identificar aqueles com maior influncia sobre a resposta avaliada. Os ensaios relativos condio do ponto central foram realizados de forma a determinar o erro experimental e avaliar a linearidade dos efeitos das variveis sobre a resposta, sendo sua triplicata utilizada para calcular as mdias e desvio padro.

A avaliao estatstica dos resultados do planejamento foi realiza-da com o auxlio do programa STATISTICA 9.1 (Statsoft, USA). Os efeitos de cada uma das variveis foram estimados a 95% de confiana

e foram considerados estatisticamente significativos aqueles com p < 0,05.16 Para a realizao de tais experimentos foi utilizado como material de referncia o sangue de um voluntrio, do qual a mdia dos valores de percentual de metemoglobina j eram conhecidos devido a uma sequncia de anlises de seu material biolgico feita em dias variados.

Validao da metodologia adaptada: avaliao de especificidade, seletividade e preciso

Os critrios de validao avaliados para as condies da meto-dologia adaptada foram a especificidade, seletividade e preciso, sendo que esta ltima foi composta por trs nveis: repetibilidade, preciso intermediria e reprodutibilidade. A repetibilidade ou preciso intracorrida objetivou a observao dos resultados obtidos em experimentos realizados em uma mesma amostra em um curto espao de tempo (em um mesmo dia). J a preciso intermediria ou preciso intercorrida avaliou o comportamento dos resultados quando as anlises foram executadas em dias diferentes utilizando a amostra colhida do mesmo voluntrio a cada dia. Para a realiza-o destas anlises, cada condio foi repetida 10 vezes no mesmo dia (preciso intracorrida) ou 15 vezes ao longo dos dias (preciso intercorrida). A existncia de outliers foi avaliada com um intervalo de confiana de 95%, visando retirada dos resultados fora deste parmetro, para calcular o coeficiente de variao associado ao mtodo. Esta avaliao necessria pois a literatura preconiza que um mtodo possui repetibilidade quando o coeficiente de variao no ultrapassa 20%.17

A reprodutibilidade ou preciso interlaboratorial foi avaliada com o objetivo de observar a concordncia dos resultados obtidos nos experimentos realizados em laboratrios distintos utilizando alquotas de uma mesma amostra. Para isso, uma amostra de sangue foi dividida em dois frascos com volumes semelhantes e cada labo-ratrio preparou as solues necessrias para a execuo da anlise. A primeira alquota denominada como A foi analisada no Setor de Agrotxicos do Laboratrio de Toxicologia do Centro de Estudos da Sade do Trabalhador e Ecologia Humana (CESTEH) localizada na Fundao Oswaldo Cruz (FIOCRUZ-RJ), e a segunda alquota, B, foi devidamente acondicionada e transportada em at duas horas para o Laboratrio de Toxicologia da Universidade Federal Fluminense (UFF), onde foi realizada a anlise.

RESULTADOS E DISCUSSO

O estudo de comparao entre as rotaes utilizadas no proces-samento da amostra foi realizado visando comparar a eficcia nesta anlise da centrfuga clnica, de mais fcil acesso e manipulao em diversos laboratrios de anlises clnicas, que permite obter 6.000 rotao por minuto, com a centrfuga de grande porte que possibi-lita alcanar uma rotao de 10.000 rpm. A proposta de mudana na rotao se justifica pelo fato de que a probabilidade de que um laboratrio de anlises clnicas tenha acesso a uma centrfuga com capacidade de rotao por minuto de 10.000 rpm pequena e que os altos custos e o tamanho ocupado por ela sejam fatores limitantes para a sua aquisio. Assim, possibilitando a utilizao de outras centrfugas sem comprometer o resultado, a metodologia se torna mais facilmente aplicvel na rotina laboratorial para anlise de ex-posio a substncias qumicas. Normalmente a centrfuga de mais alta rotao possui a opo de refrigerao, que neste experimento no foi utilizada, permanecendo com o tempo de centrifugao de 15 minutos. Os resultados gerados aps a anlise dos dados permi-tiram a inferncia de que o percentual de metemoglobina obtida no sofre mudana estatisticamente significativa do seu valor quando a

Barata-Silva et al.4 Quim. Nova

rotao por minuto de 10.000 rpm (0,44 0,19) substituda pela de 6.000 rpm (0,78 0,39), uma vez que foi encontrado um p > 0,05. Estes resultados permitem observar que a substituio por uma menor rotao por minuto no ir comprometer a fidedignidade dos resul-tados gerados na anlise. Essa etapa de desenvolvimento permitiu a alterao na metodologia para a utilizao da centrfuga com menor capacidade rotacional.

Para avaliar o comportamento da amostra frente ao tempo entre a coleta e a anlise e as condies de armazenamento, os outros par-metros do experimento, como o tempo de centrifugao e a rotao, permaneceram como o preconizado na metodologia de referncia,12,14 de 15 minutos e 10.000 rpm, respectivamente. A justificativa para alterar esse parmetro na metodologia se deve limitao operacional com relao ao tempo, visto que entre a coleta, processamento e a leitura da amostra, a metodologia preconizada recomenda no ultra-passar o tempo de 2 horas. Assim, para promover a avaliao de um quantitativo elevado de amostras ou se o local de coleta de amostra estiver a uma certa distncia do laboratrio em que a metemoglobina ser dosada, a metodologia de referncia preconizada se torna limitada e de difcil aplicao.

Os resultados deste conjunto de experimentos foram agrupados em trs grandes grupos conforme o tempo de armazenamento, sen-do eles de 0 a 6 horas (T1), 24 horas (T2) e 48 horas (T3), para a realizao das anlises estatsticas. Primeiramente, os conjuntos de dados foram avaliados quanto distribuio, que foram normais, sendo posteriormente realizado o teste t para a comparao dos resultados de cada conjunto. Foi observado que no havia diferena estatisticamente significativa (p > 0,05) entre as diferentes condies de armazenamento, com ou sem refrigerao. Sendo assim, os dados puderam ser tratados como conjuntos que teriam somente a varivel tempo entre a coleta e anlise para ser avaliada. Para T1, T2 e T3 foram excludos os outliers e foram obtidas mdias de percentual de metemoglobina de 0,55 0,21, 0,39 0,08, 0,41 0,14, respectiva-mente. Entretanto, uma limitao em algumas destas avaliaes foi o nmero restrito de rplicas (n=3) que impossibilitou uma anlise de outliers, obtendo-se assim desvios padro superiores a 20% em algumas condies experimentais, o que foi contornado na validao da metodologia empregando todas as condies adaptadas.

Os resultados gerados sugerem que a metodologia pode ser modificada, promovendo desta forma uma adaptao, visto que o tempo preconizado na metodologia de referncia12,14 (2 horas) limita a logstica do processo de coleta de amostra e anlise em laboratrio.

Avaliao dos volumes dos reagentes por planejamento experimental

Para avaliar o resultado do percentual de metemoglobina mediante a alterao do volume dos reagentes empregados na metodologia de anlise, um conjunto de experimentos foi realizado promovendo a combinao de duas variveis em diferentes condies, levando a diferentes concentraes dos reagentes, conforme o estabelecido pelo planejamento experimental DCCR em cinco nveis e mantendo a rotao da centrfuga em 6.000 rpm por 15 minutos. A Tabela 1 representa os volumes das solues de cianeto de potssio e ferri-cianeto de potssio, a normalizao das variveis e os valores de metemoglobina obtidos nos experimentos.

Para tais resultados, a mdia obtida pelas rplicas nas condies do ponto central foi de 0,98 com desvio padro de 0,15 em termos de % de MHb (erro experimental de cerca de 15 %), podendo-se afirmar que as variveis testadas no apresentam influncia sobre o percentual de metemoglobina, pois todos os nveis testados de diferentes volumes apresentam resultados similares considerando o erro experimental em torno de 15% e um intervalo de confiana de 95%.

Os resultados indicam que no h diferena estatisticamente signi-ficativa entre os volumes de reagentes testados, uma vez que todos os efeitos apresentam p > 0,05 (Tabela 2), ou seja, os resultados para os volumes de KCN e de K3Fe(CN)6 variando de 5 a 25 L so similares, indicando que o percentual de metemoglobina formada similar em toda esta faixa de reao. Assim, a anlise estatstica dos efeitos da variao de cianeto de potssio e de ferricianeto de potssio sobre o percentual de metemoglobina no mostrou efeito estatisticamente significativo da variao da metemoglobina em relao aos volumes das solues de anlise.

Mediante tais resultados foi possvel observar que o volume m-ximo a ser adicionado das respectivas solues ultrapassa o volume necessrio para promover as reaes. O analista pode selecionar qual volume utilizar no experimento, dentro da faixa testada de 5 a 25 L, sem comprometer o resultado e com 100% de rendimento da reao, evitando assim uma reao incompleta que poderia gerar um falso resultado. Tal escolha pode ser pautada na disponibilidade de instru-mentos de laboratrio para aliquotar o volume escolhido, como o uso de pipetas com definio precisa de volume ou na economia do uso de reagente e, consequentemente, o seu menor volume de descarte.

Esse conjunto de experimentos confirmou a robustez do mtodo utilizado frente variao na velocidade de rotao da centrfuga, tempo entre a coleta e anlise da amostra e a variao dos volumes das solues de anlise, pois independente dessas alteraes, o valor permaneceu estatisticamente similar.

Tabela 1. Planejamento de experimentos (DCCR) de anlise do percentual de metemoglobina variando os volumes das solues de cianeto de potssio e de ferricianeto de potssio (usando valores reais em L e valores normalizados)

Experimento KCN (L) x1K3Fe(CN)6

(L) x2 %MHb

1 8 -1 8 -1 1,27

2 8 -1 22 1 0,59

3 22 1 8 -1 0,80

4 22 1 22 1 0,76

5 15 0 15 0 0,86

6 15 0 15 0 1,15

7 15 0 15 0 0,84

8 15 0 15 0 1,07

9 5 -1,41 15 0 0,64

10 15 0 5 -1,41 0,83

11 25 1,41 15 0 0,97

12 15 0 25 1,41 0,65

Tabela 2. Avaliao estatstica dos efeitos lineares e quadrticos do DCCR variando os volumes das solues de cianeto de potssio e de ferricianeto de potssio na formao de metemoglobina

Fator Efeito Erro Padro p

Mdia/Interseo 0,98 0,09 0,00

x1 0,04 0,12 0,75

x12

-0,13 0,14 0,38

x2 -0,24 0,12 0,10

x22

-0,20 0,14 0,20

x1.x2 0,32 0,18 0,12

Adaptao da metodologia de anlise de metemoglobina 5Vol. XY, No. 00

Validao da metodologia adaptada: avaliao de especificidade, seletividade e preciso

Para a determinao da validao na condio da metodologia adaptada, a preciso do mtodo foi avaliada nos trs nveis: repeti-bilidade, preciso intermediria e reprodutibilidade.

A repetibilidade ou preciso intra-corrida teve como objetivo a observao dos resultados obtidos em experimentos realizados em uma mesma amostra em um curto espao de tempo (em um mesmo dia). Aps a avaliao da ocorrncia de outliers entre as rplicas dos experimentos, foi obtido um coeficiente de variao de 19,8%, o que considerado aceitvel dentro dos critrios de validao adotados.17 J a preciso intermediria ou preciso intercorrida objetivou a ava-liao do comportamento dos resultados quando as anlises foram executadas em dias diferentes utilizando a amostra colhida do mes-mo voluntrio a cada dia. Assim, a anlise foi realizada em 15 dias diferentes. Aps a retirada dos resultados calculados como outliers, a mdia obtida foi de 0,48 com desvio padro de 0,08 em percentual de MHb e o coeficiente de variao obtido foi de 17,8%, o que considerado aceitvel dentro dos critrios de validao adotados.17

importante ressaltar que um outlier pode ser definido como um ponto experimental que parece no se ajustar ao mesmo padro de distribuio de probabilidades definido pela maioria dos outros pontos experimentais.18 Como a anlise de outliers pode ser feita de vrias formas distintas e h discusses e controvrsias do ponto de vista estatstico, ela deve ser feita com cuidado para no levar a interpretaes errneas dos dados, tanto na manuteno quando na eliminao de um determinado ponto em comparao com a tendncia dos demais.19

O ltimo nvel avaliado foi a da reprodutibilidade ou preciso in-terlaboratorial, no qual a mdia dos resultados obtidos no laboratrio A foi de 0,55% MHb e de 0,57% MHb no laboratrio B. A partir dos resultados foi possvel observar que os valores obtidos no possuem diferena estatisticamente significativa (p > 0,05). Desta forma, a reprodutibilidade do mtodo foi confirmada e os resultados gerados em diferentes laboratrios que utilizarem corretamente a metodolo-gia proposta devem gerar resultados estatisticamente semelhantes, o que se espera de qualquer metodologia, ou seja, a aplicabilidade em qualquer ambiente laboratorial.

O mtodo adaptado foi empregado para a avaliao de uma populao ocupacionalmente exposta ao diflubenzuron (guardas de endemias), atuantes na regio metropolitana do Estado do Rio de Janeiro no ano de 2012, permitindo avaliar os nveis de metemoglo-bina antes e aps a jornada de trabalho.20

CONCLUSES

Com o presente trabalho, foi possvel concluir que a proposta de adaptao da metodologia de anlise se mostrou eficaz para a quantificao do pigmento sanguneo denominado metemoglobina, atravs de espectrofotmetro operando no visvel. Esta modificao permitiu a utilizao de uma menor rotao por minuto na etapa de centrifugao e possibilitou uma maior margem de tempo para a realizao da anlise aps a coleta sangunea. Foi possvel concluir que as propostas de alteraes na metodologia para emprego das condies de rotao, tempo, temperatura e volumes dos reagentes so aplicveis para trabalhos de avaliao da exposio em campo/no local de trabalho e garantem a fidedignidade dos resultados gerados.

Com as alteraes avaliadas foi possvel concluir que para a realizao da anlise no se tem a necessidade de aquisio de

equipamentos especficos, como por exemplo, centrfugas de altas rotaes, e nem a limitao imposta na logstica do tempo de anlise. Logo, a adaptao realizada propicia a acessibilidade de implemen-tao desta metodologia em um amplo espectro de laboratrios. Apesar da adaptao da metodologia ter sido implementada de forma exitosa, necessrio advertir que o mtodo apresenta alta variabli-dade, o que exige a realizao de um grande nmero de rplicas de cada experimento.

AGRADECIMENTOS

Este trabalho contou com apoio financeiro da FAPERJ via Auxlio Pesquisa- APQ1 (processo nmero 110.682/2013) e bolsa FIOCRUZ para Cristiane Barata Silva.

REFERNCIAS

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