PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM VIGILNCIA SANITRIA

INSTITUTO NACIONAL DE CONTROLE DE QUALIDADE EM SADE

FUNDAO OSWALDO CRUZ

Samara SantAnna de Oliveira

AVALIAO DA PRESENA DE BIOMARCADOR MOLECULAR DE

CONTAMINAO FECAL HOSPEDEIRO ESPECFICO EM GUAS DE

RECREAO COSTEIRA NO ESTADO DO RIO DE JANEIRO

Rio de Janeiro

2014

AVALIAO DA PRESENA DE BIOMARCADOR MOLECULAR DE

CONTAMINAO FECAL HOSPEDEIRO ESPECFICO EM GUAS DE RECREAO

COSTEIRA NO ESTADO DO RIO DE JANEIRO.

Samara SantAnna de oliveira

Dissertao apresentada ao Programa de Ps-

Graduao em Vigilncia Sanitria do Instituto

Nacional de Controle de Qualidade em Sade da

Fundao Oswaldo Cruz como requisito parcial para a

obteno do ttulo de Mestre em Vigilncia Sanitria.

Orientadores: Maysa Beatriz Mandetta Clementino

Alexander M. Cardoso

Rio de Janeiro

2014

Catalogao na fonte Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Sade Biblioteca

Evaluation the presence of molecular biomarkers of fecal contamination in specific host

coastal recreation waters of the State of Rio de Janeiro.

Oliveira, Samara SantAnna de

Avaliao da presena de biomarcador molecular de contaminao fecal hospedeiro especfico

em guas de recreao costeira no estado do Rio de Janeiro / Samara SantAnna de Oliveira. Rio

de Janeiro: INCQS / FIOCRUZ, 2014.

66 f.: il.

Dissertao (Mestrado em Vigilncia Sanitria) Programa de Ps-Graduao em

Vigilncia Sanitria, Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Sade, Fundao Oswaldo

Cruz. Rio de Janeiro, 2014.

Orientadores: Maysa Beatriz Mandetta Clementino e Alexander M. Cardoso

1. Poluio da gua. 2. Poluio das Praias. 3. Coliformes. 4. Methanobrevibacter. 5.

Vigilncia Sanitria. I Titulo

Samara SantAnna de Oliveira

AVALIAO DA PRESENA DE BIOMARCADOR MOLECULAR DE

CONTAMINAO FECAL HOSPEDEIRO ESPECFICO EM GUAS DE

RECREAO COSTEIRA NO ESTADO DO RIO DE JANEIRO.

Dissertao apresentada ao Programa de Ps-

Graduao em Vigilncia Sanitria do Instituto

Nacional de Controle de Qualidade em Sade da

Fundao Oswaldo Cruz como requisito parcial para a

obteno do ttulo de Mestre em Vigilncia Sanitria.

Aprovado em 21/08/2014

BANCA EXAMINADORA

___________________________________________________________________

Dr. Clia Maria Carvalho Araujo Pereira Romo (INCQS/FIOCRUZ)

____________________________________________________________________

Dra. Maria Regina Branquinho (INCQS/FIOCRUZ)

____________________________________________________________________

Dra. Jessica Manya Bittencourt Dias Vieira (UEZO)

_________________________________________________________________

Dra. Maysa Beatriz Mandetta Clementino (INCQS/FIOCRUZ) - Orientadora

Dedico ao meu pai, minha eterna fonte de inspirao .

AGRADECIMENTOS

Agradeo a Deus pelo dom da vida por mais uma etapa vencida e pelo objetivo alcanado.

Agradeo aos meus pais, Welington e Lana, exemplos na minha vida.

Agradeo a minha professora orientadora Maysa Beatriz Mandetta Clementino que teve

pacincia e que me ajudou bastante concluir este trabalho.

Coordenao da Ps-Graduao em Vigilncia Sanitria.

Aos meus amigos do Laboratrio de Micro-organismos de Referncia, meu muito obrigado.

Em especial ao Kayo, Ctia, Carla, Teko e Mayara por todas as dvidas resolvidas, pelas

informaes preciosas e pelo auxlio nos experimentos alm da pacincia, tranquilidade ao me

ajudar nos experimentos.

Ao pesquisador Dr. Marcos Sorgine pelos valiosos conhecimentos transmitidos

principalmente em PCR em tempo real e ao Dr. Alexander M. Cardoso por toda contribuio

na anlise dos resultados (bioinformtica).

Aos professores membros da Banca Examinadora, pela gentileza em participar da banca, e

pela contribuio com seus valiosos comentrios, observaes, crticas e sugestes.

A todos que direta ou indiretamente contriburam para a realizao deste trabalho e que no

tm seus nomes presentes nestes agradecimentos, o meu muito obrigada!

RESUMO

Atualmente, indicadores bacteriolgicos utilizados para avaliar a balneabilidade das guas de

recreao estabelecidos em legislaes, apresentam limitaes como a correlao com seu

hospedeiro. Uma variedade de micro-organismos anaerbios vem sendo considerados alvos

promissores no desenvolvimento de indicadores de poluio fecal hospedeiro-especifico. A

espcie M. smithii a nica espcie conhecida que coloniza exclusivamente o trato

gastrointestinal humano e altamente prevalente em esgoto. Sendo assim, este projeto tem

como objetivo avaliar a presena de M. smithii como bioindicador de contaminao fecal

hospedeiro-especifico em guas de recreao costeira no estado do Rio de Janeiro. Para isso

foram coletadas amostras de guas superficiais de 13 praias (Ilha do governador (n=4),

Copacabana (n=1), Leblon (n=2), Prainha (n=2), Ramos (1), Araruama (n=2), Niteroi (n=1))

em seguida os parmetros fsico-qumicos e as concentraes de coliformes termotolerantes

foram determinados. Em seguida foi realizada a caracterizao das comunidades de

Methanobrevibacter spp. atravs da construo de bibliotecas do gene rrs do 16S rRNAe a

deteco e quantificao do M. smithii pela qPCR do gene nifH. Os parmetros fsico-qumicos,

apresentaram alteraes significativas em relao a salinidade e condutividade. Quando

analisados em relao a balneabilidade, somente as praias Seca, Pontinha e Ramos

apresentaram-se como prprias para atividade recreativa. As anlises das bibliotecas

demonstraram a prevalncia de M. smithii e de organismos no cultivados, muito

provavelmente novas espcies do gnero Methanobrevibacter ainda no descritas. A PCR

convencional detectou M. smithii em 11 amostras, enquanto a qPCR detectou e quantificou

cpias do gene nifH em 12 amostras. A partir dos dados obtidos podemos concluir que as

aplicaes de novos indicadores na determinao da origem da contaminao das guas de

recreao contribuem para uma avaliao mais precisa da qualidade das guas e

consequentemente da sade da pblica.

ABSTRACT

Currently, bacteriological indicators used to assess bathing water recreation established in laws,

have limitations such as the correlation with its host. A variety of anaerobic micro-organisms

has been considered promising targets in the development of host-specific indicators of fecal

pollution. The specie M. smithii is the only known species that exclusively colonizes the human

gastrointestinal tract and is highly prevalent in sewage. Thus, this project aims to assess the

presence of M. smithii as bioindicator of host-specific fecal pollution in coastal recreation

waters of Rio de Janeiro. For this surface water samples from 13 beaches (Ilha do Governador

(n = 4), Copacabana (n = 1), Leblon (n = 2), Prainha (n = 2), Ramos (1), Araruama (n = 2),

Niteroi (n = 1)) then the physico-chemical parameters and concentrations of fecal coliforms

were determined. Then the characterization of communities Methanobrevibacter spp was

performed. by constructing libraries rrs 16S rRNAe detection and quantification by qPCR of

M. smithii nifH. The physico-chemical parameter settings showed significant changes in

relation to salinity and conductivity. When analyzed for bathing, only Seca, Pontinha Ramos

beaches and presented themselves as fit for recreational activity. Analyses of libraries

demonstrated the prevalence of M. smithii and uncultivated organisms, most likely new species

of the genus Methanobrevibacter not yet described. Conventional PCR detected in M. smithii

11 samples, while qPCR detected and quantified copies of the nifH 12 samples. From the data

obtained we can conclude that applications of new indicators in determining the source of

contamination of water recreation contribute to a more accurate assessment of water quality

and consequently the health of the public.

LISTA DE SIGLAS, ABREVIATURAS, SMBOLOS E UNIDADES

16SrRNA - gene 16S do cido ribonuclicoribossomal

16SrDNA - gene 16S do cido desoxiribonuclicoribossomal

ABNT - Associao Brasileira de Normas Tcnicas

ANVISA - Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria

Art. - Artigo

ATCC - American Type Culture Collection

BLAST - Basic local alignment search tool

C - Grau Celsius

CEDAE - Companhia Estadual de guas e Esgotos

CONAMA - Conselho Nacional de Meio Ambiente

DNA - cido desoxirribonuclico

dNTPs - Deoxinucleotdeo trifosfato

EDTA - cido etilenodiaminotetractico

FIOCRUZ - Fundao Instituto Osvaldo Cruz

INCQS - Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Sade

LB - Luria Bertani

LMR - Laboratrio de Micro-organismos de Referncia

MEGA - Molecular Evolutionary Genetics Analysis

mg - miligrama

MgCl2 - cloreto de magnsio

mL - mililitro

mM - milimolar

mm - milmetro

mm3 - metros cbicos

mS - miliSiemens

n - nmero

NaOAc - Acetato de sdio

NaOH - Hidrxido de sdio

NCBI - National Center for Biotechnology Information

ng - nanograma

nm- nanmetro

OD - Oxignio dissolvido

OTU Operational Taxonomic Units (unidades taxonmicas operacionais)

pb - pares de base

PBS - Tampo fosfato em salina

PCA - Principal componentes analyses (anlise de componentes principais)

PCR Polymerase chain reaction (reao em cadeia pela polimerase)

pH - potencial de hidrognio

PM - peso molecular

pmol - picomol

ppm - parte por milho

rDNA - DNA ribossomal

RDP II - RibosomalDatabase Project II

RJ - Rio de Janeiro

RNA - cido ribonuclico

RNAse - Ribonuclease

rpm - rotaes por minuto

SDS - sodiumdodecyl sulfate (dodecil sulfato de sdio)

TBE - Tris-borato EDTA

TAE - Tris-acetato EDTA

UniFrac - Uniquefractionmetric

UNT - Unidade Nefelomtrica de Turbidez

UTI - Unidade de Tratamento Intensivo

X-GAL - 5-bromo-4-cloro-3-indoyl-beta-D-galactosdio

g - micrograma

L- microlitro

M - micromolar

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Pontos de coleta.................................................................................................32

Figura 2. Mapa do vetor de clonagem pGEM-T Easy......................................................36

Figura 3. rvore filogentica ...........................................................................................44

Figura 4. Anlise de Componentes Principais (PCA).......................................................45

Figura 5. Amplificao do gene nifH para Methanobrevibacter smithii..........................46

Figura 6. Curva padro do controle interno positivo (IPC)..............................................47

Figura 7. Curva padro do M. smithii...............................................................................48

Figura 8. Perfil de amplificao........................................................................................48

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Iniciadores e condies de PCR convencional ..................................................35

Tabela 2 Resultados dos parmetros fsico-qumicos........................................................42

Tabela 3 Resultado das anlises microbiolgicas..............................................................43

Tabela 4 Resultados de PCR convencional e PCR em tempo real....................................49

SUMRIO

1. INTRODUO .............................................................................................. 17 1.1 GUA ....................................................................................................................... 17

1.2 SISTEMA SANITRIO NO RIO DE JANEIRO .................................................... 18

1.3 CONTAMINAO HDRICA E SADE PBLICA ............................................ 19

1.4 BALNEABILIDADE ............................................................................................... 21

1.5 BIOINDICADORES DE POLUIO FECAL ....................................................... 22

1.6 RASTREAMENTO DE FONTES DE CONTAMINAO MICROBIANA ........ 23

1.7 DOMNIO Archaea .................................................................................................. 26

1.8 PCR EM TEMPO REAL (qPCR) ............................................................................ 28

1.9 RELAES DO MONITORAMENTO DA QUALIDADE DA GUA COM A

VIGILNCIA SANITRIA E A SADE PBLICA ........................................................ 30

2. OBJETIVO..31

3. METODOLOGIA...322

3.1 COLETA DAS AMOSTRAS.................................................................................322

3.2 PARMETROS FSICO-QUMICOS E MICROBIOLGICOS...........................33

3.3 CONSTRUO DAS BIBLIOTECAS GNICAS ................................................. 33

3.3.1 Extrao do DNA genmico................................................................................. 33 3.3.2 Amplificao do DNA pela PCR ......................................................................... 34

3.3.3 Clonagem dos produtos de PCR para as bibliotecas ............................................ 35 3.3.4 Transformao das clulas competentes atravs de eletroporao ....................... 36

3.3.5 Seleo dos clones aps transformao ................................................................ 37 3.3.6 Mini-preparao (extrao do DNA plasmidial) .................................................. 37 3.3.7 Sequenciamento dos clones .................................................................................. 38

3.4 CONSTRUO DA CURVA-PADRO PARA QUANTIFICAO

ABSOLUTA ......................................................................................................................... 40

3.4.1 Quantificao absoluta das amostras .................................................................... 41

4. RESULTADOS ............................................................................................... 42

4.1 DOSAGEM DOS PARMETROS FSICO-QUMICOS ....................................... 42

4.2 DOSAGEM DOS PARMETROS MICROBIOLGICOS ................................... 43

4.3 SEQUENCIAMENTO E ANLISE DAS BIBLIOTECAS .................................... 44

4.4 DETECO DE M. smithii PELA PCR CONVENCIONAL ................................. 46

4.5 DETECO E QUANTIFICAO DO GENE nifH POR qPCR .......................... 46

5. DISCUSSO ................................................................................................... 50

6. CONCLUSES .............................................................................................. 56

REFERNCIAS ..................................................................................................... 57

17

1. INTRODUO

1.1 GUA

Ao observar a grande superfcie ocupada pela gua na terra, tem-se a errnea impresso

de que representa uma fonte abundante e inesgotvel. A gua formou-se com o planeta, h mais

ou menos 3,8 bilhes de anos, e ao contrrio do que muitos pensam, um recurso esgotvel. A

gua encontra-se distribuda da seguinte forma: 95,5% gua salgada nos oceanos, 2,2% gua

doce nas calotas polares e geleiras, 2,3% gua doce acessvel. As guas acessveis vm sendo

utilizada de trs formas, uma parte para a agricultura (67%), outra para a indstria (23%) e outra

para o abastecimento pblico (10%), que compreende o uso domstico, com distribuio as

residncias, hospitais e escola, irrigao de parques e jardins, limpeza de ruas e logradouros,

combate a incndios, navegao e lazer, uso em estabelecimentos comerciais (MENDONA e

MOTTA, 2005).

De acordo com a Agncia Nacional de guas - ANA, a sia apresenta o maior

percentual de disponibilidade de gua em relao aos recursos mundiais seguidos das Amricas

do Sul, Norte e Central. A Groelndia encontra-se em primeiro lugar em relao oferta

mundial de gua com a participao de 10.767.857m por pessoa ao ano, seguidas pelo Alasca,

Guiana, Islndia e Suriname, j o Brasil encontra-se em 25 lugar com 45.314m (MENDONA

e MOTTA 2005).

A maior disponibilidade de gua pode no necessariamente garantir a efetiva

distribuio homognea para as populaes. A distribuio desigual dos recursos hdricos

contrasta com as diferenas populacionais, por exemplo, a sia o continente mais populoso,

concentra 59,8% dos habitantes e cerca de 31,6% da disponibilidade total de gua doce

superficial do planeta. Por outro lado, as Amricas contam com 13,6% da populao mundial e

41% da gua disponvel. Em relao s desigualdades intracontinentais, o Brasil possui 2,8%

da populao mundial e 12% da gua doce do planeta, mas 70% dessas guas esto na Bacia

Amaznica onde a densidade populacional a menor do pas, em contradio temos a regio

Nordeste que representa a regio mais rida e pobre do Brasil, onde vive cerca de 30% da

populao, e dispe somente 5% da gua doce, enquanto que j as regies Sul e Sudeste do

pas, onde vivem cerca de 60% da populao dispe de 12,5% de gua doce. Fatores como a

alta densidade populacional, a poluio, a agricultura, a indstria energtico-intensiva e o

desmatamento provocam crescente escassez na quantidade e consequentemente qualidade da

gua (MENDONA e MOTTA 2005).

18

Muito se sabe sobre a importncia da gua em relao sade e a vida em nosso planeta,

evidente a forte congruncia entre dados relacionados a indicadores de desigualdades sociais

e indicadores de acesso e de qualidade de gua. Tal fato, no constitui uma novidade da mesma

maneira que o reconhecimento decisivo do papel da gua no desencadeamento direto e at

indireto de uma diversidade de patologias e no condicionamento da mortalidade geral e em

especial, a infantil na grande parcela dos pases em desenvolvimento.

1.2 SISTEMA SANITRIO NO RIO DE JANEIRO

Atualmente, estima-se que 80% de todas as molstias e mais de um tero de bitos dos

pases em desenvolvimento sejam causados pela ingesto de gua contaminada, e, em mdia,

at um dcimo do tempo produtivo de cada pessoa perdido devido a doenas relacionadas

gua. Os esgotos e excrementos humanos so as causas mais relevantes dessa deteriorao da

qualidade da gua em pases em desenvolvimento (VEGA et al., 1996). Corpos hdricos que

recebem despejo inadequado de resduos podem apresentar uma variedade de compostos

txicos como pesticidas metais pesados, e uma diversidade de outras substncias ocasionando

consequncias srias (VEGA et al., 1996). A exposio humana seja ela ocupacional ou no,

gera efeitos nocivos sade que podem ir desde dores de cabea, nuseas, irritaes cutneas

at srias complicaes como a redues das funes neurolgicas e hepticas. Alguns

trabalhos tm evidenciado efeitos genotxicos sade, como cncer, defeitos congnitos e

anomalias reprodutivas tambm tm sido relatados, o aumento de incidncia de carcinomas

gastrointestinais, de bexiga, anomalias reprodutivas e malformaes congnitas tem sido

fortemente relacionado a populaes que vivem prximas a regies onde o despejo frequente

(HOUK, 1992).

No Brasil, o incio da presso ambiental ocorreu em 1960 com o surgimento dos grandes

empreendimentos hidreltricos, o aumento populacional em regies urbanas e a deteriorao da

qualidade da gua em regies prximas aos centros urbanos. Os inmeros projetos de ocupao

territorial, obras de engenharia e implantao de tecnologias ocasionaram graves conflitos em

relao ao uso dos recursos naturais, provocando impactos ambientais, econmicos e sociais

que passaram a fazer parte dos fatores limitantes do desenvolvimento urbano (TUCCI, 2001).

Quando se fala em fontes de abastecimento de gua, o Rio de Janeiro passou toda sua

histria realizando grandes esforos na luta pela gua e atualmente, a regio metropolitana do

Rio de Janeiro abastecida pelas guas originadas no rio Guandu, considerada a maior estao

de tratamento de gua de produo contnua do mundo, com vazo de 43 m3/s de acordo o

19

GuineesBook, mas em relao aos canais de esgotos tanto sanitrios quanto industriais, tem

como ponto comum os rios, canais e crregos que permeiam a cidade desembocando em

oceanos.

Em termos de coleta de esgotos e sistemas de drenagem, persiste na cidade do Rio de

Janeiro uma srie de estruturas e condies de operao que indicam o alto grau de interconexo

entre os sistemas de esgotamento sanitrio e de drenagem pluvial, o que contribui com a

degradao ambiental e a vulnerabilidade desses sistemas de saneamento (PCRJ, 2001).

Atualmente, sabe-se que a interconexo entre os sistemas de esgotos uma das principais fontes

de poluio dos corpos receptores nas cidades brasileiras, entretanto na maioria das vezes

negligenciada pelo poder pblico e pelas suas concessionrias (DIAS e ROSSO, 2011).

O estado do Rio de Janeiro composto por um sistema hdrico, que inclui

aproximadamente 250 rios, canais e complexos lagunares. A sua grandiosa costa litornea, com

cerca de 86 km encontra-se limitada ao leste pela baa de Guanabara, a oeste pela baa de

Sepetiba e ao sul pelo Oceano Atlntico, e composta por 72 praias (PCRJ, 2001). O sistema

de esgotamento da Cidade do Rio de Janeiro pode ser considerado um bom exemplo, pois a

vastido da escala dos sistemas de saneamento implantados, aliados a escassez de recursos

necessrios para sua operao e a consequente falta de manuteno adequada, alm das

dificuldades decorrentes das alternativas tecnolgicas adotadas, associadas s especificidades

da cidade, resultou em uma enorme complexidade e vulnerabilidade, na gesto das guas

urbanas. No decorrer do processo de urbanizao, inmeras dificuldades de operacionalizao

dos sistemas de esgotamento sanitrio e pluvial se acumularam e o despejo de esgoto sanitrio

se d quase que em totalidade, nos corpos hdricos da cidade e sob diversas formas. Devido s

restries tcnicas dos sistemas de esgotos, como a interconexo - situao indesejvel que

lana efluentes sanitrios no sistema de drenagem pluvial, gera por consequncia a

contaminao deste sistema e de seus corpos receptores alterando os ecossistemas e submetendo

as populaes a riscos epidemiolgicos (DIAS e ROSSO, 2011).

1.3 CONTAMINAO HDRICA E SADE PBLICA

Hoje muito comum a incorporao do termo sade dentro das definies de sade

ambiental. As relaes entre a sade pblica e a sade dos oceanos esto em destaque, e so

ocasionadas pelo crescimento populacional em regies costeiras, principalmente em regies

tropicais e subtropicais que com isso, aumentam a vulnerabilidade socioambiental decorrente

20

das relaes entre os desastres naturais que envolvem o oceano e a sade (SANDIFER et al.,

2004).

No ano de 2012, a populao mundial atingiu o nmero 7,2 bilhes e espera-se que em

2050 alcance um total de 9,6 milhes de pessoas, sendo os pases em desenvolvimento os

principais responsveis por este acrscimo (REGO FILHO, BRAGA e CURI, 2014). Nas

regies costeiras, os oceanos fornecem importantes fontes de protena, qualidade de vida,

recreao, alm de ser parte integral das atividades econmicas em diversas localidades,

entretanto, tambm pode ser fonte de vrios agentes infecciosos presentes em hospedeiros

marinhos, incluindo agentes bacterianos, virais e protozorios, resultam em doenas infecciosas

em humanos (DEWAILLY,2006).

Tratando-se de sade pblica, a contaminao de corpos dgua por material fecal, uma

das principais causas de doenas entricas veiculadas gua no mundo, sendo responsveis

pela morte de aproximadamente 2 milhes de crianas por ano (WHO, 2007). Atualmente, essa

situao tem se agravado devido contaminao hdrica frequente, por patgenos emergentes

como Giardia lamblia, Cryptosporidium, Escherichia coli O157:H7, entre outros. Alm da

contaminao por dejetos de origem humana que atualmente encontra-se bem documentada,

animais domsticos e agrcolas tambm apresentam e disseminam muitos patgenos, como

Campylobacter jejuni, Giardia spp., Salmonella e o Vrus da hepatite A. O risco de

contaminao a partir de patgenos presentes em fezes destes animais considerado em geral,

inferior em relao aos patgenos presentes em fezes humanas, e isso provavelmente seja

explicado devido ao fato de que alguns patgenos, por exemplo, vrus, so altamente especficos

em relao aos seus hospedeiros, entretanto so poucos os estudos que medem o risco de

infeces zoonticas por material fecal (DEWAILLY e KNAP 2006).

A exposio da populao, principalmente crianas e idosos ou pessoas com baixa

resistncia, a guas contaminadas, pode acarretar no desenvolvimento de doenas ou infeces

causadas por bactrias, vrus ou protozorios, causando vrios desfechos que vo desde uma

infeco assintomtica at a morte, dependendo da interao entre o patgeno e o hospedeiro.

A interao em geral, est relacionada a fatores como a infectividade do patgeno, ou seja, a

quantidade capaz de iniciar uma infeco e de caractersticas do hospedeiro, como imunidade,

sexo, estado nutricional, resposta imunolgica, modo de vida, condio socioeconmica,

histrico de doenas crnicas, bem como da natureza do patgeno (GERBA, 2000) e a

virulncia do micro-organismo. Tambm pode ocorrer o desenvolvimento de doenas crnicas

e agudas aps exposio a esses patgenos (WESTRELL, 2004).

21

De acordo com a Organizao Mundial da Sade, so relatados aproximadamente de 3

a 5 milhes de casos de clera no mundo, que resulta em aproximadamente 100.000 mortes por

ano. Pases africanos foram responsveis por quase todos os casos de clera notificados entre

2000 e 2009. Ainda em 2009, foram relatados 217.333 casos de clera na frica, o que

correspondeu maioria de todos os casos notificados mundialmente (OMS, 2011). A carga

global de febre tifoide tem sido de aproximadamente10-100 casos por 100.000 pessoas por ano

na sia, frica e Amrica latina. Entretanto, as regies centro-sul e sudeste da sia apresentam

nveis superiores a 100 casos por 100.000 pessoas (CRUMP, LUBY e MINTZ, 2004).

Dessa forma, a implantao e utilizao de indicadores de desempenho dos sistemas de

saneamento podem auxiliar na elaborao de ndices ecolgicos de eficincia para os

ecossistemas urbanos contribuindo para o monitoramento e controle ambiental, que so aes

indispensveis em qualquer conjunto de intervenes que visem sade ambiental (DIAS e

ROSSA, 2011).

1.4 BALNEABILIDADE

A balneabilidade caracterizada por um conjunto de medidas destinado avaliao do

risco de contaminao das guas, sendo definida como a medida das condies sanitrias das

guas destinadas recreao de contato primrio, sendo este entendido como um contato direto

e prolongado com a gua (natao, mergulho, esqui-aqutico, etc.) no qual, a possibilidade do

banhista ingerir quantidades apreciveis de gua elevada. De acordo com a Resoluo

N274/2000 do Conselho Nacional do Meio Ambiente (CONAMA), a avaliao da condio

de balneabilidade das praias feita atravs da medio das concentraes de um ou mais

organismos indicadores presentes nos resduos humanos ou de animais de sangue quente, sendo

os valores empregados na classificao do meio como prprio ou imprprio para

balneabilidade. Esta resoluo ainda determina que os micro-organismos indicadores de

poluio fecal sejam o grupo dos coliformes termotolerantes, Escherichia coli e enterococos

(BRASIL,2000). De acordo com o INEA (Instituto Estadual do Ambiente), no estado do Rio

de janeiro, esto sendo monitoradas aproximadamente, 120 praias abrangendo um total de 15

municpios. O monitoramento feito semanalmente em praias que variam de comportamento

durante o tempo, e mensalmente, em praias onde o comportamento apresenta-se estvel ao

longo do tempo. O nmero de estaes de amostragem pode variar em relao extenso da

praia, assim como a definio das estaes que est relacionada proximidade e o

distanciamento de fontes poluidoras. As amostras so coletadas a 15 cm da superfcie da gua,

22

na profundidade mdia de um metro e levadas ao laboratrio do INEA, onde sero analisadas

em relao presena de coliformes totais e E.coli, entretanto, tambm pode haver observaes

de campo, que caracterizada pela identificao visual, de fontes de poluio que possam

comprometer a qualidade das guas. Outras metodologias de avaliao tambm podem ser

implantadas, tais como tendncias de longo prazo e metodologias para anlises de sries

temporais, cujos objetivos visam, principalmente, acompanhar o comportamento das praias

quando da realizao de intervenes (INEA, 2012).

Para avaliao anual, de um modo amplo, o INEA utiliza as categorias tima e muito

boa, praias prprias, regular, m, pssima e imprprias para enquadrar as praias avaliadas. A

divulgao desses resultados feita por meio de boletins semanais (para as praias monitoradas

semanalmente) e encaminhados para a imprensa, alm disso, os dados elaborados e analisados

so publicados na forma de relatrios; que se encontram disponveis para consulta na Biblioteca

(INEA, 2012).

1.5 BIOINDICADORES DE POLUIO FECAL

Como a deteco de agentes patognicos em uma amostra de gua difcil em funo

da baixa concentrao e da diversidade destes organismos, recomenda-se a adoo de

organismos indicadores de contaminao fecal (DUARTE, 2011). Um indicador ideal de

contaminao fecal deve ser um micro-organismo no patognico capaz de ser detectado e

quantificado por meio de tcnicas simples e rpidas e de apresentar tambm, a capacidade de

sobreviver no meio ambiente, assim como, queles potencialmente patognicos (SCOTT et al.,

2002). A avaliao da qualidade de gua um componente essencial dos programas para a

proteo da sade humana de monitoramento. Indicadores microbiolgicos como coliformes

totais, coliformes termotolerantes e E. coli so os indicadores utilizados no monitoramento da

qualidade da gua, de acordo com a legislao vigente (BRASIL, 2005).

O grupo dos coliformes totais constitudo por grande grupo de bactrias isoladas a

partir de amostras de gua e de solos poludos ou no, bem como nas fezes de seres humanos e

de outros animais de sangue quente (MACEDO, 2005). Este grupo foi utilizado como indicador

de contaminao da gua no passado e ainda de acordo com Sperling (2007), em alguns locais,

ainda continuam sendo utilizados, muito embora bactrias de origem no fecal tambm faam

parte deste grupo. Segundo o autor, o grupo dos coliformes totais poderia ser classificado como

sendo constitudo por bactrias de origem ambiental pelo fato de tambm representarem o grupo

23

de organismos de vida livre. Por tal razo, no so considerados indicadores de contaminao

de origem fecal confiveis.

A avaliao de bactrias fecais realizada em temperatura mais elevada, objetivando a

supresso de bactrias de origem no fecal, por esta razo so denominadas de bactrias

termotolerantes (SPERLING, 2006). De acordo com a resoluo CONAMA 274/2000, os

coliformes termotolerantes so classificados como bactrias que pertencem ao grupo dos

coliformes totais caracterizadas por apresentar a enzima -galactosidade e por fermentar a

lactose com produo de gs em 24 horas a 44-45C em meios contendo sais biliares e outros

agentes tenso-ativos como propriedades inibidoras semelhantes. Esses organismos esto

presentes tanto em fezes humanas quanto de outros animais e tambm em solos, plantas ou

quaisquer efluentes contendo matria orgnica.

Dentro deste grupo encontra-se a E. coli das quais muitos pesquisadores sugerem sua

utilizao exclusiva como indicador de contaminao fecal, devido sua exclusividade em

relao origem e pela facilidade de diferenciao em relao aos outros membros deste grupo.

Dessa forma, a presena de coliformes termotolerantes em guas menos eficiente em relao

enumerao direta de E. coli, porm, muito mais significativa do que a presena de coliformes

totais (MACEDO, 2005).

1.6 RASTREAMENTO DE FONTES DE CONTAMINAO MICROBIANA

O conceito de indicador microbiolgico originalmente definido para avaliar a qualidade

da gua est baseado na presena ou ausncia de bactrias ou de grupos de bactrias indicadoras

em ambientes aquticos (MACEDO, 2005). Entretanto, esses indicadores apresentam

limitaes quando se trata de discriminar a origem da contaminao (fezes humanas, de animais

domsticos, silvestres, aves e outros), o que considerado um fator relevante na implementao

de medidas efetivas de gerenciamento e remediao de guas superficiais (MACEDO, 2005).

Outra limitao apresentada por esses indicadores a sua utilizao em ambientes tropicais,

pois esses microrganismos utilizados como indicadores possuem a capacidade de sobreviver

em sedimentos, podendo ser encontradas em reas distantes da atividade humana. Alm disso,

muitos mtodos de deteco esto sujeitos a resultados falsos positivos (HAZEN e

TORANZOS, 1990). Hardina e Fujioka (1991) demonstraram que no Hava, coliformes

termotolerantes depositados em solos foram capazes de sobreviver e serem transportados para

corpos de gua atravs de guas subterrneas. Assim, a sua presena na coluna de gua poderia

no necessariamente estar associada a contaminao fecal recente. Alm disso, estudos

24

laboratoriais tm demonstrado que os coliformes apresentam perodos de sobrevivncia

superiores a trs anos em ambientes marinhos, alm de diferentes taxas de sobrevivncia o que

levantou questionamentos na interpretao dos resultados de avaliaes da qualidade da gua

(BYAMUKAMA et al; 2000).

No incio dos anos 80, a Agncia de Proteo Ambiental dos Estados Unidos (United

States Environmental Protection Agency - USEPA) recomendou o uso de Entecococcus spp.

para o monitoramento da qualidade das guas marinhas com base em pesquisas que indicavam

a superioridade desses organismos quando comparado aos coliformes, uma vez que eles

estariam fortemente associados somente ao material fecal humano e seriam mais resistentes a

ambientes salinos (USEPA, 1986). Por outro lado, apesar dessas vantagens que favorecem seu

uso como indicador, pesquisas vm comprovando que esse grupo tambm apresenta limitaes

como a sobrevivncia em solos tropicais, presenas em outros reservatrios, alm da baixa

relao com organismos patognicos como Salmonella spp., Campylobacter spp.,

Cryptosporidium e Giardia spp., enterovrus humanos incluindo adenovrus e colfagos. Dessa

forma, apresentam as mesmas limitaes dos representantes dos coliformes nas anlises de

qualidade da gua apresentando tambm resultados questionveis (WESTRELL, 2004).

Nas ltimas dcadas, devido aos questionamentos levantados em relao a eficcia dos

indicadores microbianos de poluio hdrica estabelecidos em legislao, metodologias de

Rastreamento de Fonte Microbiana (RFM) vem ganhando espao, pois tais metodologias

tornam possvel a discriminao entre fontes de poluio fecal humanas de fontes fecais de

outros animais (SANTO DOMINGO et al., 2007). Os mtodos microbiolgicos de

rastreamento de fonte microbiana esto baseados na premissa de que micro-organismos

selecionam diferentes sistemas intestinais, devido a critrios como as diferenas na dieta e no

sistema digestivo de hospedeiros, e tal metodologia no se restringe somente a avaliao de

contaminao fecal, mas tambm pode ser aplicada em outras linhas de pesquisa, como

segurana alimentar e microbiologia agrcola e veterinria (SANTO DOMINGO et al., 2007).

Em pases desenvolvidos, as fontes de contaminao no caracterizadas so as maiores

responsveis pela poluio fecal dos recursos hdricos (SANTO DOMINGO et al., 2007), nos

Estados Unidos, a RFM foi incorporada tornando-se prioridade em virtude do requerimento

federal de desenvolvimento e execuo da quantidade mxima de poluente (TMDL - total

maximum daily load) que um determinado corpo hdrico pode receber, conservando os padres

de qualidade j estabelecidos. Alm disso, a TMDL tambm utilizada para avaliar a poluio

de fontes pontuais oriundas de estaes de tratamento de esgoto ou efluentes industriais, que j

apresenta legislaes especficas bem definidas e fontes no pontuais, provenientes da

25

agricultura, reflorestamento, animais silvestres e escoamento dos solos urbanos, que so de

complicado controle e responsveis na maioria dos casos, por alteraes na qualidade da gua

(SANTO DOMINGO et al., 2007).

As metodologias de RFM em geral, podem ser divididas em duas tcnicas que so as

tcnicas dependentes de cultivo e as tcnicas independentes de cultivo. Nas tcnicas

dependentes de cultivo h a necessidade de se realizar uma biblioteca de origem ou um banco

de dados do hospedeiro que caracterizado como um conjunto de isolados bacterianos, ou de

vrus de amostras de fezes padres de origem conhecida para ser utilizada como fonte de

discriminao e essa tcnica baseia-se em uma comparao entre os perfis das bibliotecas do

banco de dados em relao aos isolados ambientais. A maior parcela das tcnicas dependente

de biblioteca necessita de cultivo acrescentando assim cada vez mais isolados ambientais como

padro para identificao e rastreamento (STEWART, SANTO DOMINGO e WADE, 2007).

As tcnicas independentes de cultura esto baseadas na segmentao de marcadores genticos

de acordo com a individualidade microbiana que cada sistema gastrointestinal possui,

influenciada por vrios fatores, incluindo a anatomia, fisiologia, alimentao servindo tanto

para humanos quanto para outros animais. Esta metodologia inclui testes qumicos como

presena de cafena, esteris e estanis fecais (SUPRIHATIN et al , 2003), pesticidas e

policclicos (STANDLEY, KARPLAN e SMITH, 2000) e testes moleculares como a reao

em cadeia de polimerase (Polymerase Chain Reaction -PCR) que utiliza um grupo ou um nico

gene como marcador molecular para discriminao de hospedeiros especficos agrupando

vantagens como especificidade, sensibilidade, rapidez, transportabilidade e principalmente

economia (SIMPSON, SANTO DOMINGO e REASOVER, 2002).

No Brasil, as pesquisas na rea de RFM ainda so escassas, dessa forma, o

desenvolvimento e seleo de novos bioindicadores utilizando metodologias mais sensveis

capazes de discriminar as diferentes fontes responsveis pela contaminao fecal em corpos

hdricos extremamente relevante a fim de assegurar a qualidades das guas e evitar

consequentemente danos ao meio ambiente e sade da populao (FIELD e SAMADPOUR,

2004).

26

1.7 DOMNIO Archaea

O domnio Archaea dividido em quatro filos: Crenarchaeota, que contm as arqueas

hipertermfilas redutoras de enxofre; Euryarchaeota, que compreende uma grande diversidade

de organismos, incluindo as espcies metanognicas, as halfilicas extremas e espcies

hipertermfilas; Korarchaeota, conhecida somente a partir de sequncias genticas de RNAr

16S obtidas de amostras de fontes hidrotermais; e Thaumarchaeota, um filo proposto

recentemente para o domnio Archaea (BROCHIER-ARMANET et al., 2008). composto por

organismos mesoflicos e desenvolve papel importante nos ciclos biogeoqumicos, como o ciclo

do nitrognio. O filo foi proposto baseado em dados filogenticos, como sequncia do gene rrs

e a presena de uma forma de topoisomerase tipo I, que previamente s era encontrada

em eucariotos (CARDOSO et al., 2003; AUCHTUNG et al., 2006;).

O filo Euryarchaeota apresenta organismos com fisiologias bem diferentes. Neste filo

so encontrados organismos metanognicos, halfilos, redutores de sulfato e hipertermfilos.

As espcies metanognicas so organismos obrigatoriamente anaerbios e libera gs metano

(CH4) como resduo metablico. So encontradas em ambientes com ausncia de oxignio e

abundncia de matria orgnica, como brejos, audes, lagos, sedimentos marinhos e rmen de

bovinos. Elas retiram hidrognio e gs carbnico desses ambientes e os utilizam em seu

metabolismo. Vivem como simbiontes de uma grande variedade de protozorios tambm

anaerbicos, convertendo produtos finais de fermentao em gs metano ou CO2. So de

grande importncia no ambiente no qual vivem pela alta eficincia de sua enzima hidrogenase,

que mantendo uma baixa presso parcial H2 para que a metanognese ocorra permite que

os demais organismos fermentadores faam reoxidao do NADH o que corresponde a um

maior rendimento de ATP e um aumento de biomassa. Esse fenmeno conhecido como

transferncia de hidrognio interespecfica (CARDOSO et al., 2003). Dentre os halfilos,

existem representantes extremos que habitam lagos ricos em carbonato de sdio, ambientes

caracterizados por grandes concentraes de sal e extremos de pH.

O gnero Methanobrevibacter pertence a ordem Methanobacteriales dentro do domnio

Archaea. Este gnero possui 15 espcies conhecidas que habitam o trato intestinal animal,

plantas em decomposio e lodo anaerbio de estaes de tratamento de esgoto. As espcies de

Methanobrevibacter incluem M. ruminantium (ruminantes); M. arboriphilus (plantas em

decomposio); M. cuticularis, M. curvatus e M. filiformis (intestino de cupim); M. oralis

(cavidade bucal humana); M. gottschalkii e M. thauerii (intestino de cavalo e porco); M. woesei

(intestino de rato e ganso); M. acididurans e M. wolinii (intestino de carneiro); M. boviskoreani

http://pt.wikipedia.org/wiki/Archaeahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Ciclo_do_nitrog%C3%AAniohttp://pt.wikipedia.org/wiki/Ciclo_do_nitrog%C3%AAniohttp://pt.wikipedia.org/wiki/Topoisomerasehttp://pt.wikipedia.org/wiki/Eucarionte

27

e M. millerae (rumem bovino); M. olleyae (rumem ovino) e M. Smithii (intestino humano) (LAI

et al., 2004). Estudos comprovam que poucas espcies ocorrem em mais de um organismo,

como M. ruminantium que tem sido encontrado em outros ruminantes, alm de bovinos e M.

gottschalkii e M. thaueri que vem sendo encontrados em cavalos e porcos. A espcie M. smithii

a nica espcie conhecida que coloniza especificamente o intestino grosso e o trato vaginal

humano e por esse motivo pode ser utilizado como indicador de poluio fecal humana no

ambiente (LAI et al. 2004).

H aproximadamente 40 anos, Nottingham e Hungate (1968), aps observaes

isolaram um micro-organismo identificado como M. smithii a partir de fezes humanas,

utilizando meio de cultura no seletivo e uma atmosfera anaerbica composta por 80% de H2

e 20% de CO2. Alguns anos depois, Miller e colaboradores (1986) tambm descreveram o

isolamento de M. smithii em fezes de adultos saudveis, utilizando culturas anaerbias

enriquecidas com atmosfera anaerbia, e em 1985, esses mesmos pesquisadores encontraram

uma segunda metanognica tambm isolada de fezes humanas, denominada Methanosphaera

stadtmanae. Mais recentemente em 1994, Ferrari e colaboradores isolaram uma terceira

metanognica, M. oralis da placa subgengival de indivduos saudveis (FERRARI et al., 1994).

A espcie M. smithii apresenta-se sob a forma de cocobacilos, possui temperatura e faixa

de pH timos de crescimento de 38C e 6.9-7.4, respectivamente. Ela capaz de colonizar o

intestino grosso e o trato vaginal humano (LAI et al., 2004) e segundo Ufnar e colaboradores

(2006), M. smithii encontrado no trato gastrointestinal de aproximadamente um tero dos

indivduos que residem nos Estados Unidos e Reino Unido, podendo compreender at 10% de

todos os anaerbios encontrados no intestino de adultos saudveis e altamente prevalente em

esgoto misto. Entretanto, estudos realizados demonstraram atravs de otimizaes no protocolo

de extrao de DNA de fezes humanas, os resultados obtidos so mais satisfatrios, onde a

todos os indivduos testados apresentaram arqueas em seu organismo. Dentre os 650 indivduos

testados foi possvel detectar uma elevada prevalncia de M. smithii (95,5%) e M. stadtmanae

(29,4%) no intestino humano (DRIDI, RAOULT D e DRANCOURT, 2011)

Pensando nisso, uma PCR convencional foi desenvolvida para detectar a presena de

M. smithii atravs do gene nifH, uma regio no funcional da enzima nitrogenase, exclusivo de

arqueas metanognicas (OHKUMA et al, 1999; UFNAR et al., 2006). Alm disso, o gene nifH

apresenta diferenas nas sequncias de arqueas metanognicas, o que o torna um bom alvo para

a discriminao filogentica das espcies. Em seu trabalho, Ufnar et al. (2006) relatou ter

encontrado um fragmento de aproximadamente 222 pb em 29% (20/70) das amostras fecais de

humanos e em 93% (25/27) de amostras de esgoto analisadas. Devido sua especificidade, em

28

relao ao hospedeiro humano, o M. smithii foi considerado um alvo promissor como indicador

de poluio fecal humana no meio ambiente.

1.8 PCR EM TEMPO REAL (qPCR)

indiscutvel que as tcnicas de biologia molecular foram um dos maiores passos

dentro da rea de pesquisas no sculo XX. O desenvolvimento da tcnica de PCR proporcionou

grandes avanos, como o sequenciamento de genomas a expresso de genes em sistemas

recombinantes, o estudo de gentica molecular, a determinao rpida da paternidade e o

diagnstico rpido de doenas infecciosas. Uma inovao tecnolgica a partir da PCR vem

ganhando fora dentro dos laboratrios de pesquisa e clnicas. Essa tcnica chamada de PCR

em tempo real permite o acompanhamento da reao e a apresentao dos resultados de forma

mais precisa e rpida, em relao PCR que apresenta somente resultados qualitativos

(BRUCE, 1999).

Para que ocorra a amplificao de DNA a partir da tcnica da PCR convencional um

conjunto de fatores necessrio, como a ausncia de inibidores, a quantidade de DNA, o estado

de degradao do DNA, entre outros. Uma limitao da reao PCR tradicional est na

caracterstica qualitativa desta tcnica. Dessa forma, para tornar possvel o monitoramento

simultneo da qualidade e tambm da quantidade do DNA amplificado, desenvolveu-se uma

tcnica variante chamada de PCR em tempo real. Esta tcnica descrita por Higuchi e

colaboradores (1993) consistia em um sistema em que uma cmera de vdeo era acoplada a fim

de monitorar a reao de PCR em todos os ciclos, dessa forma, era possvel detectar o aumento

de fluorescncia durante a reao que ocorria a partir da ligao do brometo de etdio s

molculas de DNA de dupla fita recm-sintetizadas.

A tcnica de PCR em tempo real semelhante tcnica de PCR convencional, sua

principal diferena est na possibilidade de quantificao do DNA amplificado em cada ciclo

em tempo real. Nessa tcnica, as fases de amplificao, deteco e quantificao so

automatizadas, simultneas e em tempo real (HEID et al., 1996). O sucesso da tcnica

possibilitou seu aperfeioamento, como por exemplo, o desenvolvimento de sondas de

oligonucleotdeos e a atividade exonuclease 5 -3 da Taq DNA. Atualmente, existe uma grande

variedade de plataformas de instrumentao, entretanto, a maior parte composta por um

termociclador com um sistema ptico que capta a excitao e recolhe a emisso da

fluorescncia, e um computador com software prprio para o recolhimento e anlises dos dados

no final da reao (MACKAY et al., 2007).

29

A tcnica de PCR em tempo real segue o princpio geral da PCR convencional, dessa

maneira, tambm apresenta as trs fases caractersticas que so: a fase de crescimento

exponencial, fase de crescimento linear e fase estacionria. Os compostos fluorescentes que so

adicionados na reao geram sinais que so proporcionais quantidade de produto que foi

amplificado durante as fases e que podem ser demonstrados graficamente. A fase exponencial

de crescimento a melhor fase para estudar a reao, pois possvel registrar a eficincia em

sua fase mais elevada, uma vez que a relao entre a quantidade de produto e do input de DNA

mais consistente. Dessa forma, todos os dados captados de fluorescncia so em geral,

recolhidos desde o incio do processo de amplificao (PELT-VERKUIL, VAN-BELKUM e

HAYS, 2008).

A anlise dos produtos amplificados pela PCR em tempo real realizada atravs da

utilizao de compostos fluorescentes, e uma variedade de protocolos tem sido desenvolvidos

para permitir a deteco dos produtos da PCR, ao longo da amplificao. Os mtodos qumicos

de fluorescncia utilizados para PCR em tempo real so hoje em dia diversificados, recorrendo

todos eles a um composto fluorescente cujo sinal seja passvel de ser detectado por um laser do

equipamento ao longo do processo. De acordo com a literatura, estes mtodos agrupam-se de

acordo com o tipo do composto fluorescente e respectivo comportamento durante o processo.

Atualmente, existem dois grandes grupos de compostos que so os dos corantes intercalantes e

das sondas de sequncia especfica (MACKAY et al., 2007; PELT-VERKUIL, VAN-

BELKUM e HAYS, 2008).

Os corantes intercalantes so fluorocromos que no apresentam especificidade em

relao a uma sequncia particular de DNA, dessa forma, se intercalam na dupla cadeia de

qualquer produto da PCR permitindo a sua deteco (OLIVEIRA, 2009). Entretanto, a

sintetizao eficiente dos iniciadores permite um aumento na especificidade da deteco e

quantificao por este mtodo. Neste campo, a primeira tecnologia desenvolvida foi patenteada

pela Molecular Probes, Inc, em 1990, sendo denominada de SYBR Green. Posteriormente

foram desenvolvidas outras molculas: a LCGreen Plus (Idaho Technology) e a EvaGreen

(BiotiumInc), (OLIVEIRA, 2009).

As sondas de sequncia especfica so oligonucleotdeos que possuem um fluorocromo

especifico para uma dada sequncia de DNA tornando-a capaz de detectar somente a dada

sequncia. Esta tecnologia permite que o resultado possa ser monitorado em tempo real, atravs

do computador da plataforma de instrumentao. Atualmente, as sondas utilizadas na PCR, em

tempo real, variam em funo do fabricante e da tecnologia aplicada; as mais utilizadas so as

sondas TaqMan (5 exonuclease), fluorescente resonanceenergy transfer (FRET), Molecular

30

Beacons e Scorpion, sendo que cada tipo de sonda promove a deteco dos fragmentos

amplificados de forma diferente (GLYNN et al., 2006).

1.9 RELAES DO MONITORAMENTO DA QUALIDADE DA GUA COM A

VIGILNCIA SANITRIA E A SADE PBLICA

De acordo com a Lei 8.080/90 e com a CARTILHA DE VIGILNCIA SANITRIA

(2002) entende-se por Vigilncia Sanitria um conjunto de aes capazes de eliminar, diminuir

ou prevenir riscos sade e de intervir nos problemas sanitrios decorrentes do meio ambiente.

Dentre essas aes, destacamos aquelas voltadas sade ambiental e em continuidade a isto,

sua interferncia na preservao do meio ambiente no tocante manuteno da qualidade dos

recursos hdricos. As doenas veiculadas atravs da gua tm sido apontadas constantemente

como um problema nos diversos tempos histricos da humanidade. A destinao dos resduos

produzidos pelas populaes humanas, como por exemplo, os resduos fecais sempre estiveram

presentes entre os problemas de sade pblica (BARCELLOS e QUITRIO, 2006).

Em relao ao controle da qualidade das guas de recreao foram criados instrumentos

para avaliar a evoluo da qualidade das guas, em relao aos nveis estabelecidos para a

balneabilidade, de acordo com a Resoluo CONAMA n 274, de 29 de novembro de 2000,

que classifica os sistemas hdricos em 13 classes de acordo com o tipo e usos de suas guas.

Apesar de essa definio apresentar limitaes, considerado um ponto de referncia para a

fiscalizao e gerenciamento dos recursos hdricos (PEREIRA, 2004). Os componentes dos

sistemas de abastecimento de gua (tipo de manancial, estao de tratamento e pontos de

amostragem) esto sendo cadastrados pelo Sistema de Informao do Programa de Vigilncia

da Qualidade da gua para Consumo Humano (SISAGUA), de responsabilidade da Secretaria

de Vigilncia em Sade do Ministrio da Sade. O SISAGUA permite a recuperao de dados

sobre o abastecimento de gua de modo que se produzam periodicamente relatrios sobre o

funcionamento do sistema e a qualidade da gua, incluindo as chamadas solues alternativas

de abastecimento. A Agncia Nacional de guas (ANA) mantm um programa de

monitoramento da qualidade da gua com postos de monitoramento situados nos maiores rios

do Brasil, o que permite a utilizao dessas informaes em um sistema integrado. O

desenvolvimento de um sistema para a determinao da qualidade da gua atravs da deteco

e monitoramento de contaminao fecal animal e humana certamente ir colaborar para o

aprimoramento dos servios de vigilncia ambiental e epidemiolgica, que interferem na sade

da populao.

31

2. OBJETIVOS

GERAL

O desenvolver de um sistema inovador para a determinao da qualidade da gua atravs da

deteco e monitoramento de contaminao fecal humana de guas de recreao costeira no

Estado do Rio de Janeiro utilizando o biomarcador molecular hospedeiro especfico para

Methanobrevibacter smithii.

ESPECFICOS

Avaliar os parmetros fsico-qumicos nas amostras de guas de recreao costeira

Detectar e determinar as concentraes de coliformes totais e Escherichia coli

Caracterizar as comunidades Methanobrevibacter spp. por meio de bibliotecas do gene rrs

do 16S rRNA

Detectar e quantificar o gene nifH de Methanobrevibacter smithii pela qPCR

32

3. METODOLOGIA

3.1 COLETA DAS AMOSTRAS

Foram selecionados 13 pontos de coleta de guas de recreao costeiras no estado do Rio

de Janeiro (Figura 1), sendo 10 no municpio do Rio de Janeiro, 02 em Araruama, 01 em Niteri.

Figura 1. Pontos de coleta: (1) Prainha, RJ (2304'08.97"S,43.50'57.77"W), (2) Prainha, lngua negra,

RJ (2304'08.97"S,43.50'57.77"W), (3) Praia Leblon, RJ (2298'75.13"S,4322'21.1"W), (4) Canal

Leblon, RJ (22.98'68.32"S,43.21'54.74"W), (5) Praia de Copacabana, RJ (2258'31.2"S

4311'12.6"W), (6) Piscino de Ramos, RJ (2250'22.8"S 4314'59.9"W), (7) Praia So bento, RJ

(2282'31.62"S,4318'97.7"W), (8) Praia da Bica, RJ (2281'93.44"S,-4320'05.42"W), (9) Praia da

Engenhoca, RJ (2282'13.22"S,4317'05.87"W), (10) Praia da Guanabara, RJ

(2279'07.42"S,4316'50.29"W), (11) Praia So Francisco, Niteri (2292'67.77"S,4310'42.79"W),

(12) Praia Seca, Araruama (2288'81.95"S,4234'00.43"W), (13) Praia da Pontinha, Araruama

(2293'94.24"S,4228'16.78"W).

Foram coletadas duas alquotas de 2,5 litros de guas superficiais totalizando 5 litros de

cada praia selecionada neste estudo. Um litro foi reservado para realizao das anlises fsico-

qumicas e microbiolgicas. Os outros quatro litros foram filtrados, imediatamente aps a

coleta, em uma unidade filtradora Sterivex-GS de 0,22m, com auxlio de uma bomba

peristltica com fluxo de 80mL por min. Aps a filtragem, os filtros foram lavados com 1mL

de tampo fosfato-salino (Phosphate Buffered Saline PBS), homogeneizados, transferidos

para microtubos e conservados a -20C para posterior extrao de DNA.

33

3.2 PARMETROS FSICO-QUMICOS E MICROBIOLGICOS

Foram analisados os seguintes parmetros fsico-qumicos das amostras: temperatura,

pH, condutividade, oxignio dissolvido (OD), turbidez e salinidade. As dosagens foram

realizadas atravs do equipamento Water Quality Checker U-10 (HORIBA). A determinao

do nmero mais provvel (NMP) de coliformes totais e E. coli foi realizada atravs do mtodo

do substrato definido (COLILERT, IDEXX), conforme protocolo descrito em Standard

Methods for the Examination of Water and Wastewater (APHA, AWWA & WEF 2012).

3.3 CONSTRUO DAS BIBLIOTECAS GNICAS

3.3.1 Extrao do DNA genmico

A tcnica utilizada para a extrao do DNA foi uma verso modificada de protocolos

anteriormente descritos (OGRAM et al., 1987; GROBOKOPF, JANSSEN, e LIESACK, 1998).

Os microtubos contendo os pellets das amostras foram ressuspendidos em 1mL de PBS,

centrifugados a 5000 rpm por 5 minutos e o sobrenadante desprezado (2 vezes). O pellet foi

ento ressuspenso novamente em 1mL de PBS e submetido ao choque trmico freeze-thaw: -

70C por 2 minutos; 65C por 2 minutos (3 vezes). Posteriormente, foram acrescentados 125L

de lisozima (5mg/ml) e incubado a 37C por 2 horas. Seguindo, foi acrescentado SDS 2%,

homogeneizado e incubado a 60c durante 10 minutos. Foram acrescidos aproximadamente

300g de Glass bead (0.1 mm-vidro ou zircone) e colocado no aparelho mini-beadbeater

(Biospec Products) por 80 segundos velocidade mxima (3 vezes) e centrifugado a 13000 rpm

por 10 minutos e recolhido o sobrenadante. O sobrenadante foi recolhido para novos microtubos

de 2mL e foram acrescentados 150 L de soluo CTAB/NaCl (10% CTAB/0,7M NaCl). As

amostras foram homogeneizadas em vortex e incubadas 65C por 30 min e posteriormente

armazenadas em freezer a -20C overnight. Em seguida foram acrescidos de 80 L de PBS com

1,5% BSA e 700 L de fenol saturado com TE (pH = 7,5), sendo gentilmente misturados por

10 min e posteriormente centrifugadas a 8.000 rpm por 10 min. Aps constatao da lise celular,

com a formao de 3 fases, o sobrenadante foi recolhido para um novo tubo e foram

acrescentados 800 L de clorofrmio/isoamlico (24:1), agitando manualmente por 10 min. As

amostras foram centrifugadas a 13.000 rpm por 10 min a 10C. Foram acrescentados 250 L

de acetato de amnio (3 M) e as amostras foram colocadas no gelo por 15 min. As amostras

foram centrifugadas a 10.000 rpm por 30 min a 4C. O sobrenadante foi recolhido para novo

tubo e foram acrescentados 900 L de isopropanol, agitando manualmente e incubando as

34

amostras a -20C overnight. As amostras foram centrifugadas a 10.000 rpm por 20 min a 4C.

O sobrenadante foi descartado e foram acrescentados 800 L de etanol a 70 %, para lavagem

do pellet por inverso. As amostras foram centrifugadas a 13.000 rpm por 10 min. O

sobrenadante foi descartado e as amostras foram deixadas secando de 10 a 30 min. As amostras

foram suspensas em gua ultrapura Gibco (DNase&RNase-free, INVITROGEN). A

purificao do DNA foi realizada com Kit DNeasy Blood&Tissue (QIAGEN), de acordo com

protocolo descrito no manual do fabricante. Em seguida o DNA foi quantificado em

equipamento Qubit 2.0 Fluorometer (INVITROGEN) conforme o manual do fabricante.

Foi realizada eletroforese em gel de agarose aps a extrao e purificao do DNA para

verificar a integridade do DNA genmico. O gel foi preparado com 1% de agarose (SIGMA-

ALDRICH) a 70 volts por 50 minutos em tampo Tris-Acetato-EDTA 1X (TAE). Foi

submetida tambm corrida eletrofortica, o padro de peso molecular (100 pb DNA ladder).

A colorao do gel foi realizada com soluo de brometo de etdio (0,3 ng/mL) e analisada

atravs do sistema de vdeo documentao Image Quant 300 (GE Healthcare).

3.3.2 Amplificao do DNA pela PCR

A mistura para a PCR totalizou o volume de 50 L, contendo 0,5 M de cada iniciador

(Tabela 1). Os genes alvo, sequncias dos iniciadores e as condies esto descritos na

respectiva tabela. Tambm compem a mistura: soluo tampo 1X (20 mM Tris-HCl; 50 mM

de cloreto de potssio (KCl)); 1,5 a 2,0 mM de cloreto de magnsio (MgCl2); 0,2 mM de cada

desoxiribonucleotdeo trifosfato (dNTPs dATP, dCTP, dGTP e dTTP); 2,5 U de Taq DNA

Polimerase Platinum (Life Technology); 5% de dimetilsulfxido (DMSO); aproximadamente

25 ng do DNA da amostra e gua Gibco completando o volume. A amplificao foi realizada

em termociclador Mastercycler EP (EPPENDORF). Como controle da reao, para avaliar a

ausncia de DNA contaminante na mistura, foi feita a substituio do DNA da amostra por 5

L de gua Gibco. Como controle positivo da reao, foram adicionados 5 L de DNA

referncia de Methanobrevibacter smithii (DSM 11975), que foram fornecidos pela Coleo

Alem de Microrganismos e culturas de clulas (DSMZ - Deutsche Sammlung von

Mikroorganismenund Zellkulturen) e como controle negativo, foi utilizada a cepa de Klebsiella

pneumoniae (ATCC BAA-1706).

Aps a PCR, a eletroforese foi realizada com a finalidade de observar os produtos

gerados na amplificao. O gel foi preparado com 1% de agarose (SIGMA-ALDRICH) a 70

35

volts por 50 minutos em tampo Tris-Acetato-EDTA 1X (TAE). A colorao do gel foi

realizada com soluo de brometo de etdio (0,3 ng/mL). O primeiro poo foi reservado para a

adio do padro de peso molecular (100 bp DNA Ladder, INVITROGEN). A anlise foi

realizada no equipamento de vdeo documentao Image Quant 300 (GE). Aps a confirmao

da amplificao, os produtos foram purificados utilizando kit QIAquick PCR Purification

(QIAGEN), de acordo com o manual do fabricante e quantificado em pelo equipamento Qubit

2.0 Fluorometer (INVITROGEN) tambm conforme as especificaes do fabricante.

Tabela 1. Iniciadores e condies de PCR convencional

Iniciadores /Sequncia (5 -3) Programa Alvo/ Produto Referncia

MET105f

TGGGAAACTGGGGATAATACTG

MET386r

AATGAAAAGCCATCCCGTTAAG

95C 5min.

92C 1min.

55C 35x 30 s.

72C 1min.

72C 6min.

16S rRNA

Methanobrevibacter

spp.

282 bp

UFNAR et al, 2006

Mnif342F

AACAGAAAACCCAGTGAAGA

Mnif363R

GACGTAAAGGCACTGAAAAACC

95C 5min.

92C 1min.

58C 45x 30s.

72C 1min.

72C 6min.

nifH/ M. Smithii

222bp

UFNAR et al, 2005

3.3.3 Clonagem dos produtos de PCR para as bibliotecas

Os produtos de PCR purificados obtidos a partir da amplificao do gene 16S rRNA

para Methanobrevibacter dos 13 ambientes coletados foram ligados ao vetor de clonagem

PGEM-T Easy (Promega) (figura2) com T4 DNA ligase de acordo com as instrues do

fabricante. Os produtos foram clonados utilizando o kit comercial pGEM-T Easy Vector

System I (Promega). A mistura de cada reao apresentou um total de 11 L, composta por

50ng de vetor pGEM-T, produto de PCR (aproximadamente 20ng de DNA), 3 unidades de

enzima T4 DNA ligase e tampo de reao (60mM Tris-HCI pH7,8, 20 mM MgCl2, 20 mM

DTT, 2Mm ATP, 10% polietilenoglicol).

Antes de realizar as transformaes, todas as reaes de ligao foram dialisadas. O mix

de reao acondicionado em microtubo foi colocado em um beker com gua corrente, onde

permaneceu por 2 horas em temperatura ambiente. Decorridas s 2 horas, os microtubos foram

incubados a 4C overnight. No dia seguinte, todo o volume das ligaes foi transferido para

36

membranas (Milipore 0,025m, Type VS), onde ficaram em contato com gua destilada estril

por aproximadamente 2 horas.

Figura 2: Mapa do vetor de clonagem pGEM-T Easy (Promega).

3.3.4 Transformao das clulas competentes atravs de eletroporao

Foi adicionada em uma cubeta de eletroporao de 1 mm (BioRad) previamente

resfriada, 5 l do produto da ligao dialisado com 45L de clulas competentes (E. coli,

DH10B). A eletroporao foi realizada em aparelho Gene PulserXcellTM (BioRad) nas

seguintes condies: 1,8 Kv, 200 25 F. Em seguida, foi acrescentado 1mL de meio LB na

cubeta, e transferido para tubos tipo falcon que ficaram em estufa sob agitao a 37C durante

1 hora. Aps tempo de recuperao, 200 mL da mistura foram plaqueadas em meio LB contendo

150 g/mL de ampicilina, 200 L de X-GAL (20 mg/mL) e 30 L de IPTG (1M) e incubadas

overnight em estufa a 37C. (Esse procedimento foi realizado para todos os pontos coletados).

37

3.3.5 Seleo dos clones aps transformao

As placas que foram retiradas da estufa foram analisadas. As colnias azuis foram

descartadas enquanto as colnias brancas (transformantes) foram coletadas aleatoriamente com

o auxlio de palitos de madeira estreis. Os clones foram distribudos em microplacas

DeepWell de 96 poos contendo 1mL de meio de cultivo CircleGrown (CG) com ampicilina

(100 p/mL) e 12% de glicerol. As placas foram ento seladas por adesivos furados com o

auxlio de uma agulha em cada poo correspondente para permitir a aerao e incubadas durante

24horas em um saker a 37C. Aps incubao, as bibliotecas ficaram armazenadas a -70C

(CLEMENTINO et al.; 2007).

3.3.6 Mini-preparao (extrao do DNA plasmidial)

As placas DeepWell foram descongeladas e centrifugadas (Excelsa 3 modelo 280

FANEM ) a 2000 rpm durante 20 minutos. O adesivo foi removido e o sobrenadante

desprezado tornado possvel observao do pellet formado. Depois, as placas foram colocadas

invertidas sobre o papel toalha, a fim de absorver o excesso de meio, por aproximadamente 1

minuto. Foram adicionados, em cada poo, 200 mL de GET (glicose anidra 0,92%, EDTA 0,5M

pH 8, Tris-HCI (1M, pH7.4) para lavar o pellet. As placas foram agitadas vigorosamente at

que todas as clulas ficassem ressuspendidas de forma homognea. Centrifugou-se por 16

minutos a 2000rpm. O sobrenadante foi desprezado, e adicionado 80 L em cada poo de um

mix composto por 19,8 mL de GET e 200 L de RNAse (40 mg/mL). As placas foram seladas

e agitadas em vortex por 2 minutos para ressuspender o pellet. Aps, as placas permaneceram

em temperatura ambiente por 20 minutos e depois foi adicionado uma soluo de lise (NaOH

0,2+ SDS1%) nos poos. As placas foram seladas e invertidas 10 vezes, e aps, adicionou-se

nos poos 100 L de NaOAc 3M pH4,6 bem gelado. As Placas foram novamente seladas e

invertidas 10 vezes. Passados trs minutos, ficou overnight em freezer a -80C. No dia seguinte,

as placas foram descongeladas e centrifugadas a 2000rpm durante 30 minutos e depois foram

fixadas com fita adesiva, uma placa Milipore (MAGV N22) no topo de uma microplaca de

fundo V de 250 L de polipropileno, sempre observando o alinhamento correto dos poos.

Foram transferidos 150 L do sobrenadante para a placa Milipore. As placas permaneceram por

15 minutos a -20C para compactar debri. Passaram por centrifugao a 2000 rpm durante

40 minutos, e aps, as placas foram removidas e descartadas. Foram adicionados aos filtrados

38

90 L de isopopanol gelado e posteriormente seladas para passar pelo processo de inverso 10

vezes. O material foi centrifugado a 2000rpm por 90 minutos, depois, os sobrenadantes foram

descartados e foram adicionados 150 L de etanol 70% gelado em cada poo. As placas

passaram por centrifugao a 2000 rpm durante 40 minutos, aps, os sobrenadantes foram

descartados. Para secagem do precipitado, as placas ficaram abertas em estufas a 37C durante

10 minutos. O DNA foi ressuspendido em 40 L de gua mili-Q estril e coberta adesivo que

ficou sob temperatura ambiente durante 30 minutos. Aps, as placas foram agitadas e estocadas

em geladeira.

3.3.7 Sequenciamento dos clones

3.3.7.1 Preparo das amostras para sequenciamento

Aps extrao plasmidial (mini-preparao), o DNA dos clones foram quantificados e

ajustados para 200 ng/L. As amostras para sequenciamento foram preparadas sempre em

triplicata em microplacas com 96 poos, com o Kit de reao ABI Prim BigDyeTM Terminator

Cycle Sequencing Ready (Applied Biosystems), nas seguintes propores: 2 L de iniciador

(1,6pmol/ L) para o gnero Methanobrevibacter, 2 L do tampo 5X (400mM Tris-HCI pH

9; 10mM MgCl2), 1 L de reativo BigDye (Applied Biosystems), 5,5 L de DNA (200-300ng),

totalizando 10 L. A reao foi realizada no termociclador Peltier ThermalCicler, modelo PTC-

200, MJ Researchnas seguintes condies: 40 ciclos de 94C por 10 segundos, 50C por 5

segundos e 60C por 4 minutos.

3.3.7.2 Purificao e precipitao da reao de sequenciamento

Nesta etapa, os produtos de amplificao foram precipitados e limpos para remover

didesoxinucleotdeos fluorescentes no incorporados durante a sntese de molculas de DNA,

a fim de no interferir na leitura das bases durante o processo de sequenciamento.

A precipitao, para a reao de sequenciamento do DNA, ocorreu da seguinte forma:

foram adicionados 30 L de isopropanol 75% em cada poo. As placas foram levadas ao vortex

e submetidas a pulso por 10 segundo a 1000 rpm. As placas ficaram ao abrigo da luz por 15

minutos e depois foram centrifugadas a 2000 rpm durante 90 minutos. Os sobrenadantes foram

descartados invertendo a placa em papel toalha e depois foram realizados movimentos

39

circulares nas mesmas para retirar o possvel excesso de isopropanol. Foi adicionado 50 L de

etanol a 75% e novamente centrifugado a 2000 rpm por 30 minutos. Os sobrenadantes foram

desprezados novamente, e foi repetido o mesmo processo descrito acima para remover o

excesso de etanol. Aps, as placas foram submetidas a centrifugao invertida e deu-se um

pulso de 500rpm. As placas foram deixadas em temperatura ambiente, sob a proteo da luz,

por 2 horas e depois ressuspendido em 5,5 L de gua (GIBCO) e deixado em repouso por 1

hora. Aps, as placas foram encaminhadas a plataforma de sequenciamento da Fiocruz

(Plataforma PDTIS/FIOCRUZ).

3.3.7.3 Anlise dos resultados

Aps o sequenciamento, os cromatogramas obtidos foram enviados em arquivo de

entrada para o programa PhredPhrap (EWING et al., 1998), que reproduz em dois arquivos de

sada; o primeiro o arquivo fasta onde cada pico do cromatograma foi traduzido para sua

base nitrogenada correspondente (A, T, C ou G) e um arquivo qual onde cada base recebeu

um valor de qualidade, que reflete o grau de confiana que se tem naquela posio. As

sequncias com mais de 300 bases apresentando Phred score com qualidade maior ou igual a

20 foram includas nas anlises subsequentes; e as demais descartadas. As sequncias validadas

foram comparadas com sequncias do Ribosomal Database Project II (COLE et al., 2003). A

anlise de similaridade das sequncias foi realizada online atravs do programa BLASTn

(ALTSCHUL et al., 1997). Os alinhamentos com as sequncias de referncia do banco de

dados, foram realizados atravs do programa Clustal X (THOMPSON et al., 1997).

Regies iniciais contendo sequncia de vetores foram retiradas com auxlio do mdulo de

anlise de sequncias da ferramenta VecScreen disponibilizada pelo NCBI. As sequncias

tambm foram analisadas para identificao de quimeras pelo programa Bellerophon

(HUBER, et al, 2004).

3.3.7.4 Anlise filogentica de dados e ndices de diversidade

As sequncias foram agrupadas em OTU a um nvel de estringncia de 97% atravs do

software MOTHUR (SCHLOSS et al., 2009). As rvores filogenticas foram construdas

atravs do mtodo de neighbor-joining (SAITOU e NEI, 1987) baseadas na estimativa de

40

distncia calculada pelo algoritmo Kimura-2 (KIMURA, 1980). A construo das rvores foi

feita pelo programa MEGA5 (TAMURA et al., 2011) e a anlise de bootstrap foi conduzida

com 1000 replicatas. Para verificar se as diferenas na composio das comunidades

bacterianas foram relevantes estatisticamente, as bibliotecas foram comparadas utilizando a

estatstica de LIBSHUFF (SINGLETON et al, 2001) que est baseado no mtodo Monte Carlo

para gerar curvas de cobertura homlogas e heterlogas a partir das bibliotecas do gene rrs do

16S rRNA.

Para visualizar melhor os padres globais de variao, foi utilizado o UniFrac

(LOZUPNE, HAMABY e KNIGHT, 2006) que baseado nas informaes filogenticas, nos

permitiu observar graficamente, as diferenas entre os ambientes.

3.4 CONSTRUO DA CURVA-PADRO PARA QUANTIFICAO ABSOLUTA

O DNA genmico de M. smithii (INCQS A45D/DSM 11975) foi utilizado para a

construo da curva-padro e as diluies seriadas com fator de [1:10] tiveram sua concentrao

de DNA determinadas pelo Qubit 2.0 Fluorometer quantitates (Life Technologies). Foram

estabelecidos cinco pontos de diluio seriada do DNA genmico de M. smithii. Foi utilizado

tambm o kit Exogenous Internal Positive Control TaqMan (IPC) (Integrated DNA

Technologies) para verificar a presena de inibio das reaes, de acordo com instrues do

fabricante. Com base na quantificao inicial foram estabelecidos valores dos ttulos de cada

diluio e suas respectivas concentraes em ng/l, valores posteriormente inseridos na

planilha disponibilizada pelo Software para obteno da curva padro. Os dados gerados pela

curva padro forneceram uma reta padro atravs de regresso linear, integrando os valores de

Ct (Cycle threshold) no eixo das ordenadas e o logartimo da concentrao de DNA no eixo

das abcissas. A frmula da regresso linear desta reta-padro (y=mx + b) serve como base para

os clculos posteriores na determinao de amostras cuja as concentraes so desconhecidas.

3.4.1 Quantificao absoluta das amostras

As amostras coletadas foram submetidas extrao de DNA genmico conforme

descrito e posteriormente, foram conduzidas a qPCR. A deteco e a quantificao do gene

nifH de M. smithii foram realizadas por meio da tcnica desenvolvida pelo sistema Taqman

em termociclador Applied Biosystems 7000/7500 fast Real-Time PCR System no Laboratrio

41

de Biologia Molecular do Departamento de Bioqumica Mdica da UFRJ. As amplificaes

foram realizadas utilizando os iniciadores (Mnif202F5-GAAAGCGGAGGTCCTGAA-3,

Mnif353R5-CTGAAAAACCTCCGCAAAC-3) e sonda (Mnifprobe -

[FAM]CCGGACGTGGTGTAACAGTAG[BHQ-1]).A composio de cada reao totalizou

25L, contendo: 1x PCR buffer (50 mM KCl, 20 mM TrisHCl, pH8.4), 5 mM MgCl, 800

mM dNTPs, 240 mM da sonda, 2.3 U Taq DNA polymerase usando o kit Taqman Universal

PCR Master Mix e 800mol-1 oligonucleotdeos (Invitrogen), nas seguintes condies: 10

minutos a 95C, 45 ciclos de 10 segundos a 95C e 30 segundos a 57C (JOHNSTON et al.,

2010).

42

4. RESULTADOS

4.1 DOSAGEM DOS PARMETROS FSICO-QUMICOS

Em relao aos valores de pH, houve uma variao de 5.13 no ponto (1) e 8.8 no ponto

(4) (Tabela 2). Os valores de condutividade ficaram entre 14,6mS/cm no ponto (10) e

71.4mS/cm no ponto (12) (Tabela 2). Em relao a turbidez os valores encontrados foram

considerados elevados, o menor valor foi o ponto de coleta (5) com 110 UNT enquanto que o

maior valor turbidez foi no ponto (6) com 645 UNT (Tabela 2).

Os nveis de oxignio dissolvido apresentaram-se em sua maioria superior a 6 mg/L,

somente o os pontos (5) com 5.3 mg/L e o ponto (8) 5.08 mg/L ficaram abaixo (Tabela 2). As

temperaturas variaram entre 21 e 27C, o ponto (7) obteve a temperatura mais alta de 27C em

relao aos demais, porm dentro dos padres considerados normais para regies de clima

tropical (Tabela 2). A salinidade variou entre 20 e 40%, somente os pontos (8) e (2) ficaram

abaixo da concentrao normalmente encontrada em ambientes salinos (acima de 30%), com

as concentraes de 23.8% e 20% respectivamente.

Tabela 2. Resultados dos parmetros fsico-qumicos

Pontos de coleta pH Condutividade

(mS/cm)

Turbidez

(UNT)

O.D

(mg/L)

Temperatura

(C)

Salinidade

(%)

(1) Prainha (Mar) 5.13 51.7 270 7.10 25.0 34.1

(2) Prainha (Lngua negra) 5.40 48.7 233 8.76 22.6 20.0

(3) Praia do Leblon 7.00 49.3 122 8.51 24.1 38.0

(4) Leblon (canal) 8.80 50.7 231 13.57 21.0 32.5

(5) Praia Copacabana 7.90 47.5 110 5.30 24.0 38.1

(6) Piscino de Ramos 6.40 23.6 645 10.30 22.0 33.0

(7) Praia de So Bento 7.80 40.0 180 9.80 27.0 36.0

(8) Praia da Bica 6.50 37.4 236 5.08 20.0 23.8

(9) Praia da Engenhoca 6.28 14.6 277 9.08 21.0 35.0

(10) Praia da Guanabara 7.90 25.0 238 8.55 23.0 30.0

(11) Praia So Francisco 8.30 64.8 465 6.08 23.0 40.0

(12) Praia Seca 8.27 71.4 380 6.42 25.0 40.0

(13) Pontinha 5.40 25.0 213 7.80 26.6 33.4

43

4.2 DOSAGEM DOS PARMETROS MICROBIOLGICOS

Baseado nos critrios estabelecidos na Resoluo do CONAMA, N274/00, as

condies de balneabilidade dos locais coletados foram avaliadas. Praticamente a maioria dos

pontos (n=10) foi considerada imprpria (>1000 coliformes totais por mL, >800 E. coli mL),

somente os pontos (6, 12 e 13) foram considerados prprios para atividade recreativa como

pode ser observado na Tabela 3.

Tabela 3. Anlises microbiolgicas

Locais Coliformes totais

(NMP/100mL) E. coli (NMP/100mL) CONAMA n274/2000

(1) Prainha > 2419,6 1119,9

IMPRPRIA

(2) Prainha (lngua negra) > 2419,6 1299.7

(3) Praia Leblon > 2419,6 > 2419,6

(4) Leblon (canal) > 2419,6 > 2419,6

(5) Praia Copacabana > 2419,6 > 2419,6

(7) Praia So bento > 2419,6 1119,9

(8) Praia da Bica > 2419,6 > 2419,6

(9) Praia da Engenhoca > 2419,6 > 2419,6

(10) Praia da Guanabara > 2419,6 > 2419,6

(11) Praia de So Francisco > 2419,6 > 2419,6

(6) Piscino de Ramos 913.9 791.5

PRPRIA (12) Praia Seca 119.1 99.2

(13) Pontinha 209.1 211.4

44

4.3 SEQUENCIAMENTO E ANLISE DAS BIBLIOTECAS

Das 13 bibliotecas do gene 16S rRNA contendo 260 clones, 240 foram considerados

como sequncias vlidas com Phred score 20. Artefatos, regies contendo sequncias de

vetores e quelas identificadas como quimeras (2%) foram descartadas das anlises, restando o

total de 52 sequncias vlidas. Com o objetivo de revelar as espcies que compem a

comunidade microbiana nos ambientes estudados, as sequncias de cada biblioteca foram

classificadas atravs da ferramenta de classificao do Ribossomal Database Project II.

A anlise taxonmica no RDP II demonstrou a presena de dois gneros da famlia

Methanobacteriaceae. Trinta e sete sequncias foram identificadas como pertencentes ao gnero

Methanobacterium, distribudas em: M. palustre (n=1), M. formicicum (n=1), M. alcaliphilum

(n=1) e M. subterraneum (n=34) nos pontos So Bento, Pontinha, Leblon, Bica e Engenhoca.

As outras 15 sequncias foram classificadas como pertencentes ao gnero Methanobrevibacter

distribudas em 2 espcies: M. acididurans (n=1) e M. smithii (n=14) nos pontos, Leblon, Bica,

Engenhoca e Pontinha.

Figura 3: rvore filogentica dos clones obtidos atravs das bibliotecas gnicas dos pontos coletados.

As sequncias referncia retiradas do banco de dados do GenBank so mostradas em negrito. A

topologia da rvore baseia-se na anlise de neighbor joining e o bootstrap foram calculados com 1000

repeties. Apenas bootstrap> 50 so mostrados.

45

A rvore filogentica nos permitiu conhecer como as espcies pertencentes aos gneros

Methanobacterium e Methanobrevibacter esto distribudas nos pontos analisados neste estudo

(Figura 3). Dentro do gnero Methanobacterium, a espcie M. subterraneum apresentou o

maior nmero de clones (92%) distribudos entre as praias de So Bento (21%), Engenhoca

(13%), Bica (38%), Leblon (11%) e Pontinha (17%). Um percentual bem menor de sequencias

foi associado as espcies M. palustre, M. formicicum, M. alcaliphilum.

No gnero Methanobrevibacter foram detectadas sequncias da espcie M. smithii

(contaminao fecal humana), com o maior nmero (93%), distribudas entre as praias da bica

(33%), Leblon (33%), Engenhoca (20%) e Pontinha (7%), e a espcie M. acididurans com

apenas 7% dos clones.

Figura 4. Anlise de Componentes Principais (PCA) de Methanobrevibacter spp. e Methanobacterium

spp. nas guas de praias estudadas, utilizando as distncias geradas pelo UniFrac. Os eixos so rotulados

com o percentual da variao explicada por cada componente principal.

A figura 4 mostra a anlise de componentes principais (PCA) de comunidades de

espcies metanognicas nas guas de 13 praias analisadas por meio do software UniFrac

(mtodo filogentico). Pela anlise do grfico de componentes principais, Methanobacterium

formicicum, M. alcaliphulicum e M. subterraneum (So Bento, Engenhoca, Bica, Leblon e

Pontinha) e M. petrolarium, M. kanagiense e M. palustre(Bica) foram separadas de

Methanobrevibacter smithii, M. oralis e M. acididurans (So Bento, Engenhoca, Bica e Leblon)

pelo eixo PC1. Em relao ao eixo PC2, M. smithii, M. oralis e M. acididurans (So Bento,

Engenhoca, Bica e Leblon) e Methanobacterium formicicum, M. alcaliphulicum e M.

46

subterraneum (So Bento, Engenhoca, Bica, Leblon e Pontinha) foram separados de

Methanobacterium petrolarium, M. kanagiense e M. palustre (Bica). Embora no tenham sido

observadas diferenas estatsticas significantes nas anlises comparativas, a gua das praias

analisadas mantm alguma diversidade entre os gneros Methanobrevibacter e

Methanobacterium. Atravs do grfico de coordenadas principais gerado pela anlise UniFrac

(figura 4), PC1 e PC2 explicam respectivamente 21,27% e 11,55% da variabilidade encontrada.

4.4 DETECO DE M. smithii PELA PCR CONVENCIONAL

Das 13 amostras de gua de praia analisadas, 11 apresentaram um nico fragmento de

aproximadamente 222 pb pela PCR convencional, compatvel com o fragmento detectado no

M. smithii (DSM 11975) utilizado como controle positivo da reao (Figura 5).

Figura 5. Amplificao do gene nifH para Methanobrevibacter smithii. Linha (P) Peso molecular (100

pb Invitrogen); Linhas (1) Prainha, (2) Prainha (lngua negra), (3) Praia Leblon, (4) Leblon (canal), (5)

Praia Copacabana, (6) Piscino de Ramos, (7) Praia So bento, (8) Praia da Bica, (9) Praia da Engenhoca,

(10) Praia da Guanabara, (11) Praia de So Francisco(12) Praia Seca, (13) Pontinha, (14) M. smithii

(DSM 11975), (15) Klebsiella pneumoniae ATCC BAA-1706(16) H2O.

4.5 DETECO E QUANTIFICAO DO GENE nifH POR qPCR

Primeiramente, foram padronizadas as reaes de amplificao do gene nifH com os

iniciadores para construo da curva padro. Para a construo da curva padro do controle

interno positivo (IPC) foram realizadas 5 diluies seriadas, de onde foram selecionados os 3

melhores pontos da curva utilizados nas reaes seguintes (Figura 6).

A concentrao dos iniciadores, bem como as reaes foram otimizadas para um volume

final de 25 L, sendo 5L de amostra. Essa padronizao permitiu definir as concentraes de

222 pb

47

iniciadores em 800 nM e 240nM para sonda resultando em uma eficincia entre 90 % e 110%.

Foram realizadas 10 diluies decimais seriadas de DNA genmico de M. smithii na construo

da curva padro (Figura 7). O ponto inicial da curva teve concentrao de 90 ng/L (1.98 E+12

cpias/l). O gene nifH de M. smithii foi detectado e quantificado em 12 das 13 amostras

analisadas, variando entre 2,26E+10 e 3,81E+12 cpias/l, na praia do Leblon e Prainha (lngua

negra) respectivamente (Tabela 4).

Figura 6: Curva padro do controle interno positivo (IPC). (1) Diluio 100 (DNA 0.4 ng/mL); (2)

Diluio 10-1; (3) Diluio 10-2.

48

Figura 7: Curva padro do M. smithii. (1) Diluio 100 (DNA 90 ng/L) ;(2) Diluio 10-1;(3) Diluio

10-2;(4) Diluio 10-3;(5) Diluio 10-4; (6) Diluio 10-5; (7) Diluio 10-6;(8) Diluio 10-7;(9) Diluio

10-8;(10) Diluio 10-9.

Figura 8: (A) Perfil de amplificao dos pontos de diluio da curva padro, IPC e DNA ambiental. (B)

Amplificao do DNA das amostras ambientas interpoladas com a Curva padro de M. smithii e do IPC.

49

Tabela 4. Resultados de PCR convencional e PCR em tempo real do gene nifH de M. smithii.

Pontos coletados PCR

convencional

PCR em

tempo real

Nmero de

cpias/l

(1) Prainha (mar) + + 2,70E+10

(2) Prainha (lngua negra) + + 3,81E+12

(3) Praia do Leblon + + 2,26E+10

(4) Leblon (canal) + + 4,69E+11

(5) Praia Copacabana ND + 2,98E+10

(6) Piscino de Ramos ND + 8,60E+10

(7) Praia de So Bento + - ND

(8) Praia da Bica + + 2,45E+10

(9) Praia da Engenhoca + + 8,13E+10

(10) Praia da Guanabara + + 6,09E+11

(11) Praia So Francisco + + 2,78E+11

(12) Praia Seca + + 6,23E+10

(13) Pontinha + + 7,26E+10

50

5. DISCUSSO

A zona costeira pode ser utilizada para inmeras atividades como pesca, transporte e

turismo (OLIVEIRA, 2011). Entretanto, essas atividades e ou a descarga de poluentes qumicos

e biolgicos, como o esgoto domstico e resduos industriais pode acarretar na contaminao

do ambiente marinho gerando impactos negativos ao meio ambiente e sade pblica

(DEDIOS et al., 2012).

Embora no seja considerada prpria para consumo humano, a gua do mar deve estar

dentro dos limites da legislao. Alm disso, no deve apresentar organismos patognicos e

substncias txicas em concentraes que possam causar danos sade pelo contato com a pele

ou por ingesto ocasional (SOUSA et al., 2010). Sendo assim, o monitoramento microbiolgico

da qualidade das guas costeiras uma medida essencial para garantir a balneabilidade e

segurana dos banhistas. Apesar disso, o nvel de sanidade das guas de praia assunto pouco

discutido na mdia se comparado com outros temas relacionados sade. No Rio de Janeiro, a

populao convive constantemente com diversas praias classificadas como imprprias para

banho o que implica na atividade turstica e principalmente na qualidade de vida da populao

(SOUSA et al., 2010).

Avaliar as condies fsico-qumicas de um determinado ambiente nos permite traar

um perfil das condies e do potencial ecolgico do mesmo, visando no somente a valorizao

biolgica local, mas tambm evidenciando aspectos ambientais que permitam conduzir