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ANA PAULA CARNEIRO DOS SANTOS
Construção e seleção de uma biblioteca de
anticorpos monoclonais scFv contra células
tumorais de tireóide
CAMPINAS-SP
2010
ii
ANA PAULA CARNEIRO DOS SANTOS
Construção e seleção de uma biblioteca de
anticorpos monoclonais scFv contra células
tumorais de tireóide
Orientadora: Laura Sterian Ward
Co-orientador: Luiz Ricardo Goulart
CAMPINAS-SP
2010
Dissertação de Mestrado apresentada á Pós-
Graduação da Faculdade de Ciências Médicas da
Universidade Estadual de Campinas para obtenção
do título de Mestre em Ciências Médicas, área de
concentração Clínica Médica
iv
v
Dedicatória
À minha mãe Adagmar, pelo exemplo de vida, amor e o incentivo de todos os dias.
Ao meu irmão Guilherme, pelo apoio e força em todos os momentos.
vi
Agradecimentos
Gostaria de agradecer a todos que, de maneiras diferentes, contribuíram para este trabalho:
Ao Deus, por todas as graças que tenho alcançado e por me dar saúde, sabedoria e
perseverança para finalizar mais uma etapa da minha formação.
Agradeço imensamente a minha mãe, Adagmar Batista Carneiro, e ao meu irmão
Guilherme Carneiro, pelo amor, amizade e pelo grande apoio.
Aos meus orientadores Dra. Laura Sterian Ward e Dr. Luiz Ricardo Goulart pela
oportunidade de realizar essa pesquisa e por todo o conhecimento a mim transmitido.
A querida Carol, pelo companheirismo em todos os momentos do Mestrado, no laboratório,
nas longas viagens, nas coletas das amostras no Centro Cirúgico... Sem a Carol tudo teria
sido mais difícil.
A minha família, em especial a minha tia Ivone e Sheila Tatiana que sempre torceram pelo
meu sucesso!
Agradeço aos meus companheiros de trabalho do Laboratório de Nanobiotecnologia da
UFU: Ana Carolina, Ângela, Carlos, Carolina, Érica, Janaína, Fabiana, Fausto, Juliana,
Karina, Flávia, Larissa Goulart Patrícia, Paula Cristina, Paula Sousa, Rafael, Rone, Thaise,
Washington, Galber e Yara.
Ao Carlos Ueira, pelos importantes conselhos e esclarecimentos, que foram fundamentais
para a minha formação acadêmica.
A querida Yara Cristina de Paiva Maia, pela apoio em vários momentos difíceis e
importante ajuda com a Estatística.
A querida Patrícia Tieme, pelo carinho e exemplo de força e coragem.
vii
Ao Rafael Nascimento, pelo apoio, ajuda e pelos momentos de descontração.
A equipe médica da Cirurgia Cabeça e Pescoço do Hospital de Clínicas da Universidade
Federal de Uberlândia, em especial ao Dr. Sindeval pela confiança e oportunidade de
coletar as amostras.
A Valeska Guzman, pelo exemplo de pesquisadora e por nos apresentar
à Dra. Janethe Pena, que nos ajudou com a cultura de células.
As professoras Maria Aparecida de Souza (Cida) e Janethe Pena, por todos os ensinamentos
sobre cultura de células e também por disponibilizar o laboratório para realizarmos as
culturas.
A Dra. Janete Cerruti por fornecer as células tumorais de tireóide (NPA).
Ao Dr. Fernando Augusto Soares pela doação das lâminas de Micro-arranjo de tecido
(TMA).
Ao Dr. José Vassallo, por disponibilizar seu laboratório para fazer as imunoistoquímicas e
pela gentileza em nos ajudar a analisar as lâminas. E ao Paulo, pela ajuda nos experimentos.
Meu sincero agradecimento a Elaine Cristina Morari, pelos inúmeros favorzinhos e ajuda
com a imunoistoquímica na Unicamp e no Hospital AC Camargo.
A Natássia, Cristina e Aline pelas hospedagens...
A todos do laboratório GEMOCA, que de alguma forma contribuíram para este trabalho.
A Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela bolsa de
mestrado.
viii
Resumo
Fragmentos de anticorpos recombinantes têm se tornado ferramentas importantes em
diversas áreas, tais como: Biologia Molecular, Farmacêutica e pesquisa Médica. Avanços
recentes estão relacionados à aplicação desses anticorpos na oncologia, com estratégias
diagnósticas e terapêuticas para diferentes carcinomas. Neste estudo, uma biblioteca de
fragmentos de anticorpos monoclonais scFv foi construída utilizando RNA total de sangue
periférico de 25 pacientes com Carcinoma Diferenciado da Tireóide. Essa biblioteca scFv
foi selecionada utilizando os métodos Bioppaning and Rapid Analysis of Selective
Interactive Ligands (BRASIL) e Phage display contra células tumorais de tireóide, com o
objetivo de encontrar ligantes específicos a superfície celular tumoral. Os clones
selecionados foram identificados por Dot blotting, e a reatividade contra proteínas de
tumor, adenoma e bócio foi analisada por Elisa. O clone scFv-C1 apresentou melhor
reatividade pelas proteínas tumotais e foi escolhido para a imunoistoquímica. Esta foi
realizada com lâmina de Micro-arranjo de tecido (TMA) com duzentos e vinte nove casos
de tireóide, sendo 110 Carcinomas, 52 Adenomas Foliculares, 49 Bócios e 18 tecidos
normais de tireóide. O anticorpo scFv-C1 reagiu especificamente aos tecidos de câncer,
com reatividade ao citoplasma das células tumorais, foi capaz de distinguir o Grupo Câncer
do Controle (Bócio, Adenoma e tireóide normal) com significância estatística (p<0,0001) e
entre os carcinomas reagiu melhor com os tumores pequenos (TNM 1 e 2) e com pouca
agressividade (p=0,050). O fragmento de anticorpo scFv-C1 pode ser um potencial
candidato a biomarcador para o diagnóstico do Câncer de tireóide.
ix
Abstract
Recombinant antibody fragments have become important tools in several fields, including
molecular biology, pharmaceutical and medical research. In this study, a human single-
chain variable fragment (scFv) antibody library was constructed using total RNA of
leukocyte cells obtained from blood of patients with well differentiated thyroid carcinoma.
This scFv antibody library was selected using the Biopanning and Rapid Analysis of
Selective Interactive Ligands method (BRASIL) and Phage display technology against
tumor thyroid cells, aiming to find specific cell-surface binders. The selected clones were
identified by dot blot and ELISA assays and their reactivity analyzed against tumor, goiter
and adenoma proteins. One clone (scFv-C1) presented the highest reactivity ratio between
cancer and the control group (goiter and adenoma) and was chosen for further analysis.
Immunohistochemistry was performed by means of Tissue Microarray with two hundred
and twenty-nine thyroid cases (110 carcinomas, 52 follicular adenomas, 49 goiters and 18
normal tissues) including 38 papillary, 42 follicular and 30 variant follicular in the
carcinoma group. The scFv-C1 reacted specifically to cancer tissues sections, showed
strong reactivity with cytoplasm and was able to distinguish cancer to control groups
(goiter, adenoma and normal thyroid) with statistically significance (p<0,0001). The scFv-
C1 fragment antibody described here may be a potential biomarker candidate for
diagnostics and prognostics of thyroid cancer.
x
Lista de Abreviaturas
% Porcentagem
°C Graus Celsius
µg Microgramas
mL Microlitros
mm Micrometro
mM Micromolar
BCIP 5-Bromo-4-cloro-3-indolil fosfato
BSA Soro-albumina bovina
cDNA Ácido desoxirribonucléico complementar
DNA Ácido desoxirribonucléico
DEPC Dietil pirocarbonato
dNTP Desoxirribonucleotídeo trifosfatado
O.D. Densidade ótica
DTT Ditiotreitol
EDTA Ácido etilenodiamino tetracético
ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
g Grama
IgG Imunoglobulina G
IPTG Isopropil β-D-1-tiogalactopiranosideo
kDa Quilodalton
L Litro
M Molar
M13KE Bacteriófago filamentoso
mA Miliampere
mRNA Ácido ribonucléico mensageiro
NBT Cloreto nitroblue tetrazolium
ng Nanogramas
xi
Ni Níquel
rpm Rotações por minuto
RNA Ácido ribonucléico
pmol Picomol
pb Pares de base
PBS Tampão salina fosfato
pComb3XSS Fagomídeo
PCR Reação em cadeia da polimerase
PEG Polietilenoglicol
pH Potencial de Hidrogênio
p/v Peso por volume
scFv single-chain Fv fragment
SDS Dodecil sulfato de sódio
Taq Enzima Taq DNA polimerase de Thermus aquaticus
TBS Tampão tris-base salino
TMA Micro-arranjo de tecido
U Unidade de enzima
ufc Unidades formadoras de colônias
UFU Universidade Federal de Uberlândia
Unicamp Universidade Estadual de Campinas
xii
Lista de Tabelas
Tabela 1. Oligonucleotídeos utilizados no trabalho. -------------------------------------------------- 23
Tabela 2. Seqüência de aminoácidos de clones VL (Cadeia variável leve: kappa ou
lambda) obtidos no programa IgBlast. ------------------------------------------------------------- 62
Tabela 3. Características dos pacientes da lâmina de micro-arranjo (TMA) ---------------------- 68
Tabela 4. Resultado da marcação do fragmento de anticorpo scFv- C1 para as variáveis a
anátomo patológicas dos casos de tireóide analisados por micro-arranjo de tecido
(TMA) -------------------------------------------------------------------------------------------------- 70
Tabela 5. Comparação entre a marcação positiva do anticorpo scFv-C1 e as variáveis
anátomo patológicas das casos de tireóide analisados por micro-arranjo de tecido
(TMA) -------------------------------------------------------------------------------------------------- 71
Tabela 6. Análise da intensidade e área da marcação entre os grupos com o teste ANOVA-
Bonferroni ---------------------------------------------------------------------------------------------- 73
xiii
Lista de Figuras
Figura 1. Estrutura básica de um anticorpo IgG. ------------------------------------------------------ 10
Figura 2. Representação esquemática de diferentes formatos de fragmentos de anticorpos. --- 11
Figura 3. Representação esquemática do fragmento scFv. ------------------------------------------- 12
Figura 4. Estrutura básica de um bacteriófago filamentoso. ----------------------------------------- 14
Figura 5. Ciclos de seleção de proteínas ligantes a partir de uma biblioteca de Phage
Display -------------------------------------------------------------------------------------------------- 17
Figura 6. Vetor fagomídeo pComb3X usado na construção de bibliotecas combinatoriais
de anticorpos. ------------------------------------------------------------------------------------------ 22
Figura 7. Esquema da construção e seleção da biblioteca de scFv de pacientes com
carcinoma diferenciado de tireóide. ---------------------------------------------------------------- 24
Figura 8. Método BRASIL de seleção de ligantes na superfície celular. -------------------------- 44
Figura 9. Análise do produto da amplificação das regiões variáveis da cadeia pesada (VH),
cadeia leve (VL) e do fragmento de anticorpo scFv. -------------------------------------------- 61
Figura 10. Culturas de células humanas de tireóide visualizada em microscópio invertido63
Figura 11. Dot Immunoblotting para análise da expressão dos fragmentos de anticorpos em
cultura induzida por IPTG. -------------------------------------------------------------------------------- 64
Figura 12. Gel SDS-PAGE para análise das proteínas extraídas de tecidos tireoidianos. ------- 65
Figura 13. Reatividade do fragmento de anticorpo scFv nas células tumorais de tireóide. ----- 69
xiv
Lista de Gráficos
Gráfico 1. Elisa para análise da reatividade dos scFvs selecionados. ------------------------------- 66
Gráfico 2. Análise da intensidade e área da coloração na lâmina TMA. ---------------------------- 72
xv
Lista de Quadros
Quadro 1. Classificação do Carcinoma da Tireóide de acordo com a 6ª edição da UICC
(International Union Against Cancer) -------------------------------------------------------------- 54
Quadro 2. Classificação do TNM dos pacientes da lâmina TMA ----------------------------------- 55
xvi
Sumário
1-Introdução ----------------------------------------------------------------------------------------------- 1
1.1- Câncer ---------------------------------------------------------------------------------------------- 2
1.2- Câncer de tiróide ---------------------------------------------------------------------------------- 3
1.2.1-Epidemiologia -------------------------------------------------------------------------------- 3
1.2.2- Nódulos de tireóide ------------------------------------------------------------------------- 3
1.2.3-Diagnóstico do carcinoma de tireóide ---------------------------------------------------- 4
1.3-Resposta imune contra tumores ----------------------------------------------------------------- 6
1.4-Imunoglobulinas ----------------------------------------------------------------------------------- 8
1.5- Fragmentos de anticorpos ---------------------------------------------------------------------- 10
1.6- Apresentação de fragmentos de anticorpos scFv por Phage display --------------------- 12
2-Objetivos ------------------------------------------------------------------------------------------------ 18
2.1- Objetivo Geral ----------------------------------------------------------------------------------- 19
2.2- Objetivos Específicos --------------------------------------------------------------------------- 19
3- Material e métodos ----------------------------------------------------------------------------------- 20
3.1- As soluções utilizadas estão descritas no ANEXO 1. -------------------------------------- 21
3.2-Linhagem de Células Humanas ---------------------------------------------------------------- 21
3.3- Linhagens Bacterianas -------------------------------------------------------------------------- 21
3.4- Vetor fagomídeo --------------------------------------------------------------------------------- 21
3.5- Bacteriófago auxiliar ---------------------------------------------------------------------------- 22
3.6- Oligonucleotídeos Sintéticos ------------------------------------------------------------------ 22
3.7- Construção da Biblioteca de anticorpos: Amplificação das Sequências
Codificadoras de VH e VL por PCR e Montagem do scFv ------------------------------------- 24
3.7.1- Obtenção das amostras e extração de RNA total de Linfócitos dos Pacientes
com Carcinoma de Tiróide -------------------------------------------------------------------------- 25
xvii
3.7.2- Síntese da primeira fita de cDNA -------------------------------------------------------- 25
3.7.3- Primeiro ciclo de PCR --------------------------------------------------------------------- 26
3.7.4- Precipitação e purificação dos produtos de PCR -------------------------------------- 28
3.7.5- Amplificação dos fragmentos scFv ------------------------------------------------------ 29
3.7.6- Precipitação e purificação dos produtos de PCR -------------------------------------- 30
3.7.7- Restrição dos scFvs obtidos por PCR e do vetor pComb3XSS com a Enzima
SfiI ------------------------------------------------------------------------------------------------------ 30
3.7.8- Ligação do scFv com o vetor pComb3XSS digeridos com a Enzima SfiI e
purificados --------------------------------------------------------------------------------------------- 31
3.7.9- Ligação definitiva dos fragmentos de DNA scFv com o vetor pComb3X --------- 32
3.8- Análise do repertório da biblioteca de scFv ------------------------------------------------- 33
3.9- Seleção da biblioteca ---------------------------------------------------------------------------- 33
3.9.1- Preparação de células eletrocompetentes ----------------------------------------------- 33
3.9.2- Preparação do fago auxiliar VCSM13 -------------------------------------------------- 34
3.9.2.1- Obtenção de placas de lise ------------------------------------------------------------ 34
3.9.2.2- Amplificação de placas de lise ------------------------------------------------------- 35
3.9.2.3- Determinação do título da preparação de fagos auxiliares ----------------------- 35
3.9.3- Transformação de Células de Escherichia coli por Eletroporação com a
Biblioteca----------------------------------------------------------------------------------------------- 36
3.9.4- Preparação de DNA plasmidial em placas de microtitulação ------------------------ 38
3.9.5- Reamplificação da biblioteca ------------------------------------------------------------- 40
3.9.6- Cultura de células humanas de tireóide ------------------------------------------------- 41
3.9.6.1- Congelamento de células humanas -------------------------------------------------- 42
3.9.6.2- Descongelamento de células humanas ---------------------------------------------- 42
3.9.7- Seleção da biblioteca de scFv contra células humanas de tireóide pelo método
BRASIL ------------------------------------------------------------------------------------------------ 43
xviii
3.9.8- Transformação de bactérias eletrocompetentes com a biblioteca scFv
selecionada --------------------------------------------------------------------------------------------- 45
3.10- Produção de scFv na forma solúvel --------------------------------------------------------- 46
3.11- Detecção de proteína recombinante por Dot blot ----------------------------------------- 47
3.12- Ensaio de Imunoadsorção por ligação enzimática (ELISA) para seleção dos
fragmentos de anticorpos scFv com maior afinidade às proteínas de tumor de tireóide ---- 47
3.12.1- Tecidos tireoidianos ---------------------------------------------------------------------- 47
3.12.2- Extração de proteínas totais ------------------------------------------------------------- 48
3.12.3- ELISA -------------------------------------------------------------------------------------- 48
3.12.4 Gráficos ------------------------------------------------------------------------------------- 49
3.13- Sequenciamento de DNA --------------------------------------------------------------------- 49
3.14- Purificação de scFv por cromatografia de afinidade em HPLC ------------------------- 50
3.15- Ensaios de Western Blotting ------------------------------------------------------------------ 51
3.16- Imunoistoquímica ------------------------------------------------------------------------------ 52
3.16.1- Procedimento ------------------------------------------------------------------------------ 52
3.16.2- Estadiamento dos tumores dos pacientes da lâmina de micro-arranjo de
tecido (TMA) ------------------------------------------------------------------------------------------ 54
3.16.3- Leitura dos resultados -------------------------------------------------------------------- 56
3.16.4- Análise estatística ------------------------------------------------------------------------- 57
4-Resultados ---------------------------------------------------------------------------------------------- 59
4.1- Amplificação dos fragmentos da cadeia pesada (VH) e da cadeia leve (VL) e dos
fragmentos scFv --------------------------------------------------------------------------------------- 60
4.2- Análise do repertório da biblioteca de scFv ------------------------------------------------- 60
4.3- Culturas de células humanas de tireóide ----------------------------------------------------- 63
4.4- Análises dos clones selecionados ------------------------------------------------------------- 64
4.4.1- Análise Monoclonal por Dot Immunoblotting ----------------------------------------- 64
xix
4.4.2- Ensaio de Imunoadsorção por ligação enzimática (ELISA) para seleção dos
fragmentos de anticorpos scFv com maior afinidade às proteínas de tumor de tireóide ---- 65
4.4.2.1- Análise das proteínas utilizadas no ensaio ELISA por eletroforese em gel
SDS-PAGE -------------------------------------------------------------------------------------------- 65
4.4.2.2- Elisa em extrato protéico -------------------------------------------------------------- 65
4.4.3- Clone selecionado para imunoistoquímica --------------------------------------------- 67
4.4.4- Análise in Silico do clone selecionado -------------------------------------------------- 67
4.5- Imunoistoquímica ------------------------------------------------------------------------------- 67
5- Discussão ---------------------------------------------------------------------------------------------- 74
6- Conclusão ---------------------------------------------------------------------------------------------- 79
7-Referências Bibliográficas --------------------------------------------------------------------------- 81
8- ANEXOS ---------------------------------------------------------------------------------------------- 90
1
1-INTRODUÇÃO
2
1.1- Câncer
Existem evidências da existência do câncer desde que as primeiras civilizações
humanas começaram a deixar registros de suas atividades. Essa doença já era bem
conhecida na sociedade egípcia, mas como sempre esteve associada à velhice e só se tornou
mais evidente em meados do século XIX, quando a expectativa média de vida da população
como um todo, aumentou consideravelmente. Atualmente, a principal causa de morte no
mundo são as doenças do coração, e nos países subdesenvolvidos, doenças como
desnutrição e infecções parasitárias são problemas ainda mais sérios do que o câncer. No
entanto, estima-se que, no mínimo, um em cada três indivíduos vai desenvolver algum tipo
de câncer (Franks e Teich, 1997).
O termo câncer descreve um processo de doença caracterizado por uma proliferação
celular descontrolada que leva à formação de um tumor, também chamado neoplasma ou
neoplasia (Thompson e Thompson, 2002). O câncer ocorre devido a danos genéticos
herdados e/ou adquiridos que alteram a expressão ou as propriedades bioquímicas de genes
envolvidos na regulação do crescimento e diferenciação celular (Bishop, 1987; Knudson,
1993; Ward, 1997). Anormalidades tanto nos genes estimuladores de divisão celular
(chamados de proto-oncogenes), como nos protetores ou bloqueadores do ciclo celular
(chamados de genes supressores tumorais), podem conferir a uma célula vantagens de
crescimento e desenvolvimento sobre as células normais (Ward e Fagin, 1998). Os genes
que controlam o tempo de vida ou a morte celular, como o gene da telomerase, os genes
envolvidos na apoptose e os genes de reparo do DNA também intervêm diretamente no
processo de tumorigênese (Ward, 1997).
3
1.2- Câncer de tiróide
1.2.1-Epidemiologia
O câncer de tireóide é considerado raro embora seja o tumor endócrino mais freqüente
(Jemal et al., 2008; American Cancer Society, 2003). O Carcinoma Diferenciado da Tireóide
(CDT) corresponde a aproximadamente 1% de todos os tipos de câncer (Hundahl et al., 2000;
Jemal et al., 2004) e de acordo com o Instituto Nacional do Câncer (INCA, 2009) é o câncer
mais comum da região da cabeça e pescoço e três vezes mais freqüente no sexo feminino.
A freqüência do CDT tem aumentado progressivamente cerca de 3% ao ano por
fatores etiopatogênicos desconhecidos e devido à melhora nos métodos de diagnóstico.
Estima-se a ocorrência de mais de 300.000 casos nos Estados Unidos da América, 37.200
casos novos sendo diagnosticados em 2009, com 1630 mortes relacionadas ao câncer de
tireóide (National Cancer Institute, 2009).
1.2.2- Nódulos de tireóide
Nódulos de tireóide são extremamente comuns. Estima-se que 10% da população
venham a desenvolver um nódulo palpável durante a vida e vários dados indicam que este
número deve ser ainda maior no Brasil, onde, há poucas décadas atrás, ainda havia extensas
áreas carentes de aporte adequado de iodo na alimentação (Welker e Orlov, 2003; Knobel e
Medeiros-Neto, 2004; Tomimori et al., 1995; Furlanetto et al., 2000). Mais recentemente, o
uso da ultra-sonografia como método acessível a grandes populações e de custo
relativamente pequeno em nosso meio, vem aumentando sensivelmente o número de
pacientes com nódulos diagnosticados já que a ultra-sonografia diagnostica nódulos em até
67% da população (Chow et al., 2003; Hegedus et al., 2003; Tan e Gharib, 1997). No
entanto, a maioria dos nódulos tireoidianos é causada por doenças benignas, como nódulos
4
colóides, cistos e neoplasias Foliculares benignas, de modo que menos de 5% dos pacientes
são portadores de câncer de tireóide (Tan e Gharib, 1997; Hegedus et al., 2003).
Os tumores benignos da tireóide são denominados Adenomas. São raros, de origem
epitelial, bem encapsulado, não invadem os tecidos vizinhos e não produzem metástases. Os
tumores malignos da tireóide são raros e apresentam quadros clínicos extremamente variáveis,
desde aqueles com crescimento muito lento e compatível com uma expectativa de vida normal,
até aqueles com péssima evolução e que levam ao óbito em períodos de semanas ou meses
(Morari, 2006).
O Carcinoma Papilífero é o mais freqüente tipo de câncer de tireóide, acomete
aproximadamente 85% dos casos diagnosticados (Jemal et al., 2008). Cerca de 10% dos
carcinomas diferenciados são classificados de Foliculares. O carcinoma de tireóide medular é
derivado de células C para-Foliculares, tem uma taxa de herança familiar de aproximadamente
10% e é responsável por cerca de 5% dos cânceres da tiróide (Robbins et al., 1991). Há ainda
um pequeno número de carcinomas indiferenciados denominados tumores anaplásicos que são
mais agressivos e fatais.
1.2.3-Diagnóstico do carcinoma de tireóide
O exame de ultra-som (US) é muito empregado no diagnóstico dos nódulos
tireoidianos benignos e malignos, muitas vezes o nódulo é descoberto a partir de um US de
rotina. No entanto, seus achados são muito inespecíficos para caracterização do nódulo,
quanto à sua natureza (Barraclough e Barraclough, 2000).
Assim, o diagnóstico de CDT necessita de confirmação citológica ou histológica. A
aspiração por agulha fina (PAAF) é a forma mais interessante, do ponto de vista custo-
efetividade, para distinguir lesões benignas de malignas. Na maior parte dos casos, a
5
citologia obtida na punção aspirativa por agulha fina possibilita adequado planejamento
cirúrgico. Entretanto, principalmente nas lesões Foliculares denominadas “suspeitas” para
Carcinoma Folicular ou neoplasia de Hürthle, o diagnóstico definitivo do CDT depende de
cuidadoso exame anatomopatológico. A invasão da cápsula do nódulo ou de vasos é
essencial para o diagnóstico de Carcinoma Folicular (incluindo a variante de Hürthle)
(Schlumberger e Torlantano, 2000).
Com isso, o diagnóstico citológico das lesões de padrão Folicular não é tão simples.
É difícil distinguir Adenomas de Carcinomas Foliculares, além de vários casos de
Carcinomas Papilíferos de variante Folicular e mesmo casos de hiperplasias poderem se
assemelhar. Marcadores moleculares de malignidade como a galectina- 3, as citoqueratinas
e o HBME-1, entre outros, podem ajudar no diagnóstico, embora nenhum marcador tenha
se mostrado particularmente útil até o presente momento (Schlumberger e Torlantano,
2000; Boone et al., 2003; Matos et al., 2005).
Pesquisadores têm buscado intensamente marcadores moleculares que possam, ao lado
dos clássicos parâmetros clínicos e anatomopatológicos, distinguirem pacientes com tumores
que poderiam evoluir de forma desfavorável daqueles com melhor prognóstico, e assim
determinar um tratamento mais apropriado para cada indivíduo, minimizando os riscos
cirúrgicos e o custo efetivo de cada tratamento (Ward e Assumpção, 2004). Os pacientes de
alto risco poderiam ser alvo de uma abordagem cirúrgica mais agressiva e de um seguimento
mais próximo, em oposição à grande maioria de casos de bom prognóstico, ou baixo risco, que
poderiam ser poupados de tais medidas (Mazzaferri e Jhiang, 1994; Zidan et al., 2003; Ward
et al., 2003; Souza et al., 2003).
6
Portanto, a busca de marcadores para esses tumores é importante para melhorar
tanto o diagnóstico como o prognóstico, assim como para diminuir o número de cirurgias
desnecessárias.
1.3-Resposta imune contra tumores
A possibilidade de que cânceres possam ser erradicados por respostas imunológicas
específicas foi o ímpeto para grande quantidade de trabalhos no campo da imunologia
tumoral. O conceito de vigilância imunológica, proposto por Macfarlane Burnet na década
de 1950, afirma que uma função fisiológica do sistema imunológico é reconhecer e destruir
clones de células transformadas antes que eles se transformem em tumores e destruir os
tumores depois que já estão formados. Embora a importância da vigilância imunológica
tenha sido controversa, está claro que o sistema imunológico de fato reage contra muitos
tumores, e o aproveitamento dessas reações para destruir tumores de forma específica
continua sendo um objetivo dos pesquisadores (Abbas et al., 2000).
A imunidade contra tumores é mediada por células Natural killer (NK), macrófagos
do sistema imune inato; linfócitos T e anticorpos do sistema adaptativo. Ocorre a partir do
reconhecimento de antígenos tumorais expressos pelos tumores. Contudo, a maioria dos
tumores é fracamente imunogênica e as respostas imunológicas com freqüência não
previnem o crescimento de tumores (Abbas et al., 2000). Além do sistema imune não
eliminar com eficácia as células tumorais, o estudo de Lewis e Pollard (2006) detalhou que
os macrófagos podem ser “reeducados” pelas células cancerosas para tornarem fábricas de
citocinas e fatores de crescimento que nutrem o desenvolvimento tumoral. Ou seja, os
7
tumores interceptam o sistema imune para promover seu próprio crescimento e
sobrevivência.
Com relação aos antígenos tumorais que desencadeiam uma resposta imune no
paciente, estes podem ser de vários tipos, tais como: produtos de oncogenes e genes
supressores de tumorais, mutantes de genes celulares não envolvidos em tumorigênese,
produtos de genes que são silenciosos na maioria dos tecidos normais, produtos de genes
hiperexpressos, produtos de vírus oncogênicos, antígenos oncofetais, glicolipídeos e
glicoproteínas, antígenos de diferenciação normalmente presentes no tecido de origem
(Abbas et al., 2000). Esses antígenos podem ser utilizados como marcadores tumorais
auxiliando o diagnóstico precoce e prognóstico do câncer.
Tradicionalmente, a maioria dos métodos de identificação de marcadores tumorais é
baseado em anticorpos monoclonais (mAbs). Os mAbs são gerados tanto pela tecnologia de
hibridoma, quanto por bibliotecas de anticorpos (Popkov, 2004), as quais podem ser do tipo
naïve, semi-sintética ou completamente sintética (Hust e Dubel, 2004). Diversas são as
vantagens apresentadas por anticorpos recombinantes, tais como: podem ser produzidos em
bactérias, fungos ou plantas, não necessitam de imunização e as suas propriedades
intrínsecas que incluem imunogenicidade, afinidade, especificidade e estabilidade podem
ser aprimoradas por tecnologias mutagênicas (Pansri et al., 2009). A construção e seleção
de bibliotecas combinatórias de anticorpos expressos em fagos filamentosos tem se tornado
uma alternativa na busca de clones antígeno-específicos, sem reatividade cruzada, mas com
aplicação diagnóstica e terapêutica (Kim et al., 2005).
A técnica de bibliotecas apresentadas na superfície de fagos permite a utilização não
de apenas um anticorpo monoclonal, mas de uma vasta biblioteca de anticorpos ou
peptídeos contra o conjunto das proteínas do tumor. Desde a sua concepção, a técnica de
8
Phage display vem sendo empregada visando à identificação de marcadores tumorais
(Austin, 1989).
1.4-Imunoglobulinas
As imunoglobulinas são moléculas capazes de localizar, reconhecer e ligar-se a
antígenos específicos com a finalidade de inativar ou dar início a eliminação destes. Essas
moléculas são produzidas por linfócitos B, são glicoproteínas de massa molecular elevada,
em torno de 150 kDa, e estão presentes por exemplo no sangue circulante e na linfa
(Silverton, 1977).
As imunoglobulinas são de natureza tetramérica, compostas por duas cadeias leves e
duas cadeias pesadas, unidas por uma extensiva rede de interações não-covalentes,
estabilizadas por pontes dissulfeto. Tanto as cadeias leves quanto as pesadas contêm uma
série de unidades homólogas repetidas, cada uma com cerca de 110 resíduos de
aminoácidos que se enovelam independentemente em um motivo globular classificado
como Domínio Imune (Padlan, 1994).
A cadeia leve é composta por uma porção variável (VL) e uma porção constante
(CL), e a cadeia pesada é composta de uma porção variável (VH) e três ou quatro porções
constantes, dependendo da classe de imunoglobulina, chamadas de CH1, CH2, CH3 e CH4
(Figura 1). A região constante da cadeia leve pode apresentar dois tipos de domínios
segundo suas seqüências de aminoácidos: kappa (κ) ou lambda (λ). Já as regiões constantes
das cadeias pesadas são constituídas de três ou quatro domínios agrupando-se em cinco
padrões diferentes de seqüências de aminoácidos designadas pelas letras do alfabeto grego
α, δ, ε, γ e μ. Esse último é o critério determinante da classe ou isótipo ao qual o anticorpo
9
pertence, podendo este ser uma IgA, IgD, IgE, IgG ou IgM, correspondendo,
respectivamente, aos cinco tipos de regiões constantes (Abbas et al., 2000).
A imunoglobulina pode ser subdividida em porções Fc e Fab, a Fab é constituída
pelos domínios VH-CH1 e VL-CL, no qual a regiões variáveis (V) determinam a
especificidade, diversidade e afinidade da ligação ao antígeno. Em cada domínio variável
existem três regiões hipervariáveis, essas regiões são responsáveis pelo reconhecimento
antigênico com a formação de um sítio complementar ao epítopo (região que é reconhecida
no antígeno), essas regiões hipervariáveis são também chamadas de regiões determinantes
de complementaridade (CDRs) (Weisser, 2009).
As três CDRs de cada cadeia são nomeadas como CDR1, CDR2 ou CDR3, ou
então, H1, H2, H3 e L1, L2, L3, explicitando a cadeia a qual pertencem, pesada ou leve,
respectivamente. As regiões que intercalam as CDRs são conhecidas como arcabouço
(Framework – FW) dos domínios variáveis (Abbas et al., 2000).
Além da porção Fab responsável pelo reconhecimento de antígenos, a
imunoglobulina é constituída pela porção Fc que é responsável por manter a estrutura do
anticorpo, determinar a meia- vida sérica e desencadear funções efetoras. Entre as funções
efetoras está a liberação de citocinas, a citotoxicidade dependente de complemento (CDC) e
a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). Com relação à função ADCC
nas células, tumorais a ativação do sistema imune ocorre da seguinte maneira, após a
ligação do anticorpo a um antígeno da superfície celular tumoral a porção Fc pode interagir
com células efetoras de sistema imune como as células NK, que provocam a lise celular
pela liberação de granzimas e perforinas, os debris celulares resultantes da lise celular são
apresentados aos Linfócitos T e B que agirão especificamente nas células tumorais (Adams,
2005).
10
Figura 1. Estrutura básica de um anticorpo IgG. Cadeias pesadas (azul); cadeias leves
(amarelo); domínios variáveis (VH e VL). A molécula de IgG possui um carboidrato na
região N- terminal ligado ao aminoácido Asn297 do domínio CH2. A ligação funcional do
antígeno é mediada pela porção Fab, sendo a especificidade ao antígeno determinada pela
porção Fv. As funções biológicas efetoras são mediadas pela região Fc da molécula
(Adaptado de Weisser e Hall, 2009)
1.5- Fragmentos de anticorpos
Fragmentos de anticorpos recombinantes (rAb) estão se tornando alternativas em
relação ao uso de anticorpos monoclonais inteiros uma vez que são menores, possuem
diferentes propriedades vantajosas em determinadas aplicações médicas (diagnóstica e
terapêutica), podem ser produzidos de forma mais econômica e são facilmente alteráveis
por manipulação genética (Weisser, 2009). Uma grande variedade de formatos de rAb
(Figura 2) tem sido construídos para diversas aplicações, tais como: biomarcadores de
doenças, acoplados a reagentes incluindo drogas e toxinas para o tratamento do câncer,
vírus para terapia gênica, lipossomos para melhorar a entrega de drogas e biosensores para
detecção em tempo real das moléculas alvo (Hollinger e Hudson, 2005).
11
Figura 2. Representação esquemática de diferentes formatos de fragmentos de anticorpos. Uma
molécula clássica de IgG é mostrada e também uma variedade de fragmentos de anticorpos, incluindo scFv,
Fab, Bis-scfv, diabodies, triabodies e tetrabodies (Adaptado de Hollinger e Hudson, 2005).
Um dos tipos mais populares de rAb são scFvs (single-chain variable fragment),
cuja massa molecular é de 26 a 28 kDa, são compostos pelas cadeias VH e VL unidas por
um peptídeo conector flexível (Maynard e Georgiou, 2000) (Figura 3). Os primeiros scFvs
foram desenvolvidos independentemente por Huston et al. (1988) e Bird et al. (1988) e
foram originalmente derivados de genes isolados de linhagens celulares de hibridomas. Os
peptídeos conectores que ligam as cadeias VH e VL são usualmente compostos por 10 a 25
aminoácidos, sendo o decapeptídeo (Gly4Ser)3 o mais comum deles. As regiões variáveis
podem ser conectadas no sentido VH-conector-VL ou VL-conector-VH e a orientação das
cadeias no scFv pode afetar a eficiência da expressão (Merk et al., 1999), a estabilidade e a
capacidade de ligação do mesmo ao antígeno (Desplancq et al., 1994).
12
Figura 3. Representação esquemática do fragmento scFv. Os domínios VH e VL presentes na
molécula scFv aparecem nas cores verde e vermelho, respectivamente. O polipeptídeo (peptide
linker) estabilizador dos domínios está indicado em azul.
1.6- Apresentação de fragmentos de anticorpos scFv por Phage
display
Diversas metodologias de apresentação de moléculas na superfície de vírus e células
têm sido descritas, incluindo as técnicas de Phage-Display (Ph.D.) (McCafferty et al.,
1990), Ribossome Display (Hanes e Pluckthun, 1997; He e Taussig, 1997) e Cell-Surface
Display (Francisco et al., 1993), através das quais anticorpos ou fragmentos de anticorpos
podem ser selecionados pela reatividade a antígenos de interesse.
A tecnologia Phage Display (Ph.D.) de apresentação de polipeptídeos na superfície
de bacteriófagos filamentosos foi introduzida pela primeira vez por G. Smith em 1985
(Smith, 1985). Ph.D. é a mais antiga e mais utilizada técnica de apresentação de moléculas
e é utilizada para apresentar, enriquecer e amadurecer a afinidade de um vasto número de
proteínas e peptídeos a partir de uma grande biblioteca com mais de 1010
variantes. A
13
vantagem crucial desta tecnologia é sua capacidade de conectar o fenótipo experimental (a
molécula apresentada) com o seu genótipo encapsulado (o DNA codificante da molécula
apresentada) (Scott e Smith, 1990).
Tipicamente, utilizam-se bacteriófagos da família Inoviridae (M13, fd, f1) (Sidhu,
2001), vírus bacteriófagos filamentosos que parasitam bactérias gramnegativas que
possuem o pílus F. O vírus aproveita a maquinaria de replicação, transcrição e tradução da
bactéria para se reproduzir. O bacteriófago M13 não provoca lise na célula hospedeira, mas
induz um estado no qual a célula infectada origina e libera partículas virais, causando uma
queda na taxa de reprodução bacteriana (Azzazy e Highsmith, 2002).
A partícula de fago é formada por uma fita simples de DNA circular envolta por
uma capa protéica constituída por cinco proteínas (pIII, pVI, pVII, pVIII e pIX) (Figura 4).
Destas cinco proteínas, existem aproximadamente 2800 cópias da pVIII e cinco cópias da
pIII. Neste sistema, o gene codificador do peptídeo ou proteína de interesse é geralmente
fusionado a um dos genes destas duas proteínas da capa protéica do fago (Phizicky e Fields,
1995).
14
Figura 4. Estrutura básica de um bacteriófago filamentoso. A- Sítio de clonagem no
fagomídeo junto à seqüência da proteína pIII. B- Estrutura do capsídeo viral, mostrando as
proteínas de superfície pIII, pVII, pVIII e pIX. C- Sub-unidades D1 e D2 da proteína pIII,
mostrando a extremidade N- terminal da proteína ( Adaptado de Hollinger e
Williams,1999).
Em 1990, foram obtidos os primeiros fragmentos de anticorpos expressos em fago
(McCafferty et al., 1990). Normalmente, bibliotecas combinatórias de anticorpos são
sintetizadas a partir da construção de genes dos fragmentos de anticorpos recombinantes na
forma de scFv ou Fab e, em seguida, estes genes são introduzidos por manipulação genética
em fagomídeos fusionados ao gene codificador de uma proteína capsídica. No caso de
bibliotecas, são utilizados genes codificantes para milhões de fragmentos distintos.
Os fagomídeos representam uma alternativa prática ao uso e manipulação do DNA
viral para expressão de anticorpos recombinantes. Fagomídeos são plasmídeos que
15
possuem origem de replicação bacteriana, origem de replicação viral, gene de fusão (pIII ou
pVIII), sítio de inserção do fragmento codificante do anticorpo ou qualquer outra proteína
de interesse e genes de resistência a antibióticos para seleção em meio apropriado. Como os
fagomídeos não possuem todas as proteínas necessárias para a encapsidamento da partícula
viral, fagos auxiliares (helper) contendo todos os genes dos bacteriófagos filamentosos são
utilizados nas culturas de células transformadas com o fagomídeo, permitindo o resgate da
partícula viral (Barbas et al., 2001).
Durante a infecção viral, o DNA proveniente dos fagomídeos é revestido pelas
proteínas estruturais, pois os fagos helper possuem mutações na origem de replicação,
dificultando sua reprodução e empacotamento de seu próprio material genético (Barbas et
al., 2001).
A descoberta de que sítios funcionais de anticorpos, como os scFvs, podem ser
apresentados na superfície de bacteriófagos permitiu a seleção de anticorpos contra
antígenos de interesse sem a necessidade de utilização da tecnologia do hibridoma
(McCafferty et al., 1990). Bibliotecas de scFv apresentadas em fagos consistem de diversos
domínios de cadeias leves e pesadas fusionados à proteína pIII do fago e apresentados
externamente como um scFv (Vaughan et al., 1996). Os fragmentos de anticorpos podem
ser expressos em bactérias rapidamente, em grandes quantidades e a baixos custos, se
comparados à expressão de anticorpos completos em cultura de células animais. O DNA
codificante para uma biblioteca de scFv pode ser clonado no genoma de um fago ou em um
vetor fagomídeo para produzir uma fusão scFv-pIII. Em vetores, o DNA codificante da
biblioteca pode ser clonado no genoma de fagos filamentosos (Scott e Smith, 1990) ou
pode ser inserido como um cassete gênico que codifique a seqüência completa da fusão
scFv pIII dentro do genoma do fago. Ambos os tipos de vetores possuem seqüências
16
codificantes para todas as proteínas necessárias para a replicação e montagem do fago
(McLafferty et al., 1993).
O método mais comum de Ph.D. para bibliotecas de anticorpos é realizado com
vetores fagomídeos, uma vez que esse sistema utiliza uma estratégia de clonagem mais fácil
e apresenta uma estabilidade genética maior quando comparados aos demais vetores, além
de permitir a ligação mais eficiente do scFv ao alvo. Fagomídeos têm sido desenvolvidos
para aumentar a eficiência da expressão (Pavoni et al., 2007) e fagos auxiliares têm sido
remodelados para reduzir sua influência negativa („bald phage‟ background) nos processos
de seleção dos fagos ligantes (Kristensen e Winter, 1998).
A seleção dos fragmentos de anticorpos das bibliotecas de scFv expressas em fagos
é um procedimento relativamente padronizado que envolve a exposição dos fagos ao
antígeno alvo, permitindo a ligação e enriquecimento daqueles que expressam moléculas
antígeno-específicas em um processo conhecido como panning (Figura 5).
No processo de seleção, a biblioteca de fagos apresentando os fragmentos de
anticorpos é incubada com o antígeno alvo que está imobilizado em um suporte sólido,
como uma placa de microtitulação (Schofield et al., 2007), ou ligada a antígenos
biotinilados em solução (Parmley e Smith, 1988). Os fagos não ligantes são removidos por
sucessivas lavagens e os ligantes são eluídos pela incubação dos mesmos em soluções com
valores de pH extremamente altos ou baixos (Mackenzie e To, 1998; Pincus et al., 1988),
por clivagem proteolítica (Goletz et al., 2002) ou utilizando centrifugação em gradiente ou
em fase orgânica (Giordano, 2001).
17
Figura 5. Ciclos de seleção de proteínas ligantes a partir de uma biblioteca de Phage Display. Bibliotecas
de proteínas (coloridas) são apresentadas em partículas de fagos fusionadas às proteínas de superfície (preto).
Bibliotecas altamente diversas (1010
) podem ser apresentadas em fagos e clones com especificidade a
determinados antígenos podem ser selecionados pela ligação aos antígenos imobilizados, seguido pela
lavagem e remoção dos fagos não ligantes. Os fagos ligantes podem ser amplificados pela infecção em
bactérias e utilizados em outros ciclos de seleção, para enriquecimento dos fagos ligantes ao antígeno de
interesse. O DNA de cada clone selecionado pode ser sequenciado e revelar a sequencia da proteína
apresentada que possua afinidade com o antígeno (Adaptado de Sidhu e Koide, 2007).
Diversas bibliotecas de scFv expressas em fagos têm sido desenvolvidas (Azriel-
Rosenfeld et al., 2004; Krebs et al., 2001; Vaughan et al., 1996), algumas delas com
finalidades específicas, como para otimizar a expressão de anticorpos no citoplasma celular
(biblioteca de anticorpos internos) (Philibert et al., 2007), ou para aumentar o
reconhecimento de antígenos como proteínas (Sheets et al., 1998) ou carboidratos (Ravn et
al., 2004). Embora diversas formas de anticorpos estejam sendo desenvolvidas para Ph.D.,
os scFvs mantêm-se ainda como os mais utilizados.
18
2-OBJETIVOS
19
2.1- Objetivo Geral
O objetivo geral deste trabalho consistiu na construção de uma biblioteca de
fragmentos de anticorpos monoclonais scFv expressa em fagos para seleção e
caracterização de anticorpos ligantes a células tumorais de tireóide.
2.2- Objetivos Específicos
1. Construção de uma biblioteca imune e humana de fragmentos de anticorpos
monoclonais (scFv) apresentada em fagos (Phage Display) de pacientes com
Carcinoma Diferenciado da Tireóide.
2. Avaliação da qualidade da biblioteca por análise da diversidade do repertório de
anticorpos clonados.
3. Seleção de fragmentos de anticorpos ligantes e específicos à células tumorais de
tireóide.
4. Caracterização dos fragmentos de anticorpos selecionados.
5. Análise da reatividade do scFv aos tecidos de carcinoma de tireóide, bócio colóide,
Adenoma Folicular e tireóide normal por imunoistoquímica.
6. Relacionar a reatividade do fragmento de anticorpo scFv na imunoistoquímica com
os dados clínicos, como o estadiamento de tumor, evolução clínica, idade ao
dignóstico.
20
3- MATERIAL E MÉTODOS
21
3.1- As soluções utilizadas estão descritas no ANEXO 1.
3.2-Linhagem de Células Humanas
NPA: linhagem de células tumorais de Carcinoma Papilífero de tireóide.
3.3- Linhagens Bacterianas
As linhagens de Escherichia coli utilizadas na metodologia do trabalho foram:
XL1-Blue (Stratagene) supE44 hsdR17 recA1 endA1 gyrA46 relA1 lac [F' ProAB
lacIq lacIqZ M15, Tn10(tetr)]. Essa linhagem foi utilizada para produção de partículas
virais, transformação e amplificação de fagomídeos.
Top 10 (Invitrogen): F- mcrA ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZ∆M15 ∆lacX74
recA1 araD139 galU galK ∆(ara-leu) 7697 rpsL (StrR) endA1 nupG. Essa linhagem foi
empregada na expressão de scFv em solução.
3.4- Vetor fagomídeo
pComb3XSS -f(-)-4,5 kb, promotores plac, ori ColE1, ori f1, AmpR (Figura 6)
Após a região de clonagem do gene do anticorpo há uma região com seis histidinas (H6)
para purificação na coluna de níquel ou para detecção com anticorpo monoclonal anti-His
Tag e uma região codificadora de resíduos que constituem o epítopo de uma hemaglutinina
(HA) que possibilita a detecção do scFv utilizando um anticorpo anti-hemaglutinina (anti-
HA). Apresenta ainda um códon de parada âmbar (TAG) não reconhecido eficientemente
por linhagens supressoras como a XL 1-Blue ou ER2537, mas reconhecido por cepas de
bactérias não supressoras como a TOP 10 permitindo assim a expressão de proteínas de
22
fusão ou a produção do anticorpo na forma solúvel livre da proteína III. Possui a sequência
codificadora para parte da proteína III de bacteriófagos filamentosos (Scott e Barbas III,
2000).
3.5- Bacteriófago auxiliar
VCSM13: Derivado do bacteriófago M13 com o gene II mutado: origem de
duplicação plasmidial derivada do p15 e gene de resistência à kanamicina (Stratagene).
3.6- Oligonucleotídeos Sintéticos
Os oligonucleotídeos utilizados estão listados na Tabela 1. Os iniciadores utilizados
para amplificar os cDNAs específicos de genes de imunoglobulinas foram sintetizados
segundo Marks e colaboradores (1991). Os iniciadores MMB4 e MMB5 utilizados no
seqüenciamento foram desenhados por Maranhão e colaboradores (2001).
Figura 6. Vetor fagomídeo pComb3X usado na construção de bibliotecas combinatoriais de
anticorpos. O vetor foi desenhado para expressar fragmentos de anticorpos na superfície de fagos
filamentosos ou como proteínas solúveis. Os fragmentos de anticorpos (scFv ou Fab) são fusionados
ao domínio C-terminal da proteína III (coat protein III) e são expostos na superfície das partículas de
fagos. O códon âmbar foi inserido entre o sítio de restrição da enzima SfiI (posição 39) e a porção
terminal do gene III. Isto permite a expressão da proteína em solução por bactérias não supressoras
sem a excisão do gene III. A cauda de histidina (HIS) foi inserida na porção C-terminal do fragmento
Fd para purificação universal de proteínas. O decapeptídeo hemaglutinina (HA) foi inserido para
detecção usando anticorpos anti-HA (Adaptado de Andris-Widhopf et al., 2000).
23
Tabela 1. Oligonucleotídeos utilizados no trabalho.
VH primers senso
HSCVH1-F 5‟ GGT GGT TCC TCT AGA TCT TCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GG 3‟
HSCVH2-F 5‟ GGT GGT TCC TCT AGA TCT TCC CAG ATC ACC TTG AAG GAG TCT GG 3‟
HSCVH35-F 5‟ GGT GGT TCC TCT AGA TCT TCC GAG GTG CAG CTG GTG SAG TCT GG 3‟
HSCVH3a-F 5‟ GGT GGT TCC TCT AGA TCT TCC GAG GTG CAG CTG KTG GAG TCT G 3‟
HSCVH4-F 5‟ GGT GGT TCC TCT AGA TCT TCC CAG GTG CAG CTG CAG GAG TCG GG 3‟
HSCVH4a-F 5‟ GGT TCC TCT AGA TCT TCC CAG GTG CAG CTA CAG CAG TGG GG 3‟
VH primers reverso
HSCG1234-B 5‟ CCT GGC CGG CCT GGC CAC TAG TGA CCG ATG GGC CCT TGG ARG C 3‟
HSCM-B 5‟ CCT GGC CGG CCT GGC CAC TAG TAA GGG TTG GGG CGG ATG CAC TCC C 3‟
Vκ primers senso
HSCK1-F 5‟ GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCC AGA TGA CCC AGT CTC C 3‟
HSCK24-F 5‟ GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG TGA TGA CYC AGT CTC C 3‟
HSCK3-F 5‟ GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG TGW TGA CRC AGT CTC C 3‟
HSCK5-F 5‟ GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCA CACTCA CGC AGT CTC C 3‟
Vκ primers reverso
HSCJK14o-B 5‟ GGA AGA TCT AGA GGA ACC ACC TTT GAT YTC CAC CTT GGT CCC 3‟
HSCJK2o-B 5‟ GGA AGA TCT AGA GGA ACC ACC TTT GAT CTC CAG CTT GGT CCC 3‟
HSCJK3o-B 5‟ GGA AGA TCT AGA GGA ACC ACC TTT GAT ATC CAC TTT GGT CCC 3‟
HSCJK5o-B 5‟ GGA AGA TCT AGA GGA ACC ACC TTT AAT CTC CAG TCG TGT CCC 3‟
Vλ primers senso
HSCLam1a 5‟ GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG TGB TGA CGC AGC CGC CCT C 3‟
HSCLam1b 5‟ GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG TGC TGA CTC AGC CAC CCT C 3‟
HSCLam2 5‟ GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG CCC TGA CTC AGC CTC CCT CCG T 3‟
HSCLam3 5‟ GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AGC TGA CTC AGC CAC CCT CAG TGT C 3‟
HSCLam4 5‟ GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG TGC TGA CTC AAT CGC CCT C 3‟
HSCLam6 5‟ GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCA TGC TGA CTC AGC CCC ACT C 3‟
HSCLam78 5‟ GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG TGG TGA CYC AGG AGC CMT C 3‟
HSCLam9 5‟ GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG TGC TGA CTC AGC CAC CTT C 3‟
HSCLam10 5‟ GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG GGC AGA CTC AGC AGC TCT C 3‟
Vλ primers reverso
HSCJLam1236 5‟ GGA AGA TCT AGA GGA ACC ACC GCC TAG GAC GGT CAS CTT GGT SCC 3‟
HSCJLam4 5‟ GGA AGA TCT AGA GGA ACC ACC GCC TAA AAT GAT CAG CTG GGT TCC 3‟
HSCJLam57 5‟ GGA AGA TCT AGA GGA ACC ACC GCC GAG GAC GGT CAG CTS GGT SCC 3‟
Primers da extensão overlap
RSC-F senso 5‟ GAG GAG GAG GAG GAG GAG GCG GGG CCC AGG CGG CCG AGC TC 3‟
RSC-B reverso 5‟ GAG GAG GAG GAG GAG GAG CCT GGC CGG CCT GGC CAC TAG TG 3‟
Primers para sequenciamento do scFv clonado no vetor pComb3XSS
MMB4 5‟ GCT TCC GGC TCG TAT GTT GTG T 3‟
MMB5 5‟ CGT TTG CCA TCT TTT CAT AAT C 3‟
24
3.7- Construção da Biblioteca de anticorpos: Amplificação das
Sequências Codificadoras de VH e VL por PCR e Montagem do scFv
A Figura 7 apresenta um esquema geral de todos os passos executados para a
obtenção da biblioteca de fragmentos de anticorpos scFv apresentados em fagos e posterior
seleção contra células humanas de tireóide.
Figura 7. Esquema da construção e seleção da biblioteca de scFv de pacientes com carcinoma
diferenciado de tireóide.
Crescimento e transformação de
XL1-Blue e vetor pComb3XSS
Preparação do RNA
Síntese do cDNA
↓ ↓
Preparação de plasmídeo PCR Vκ e VH
↓ ↓
Digestão de 20 µg com SfiI Purificação em gel
↓ ↓
Purificação do gel / vetor e
fragmento Fab liberado
→ Ligação teste
(Transformação) Quantificação
↓ ↓
Ligação dos scFvs
PCR Overlap para produzir a
ligação cadeias leve e pesada
↓ ↓
Transformação de células
competentes Purificação em gel
↓
Digestão com SfiI
↓
Purificação em gel
↓
scFv preparado
↓
Ligação teste
(Transformação)
Titulação → Resgate com fago
auxiliar → Preparação dos fagos
↓
↑ Seleção Titulação
↓
Infecção ← Centrifugação ← Incubação com o antígeno
25
3.7.1- Obtenção das amostras e extração de RNA total de Linfócitos dos
Pacientes com Carcinoma de Tiróide
Vinte e cinco pacientes atendidos no Hospital de Clínicas da Unicamp com
diagnóstico estabelecido de Carcinoma diferenciado de tiróide foram doadores de sangue
para este trabalho. O trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética da Faculdade de Ciências
Médicas número 096/2008 (ANEXO 2).
De cada paciente foram coletados cerca de 4 mL de sangue total em tubo contendo
EDTA. O material foi encaminhado ao Laboratório de Genética Molecular do Câncer
(GEMOCA) e o RNA foi extraído conforme o protocolo em ANEXO 3.
3.7.2- Síntese da primeira fita de cDNA
Para a síntese da primeira fita de cDNA foi utilizado o kit SuperScript® III
(Invitrogen) com primer randômico, a reação foi submetida às seguintes condições: 5 µg de
RNA total, 1µL do primer randômico, 1 µL do mix de dNTPs (10mM) e H2O DEPC para
completar 13µL de volume final. As amostras foram incubadas em termociclador PTC-150
(MJ Research, Inc.) a 65°C por 5 minutos e colocadas imediatamente no gelo por 1 minuto.
Em seguida foi adicionada a cada reação uma mistura de: 1 µL de RNase Out, 4 µL de 5X
tampão da primeira fita, 1 µL de DTT 0,1M e 1 µL de superscript III. Na sequencia, a
amostra foi incubada a 25°C por 5 minutos e, posteriormente, a 50°C por 60 minutos e a
70°C por 15 minutos. Para remover o RNA complementar do cDNA foi adicionado 1µL de
RNase H e incubado a 37°C durante 20 minutos. A primeira fita de cDNA foi estocado a -
20°C para posterior amplificação.
26
3.7.3- Primeiro ciclo de PCR
Para a construção da biblioteca de scFv foram realizadas 12 reações de PCR para
amplificação dos genes da cadeia variável pesada VH e 43 reações para os genes da cadeia
leve, esta subdividida em Vκ (kappa) e Vλ (lambda). Em cada reação foi utilizado o cDNA
como molde e uma combinação de primer, como listado abaixo:
Combinações de VH:
Reação 1 HSCVH1-F com HSCG1234-B
Reação 2 HSCVH35-F com HSCG1234-B
Reação 3 HSCGVH4-F com HSCG1234-B
Reação 4 HSCVH1-F com HSCM-B
Reação 5 HSCVH35-F com HSCM-B
Reação 6 HSCVH4-F com HSCM-B
Reação 7 HSCVH2-F com HSCG1234-B
Reação 8 HSCVH3a-F com HSCG1234-B
Reação 9 HSCVH4a-F com HSCG1234-B
Reação 10 HSCVH2-F com HSCM-B
Reação 11 HSCVH3a-F com HSCM-B
Reação 12 HSCVH4a-F com HSCM-B
Combinações de Vκ:
Reação 13 HSCK1-F com HSCJK14o-B
Reação 14 HSCK3-F com HSCJK14o-B
Reação 15 HSCK1-F com HSCJK2o-B
Reação 16 HSCK3-F com HSCJK2o-B
Reação 17 HSCK1-F com HSCJK3o-B
Reação 18 HSCK3-F com HSCJK3o-B
Reação 19 HSCK1-F com HSCJK5o-B
Reação 20 HSCK3-F com HSCJK5o-B
Reação 21 HSCK24-F com HSCJK14o-B
Reação 22 HSCK5-F com HSCJ14o-B
Reação 23 HSCK24-F com HSCJK2o-B
Reação 24 HSCK5-F com HSCJK2o-B
27
Reação 25 HSCK24-F com HSCJK3o-B
Reação 26 HSCK5-F com HSCJK3o-B
Reação 27 HSCK24-F com HSCJK5o-B
Reação 28 HSCK5-F com HSCJK5o-B
Combinações de Vλ:
Reação 29 HSCLam1a com HSCJLam1236
Reação 30 HSCLam2 com HSCJLam1236
Reação 31 HSCLam4 com HSCJLam1236
Reação 32 HSCLam78 com HSCJLam1236
Reação 33 HSCLam10 com HSCJLam1236
Reação 34 HSCLam1a com HSCJLam4
Reação 35 HSCLam2 com HSCJLam4
Reação 36 HSCLam4 com HSCJLam4
Reação 37 HSCLam78 com HSCJLam4
Reação 38 HSCLam10 com HSCJLam4
Reação 39 HSCLam1a com HSCJLam57
Reação 40 HSCLam2 com HSCJLam57
Reação 41 HSCLam4 com HSCJLam57
Reação 42 HSCLam78 com HSCJLam57
Reação 43 HSCLam10 com HSCJLam57
Reação 44 HSCLam1b com HSCJLam1236
Reação 45 HSCLam3 com HSCJLam1236
Reação 46 HSCLam6 com HSCJLam1236
Reação 47 HSCLam9 com HSCJLam1236
Reação 48 HSCLam1b com HSCJLam4
Reação 49 HSCLam3 com HSCJLam4
Reação 50 HSCLam6 com HSCJLam4
Reação 51 HSCLam9 com HSCJLam4
Reação 52 HSCLam1b com HSCJLam57
Reação 53 HSCLam3 com HSCJLam57
Reação 54 HSCLam6 com HSCJLam57
Reação 55 HSCLam9 com HSCJLam57
28
Cada uma dessas reações consistia de:
cDNA (~0,5µg) 2 µL
Primer 5‟ (10 pmoles/μL) 60,0 pmoles
Primer 3‟ (10 pmoles/μL) 60,0 pmoles
Tampão de PCR 10X 10,0 µL
dNTPs (10 mM) 2 mM
MgCl2 2,5 mM
Taq DNA Polimerase (0,5 U/μL) 0,5 µL
Água bidestilada q.s.p. 100,0 µL
As reações em cadeia da polimerase foram realizadas nas seguintes condições:
1. 94°C por 5 minutos;
2. 37 ciclos de:
94°C por 1 minuto;
57°C por 1 minuto;
72°C por 90 segundos;
3. 72°C por 10 minutos.
As reações foram aplicadas em gel de agarose 1,5% para análise dos fragmentos
amplificados. As bandas de VH e VL tem aproximadamente 400 pb e 350 pb,
respectivamente.
3.7.4- Precipitação e purificação dos produtos de PCR
Pools dos produtos de cada tipo de reação VH, Vκ e Vλ foram precipitadas com 2
volumes de etanol e 0,1 volume de acetato de sódio 3M (pH 5,0), centrifugados e
posteriormente ressupensos em 20 µL de água. Em seguida, foram submetidos à
eletroforese em gel de agarose 1,5% e purificados conforme protocolo (ANEXO 4). Os
produtos foram quantificados em espectrofotômetro a 260 nm.
29
3.7.5- Amplificação dos fragmentos scFv
Para a amplificação dos fragmentos de anticorpos scFv, os produtos da amplificação
das cadeias VH e VL foram reunidos em quantidades iguais para gerar um produto final de
sobreposição (overlap). Os primers do primeiro ciclo criaram sequências complementares
na região variável da cadeia leve e pesada o que possibilitou a extensão do produto gerando
o fragmento scFv.
Dez replicas de cada reação seguiram as combinações (VH + Vκ) e (VH + Vλ)
foram realizadas como descrito a seguir:
Fragmentos amplificados VH 200 ng
Fragmentos amplificados Vκ ou Vλ 200 ng
Primer RSC-F senso 60,0 pmoles
Primer RSC-B reverso 60,0 pmoles
Tampão de PCR 10X 10,0 µL
dNTPs (10 mM) 2 mM
MgCl2 2,5 mM
Taq DNA Polimerase (5 U/ µL) 0,5 µL
Água bidestilada q.s.p. 100,0 µL
As reações em cadeia da polimerase foram realizadas nas seguintes condições:
1. 56°C por 1 minuto
2. 72°C por 5 minutos
3. 94°C por 5 minutos
4. 94°C por 1 minuto
5. 50°C por 1 minuto
6. 72°C por 4 minutos
7. Dez vezes o passo 4
8. 94°C por 1 minuto
9. 56°C por 2 minutos
30
10. 72°C por 4 minutos
11. Quinze vezes o passo 8
Extensão final a 72°C por 10 minutos.
As reações foram aplicadas em gel de agarose 1,5% para análise e separação dos
fragmentos amplificados. O produto scFv apresentou banda de aproximadamente 800 pb.
3.7.6- Precipitação e purificação dos produtos de PCR
Pools dos produtos de cada tipo de reação (VH +Vκ) e (VH +Vλ) foram precipitadas
com 2 volumes de etanol e 0,1 volume de acetato de sódio 3M (pH 5,0), centrifugados e
posteriormente ressupensos em 20 µL de água. Em seguida, foram submetidos à
eletroforese em gel de agarose 1,5% e as bandas de aproximadamente 800pb foram
purificados utilizando o kit Promega. Após a purificação, os fragmentos scFv foram
quantificados em espectrofotômetro a 260 nm.
3.7.7- Restrição dos scFvs obtidos por PCR e do vetor pComb3XSS com a
Enzima SfiI
Os fragmentos scFv bem como o vetor pComb3XSS foram digeridos com a enzima
SfiI (Fermentas) de acordo com as reações descritas abaixo:
scFv purificado 12 µg
SfiI (20 U por µg de DNA) 443 U
Tampão da enzima 10X 20 µL
Água Bidestilada q.s.p. 200 µL
Vetor pComb3XSS contendo fragmento não relacionado 10µg
31
SfiI (40 U por µg de DNA) 400U
Tampão da enzima 10X 20 µL
Água Bidestilada q.s.p. 200 µL
As reações foram incubadas a 50°C em banho-maria durante 36 horas.
Os fragmentos digeridos (scFv, vetor pComb3XSS) foram precipitados com 2
volumes de etanol e incubados a -80°C durante a noite. Em seguida, foram submetidos à
eletroforese em gel de agarose 1,5% para o fragmento scFv e gel a 0,8% para o vetor, em
seguida purificados conforme protocolo em ANEXO 4. Após a purificação, os fragmentos
scFv foram quantificados em espectrofotômetro a 260 nm.
3.7.8- Ligação do scFv com o vetor pComb3XSS digeridos com a Enzima SfiI e
purificados
Primeiramente foram feitos testes de ligação em pequena escala para verificar a
qualidade do vetor e insertos para uma eficiente ligação e transformação. Cada uma destas
reações está descrita abaixo:
Ligação teste
pComb3XSS digerido com SfiI 140ng
scFv digerido com SfiI 125 ng
Tampão de ligase 5X 4 µL
T4 DNA ligase 1 µL
Água Bidestilada q.s.p. 20 µL
32
Ligação controle (teste de auto ligação do vetor)
pComb3XSS digerido com SfiI 140 ng
Tampão de ligase 5X 4 µL
T4 DNA ligase 1 µL
Água Bidestilada q.s.p. 20 µL
As amostras foram incubadas a 24°C em termociclador durante 20 horas. Em
seguida 3µL de cada sistema foram utilizados para transformar alíquotas de XL1-Blue
competentes. Após incubação durante a noite a 37°C, foram feitos os cálculos da eficiência
da ligação. É considerada uma boa ligação se a produção é de pelo menos 108
unidades
formadoras de colônias (cfu) por µg de DNA e a ligação teste de auto-ligação não exceder
10%.
3.7.9- Ligação definitiva dos fragmentos de DNA scFv com o vetor pComb3X
pComb3XSS digerido com SfiI 1500 ng
scFv digerido com SfiI 700 ng
Tampão de ligase 5X 40 µL
T4 DNA ligase 10 µL
Água Bidestilada q.s.p. 200 µL
Quatro sistemas idênticos de ligação foram realizados para aumentar a variabilidade
da biblioteca. As reações de ligação foram incubadas a 24ºC no termociclador durante 20
horas. No dia seguinte, as ligações foram precipitadas com a adição de 1,5 µL de
glicogênio, 20 µL de acetato de sódio 3M e 440 µL de etanol absoluto e incubados a -80°C
por 16 horas. Em seguida, a biblioteca foi centrifugada a 14000 x g por 15 minutos a 4°C e
33
o sobrenadante foi descartado. O pellet foi lavado com etanol 70% (v/v) e os tubos foram
deixados à temperatura ambiente por 15 minutos para evaporação do etanol residual. O
pellet foi diluído em 15 µL de água bidestilada.
Em seguida 1,5 µL de cada sistema foram misturados e utilizados para transformar
alíquotas de bactéria XL1-Blue competentes, foram realizados os cálculos do número de
colônias e estimado o tamanho da biblioteca.
3.8- Análise do repertório da biblioteca de scFv
Uma investigação da variabilidade dos fragmentos de anticorpos presentes na
biblioteca com relação à definição das famílias de imunoglobulinas foi feita com base em
alinhamento usando o programa Blast contra banco específico de imunoglobulinas, o
programa IgBlast (www.ncbi.nlm.nih.gov).
3.9- Seleção da biblioteca
Os protocolos desta seção descrevem a preparação de ferramentas necessárias para a
produção e seleção da biblioteca, tais como a preparação de bactérias eletrocompetentes,
obtenção do fago auxiliar, a cultura de células humanas e a seleção propriamente dita.
3.9.1- Preparação de células eletrocompetentes
Uma colônia de células XL1-Blue foi isolada e inoculada em 10 mL de meio SB
contendo tetraciclina (30 g/mL) e incubada a 37ºC sob agitação de 250 rpm por 16 horas.
Cinco microlitros do pré-inóculo foi inoculado em 500 mL de meio SB contendo 2,5 mL da
solução estoque de glicose 2M e 2,5 mL de solução estoque de Mg 2 M em um frasco de
34
1L. Foi incubado a 37ºC sob agitação de 250 rpm até atingir uma densidade óptica OD a
600 nm igual a 0,7. Após ter atingido a OD desejada, os frascos foram resfriados no gelo
durante 15 minutos e a cultura foi centrifugada a 3000 rpm durante 20 minutos a 4ºC. O
sobrenadante foi descartado e os sedimentos ressuspendidos em 100 mL de glicerol 10%
gelado. A suspensão de células foi centrifugada a 3000 rpm durante 20 minutos a 4ºC e o
sobrenadante descartado. Os sedimentos foram submetidos a mais duas lavagens com 50 e
25 mL de glicerol 10% gelado. Após a terceira lavagem, as células foram ressuspendidas no
volume residual de glicerol e aliquotadas em volume de 75 L e transferidas para
microtubos novos e estéreis. As alíquotas foram congeladas em banho de álcool e gelo seco
e estocadas a -80ºC até serem utilizadas para eletroporação e para os experimentos de
seleção.
3.9.2- Preparação do fago auxiliar VCSM13
Adaptado de Rader et al., 2000.
3.9.2.1- Obtenção de placas de lise
Para a obtenção das placas de lise foram inoculados 2 L de células XL1-Blue
competente em 2 mL de meio SB contendo tetraciclina a uma concentração final de 10
g/mL, em seguida incubado a 37ºC sob agitação de 250 rpm até atingir OD a 600nm igual
a 0,5. Diluições do fago helper VCSM13 da ordem de 10-6 a 10
-11 foram preparadas, sendo
utilizado 1 μL de cada diluição na inoculação de 200 μL da cultura de bactérias.
Posteriormente, células e fagos foram incubados durante 15 minutos a temperatura
ambiente. Os 200 L da cultura foram plaqueados em placa de petri contendo LB ágar com
tetraciclina a 10 g/mL. As placas foram incubadas a 37ºC durante a noite e no dia seguinte
35
observou-se a formação de placas de lise (colônias de bactérias com retardo no crescimento
devido à infecção pelo fago).
3.9.2.2- Amplificação de placas de lise
Para a amplificação das placas de lise, foram inoculados 10 L de células XL1-Blue
competente em 10 mL de meio SB contendo tetraciclina 10 g/mL, em um tubo de 50 mL e
incubado a 37ºC durante uma hora sob agitação. Uma placa de lise, obtida no experimento
anterior, foi selecionada com o auxílio de um palito estéril e transferida para o tubo
contendo a cultura de bactérias, seguido de incubação nas mesmas condições por 2 horas. A
cultura infectada foi então transferida para um frasco tipo erlenmeyer de 1L com 500 mL
de meio SB contendo tetraciclina a 10 g/mL kanamicina a 70 g/mL. Após
homogeneização metade da cultura foi transferida para outro frasco erlenmeyer de 1L e
ambos os frascos foram incubados a 37ºC durante a noite sob agitação de 250 rpm. No dia
seguinte, a cultura foi transferida para tubos, centrifugado a 2500 x g durante 15 minutos e
o sobrenadante coletado em tubos novos. O sobrenadante foi submetido à incubação a 70ºC
durante 20 minutos para eliminar as células residuais. Em seguida, as amostras foram
centrifugadas novamente a 2500 x g durante 15 minutos, ao sobrenadante foi acrescentado
0,02% de azida sódica, em seguida transferido para novos tubos e estocados a 4ºC.
3.9.2.3- Determinação do título da preparação de fagos auxiliares
O título do fago foi obtido em um procedimento de infecção de cultura de células
XL1-Blue como descrito para a obtenção de placas de lise do item 3.2.4.1. Após a
36
incubação durante a noite, o título foi determinado pela contagem do número de placas de
lise presentes multiplicada pela diluição do fago.
3.9.3- Transformação de Células de Escherichia coli por Eletroporação com a
Biblioteca
Dois microlitros de cada sistema de ligação foram misturados e mantidos no gelo,
bem como uma cubeta de eletroporação e a alíquota de células eletrocompetentes recém
retiradas do ultrafreezer (200 µL).
Cinco microlitros do pool das ligações precipitadas foram adicionadas ao tubo das
células eletrocompetentes recém descongeladas e misturadas com pipeta e transferidos para
a cubeta pré-resfriada. Após 1 minuto de incubação, as células foram submetidas à
eletroporação em eletroporador (Bio-Rad) nas seguintes condições: voltagem de 2,5 kV, 25
µF de capacitância e 200 Ω de resistência, gerando pulsos de cerca de 4 a 5 mili segundos
de duração.
Imediatamente após, adicionou-se 1mL de meio SOC à cubeta e posteriormente 2
mL, os 3 mL foram colocados em um tubo de 50 mL e incubados a 37°C sob agitação de
250 rpm por 1 hora.
Após a incubação, uma alíquota de 50 μL dessa biblioteca original foi plaqueada em
meio LB ágar com 100 μg/mL de carbenicilina e incubada a 37°C por 16 horas. As colônias
isoladas foram calculadas para estimar o tamanho da biblioteca e selecionadas com palito
estéril para posterior extração de DNA plasmidial e seqüenciamento.
Ao restante da cultura foram adicionados 10 mL de meio SB contendo 3 μL de
carbenicilina a 100 mg/mL e 15 μL de tetraciclina a 10 mg/mL. Os 15 mL de cultura foram
37
incubados por 1 hora a 37ºC e 250 rpm, seguidos pela adição demais 4,5 μL de
carbenicilina a 100 mg/mL e incubação sob as mesmas condições por mais 1 hora.
A cultura foi transferida para um frasco do tipo erlenmeyer de 1L e a ela
acrescentados 2 mL de fago auxiliar VCSM13 (1012
a 1013
pfu/mL) e 183 mL de meio SB
contendo 92,5 μL de carbenicilina a 100 mg/mL e 185 μL de tetraciclina a 10 mg/mL. A
cultura foi então incubada a 37ºC sob agitação de 250 rpm por 2 horas.
À cultura foram adicionados 140 μL de Kanamicina a 100 mg/mL, sendo a mesma
mantida sob agitação durante a noite (por aproximadamente 14 horas) nas mesmas
condições descritas no passo anterior.
A cultura crescida durante a noite foi centrifugada a 3.000 x g por 15 minutos a 4ºC
e o sedimento de bactérias descartado. Os sobrenadantes foram transferidos para novos
tubos e centrifugados novamente sob as mesmas condições. Os sobrenadantes foram então
transferidos para novos tubos e aos mesmos foram adicionados Ao sobrenadante foram
adicionados 8 g [4% (p/v)] de polietilenoglicol (PEG 8.000) e 6 g [3% (p/v)] de cloreto de
sódio (NaCl). A fase sólida foi dissolvida incubando-se as soluções a 37ºC sob agitação de
250 rpm por 10 minutos.
Os fagos foram coletados por centrifugação a 15.000 x g por 15 minutos a 4ºC. Os
sobrenadantes foram descartados e os tubos contendo os sedimentos de fagos foram
deixados invertidos sobre papel toalha por 10 minutos para secagem.
Os sedimentos de fagos foram ressuspendidos em 2 mL de TBS-BSA 1% (p/v) e
transferidos para microtubos, que foram então centrifugados a 14.000 rpm por 5 minutos a
4ºC.
38
Em seguida, os sobrenadantes contendo as partículas virais foram transferidos para
novos microtubos contendo azida sódica a uma concentração final de 0,02% e estocados a
4ºC.
3.9.4- Preparação de DNA plasmidial em placas de microtitulação
Após a transformação de bactérias XL1-Blue com a biblioteca original, 50 μL do
produto foi plaqueado em meio LB ágar acrescido de 100 μg/mL de carbenicilina e
incubado por 16 horas a 37ºC.
Clones isolados foram retirados das placas e inoculados em 1 mL de meio SB
contendo 100 μg/mL de carbenicilina em placa do tipo deep well.
A placa foi selada com selo perfurado para permitir a aeração e então incubada por
20 horas a 37ºC sob agitação de 300 rpm. Após a incubação, a placa foi centrifugada a 3700
rpm por 10 minutos a 20ºC, os sobrenadantes foram retirados e os sedimentos de bactérias
ressuspensos em 240 μL de GET. A placa foi selada e agitada por 2 minutos em vortex para
ressuspensão das células. Em seguida, a placa foi centrifugada novamentea 3700 rpm por
10 minutos a 20ºC.
Os sobrenadantes foram descartados e a placa invertida em papel toalha por 5
minutos. As bactérias foram ressuspensas novamente em 80 μL de GET.
Foram adicionados 2,5 μL de RNAse A (10 mg/mL) a cada poço de uma placa de
microtitulação de fundo redondo para onde foram transferidos 60 μL da suspensão de
células.
A cada poço foram adicionados 60 μL de uma solução recém preparada de NaOH
0,2 N e SDS 1%. Em seguida a placa foi fortemente selada com um adesivo novo e
39
cuidadosamente invertida por 20 vezes, incubada por 10 minutos a temperatura ambiente e
centrifugada rapidamente.
Em seguida foram adicionados 60 μL de Acetato de Potássio 3M a cada poço, sendo
a placa selada e agitada 20 vezes por inversão, seguida de incubação por 10 minutos a
temperatura ambiente e rápida centrifugação.
O adesivo foi removido e a placa incubada em estufa a 90ºC por 25 minutos, sendo
posteriormente selada e incubada no gelo por 10 minutos. A placa foi então centrifugada
por 10 minutos a 3700 rpm e 20ºC.
Os sobrenadantes foram transferidos para uma placa com filtro (Millipore) fixada
com adesivo no topo de uma microplaca de fundo em “V” e, em seguida, centrifugados por
6 minutos a 3700 rpm a 20ºC.
Ao filtrado foram adicionados 100 μL de isopropanol, que foi levemente
homogeneizado e centrifugado a 3700 rpm e 20ºC por 45 minutos.
Após o descarte do sobrenadante, o DNA foi lavado com 200 μL de etanol 70%
gelado e centrifugado a 3700 rpm e 20ºC por 5 minutos.
Os sobrenadantes foram retirados e a placa, invertida em papel toalha, foi
centrifugada até atingir a rotação de 900 rpm. A placa foi deixada à temperatura ambiente
por 60 minutos para evaporação do etanol residual.
O DNA foi ressuspenso em 60 μL de água bidestilada, analisado em gel de agarose
1% corado com brometo de etídio e então estocado a -20ºC.
40
3.9.5- Reamplificação da biblioteca
Foram inoculados 50 μL de células XL1-Blue em 50 mL de meio SB contendo 10
μg/mL de tetraciclina. A cultura foi incubada a 37ºC e 270 rpm por 1,5 a 2,5 horas até
atingir uma OD 600nm igual a 1,0.
À cultura foram adicionados 70 μL de fagos, seguido pela incubação a temperatura
ambiente por 30 minutos. Em seguida foram adicionados 10 μL de carbenicilina a 100
mg/mL e 2% (v/v) de glicose 2M, seguido pela incubação a 37ºC e 270 rpm por 1 hora.
Após esse período, foram adicionados à cultura 15 μL de carbenicilina a 100 mg/mL,
seguido pela incubação por 1 hora nas mesmas condições.
A cultura foi então centrifugada a 3000 x g por 10 minutos e ressuspensa em 200
mL de meio SB contendo 100 μL de carbenicilina a 100 mg/mL e 100 μL de tetraciclina a
20 mg/mL.
Em seguida foram adicionados 2 mL de fago auxiliar VCSM13, a cultura foi então
incubada a 37ºC e 250 rpm por 2 horas, seguida da adição de 140 μL de kanamicina a 100
mg/mL e incubação nas mesmas condições durante 14 horas.
A cultura foi centrifugada a 3000 x g por 15 minutos a 4ºC, o sobrenadante foi
retirado, transferido para novo frasco e centrifugado nas mesmas condições. Dois mililitros
(2 mL) do sobrenadante foram estocados para futuras análises de atividade ligante das
partículas virais aí presentes.
Ao sobrenadante foram adicionados 8 g [4% (p/v)] de polietilenoglicol (PEG 8.000)
e 6 g [3% (p/v)] de cloreto de sódio (NaCl). A fase sólida foi dissolvida por agitação a 37ºC
e 270 rpm por 5 minutos. Em seguida o sobrenadante foi incubado no gelo por 30 minutos.
41
A solução foi centrifugada a 15000 x g e 4ºC por 15 minutos e o sobrenadante
descartado. O frasco contendo os fagos sedimentados foi então invertido em papel toalha
estéril por 10 minutos para secagem do sedimento.
O sedimento de fagos foi ressuspendido em 2 mL de TBS e BSA 1% (p/v),
transferido para um microtubo e centrifugado a 14000 rpm a 4ºC por 5 minutos. Em
seguida, o sobrenadante contendo as partículas virais foi transferido para um microtubo
novo, adicionado azida sódica a uma concentração final de 0,02% e estocado a 4ºC.
3.9.6- Cultura de células humanas de tireóide
Uma vez construída a biblioteca de anticorpos recombinantes procedeu-se a seleção
contra células de tireóide. Para tanto foi utilizada uma linhagem celular tumoral de
Carcinoma Papilífero de Tireóide, denominada NPA, que é uma cultura secundária, ou seja,
com capacidade ilimitada de crescimento em cultura, essas células NPAs foram gentilmente
doada pela Profa. Dra. Janete Maria Cerutti – UNIFESP. Foi também utilizada uma cultura
primária de células de bócio colóide, designada primária porque foi desenvolvida a partir de
tecidos tireoidianos de pacientes com bócio que foram submetidos à Tireoidectomia pela
Equipe de Cirurgia de Cabeça e Pescoço do Hospital das Clínicas de Uberlândia, sob a
coordenação do Dr. Sindeval José da Silva.
As células foram cultivadas em meio DMEM (Eagle modificado por Dulbecco da
Nutricell) suplementado com antibiótico estreptomicina e adicionado 10% de soro fetal
bovino (SFB, Nutricell), mantidas em uma atmosfera de 5% de CO2.
Com relação à cultura primária de bócio, foram realizados os seguintes
procedimentos: o tecido de bócio foi coletado durante a cirurgia em seguida colocado em
um tubo contendo meio DMEM para o transporte até o Laboratório de Biologia Molecular-
42
UFU, sob orientação das professoras Dra. Janethe Deolina de Oliveira Pena e Dra. Maria
Aparecida de Souza; em seguida o tecido foi colocado em placa de petri estéril e cortado
com bisturi em fragmentos menores de aproximadamente 5 mm; esses fragmentos foram
colocados em uma garrafa de cultura (25 cm2) e adicionados sobre eles 100 μL de meio
DMEM; após 20 minutos os tecidos já estavam aderidos a garrafa e em seguida foi
adicionado 5 mL de meio DMEM suplementado com 20% de SFB; por fim, as garrafas
foram mantidas em uma atmosfera de 5% de CO2.
As células tumorais secundárias (NPA) e as células primárias de bócio não são
aderentes, e as células de bócios apresentam crescimento mais lento comparado com as
células tumorais. As trocas de meio foram realizadas a cada 4 ou 5 dias e os repiques
quando as garrafas estavam confluentes. Para garantir um estoque de células, estas foram
congeladas em meio próprio contendo DMSO.
3.9.6.1- Congelamento de células humanas
Após serem coletadas por centrifugação a 2000 rpm por 10 min., as células com
aproximadamente 500 μL de meio foram transferidas para tubo de congelamento e em
seguida, adicionado 500 μL de SFB (gelado) e 100 μL de DMSO. Seguido de incubação a
-80°C por 24 horas e posterior estocagem em N2 líquido.
3.9.6.2- Descongelamento de células humanas
As células retiradas do N2 líquido foram transportadas em gelo até a câmara de
fluxo. Em seguida, foram ressuspendidas em meio DMEM sem SFB e transferido para um
tubo de 15 mL. Posteriormente, as células foram centrifugadas a 2000 rpm por 10 min, o
sobrenadante descartado e ressuspendidas em meio DMEM suplementado com 10% de
43
SFB. As células foram adicionadas em uma garrafa de cultura e mantidas em uma
atmosfera de 5% de CO2.
3.9.7- Seleção da biblioteca de scFv contra células humanas de tireóide pelo
método BRASIL
A seleção da biblioteca de anticorpos procedeu-se na superfície das células visando
à obtenção de anticorpos contra antígenos expressos nas células de carcinoma Papilífero de
tireóide. A metodologia de seleção empregada foi descrita por Giordano e colaboradores
(2001) e denomina-se BRASIL (Biopanning and Rapid Analysis of Selective Interactive
Ligands), está esquematizada na Figura 8.
Para selecionar ligantes específicos a antígenos de células tumorais de tireóide
foram utilizadas células de cultura de bócio colóide (doença benigna) para a seleção
negativa, o que permite a redução de ligantes não desejáveis. Foram conduzidos três ciclos
de seleção, sendo cada um deles antecedido pela reamplificação da biblioteca de scFv,
como descrito no item 3.8.5.
As células em cultura foram centrifugadas e ressuspensas em meio a uma
concentração de cerca de 1 x105 células por mL. Estas células foram incubadas com 70 μL
dos fagos por 1 hora no gelo. Após esse período, 100 μL da suspensão células fagos foram
transferidas para um tubo tipo eppendorf de 500 μL contendo 200 μL de uma mistura de
9:1 de dibutil phthalato: cicloexano e centrifugadas a 10.000 x g por 10 minutos a
temperatura ambiente. Alternativamente, nas etapas de subtração da biblioteca, quando os
fagos eram incubados com a linhagem de células normais após a centrifugação, recolhia-se
a fase líquida acima da camada orgânica e estes fagos eram incubados por mais 1,5 hora,
com as células tumorais em gelo. Após a centrifugação, o tubo foi congelado em nitrogênio
44
líquido para a base ser cortada, esse sedimento foi transferido para um tubo contendo 50 ml
de uma cultura de E.coli XL1-Blue em fase log e incubado por 15 minutos a temperatura
ambiente, para a recuperação dos fagos.
A. Seleção Negativa B. Seleção na célula tumoral
Figura 8. Método BRASIL de seleção de ligantes na superfície celular. A estratégia de seleção para isolar
fagos que se ligam especificamente em células de tireóide. A. Subtração da biblioteca em células controle, de
bócio. Células de bócio são incubadas com a biblioteca de fragmentos de anticorpos scFv e separadas por
centrifugação na fase orgânica. B. Seleção contra as células tumorais. O sobrenadante contendo células
tumorais (NPA) e após incubação as células e os fagos a elas ligados são separados por centrifugação em fase
orgânica. Os fagos aderidos às células tumorais no sedimento são recuperados por infecção de E. coli,
amplificados e usados em um novo ciclo de seleção (Adaptado de Giordano et al., 2001).
Célula controle de tireóide (bócio)
Célula tumoral de tireóide
Fagos apresentando o fragmento de anticorpo
Fase orgânica
45
3.9.8- Transformação de bactérias eletrocompetentes com a biblioteca scFv
selecionada
Após a seleção dos fragmentos de anticorpos scFv ligantes às células de Carcinoma
Papilífero da Tireóide (NPA), os mesmos foram expressos em sobrenadante de cultura por
bactérias TOP10 (Invitrogen) em placas do tipo deep well.
Para que a expressão em bactérias TOP10 fosse realizada, os fagos oriundos do
terceiro ciclo de seleção foram amplificados em bactérias XL1-Blue, o DNA plasmidial das
mesmas foi então extraído e utilizado para transformar bactérias TOP10 eletrocompetentes.
Para tanto, bactérias XL1-Blue foram amplificadas em 50 mL de meio SB contendo
10 μg/mL de tetraciclina até atingir uma OD600= 0,5. À cultura foram adicionados 90 μL de
fagos eluídos no segundo ciclo de seleção, seguido por incubação a temperatura ambiente
por 15 minutos e acréscimo de 2% (v/v) de glicose 2M e carbenicilina a uma concentração
final de 50 μg/mL. A cultura foi incubada por 14 horas a 37ºC e 250 rpm.
O DNA plasmidial das bactérias amplificadas foi extraído utilizando-se o kit
GenEluteTM Plasmid Miniprep (Sigma-Aldrich), seguindo-se as recomendações do
fabricante. O DNA foi quantificado em espectrofotômetro e utilizado para transformar
bactérias TOP10 eletrocompetentes. O protocolo utilizado para transformação foi o mesmo
descrito para a transformação de bactérias XL1-Blue com a biblioteca de anticorpos, com
poucas modificações. As bactérias transformadas foram plaqueadas em meio LB ágar
acrescido de 2% (v/v) de glicose 2M e carbenicilina a 50 μg/mL e incubadas a 37ºC por 16
horas.
46
3.10- Produção de scFv na forma solúvel
Em duas placas do tipo deep well de 96 poços foi adicionado, a cada poço, 1 mL de
meio SB contendo carbenicilina a 50 μg/mL e 2% (v/v) de glicose 2M, seguido pela
inoculação de uma colônia de bactérias TOP10 transformadas com a biblioteca de scFv
selecionada. Em um poço de cada placa, foram amplificadas bactérias TOP10 utilizadas
como controle da expressão e que foram transformadas apenas com o plasmídeo vazio
pComb3XSS, sem a inserção de sequências codificadoras para fragmentos de anticorpos
scFv. As placas foram seladas com filme plástico, sendo o mesmo perfurado para permitir a
aeração, seguido pela incubação por 14 horas a 37ºC e 300 rpm.
No dia seguinte, 50 μL de cultura de cada clone foram transferidos para outras duas
placas contendo, em cada poço, 1 mL de meio SB acrescido de carbenicilina a 50 μg/mL e
2% (v/v) de glicose 2M. As placas foram seladas, perfuradas e incubadas por 4 horas a
37ºC e 300 rpm.
Após incubação por 4 horas, as placas foram centrifugadas a 3.700 rpm por 10
minutos e o sobrenadante descartado. Cada pellet de bactérias foi então ressuspendido em 1
mL de meio SB contendo 50 μg/mL de carbenicilina e IPTG a uma concentração final de
2,5 mM. As placas foram incubadas por 18 horas a 30ºC e 300 rpm.
Após a incubação, as placas foram submetidas à centrifugação a 3.700 rpm durante
15 minutos a 4ºC, o pellet foi estocado com glicerol 25% a -20ºC e o sobrenadante
contendo as moléculas scFv na forma solúvel foi transferido para outra placa e armazenado
a 4ºC por até ser utilizado nos ensaios de Dot blot e ELISA.
47
3.11- Detecção de proteína recombinante por Dot blot
Para detectar os clones que secretavam scFv no sobrenadante de cultura induzida
por IPTG foi realizado o Dot blot. Para tanto, 5 μL do sobrenadante de cultura de cada
clone expresso foram aplicados em uma membrana de nitrocelulose HybondTM ECL de 0,2
μm (Amersham Biosciences) e deixados secar por 30 minutos a temperatura ambiente.
Em seguida, a membrana foi bloqueada com uma solução de PBS e BSA 3% por 1
hora a temperatura ambiente. Após o bloqueio, a membrana foi lavada 2 vezes com PBST
0,05% e então incubada em uma solução de PBS contendo o anticorpo anti-HA marcado
com peroxidase (Roche Applied Science) em diluição de 1:2.500 por 1,5 hora a
temperatura ambiente. Em seguida, a membrana foi lavada 3 vezes com PBST 0,05% e
revelada com SigmaFastTM 3,3‟-Diaminobenzidine (Sigma-Aldrich).
Para parar a reação, a membrana foi lavada com água e deixada secar a temperatura
ambiente.
3.12- Ensaio de Imunoadsorção por ligação enzimática (ELISA)
para seleção dos fragmentos de anticorpos scFv com maior afinidade às
proteínas de tumor de tireóide
3.12.1- Tecidos tireoidianos
Os fragmentos de tecidos tireoidianos (Tumor, Bócio e Adenoma) utilizados na
extração de proteínas para o ensaio ELISA foram provenientes de pacientes submetidos à
Tireoidectomia pela Equipe de Cirurgia de Cabeça e Pescoço do Hospital das Clínicas de
Uberlândia, sob a coordenação do Dr. Sindeval José da Silva. O estudo foi aprovado pelo
48
Comitê de Ética da Universidade Federal de Uberlândia número 249/2009 (ANEXO 5),
assim como o Termo de Consentimento e Questionário (ANEXO 6 e 7).
3.12.2- Extração de proteínas totais
Proteínas totais foram extraídas de biópsias de tecido de tireóide, tais como: tumor
de Carcinoma Papilífero, Adenoma Folicular e Bócio colóide. Os tecidos foram macerados
em nitrogênio líquido, em seguida foi adicionado ao macerado o tampão de extração
(40mM Hepes pH 7,4, 10mM EDTA, 2mM EGTA, 1mM DTT, 1mM Benzamidina,
0,5mM PMSF) e por fim centrifugado por 30 minutos a 4000 x g. O sobrenadante foi
coletado e as proteínas quantificadas pelo método de Bradford. O perfil protéico foi
avaliado por SDS-PAGE (10%).
3.12.3- ELISA
Após a análise da expressão dos fragmentos de anticorpos em sobrenadante de
cultura por Dot blot, os clones com marcação positiva foram testados em ensaio
imunoenzimático ELISA para seleção daqueles com maior afinidade às proteínas de tumor
de carcinoma Papilífero de tireóide.
Uma placa de microtitulação de alta afinidade (Nunc) foi sensibilizada em triplicata
com 1 μg de proteínas de tecido de tumor, Adenoma e bócio colóide em poços diferentes.
As proteínas foram diluídas 100 μL de tampão carbonato (bicarbonato de sódio 0,1M, pH
8,6), que foram então incubados por 14 horas a 4°C.
As placas foram lavadas 3 vezes com 350 μL/poço de PBST 0,05% (PBS e Tween
20 a 0,05%) e bloqueadas com 350 μL/poço de PBSM 5% (PBS e leite desnatado a 5%),
sendo então incubadas a 37ºC por 1 hora.
49
Após o bloqueio, cada poço foi lavado 3 vezes com 350 μL de PBST 0,05% e
incubado por 2 horas a 25ºC com 50 μL de sobrenadante de cultura de bactérias contendo
os fragmentos de anticorpos scFv expressos. As placas foram lavadas 3 vezes com 350
μL/poço de PBST 0,05% e incubadas por 1 hora a 37ºC em uma solução de PBSM 5%
contendo o anticorpo anti-HA marcado com peroxidase (Roche Applied Science) em
diluição de 1:1000.
Após a incubação, as placas foram lavadas 4 vezes com 350 μL/poço de PBST
0,05% e reveladas com SigmaFastTM OPD (Sigma-Aldrich). A reação foi parada utilizando-
se 20 μL/poço de ácido sulfúrico 4N e as placas lidas a 492 nm em leitor de microplaca
(ThermoPlate).
3.12.4 Gráficos
Os resultados do ensaio Elisa foram analisados por gráficos construídos no
programa Prisma.
3.13- Sequenciamento de DNA
O sequenciamento das cadeias leve e pesada da biblioteca de anticorpos e dos
clones selecionados após o Biopanning foi realizado utilizando o kit DyEnamic ET Dye
Terminator Cycle Sequencing e o seqüenciador automático capilar MegaBaceTM 1000 (GE
Healthcare). O DNA dos clones selecionados foram extraídos de bactérias TOP10
utilizando-se o kit GenEluteTM Plasmid Miniprep (Sigma-Aldrich), seguindo-se as
recomendações do fabricante.
50
As amostras foram preparadas em placas de 96 poços contendo aproximadamente
500 ng de DNA plasmidial e 2,5 picomoles do oligonucleotídeo MMB4 (senso) ou 2,5
picomoles do oligonucleotídeo MMB5 (reverso) em um volume final de 10 µL.
As reações de PCR foram realizadas nas seguintes condições:
1) 95ºC por 20 segundos;
2) 50ºC por 15 segundos;
3) 60ºC por 1 minuto.
As reações foram precipitadas com o kit de seqüenciamento conforme
recomendações do fabricante e as placas foram injetadas imediatamente no seqüenciador
automático.
3.14- Purificação de scFv por cromatografia de afinidade em HPLC
A cromatografia líquida de alta afinidade (HPLC) para purificação de proteínas é
fundamentada na capacidade de alguns aminoácidos doadores de elétrons tais como a
histidina (his), o triptofano (trp) e a fenilalanina (phe) de se ligarem de maneira reversível a
íons metálicos (como o níquel) imobilizados em uma matriz. O Kit HisTrap HP (GE
Healthcare Life Sciences) utilizado neste passo foi desenvolvido para uma rápida e
reproduzível purificação de proteínas recombinantes expressas com calda de histidina
(HisTag). A purificação foi realizada seguindo as recomendações do fabricante.
O sobrenadante de cultura de 200 mL resultante da expressão dos fragmentos de
anticorpos scFv por bactérias TOP10 (produzido como descrito no item 3.9, resguardada as
51
devidas proporções), foi dividido em quatro alíquotas de 50 mL, centrifugado a 10.000 rpm
por 60 minutos a 4°C e então filtrado em filtro de 0,45 μm (Millipore). Para preparar a
amostra, 25 mL de tampão fosfato 8X e 1 mL de imidazol 2M foram adicionados a 174 mL
do sobrenadante de cultura filtrado. O pH da solução foi então ajustado para 7,4.
A coluna HisTrap de 1 mL foi umidificada pela injeção de 5 mL de água destilada e
conectada ao aparelho HPLC. Em seguida, a coluna foi equilibrada com 10 mL de tampão
de ligação (Fosfato 20 mM, NaCl 0,5 M, Imidazol 20mM, pH 7,4).
A amostra foi aplicada à coluna sob fluxo de 2 mL/min até o volume final de 50 mL
por purificação. Em seguida, a coluna foi lavada com 10 mL de tampão de ligação para
lavagem das moléculas não ligantes.
Após a lavagem, os fragmentos de anticorpos foram eluídos com 5 mL de tampão
de eluição (Fosfato 20 mM, NaCl 0,5 M, Imidazol 500 mM, pH 7,4), que foram coletados
em alíquotas de 0,5 mL. As alíquotas foram armazenadas a 4ºC e analisadas por dot blot
para detecção dos anticorpos scFv, seguindo-se o mesmo protocolo descrito anteriormente.
A amostra resultante foi congelada a -80ºC por 1 hora, liofilizada por 24 horas e
ressuspendida em 1 mL de água bidestilada. A amostra foi então quantificada em
espectrofotômetro NanoDrop® e estocada a -20ºC.
3.15- Ensaios de Western Blotting
Foi realizado o ensaio de western blottting para detectar a presença do scFv-C1 na
amostra produzida pela purificação cromatográfica, 50 μg do scFv purificado foram
separadas eletroforeticamente em um gel SDS-PAGE 16% e, em seguida, transferidas para
uma membrana de nitrocelulose (HybondTM-ECL de 0,2 μm; Amersham- Biosciences)
52
utilizando-se o sistema de transferência Mini Trans-Blot Eletrophoretic Transfer Cell (Bio-
Rad). A transferência foi realizada durante 16 horas sob as condições elétricas de 300 V e
20 mA a 4°C.
Após a confirmação da transferência pela visualização do marcador na membrana, a
mesma foi incubada sob agitação com PBSM 5% (PBS e Leite Desnatado 5%) a
temperatura ambiente por 1 hora para bloqueio de sítios inespecíficos. A membrana foi
então lavada três vezes com tampão PBST 0,05%.
Após o bloqueio, a membrana foi incubada sob leve agitação, a 37ºC e por 2 horas
com PBSM 5% contendo o anticorpo anti-HA conjugado com peroxidase (Roche) na
proporção de 1:5000. Em seguida, a membrana foi lavada três vezes com PBST 0,05% e
revelada com SigmaFastTM 3,3‟- Diaminobenzidine (Sigma-Aldrich). Para parar a reação, a
membrana foi lavada com água e deixada secar a temperatura ambiente.
3.16- Imunoistoquímica
3.16.1- Procedimento
A afinidade do fragmento de anticorpo scFv aos tecidos tireoidianos foi verificada
por imunoistoquímica. Inicialmente foram feitas algumas lâminas testes e em seguida,
duzentos e vinte nove casos de tireóide foram analisados utilizando uma lâmina de Micro-
arranjo de tecido (TMA) fornecida pelo Prof. Dr. Fernando Augusto Soares do
Departamento de Anatomia Patológica do Hospital AC Camargo, São Paulo. A lâmina
TMA era composta por 110 casos de carcinoma diferenciado de tireóide, sendo 38 de
Carcinoma Papilífero, 42 de Folicular e 30 de Papilífero variante Folicular e também casos
benignos como 35 Adenomas Foliculares, 49 Bócios e 18 tireóides normais.
53
Os cortes foram desparafinizados em banho de xilol a 110°C e, a seguir, banhos
subseqüentes em xilol à temperatura ambiente. Logo após este processo, as lâminas foram
hidratadas em álcool etílico nas concentrações decrescentes de 100%, 80%, 50% e
posteriormente lavadas por 5 minutos em água corrente e destilada. Em seguida, as secções
foram incubadas com peróxido de hidrogênio 3% por três vezes de 5 minutos para bloqueio
da peroxidase endógena.
Para a recuperação antigênica, as lâminas foram imersas em tampão citrato de sódio
(1M, pH 6,0) a 95ºC durante 35 minutos, para atingir a temperatura desejada foi utilizada a
panela a vapor Arno Aqua Timer. Após as lâminas esfriarem, estas foram lavadas por 5 min
em água corrente e destilada, e em seguida incubadas com PBSBSA 10% durante 30
minutos à temperatura ambiente com para bloqueio dos sítios inespecíficos.
Os cortes foram lavados com PBS e o scFv-C1 foi adicionado às secções, seguido
por incubação overnight a 4ºC. Os cortes utilizados como controles negativos da reação
foram incubados somente com PBS. A ligação dos fragmentos de anticorpos ao antígeno
foi verificada pela incubação dos cortes com o anticorpo anti-HA conjugado com
peroxidase (Sigma-Aldrich) diluído no tampão (Novocastra IHC Diluent) na proporção de
1:200.
Após esta etapa, para realçar a marcação da peroxidade as lâminas foram incubadas
com o reagente Advance HRP Enzyme (Dako) a 37° C durante 30 minutos. Posteriormente,
o anticorpo que reagiu com as células tireoidianas foi detectado com DAB líquido (3-3‟ –
diaminobenzidine tetrahydrochloride, Dako código K3468) durante cinco minutos a
temperatura ambiente e em seguida as lâminas foram contracoradas com Hematoxilina de
Mayer durante 30 segundos.
54
Por fim, os cortes foram desidratados com álcool etílico e diafanizadas em xilol, e
em seguida montadas utilizando Entellan™ (Merck 1079610100).
3.16.2- Estadiamento dos tumores dos pacientes da lâmina de micro-arranjo de
tecido (TMA)
O estadiamento das neoplasias malignas da tireóide da lâmina TMA foram
classificadas de acordo com a sexta edição do International Union Against Cancer (UICC),
que se baseia na idade do paciente ao diagnóstico, no tipo histológico e no sistema TNM.
Este sistema inclui 3 componentes: o tamanho do tumor primário (T), a presença ou
ausência de metástase para linfonodo regional (N) e a presença ou ausência de metástase a
distância (M) (Varandas et al., 2004) (Quadro 1).
Quadro 1. Classificação do Carcinoma da Tireóide de acordo com a 6ª edição da UICC
(International Union Against Cancer)
Tumor
Tx Sem definição do tamanho tumoral
T1 < 2cm, restrito à tireóide
T2 > 2 e ≤ 4 cm, restrito à tireóide
T3 > 4 cm, restrito à tireóide ou mínima extensão extra-tireoideana
T4a tumor com extensão além da cápsula,invasão de tecido mole subcutâneo,
laringe, traquéia, esôfago ou nervo laringeo recorrente
T4b tumor invadindo fáscia pré-vertebral, vasos mediastínicos ou artéria
carótida
Linfonodo
Nx Sem definição de acometimento de linfonodos
N1 Metástase para linfonodo regional
N1a Metástase nível VI (pré e para-traqueal, pré-laríngeo e de Delphian)
N1b Metástases em outros cervicais unilaterais,bilaterais ou contra-laterais ou
55
mediastínicas
Metástase
Mx Sem definição de metástases à distância
M0 Sem metástases à distância
M1 Metástases à distância
Estádio I TxNxM0 < 45 anos; T1N0M0 ≥ 45 anos
Estádio II TxNxM1 < 45 anos; T2N0M0 ≥ 45 anos
Estádio III T3N0M0 > 45 anos; T1–3N1aM0 ≥ 45 anos
Estádio IV IVA: T1-3N1bM0 > 45 anos; T4aN0–1 M0 ≥ 45 anos
IVB: T4bNxM0 ≥ 45 anos
IVC: TxNxM1 ≥ 45 anos
Fonte: (Varanda et al., 2007)
De acordo com a classificação de TNM da International Union Against Cancer
(UICC) os casos da lâmina TMA foram agrupados de acordo com o Quadro 2.
Quadro 2. Classificação do TNM dos pacientes da lâmina TMA
TNM Estadiamento
TNM 1 T1
TNM 2 T2
TNM 3 T3
TNM 4 T4a e T4b
TNM 5 Estádio IV: subgrupo IVA
TNM 6 Estádio IV: subgrupo IVB
TNM 7 Estádio IV: subgrupo IVC
56
3.16.3- Leitura dos resultados
A verificação da marcação do fragmento de anticorpo scFv pelos tecidos de tireóide
foi analisada de modo semi-objetivo pelo Prof. Dr. José Vassallo e pela Dra. Elaine Cristina
Morari no microscópio óptico de luz (Axiophot, Zeiss). A análise semi-objetivo foi
realizada da seguinte maneira, toda a extensão do tecido foi analisada e os casos positivos e
negativos foram diferenciados e agrupados, foram consideradas positivas as células com
coloração marrom. Depois de confirmada a marcação positiva do scFv, a intensidade e a
área da marcação dos casos da lâmina TMA foram quantificados pelo equipamento ACIS
(Dako) do Hospital AC Camargo, São Paulo.
Inicialmente a lâmina TMA foi digitalizada e as imagens fornecidas pelo software
foram exibidas em um monitor. A partir dessas imagens foi realizada uma padronização
prévia do contraste, foco e saturação das imagens dos tecidos, ou seja, foram determinadas
para o software algumas regiões consideradas como marcação positiva ou negativa para
posteriormente este diferenciar o que é marcação positiva de negativa e também excluir as
marcações de artefatos. Após essa padronização foram realizadas todas as análises de
intensidade da coloração.
Para avaliar a intensidade da coloração, o sistema de análise de imagem
HistoQuant ™ (3DHistech ™, Budapeste, Hungria) foi utilizado. Este software
identifica e quantifica a marcação da imunoistoquímica minimizando a presença de
artefatos de coloração através de filtros de imagem. O valor relativo emitido pelo software
referente à intensidade da coloração varia de 0 a 250, o valor 0 é o mínimo e
correspondente a luz branca e o valor 250 é o máximo e corresponde a luz negra.
A intensidade da coloração e a área da marcação de cada paciente foram analisadas
em triplicata, foram consideradas três regiões diferentes de cada spot, os valores numéricos
57
da intensidade e da área da marcação foram anotados, em seguida foi realizada a média
desses valores para cada grupo de pacientes. Além disso, os valores da intensidade e da
área da marcação foram submetidos à seguinte fórmula: intensidade multiplicada pela área
marrom e dividida pelo somatório área azul mais área marrom, essa fórmula foi realizada
para as três análises de cada paciente e depois foi feita a média para obter um valor único
para cada caso, com esse valor foi realizada a análise estatística.
3.16.4- Análise estatística
O software SPSS (Software Package Statistical System) versão 10.0 foi utilizado
para as análises estatísticas e o Prisma para fazer os gráficos. O teste Qui-quadrado foi
usado para avaliar a diferença entre freqüências de variáveis categorizadas e o teste
ANOVA quando as variáveis eram quantitativas.
Inicialmente foi feita uma análise descritiva da freqüência dos resultados positivos
ou negativos da imunoistoquímica para cada grupo de pacientes. Posteriormente, foi
utilizado o teste Qui-quadrado para comparar o resultado da marcação do scFv entre duas
variáveis de anátomo patológico, como o Carcinoma Papilífero e o Adenoma Folicular. A
finalidade dessa análise foi avaliar se a marcação desse fragmento de anticorpo é capaz de
diferenciar os grupos de pacientes, foram consideradas significativas as diferenças com
valor p<0,05.
O teste Qui-quadrado também foi empregada ao grupo câncer (Papilífero, Folicular
e Papilífero Variante Folicular) para correlação da marcação do scFv e o estadiamento do
tumor. Essa análise foi baseada na classificação do carcinoma da tireóide de acordo com a
6ª edição da UICC (International Union Against Cancer) apresentado no Quadro 1 do item
3.15.2. Foram comparados os tumores de estágio inicial e restritos a tireóide (T1 e T2)
58
contra os demais estágios, com tumores com extensão extra-tireoidiana, com acometimento
de linfonodos e ou metástase. O objetivo dessa análise foi verificar se o fragmento de
anticorpo scFv reconhece tumores de estágio inicial ou avançado, de mal prognóstico.
Outra comparação utilizando o Qui-quadrado foi realizada entre o resultado da
imunoistoquímica (positivo ou negativo) com os dados clínicos, como a presença ou
ausência de metástase no paciente e conclusão clínica de cura ou evolução ruim (presença
de metástase ou aumento da tireoglobulina). Definiu-se o prognóstico como bom para os
pacientes que evoluíram sem evidência de doença ativa, caracterizando este grupo por níveis de
Tg abaixo de 2ng/dL, ausência de queixas ou imagens suspeitas de recidiva local ou à distância
durante o período de acompanhamento. E como pertencentes ao grupo de má evolução ou de
mau prognóstico os pacientes que apresentavam evidência de recidiva local ou à distância ou
que evoluíram para óbito durante o acompanhamento.
A análise estatística da intensidade e área da marcação entre os grupos de pacientes
foi realizada pelo teste ANOVA, seguido do coeficiente de correção Bonferroni, sendo
consideradas significativas as diferenças com valor p<0,05. Nessa análise foi utilizada a
fórmula intensidade e área da marcação descrita no item anterior.
59
4-RESULTADOS
60
4.1- Amplificação dos fragmentos da cadeia pesada (VH) e da cadeia
leve (VL) e dos fragmentos scFv
Os tamanhos dos fragmentos gênicos observados no gel de agarose correspondentes
às cadeias leves VL (cerca de 350 pb) e pesada VH (cerca de 400 pb) coincidiram com o
tamanho esperado (Figura 9). A figura 9C mostra o produto resultante da fusão gênica entre
as cadeias leves e pesada resultando no fragmento scFv com tamanho igual a 800 pb.
Nos três géis de agarose da Figura 9 foi observada a presença de vários fragmentos
de DNA de tamanhos diferentes do esperado, no caso das cadeias leves e pesadas isso é
devido à amplificação de produtos inespecíficos, e com relação ao gel do scFv os produtos
menores que 800 pb são fragmentos de VH e VL que não foram unidos na formação do
produto final.
4.2- Análise do repertório da biblioteca de scFv
Foram seqüenciadas 48 amostras com os primers MMB4 para VH e MMB5 para
VL, os resultados das seqüências com o primer MMB4 foram apresentados maiores e de
melhor qualidade. Com a análise do repertório da biblioteca realizado no programa IgBlast
pode-se concluir que a biblioteca resultante possui no mínimo genes VH de três famílias
diferentes (VH 1, 3 e 4) e os genes da cadeia leve pertencem às famílias VL 1, 2, 3 , 4, 6 e
7. As seqüências resultantes da análise no programa Igblast foram caracterizadas quanto à
família e as regiões determinantes de complementariedade (CDR) e framework (FR,
regiões conservadas) indicadas na Tabela 2.
61
Figura 9. Análise do produto da amplificação das regiões variáveis da cadeia pesada (VH),
cadeia leve (VL) e do fragmento de anticorpo scFv. A. Colunas 1 a 6: Fragmentos VH (~400pb),
B. Colunas 1a 6: Fragmentos VL (~350pb), C. Colunas 1 a 6: Fragmentos scFv (~800pb). Tanto em
A quanto em B e C- Coluna M é Marcador de massa molecular 100pb (Invitrogen). Eletroforese em
gel de agarose 1,5% corado com brometo de etídio.
62
Tabela 2. Seqüência de aminoácidos de clones VL (Cadeia variável leve: kappa ou lambda) obtidos no programa IgBlast. As regiões
determinantes de complementariedade (CDR) e framework (FR, regiões conservadas) estão indicadas. IGKV= Imunoglobulina variável leve
kappa, IGLV= Imunoglobulina variável leve lambda.
Clone
família
VL
FR 1 CDR 1 FR 2 CDR 2 FR 3 CDR 3
Subgrupo I
IGKV1-5*03 D I Q M T Q S P S T L S A S V G D R V T I T C R A S Q S I S S W L A W Y Q Q K P G K A P K L L I Y K A S S L E S G V P S R F S G S G S G T E F T L T I S S L Q P
IGKV1D-33*01 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C Q A S Q D I S N Y L N W Y Q Q K P G K A P K L L I Y D A S N L E T G V P S R F S G S G S G T D F T F T I S S L Q P E D I A T Y Y C Q Q Y D N L P
IGKV1D-16*01 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q G I S S W L A W Y Q Q K P E K A P K S L I Y A A S S L Q S G V P S R F S G S G S G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C QQ
IGKV1-16*01 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q G I S N Y L A F Q Q K P G K A P K S L I Y A S S L Q S S R F S G S G S G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y
IGKV1D-12*02 D I Q M T Q S P S S V S A S V G D R V T I T C R A S Q G I S S W L A W Y Q Q K P G K A P K L L I Y A A S S L Q S G V P S R F S G S G S G T D F T L T I S S L Q P E D
IGKV1D-13*01 T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q G I S S A L A W Y Q Q K P G K A P K L L I Y D A S S L E S G V P S R F S G S G S G T D F T L T I S S L Q P E D F A
IGLV1-44*01 Q S V L T Q P P S A S G T P G Q R V T I S C S G S S S N I G S N T V N W Y Q Q L P G T A P K L L I Y S N N Q R P S G V P D R F S G S K S G T S A S L A I S G L Q S E D E A D Y Y
IGLV1-47*01 Q S V L T Q P P S A S G T P G Q R V T I S C SG S S S N I G S N Y V Y W Y Q Q L P G T A P KL L I Y R N N Q R P S G V P D R F S G S K S GT S A S L A I S G L R S E D E A D Y Y C
IGLV1-51*01 Q S V L T Q P P S V S A A P G Q K V T I S C S G S S S N I G N N Y V S W Y Q Q L P G T A P K L L I Y D N N K R P S G I P D R F S G S K S G T S A T L G I T G L Q T G D E A D Y Y C
IGLV2-8*01 Q S A L T Q P P S A S G S P G Q S V T I S C T G T S S D V G G Y N Y V S W Y Q Q H P G K A P K L M I Y E V S K R P S G V P D R F S G S K S G N T A S L T V S G L Q A E D E A D Y Y C SSY
Subgrupo II
IGKV2D-30*01 D V V M T Q S P L S L P V T L G Q P A S I S C S S Q S L V Y S D G N T Y L N W F Q Q R P G Q S P R R L I Y K V S N W D S G V P D R F S G S G S G T D F T L K I S R V E A E D V G V Y YC
IGLV2-14*01 Q S A L T Q P A S V S G S P G Q S I T I S C G T S S D V G G Y N Y V S W Y Q Q H P G K A P K L M I Y E V S N R P S G V S N R F S G S K S G N T A S L T I S G L Q A E D E A D Y Y C
Subgrupo III
IGKV3-20*01 E V L T Q S P G T L S L S P G E R A T L S C R A S Q S V S S S Y L A W Y Q Q K P G Q A P R L L I Y G A S S R A T G I P D R F S G S G S G T D F T L T I S R L
IGKV3-11*01 E I V L T Q S P A T L S L S P G E R A T L S C R A S Q S V S S Y L A W Y Q Q K P G Q A P R L L I Y D A S N R A T G I P A R F S G S G S G T D F T L T I S S L E P E D F
IGKV3-15*01 E I V M T Q S P A T L S V S P G E R A T L S C R A S Q S V S S N L A W Y Q Q K P G Q A P R L L I Y G A T R A T G I P A R F S G S G S G T E F T L T I S S L Q S E D F A V Y Y C Q
IGLV3-21*02 L T Q P P S V S V A P G Q T A R I T C G G N N I G S K S V H W Y Q Q K P G Q A P V L V V Y DD S D R P S G I P E R F S G S N S G N T A T L T I S R V E A G D E A D
Subgrupo IV
IGLV4-69*01 Q L V L T Q S P S A S A S L G A S V K L T C T L S S G H S S Y A I A W H Q Q Q P E K G P R Y D G S H S K G D G I P D R F S G S S S G A E R Y L T I S S L Q S E D E A D Y
Subgrupo VI
IGLV6-57*01 N F M L T Q P H S V S E S P G K T V T I S C T R S S G S I A S N Y V Q W Y Q Q R P G S S P T T V I Y E D N Q R P S G V P D R F S G S I D S S S N S A S L T I
Subgrupo VII
IGLV7-46*02 Q A V V T Q E P S L T V S P G G T V T L T C GS S T G A V T S G H Y P Y W F Q Q K P G Q A P R T L I Y D T S N K H S W T P A R F S G S L L G G
63
4.3- Culturas de células humanas de tireóide
As células humanas de tireóide (Figura 10), tanto da cultura secundária tumoral
(NPA) como da primária de bócio, cresceram em suspensão no meio, o que dificultou o
contato entre célula-célula importante para a dispersão celular, por isso essas linhagens
apresentaram crescimento celular lento e demoraram cerca de um mês para atingirem a fase
log, período durante o qual a multiplicação é máxima e constante. A cultura primária de
bócio apresentou crescimento mais lento comparado com a cultura secundária e tempo de
vida curto de aproximadamente três meses, após esse período foi observada grande número
de células mortas. Já a cultura secundária é capaz de proliferar indefinidamente e não
entrou em fase de senescencia.
Figura 10. Culturas de células
humanas de tireóide visualizada em
microscópio invertido. Cultura primária
de bócio (A) 400X, (B) 200X e cultura
secundária de células tumorais de
tireóide (C) 200X.
64
4.4- Análises dos clones selecionados
4.4.1- Análise Monoclonal por Dot Immunoblotting
Os clones do último ciclo de seleção depois de induzidos com o reagente IPTG para a
produção de scFv na forma solúvel foram avaliados por Dot Immunoblotting quanto à expressão
desses fragmentos no sobrenadante de cultura, como mostrado na Figura 11.
Dentre os 96 fragmentos de anticorpos expressos em placas deep well, 21 clones (23%)
expressaram o epítopo da hemaglutinina e foram reconhecidos pelo anticorpo anti-HA no Dot
blottting. Os clones positivos foram utilizados no ensaio imunoenzimático ELISA para seleção
dos fragmentos de anticorpos scFv com maior afinidade às proteínas de tumor de tireóide.
Figura 10. Dot Immunoblotting para análise da expressão dos fragmentos de anticorpos em cultura
induzida por IPTG. As marcações circundadas na membrana foram consideradas positivas, sendo os
demais clones negativos por não apresentarem reatividade ao anticorpo anti- HA.
65
4.4.2- Ensaio de Imunoadsorção por ligação enzimática (ELISA) para seleção dos
fragmentos de anticorpos scFv com maior afinidade às proteínas de tumor de tireóide
4.4.2.1- Análise das proteínas utilizadas no ensaio ELISA por eletroforese em gel
SDS-PAGE
O processo de extração de proteínas de tecidos tireoideanos, como o tumor, Adenoma e
bócio foi eficiente, como pode ser observado pelo padrão de bandas formadas no gel SDS-
PAGE (Figura 12), no qual o evidenciamento de várias bandas é um indicativo da diversidade
das proteínas.
Figura 11. Gel SDS-PAGE para análise das proteínas extraídas de tecidos
tireoidianos. Coluna M: Marcador de peso molecular Prestained SDS-PAGE
Standards Broad Range (Bio-rad). Colunas 1 a 6: 15 microgramas de proteínas de
tecidos tireoidianos de bócio.
4.4.2.2- Elisa em extrato protéico
O ensaio imunoenzimático ELISA possibilitou a seleção de treze fragmentos de
anticorpos com maior afinidade às proteínas tumorais de tireóide. Os resultados foram
66
analisados quanto à absorbância absoluta e quanto à razão entre as reatividades dos clones às
proteínas de tumor pela média entre Bócio e Adenoma.
O fragmento de anticorpo scFv-C8 mostrou maior reatividade absoluta, provavelmente
devido a sua maior produtividade no sobrenadante de cultura. Entretanto, a análise quanto à
razão entre as reatividades às proteínas de tumor e Bócio e Adenoma, os clones A4, A9, C1, E4
e F3 mostraram as maiores diferenças (Gráfico 1). O sobrenadante de cultura de bactérias
expressando o pComb3XSS vazio, sem a inserção de um fragmento de anticorpo scFv, foi
analisado quanto à reatividade às proteínas de tumor de tireóide, Bócio e Adenoma e, em todos
os casos, foi pouco reativo.
Gráfico 1. Elisa para análise da reatividade dos scFvs selecionados. Fragmentos de anticorpos scFv solúveis
(induzidos por IPTG) contra proteínas de tecido de Câncer (azul), Adenoma (rosa) e Bócio (verde). Todos os
clones mostraram melhor reatividade com as proteínas de câncer. Razão OD 492nm: proteínas de câncer dividido
pela média entre as proteínas de Adenoma e Bócio de cada clone analisado.
Razão DO 492nm
Câncer/ Média (Bócio: Adenoma)
A4- 1,90
A5- 1,65
A9- 2,07
C1- 2,04
C4- 1,58
C8-1,69
C9- 1,86
D8- 1,50
D11- 1,73
E3-1,62
E4-2,02
F3-1,94
G1- 1,72
67
4.4.3- Clone selecionado para imunoistoquímica
O clone scFv-C1 foi escolhido para a realização da imunoistoquímica, pois apresentou
melhor afinidade às proteínas de tumor comparado com as proteínas de bócio e adenoma no
ensaio Elisa.
4.4.4- Análise in Silico do clone selecionado
A análise da sequência do clone scFv-C1 realizada no programa IgBlast foi feita como
na Figura 10. A Cadeia Leve (VL) e Pesada (VH) desse fragmento de anticorpo fazem parte da
família 3, com as respectivas denominações fornecidas pelo programa, IGLV3-21*03 e
IGHV3-7*01.
4.5- Imunoistoquímica
O fragmento de anticorpo monoclonal scFv, clone C1, foi empregado em um micro-
arranjo de tecido (TMA) contendo 229 casos de tireóide. Formado por 110 Carcinomas
Diferenciados da Tireóide, sendo 38 de Carcinoma Papilífero, 42 de Folicular e 30 de Papilífero
variante Folicular e também casos benignos como 35 Adenomas Foliculares, 49 Bócios e 18
tireóides normais. Destes, 164 eram do sexo feminino e 36 do sexo masculino e a idade ao
diagnóstico variou de 15 a 88 anos, com média de 48,78±15,95 anos. Os dados do TNM e
tempo de seguimento em meses do grupo Carcinoma também estão na inseridos na Tabela 3.
68
Tabela 3. Características dos pacientes da lâmina de micro-arranjo (TMA)
O scFv-C1 reagiu especificamente ao citoplasma e membrana das células tumorais de
tireóide, e não ocorreu marcação nos tecidos controles incubadas sem o anticorpo scFv
representado na Figura 13. A marcação do anticorpo recombinante scFv foi positiva em 55%
dos casos de carcinomas, ou seja, o anticorpo provavelmente reconhece uma proteína que não é
Carcinomas Controles
Papilífero Pap. Variante
Folicular Folicular
Adenoma
Folicular
Bócio
colóide
Tireóide
Normal
Números de pacientes Números de pacientes
Total 38 30 42 52 49 18
Idade
Média 48 46 55
45 48 58
Mín- Máx 16-69 15-74 28-88 15-77 16-77 30-73
F(%)/ M(%) 26 (74,3)
9 (25,7)
21 (77,8)
6 (22,2)
31 (83,8)
6 (16.2)
41 (83,7)
8 (16,3)
31 (83,8)
6 (16,2)
14 (93,3)
1 (6,7)
TNM n/total (%)
1.T1 18/38 (47,4) 19/26 (73,1) 7/17 (41,2)
2.T2 1/38 (2,6) 2/26 (7,7) 3/17 (17,6)
3.T3 10/38 (26,3) 4/26 (15,4) 0
4. T4a e b 0 0 0
5.IVA 6/38 (15,8) 0 1/17 (5,9)
6.IVB 1/38 (2,6) 1/26 (3,8) 5/17 (29,4)
7.IVC 2/38 (5,3) 0 1/17 (5,9)
Tempo
seguimento
Média (Min-
Max)
51,08 (9-81) 51,92 (21-87) 70,57 (1-175)
69
expressa em todos os pacientes com carcinoma de tireóide. Com relação ao grupo controle,
houve marcação positiva do scFv em 29% dos casos de Adenoma, em 6% dos Bócios e não
ocorreu marcação em tireóides normais (Tabela 4).
Figura 12. Reatividade do fragmento de anticorpo scFv nas células tumorais de tireóide, em marrom
(indicado pelas setas). Marcação positiva na lâmina A. Carcinoma Papilífero (aumento original x 400) e B.
Carcinoma Folicular (aumento original x 200). Marcação negativa foi observada em C. Bócio (aumento original
x 400) e na lâmina controle D. um Carcinoma Papilífero sem o scFv-C1.
70
Tabela 4. Resultado da marcação do fragmento de anticorpo scFv- C1 para as variáveis a
anátomo patológicas dos casos de tireóide analisados por micro-arranjo de tecido (TMA)
Análises estatísticas realizadas no programa SPSS revelaram que a marcação positiva do
fragmento de anticorpo scFv foi capaz de diferenciar o grupo câncer do grupo controle com
significância estatística (p< 0,0001), entretanto para o grupo câncer não distinguiu os casos de
Carcinoma Papilífero, Folicular e Papilífero variente folicular (Tabela 5).
No grupo câncer foi realizada a análise estatística para verificar se existe relação entre a
marcação do anticorpo scFv- C1 e o estadiamento do tumor. Foi observado que o scFv reagiu
em maior número de tumores pequenos e restritos a tireóide (T1 e T2), ou seja, reconheceu
tumores considerados de baixa agressividade e de bom prognóstico. O valor de p resultante
dessa comparação foi igual a 0,005, considerado um valor limítrofe e estatisticamente
significativo.
Também com relação ao prognóstico, foi observado a reatividade do scFv-C1 em maior
número de casos de pacientes com boa evolução. Do total de 49 pacientes positivos na
Variáveis Fragmento de anticorpo scFv-C1
Negativo
N (%)
Positivo
N (%)
Total
Carcinoma Papilífero 18 (47%) 20 (53%) 38
Carcinoma Papilífero variante
Folicular 15 (50%) 15 (50%) 30
Carcinoma Folicular 17 (40%) 25 (60%) 42
Adenoma Folicular 37 (71%) 15 (29%) 52
Bócio 46 (97%) 3 (6%) 49
Normal 18 (100%) 0 18
Total 110
71
imunoistoquímica, 40 casos eram de pacientes com evolução sem metástase. Entretanto, esse
dado não foi estatisticamente significativo (p=0,916) devido ao pequeno número de casos de
pacientes com mal prognóstico, o que impossibilita a comparação entre os dois grupos (bom e
mal prognóstico).
Tabela 5. Comparação entre a marcação positiva do anticorpo scFv-C1 e as variáveis anátomo
patológicas das casos de tireóide analisados por micro-arranjo de tecido (TMA)
Variáveis
N casos (% positivo para o anticorpo scFv-C1)
P#
Grupo Câncer
N=110 (55%)
Normal 18 (0%) 0,000*
Bócio 49 (6%) 0,000*
Adenoma Folicular 52 (29%) 0,002*
Grupo controle 119 (15%) 0,000*
Carcinoma Papilífero
N=38 (52%)
Normal 18 (0%) 0,000*
Bócio 49 (6%) 0,000*
Adenoma Folicular 52 (29%) 0,000*
Carcinoma Papilífero variante
Folicular 30 (50%) 0, 829
Carcinoma Folicular 42 (59%) 0,535
Carcinoma Papilífero variante
Folicular
N=30 (50%)
Normal 18 (0%) 0,000*
Bócio 49 (6%) 0,000*
Adenoma Folicular 52 (29%) 0,055*
Carcinoma Folicular 42 (59%) 0,423
Carcinoma Folicular
N=42 (59%)
Normal 18 (0%) 0,000*
Bócio 49 (6%) 0,000*
Adenoma Folicular 52 (29%) 0,000*
O grupo Carcinoma é formado pelo Carcinoma Papilífero, Papilífero variante Folicular e o
Folicular, e o grupo Controle pelos casos de Bócio, Adenoma Folicular e tireóide normal. #valor de P para comparação de freqüências.
*valor de P significativo entre os grupos.
72
A análise da intensidade para cada grupo está representada no Gráfico 2. A, e os valores
resultantes da fórmula da intensidade e área da marcação no Gráfico 2. B. A análise estatística
da intensidade e área da marcação entre os grupos de pacientes foi realizada pelo teste
ANOVA- Bonferroni (Tabela 6) foi observada diferença significativa entre o grupo Carcinoma
Papilífero clássico em relação ao bócio e tireóide normal, o Carcinoma Papilífero variante
Folicular foi diferente dos grupos bócio e tireóide normal, o Carcinoma Folicular apresentou
diferença estatística além dos casos de bócio e tireóide normal foi diferente também do grupo
Adenoma Folicular. Não foi observada diferença significativa entre os carcinomas.
Gráfico 2. Análise da intensidade e área da coloração na lâmina TMA. O Gráfico A. mostra o valor relativo da
intensidade da coloração de todos os pacientes positivos na imunoistoquímica. O Gráfico B. apresenta os valores
resultantes da fórmula intensidade e área da marcação: intensidade multiplicada pela área marrom e dividida pelo
somatório área azul mais área marrom. n= Número de casos positivos na Imunoistoquímica para cada grupo
anátomo patológico. * O valor de P é significativo entre os grupos.
73
Tabela 6. Análise da intensidade e área da marcação entre os grupos com o teste ANOVA-
Bonferroni
Grupo de pacientes P
Carcinoma Papilífero
Carcinoma Papilífero Variante Folicular
Carcinoma Folicular
Tireóide Normal
Bócio
Adenoma Folicular
1,000
1,000
0,001*
0,000*
0,109
Carcinoma Papilífero
variante Folicular
Carcinoma Folicular
Tireóide Normal
Bócio
Adenoma Folicular
1,000
0,004*
0,000*
0,319
Carcinoma Folicular
Tireóide Normal
Bócio
Adenoma Folicular
0,000*
0,000*
0,003*
Adenoma Folicular Tireóide Normal
Bócio
0,527
0,189 * A diferença é significativa entre os grupos.
74
5- DISCUSSÃO
75
O objetivo do presente estudo foi a construção de uma biblioteca humana de fragmentos
de anticorpos monoclonais (scFv) apresentada em fagos (Phage display), seleção dessa
biblioteca contra células tumorais de tireóide e posterior caracterização das moléculas scFv
ligantes à superfície celular tumoral. Almeja-se que esses scFvs possam ser utilizados como
biomarcadores auxiliando as metodologias já existentes no diagnóstico e prognóstico do
carcinoma de tireóide.
Este trabalho é a primeira investigação de fragmentos de anticorpos scFv em carcinoma
diferenciado de tireóide, porém existem várias pesquisas relacionadas a busca por anticorpos
monoclonais em outros tipos de carcinomas, tais como: próstata (Flego M, 2007), carcinoma
renal, pancreático, gástrico, de ovário, cólon e pulmão (Kurosawa G, 2008).
A vantagem da utilização de uma biblioteca de fragmentos de anticorpos humana e
imune em aplicações terapêuticas, ou seja, produzida a partir de material (sangue) de pacientes
com carcinoma de tireóide, está associado à eliminação de possível resposta imune não desejada
contra anticorpos produzidos em camundongos (Hwang e Foote, 2005). Além disso, partindo do
princípio que os pacientes com carcinoma de tireóide produzem anticorpos contra o tumor,
utilizar os linfócitos circulantes no sangue periférico dos pacientes parece ser uma fonte
plausível de potenciais ligantes a antígenos tumorais, de certa forma, eles podem ser
considerados imunizados pelo tumor (Dantas-Barbosa, 2004).
O tamanho da biblioteca de fragmentos de anticorpos monoclonais scFv produzida a
partir de pacientes com carcinoma diferenciado de tireóide é de 1,02x106
clones. Segundo
alguns autores, o sucesso na obtenção de anticorpo de alta afinidade geralmente está associado
ao tamanho inicial da biblioteca, mesmo que, essa relação dependa mais real interação do
anticorpo com o antígeno, que não pode ser prevista em teoria. As bibliotecas bem sucedidas
variam na ordem de 106 a 10
10 (Itoh et al., 2003, Vaughan et al., 1996).
76
Com relação aos segmentos gênicos da cadeia pesada (VH), estes são divididos em três
subgrupos, sendo que o subgrupo I possui as famílias VH1, VH5 e VH7, o subgrupo II é
formado por VH2, VH4 e VH6 e o subgrupo III contém apenas a família VH3. A biblioteca de
anticorpos scFv construída nesse trabalho possui no mínimo genes VH de três famílias
diferentes VH 1, 3 e 4, portanto possui um representante gênico VH de cada subgrupo. Segundo
os autores Honjo e Matsuda, a família VH3 é a mais abundante do repertório humano, a VH1 é
a segunda mais representada seguida por VH4 e, contribuindo com pequena proporção do
repertório estão as famílias VH2, VH5, VH6 e VH7. Com isso, a biblioteca scFv possui os
genes VH das famílias mais representativas do repertório humano de imunoglobulinas.
O repertório da cadeia leve apresentou mellhor variabilidade (VL 1, 2, 3, 4, 6 e 7)
comparado com a cadeia pesada, isso pode ser devido a melhor qualidade do seqüenciamento
dos fragmentos VL, que possibilitou melhor análise in silico. Outra característica importante da
biblioteca de scFv é que os fragmentos de anticorpos expressam 50% tanto de cadeia leve κ
(kappa) quanto de λ (lambda), sendo que no repertório humano cerca de 70% dos anticorpos
expressam cadeia leve κ e apenas 30% a cadeia leve λ (Farner et al., 1999). A mesma proporção
dos subtipos da cadeia leve (κ e λ) presente na biblioteca foi devido a utilização de quantidades
iguais de genes codificadores dessas regiões durante a construção do fragmento scFv.
Nesse estudo, a biblioteca de scFv foi selecionada contra toda a superfície das células
tumorais de tireóide não utilizando proteínas isoladas. A maioria das seleções é realizada com
proteínas isoladas, ou seja, com um antígeno previamente conhecido e relacionado à biologia do
câncer, como por exemplo, o estudo sobre a seleção de fragmentos de anticorpos específicos ao
receptor do fator de crescimento fibroblástico (Gorbenko et al., 2009; Martinez et al., 2005;
Rauchenberger et al., 2003). A utilização de metodologias que permitem fazer uma varredura
77
das células tumorais, sem conhecimento prévio das proteínas nelas presente, propicia a
identificação de marcadores tumorais novos (Dantas- Barbosa, 2004).
Além disso, o procedimento de seleção com a célula é vantajoso em comparação ao uso
de proteínas isoladas, pois a expressão e purificação dessas proteínas geralmente são difíceis e
com o uso das células as proteínas associadas à membrana mantêm a estrutura complexa e a
conformação nativa (Lipes, 2008).
Assim, o procedimento da imunoistoquímica além de analisar a reatividade do fragmento de
anticorpo scFv-C1 pelas células de tireóide teve o objetivo de avaliar a utilidade prognóstica desse
fragmento de anticorpo. A associação da reatividade do scFv com tumores primários relacionados a
outros parâmetros bem conhecidos de prognóstico poderia ajudar a traçar diferentes estratégias de
tratamento para o CDT.
Os resultados da imunoistoquímica sugerem que o fragmento de anticorpo scFv-C1 é
específico às células tumorais de tireóide e com capacidade de distinguir o grupo câncer
(Carcinoma Papilífero, variante Folicular e Folicular) do grupo controle (Adenoma, bócio e
tireóide normal) com significância estatística (p<0,0001). Com relação aos valores da
intensidade e da área da marcação do scFv-C1 analisados pelo programa ACIS (Dako), foi
observado valores maiores para o grupo câncer do que para o grupo controle, ou seja, o
anticorpo recombinante apresentou maior reatividade pelos tecidos tumorais. Com isso, esse
scFv é um potencial candidato para complementar o diagnóstico diferencial entre lesões de
padrão folicular da tireóide, um grupo que inclui nódulos Adenomatosos ou hiperplásicos,
Adenomas Foliculares, Carcinomas Foliculares e variantes Foliculares dos carcinomas
Papilíferos, que comumente causam dificuldades diagnósticas (Sosa e Udelsman, 2006; Cheung
et al., 2001; Demellawy et al., 2008; Serra e Asa, 2008). Além disso, um diagnóstico
78
histopatológico correto é essencial para o planejamento clínico e cirúrgico e conseqüente
prognóstico do paciente (Ward et al., 2008; Fagin et al., 2007).
Além de diferenciar o grupo câncer do controle, uma análise do anticorpo scFv somente
no grupo câncer demonstrou que o scFv-C1 reagiu em maior número de pacientes com
carcinomas T1 e T2 com significância estatística. Os tumores T1 e T2 são pequenos, menores
que 4 cm e restritos a tireóide, essa classificação dos tumores foi baseada na 6ª edição da
International Union Against (UICC) (Varanda et al., 2007). Pode-se concluir que o anticorpo
scFv-C1 possui maior reatividade por tumores de baixo risco e de pouca agressividade,
indicando ser um possível marcador de bom prognóstico para tumores de tireóide.
Outro dado que reforça a proposição do scFv ser um possível marcador de bom
prognóstico é a sua reatividade em maior número de pacientes com evolução clínica sem
metástase e livre de doença, entretanto esses dados não foram significativos devido ao pequeno
número de casos com evolução clínica ruim, é frequente a maioria dos casos de carcinoma
diferenciado de tireóide ter bom prognóstico.
Neste trabalho, foi construída uma biblioteca imune e humana de fragmentos de
anticorpos monoclonais scFv apresentados em fagos, essa biblioteca apresentou repertório
variado e tamanho adequado para prosseguir a seleção. A seleção foi realizada utilizando os
métodos Brasil e Phage display contra células tumorais de tireóide para obtenção de anticorpos
específicos ao tumor. Os ligantes selecionados foram caracterizados quanto à sequência e
reatividade em relação às proteínas e tecidos tireoidianos. Após a caracterização encontramos
um possível bom candidato a marcador de diagnóstico de Câncer de Tireóide. Para afirmarmos
se esse anticorpo terá utilidade clínica serão necessários mais testes de validação.
79
6- CONCLUSÃO
80
O fragmento de anticorpo scFv-C1 pode ser um potencial candidato a biomarcador para
o diagnóstico do Câncer de tireóide, pois foi capaz de distinguir o grupo Câncer do grupo
Controle e mostrou reatividade significativa aos tumores com estadiamento T1 e T2.
81
7-REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
82
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4 ed., 2000.
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http://www.cancer.org./docroot/PRO (acesso em 11/2003).
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generation of chicken monoclonal antibody fragments by phage display. Journal of
Immunological Methods. 2000; 242:159-81.
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90
8- ANEXOS
91
ANEXO 1
MEIOS DE CULTURA
Meios para cultivo de Bactéria
Meio LB (Luria Bertani), pH 7,0
Peptona de caseína 1,0% (p/v)
Extrato de levedura 0,5% (p/v)
NaCl 1,0% (p/v)
Meio LB ágar (sólido)
Meio LB adicionado de ágar bacteriológico a uma concentração final de 1,4% (p/v).
Meio SB, pH 7,0
Peptona de caseína 1,0% (p/v)
Extrato de levedura 0,5% (p/v)
MOPS 1,0% (p/v)
Meio SOB, pH 7,0
Peptona de caseína 2,0% (p/v)
Extrato de levedura 0,5% (p/v)
NaCl 0,05% (p/v)
KCl 0,00186% (p/v)
Meio SOC
Meio SOB 97 mL
Glicose 2M (filtrada) 1mL
MgCl2 1M (autoclavado) 1 mL
Mg SO4 (autoclavado) 1 mL
92
Os meios foram autoclavados a 120°C durante 20 minutos e conservados a temperatura
ambiente até a utilização.
MEIOS PARA CULTIVO DE CÉLULAS HUMANAS
Meio de cultura Dulbecco‟s Modified Eagle Medium – D-MEM (Nutricell)
ANTIBIÓTICOS
As soluções estoque dos antibióticos: ampicilina, carbenicilina e kanamicina foram
preparadas em água milli Q nas concentrações de 150, 100 e 50 mg/mL, respectivamente. A
solução de tetraciclina foi preparada a 20 mg/ml em etanol. Todas essas soluções foram
esterilizadas por filtração em filtro Millipore 0,2 m e estocadas em alíquotas de 2 mL a -20ºC,
sob o abrigo da luz.
SOLUÇÕES DE USO GERAL
Tampão TE
Tris-HCl pH 8,0 10 mM
EDTA pH 8,0 1 mm
Glicose 20%
Glicose anidra 20 mL
Água bidestilada q.s.p. 100 mL
Solução esterilizada por filtração em filtro Millipore de 0,2 mm.
Glicerol 10%
Glicerol 10 mL
Água bidestilada q.s.p. 100 mL
Solução esterilizada por autoclavagem.
93
Glicerol 50%
Glicerol 50 mL
Água bidestilada q.s.p. 100 mL
Solução esterilizada por autoclavagem.
TBS-BSA 1%
Tris-HCl (pH 7,5) 50mM
NaCl 150mM
Albumina Bovina Sérica (BSA) 1% (p/v)
IPTG (isopropil-β-D tiogalactosídeo) 0,5M
Para solução estoque de 0,5M foram dissolvidos 3,0g de IPTG em 25 mL de água milli
Q, em seguida a solução foi esterilizada por filtração em filtro Millipore 0,2 m, dividida em
alíquotas de 1 mL e estocadas a -20°C.
SOLUÇÕES PARA ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE E DE
POLIACRILAMIDA
Tampão de corrida para gel de Agarose (TBE) 10X
Tris base 54g
Ácido bórico 27,5g
EDTA 0,5M; pH 8,0 20 mL
Água bidestilada q.s.p 1000mL
Ajustar o pH para 8,3 se necessário.
Tampão de amostra para gel de agarose
Glicerol 50% (v/v)
Azul de bromofenol 0,2% (p/v)
Solvente TBE 2,5%
Estocado a 4ºC.
94
Solução de Brometo de Etídeo
Estoque 5 mg/mL
Uso 0,1-0,5 µg/mL
Estocada a temperatura ambiente e ao abrigo da luz.
Tampão de corrida para SDS-PAGE (5X)
Tris base 125 mM
Glicina 0,96 M
SDS 0,5% (p/v)
Estocado a temperatura ambiente.
Tampão da amostra para SDS-PAGE (2X)
Tris-HCl pH 6,8 100mM
SDS 4% (v/v)
Glicerol 20% (v/v)
β –mercaptoetanol 5% (v/v)
Azul de bromofenol 0,2% (p/v)
Estocada a 4°C.
Acrilamida 49,5% (49:0,5)
Acrilamida 49g
Bis- acrilamida 0,5g
Água bidestilada q.s.p 100 mL
Estocada na geladeira ao abrigo da luz.
Tris-HCl 1,5 M, pH 8,8
Tris 36,34g
Água bidestilada q.s.p 200mL
95
Tris-HCl 1,0 M, pH 6,8
Tris 12,11g
Água bidestilada q.s.p 100mL
SDS 10% (p/v)
SDS 10 g
Água bidestilada q.s.p 100mL
PSA 10%
Persulfato de Amônio 100mg
Água bidestilada q.s.p 1mL
Gel empilhamento SDS-PAGE
Solução Acrilamida/Bis-acrilamida (49,5%) 420 µL
Tris-HCl 1,0 M pH 6,8 717 µL
Água bidestilada 1.860 µL
Temed 9 µL
Persulfato 10% 54 µL
Gel Separador SDS-PAGE
Solução Acrilamida/Bis-acrilamida (49,5%) 2.980 µL
Tris-HCl 1,0 M pH 6,8 2.980 µL
H2O 1.326 µL
Glicerol 1.683 µL
Temed 9 µL
Persulfato 10% 54 µL
Solução Corante para Gel SDS-PAGE
Azul brilhante de Coomassie R-250 0,25% (p/v)
Metanol 30% (v/v)
Ácido acético glacial 7% (v/v)
96
Agitar bem (agitador magnético)
Solução filtrada em papel alumínio
Solução descorante para Gel SDS-PAGE
Metanol 30% (v/v)
Ácido acético glacial 7% (v/v)
SOLUÇÕES PARA ELISA, DOT BLOT E WESTERN BLOT
Tampão PBS (Phosphate- Buffered Saline) 10X pH 7,4
NaCl 80g
KCl 2,0g
Na2HPO4 17,0g
KH2PO4 1.63g
Completado para 1 litro deágua bidestilada e esterilizado por autoclavagem, pH 7,4,
ajustado quando necessário.
PBST 1X, pH 7,4
PBS adicionado de tween 20 a 0,05% (v/v).
Vermelho de Ponceau S- solução estoque 10 X
Ponceau S 2 g
Ácido tricloroacético 30 g
Ácido sulfosalicílico 30 g
Água bidestilada q.s.p 100 mL
Solução de bloqueio (Dot blot e Western)
PBS 1X adicionado de albumina bovina sérica a 3% (p/v).
Solução de bloqueio (Elisa)
PBS 1X adicionado de leite desnatado a 5% (p/v).
97
Ácido Sulfúrico 4N (parar reação de Elisa)
H2O 60 mL
Ácido sulfúrico 40 mL
Adicionar primeiro a água e depois o ácido.
Tampão de transferência
Tris 5,8g
Glicina 2,9 g
SDS 0,37 g
Metanol 200 mL
Água bidestilada q.s.p 1000 mL
O pH deve ser de 8,3 sem precisar de ajuste.
Tampão da fosfatase alcalina (APB)
NaCl 100 mM
Tris-HCl; pH 9,5 100 mM
MgCl2 5 mM
Solução reveladora para Western blot
Para o preparo da solução estoque de NBT (nitro blue tetrazolium) foram diluídos 50 mg
em 1 mL de dimetil formamida a 70%, e o BCIP (Fosfato de bromo cloroindolil) foram diluídos
50 mg em 1mL de água. Solução trabalho: 134 µL de NBT em 10mL de APB, misturar e
adicionar 66 µL de BCIP nessa solução.
Solução reveladora de peroxidase
Foi dissolvido 10 mg de DAB em pó em 15 mL de PBS 1X, filtrado em filtro Millipore
0,2 m e adicionado 12 µL de H2O2 a 30%.
Anticorpos
Anti-HA marcado com fosfatase
Anti-HA marcado com peroxidase
98
SOLUÇÕES PARA PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNA EM COLUNA DE NÍQUEL
(HPLC)
Tampão fosfato 8X, pH 7,4
NaCl 23,38g
Na2HPO4 . 2H2O 1,42g
NaH2PO4 . H2O 1,11g
Água bidestilada q.s.p. 100 mL
A solução foi filtrada com filtro Millipore de 0,22 μm.
Imidazol 2M, pH 7,4
Imidazol 27,4g
Água bidestilada q.s.p. 200 mL
A solução foi filtrada com filtro Millipore de 0,22 μm.
Tampão de ligação, pH 7,4
Tampão fosfato 1X
Imidazol 10 mM
A solução foi filtrada com filtro Millipore de 0,22 μm.
Tampão de Eluição, pH 7,4
Tampão fosfato 1X
Imidazol 500 mM
A solução foi filtrada com filtro Millipore de 0,22 μm.
Todos os tampões da purificação foram armazenados a 4°C.
SOLUÇÕES DE PREPARAÇÃO DE DNA PLASMIDIAL
GET
Glicose filtrada 20% 0,92 %
EDTA 0,5 M pH 8,0 (autoclavado) 10 mM
Tris-HCl 1M pH 7,4 (autoclavado) 26mM
99
KOAc
Ácido acético glacial 60,0 mL
KOAc 5M (filtrado) 11,5 mL
Água milli Q (autoclavada) 28,5 mL
RNase
RNase A 10 mg
Água bidestilada q.s.p. 1mL
Dissolvida em água milli Q e fervida em banho-maria por 15 minutos.
SOLUÇÃO PARA DOSAGEM DE PROTEÍNAS PELO MÉTODO DE
BRADFORD
Reagente de Bradford
Coomassie Blue G-250 100 mg
Etanol 95% 50 mL
Ácido ortofosfórico 100 mL
Água bidestilada q.s.p. 200 mL
O Coomassie Blue foi dissolvido no etanol, em seguida adicionado o ácido ortofosfórico
e o volume completado com água. Esse reagente é estável a 4°C por até seis meses.
Solução padrão de proteína em tampão PBS
Albumina de soro bovino (BSA) 1mg/ mL
100
ENZIMAS, REAGENTES E KITS UTILIZADOS
Agarose (BioNovagency) para gel de eletroforese.
Cubetas de 0,2 cm – (Bio-Rad) usadas para eletroporação no equipamento Gene Pulser com
Pulser Controller.
Platinum Taq DNA Polimerase - (Invitrogen, 5 U/ L) fornecida com o seu tampão de reação
10X, utilizada nas reações de PCR.
Mistura de dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 100mM (Sinapse) utilizados nas reações de
PCR.
Marcador de Massa Molecular 100bp (Sinapse).
DYEnamic ET Dye Terminator Cycle Sequencing Kit for MegaBace- (Amershan) Mix de
reação de sequenciamento.
T4 DNA Ligase - (Invitrogen, 1 u/ L) fornecida com o seu tampão 5X, utilizada nas reações de
ligação.
PEG-8000 Anresco-(GoldLab) para precipitação dos fagos.
Soro bovino fetal (Nutricell)
Glicogênio - (Roche Molecular Biochemicals) 20 mg/mL.
Enzima de restrição Sfi I - (New England Biolabs, 20 U/ L), acompanhada do tampão de
reação NEB 2 10X, utilizada para restrição do vetor pComb e o fragmento do anticorpo scFv.
HisTrap™ HP Columns - Easy, High-performance Purification GE Healthcare
101
ANEXO 2
102
ANEXO 3
Extração de RNA de Sangue
1- Colocar todo o sangue em tubo falcon (15mL);
2- Centrifugar o sangue por 10 min a 2.500 rpm a 4°C;
3- Transferir o plasma para um microtubo e armazenar a -80°C;
4- Deixar no máximo 2,5mL no tubo. Caso o volume esteja à cima de 2,5mL dividir o total em
dois tubos;
5- Adicionar nove partes (11,5mL) de cloreto de amônio e uma parte (1,25mL) de bicarbonato
de amônio. Misturar antes de adicionar às células, 5 vezes o volume das hemáceas;
6- Inverter delicadamente para misturar bem;
7- Incubar em gelo por 15 minutos;
8- Centrifugar a 3000 rpm por 15 minutos a 4°C e descartar o sobrenadante;
9- Adicionar 1,0mL de solução D (ou 950µL de solução D + 50µL de sarcosil 10%);
10- Adicionar 8µL de β-mercaptoetanol;
11- Agitar no vórtex para diluir o pellet de células e mergulhar no gelo;
12- Adicionar 100µL de acetato de sódio 2M pH= 4;
13- Adicionar 1,0 mL de fenol saturado em água (pH = 4 e 5);
14- Acrescentar 200µL de clorofórmio-álcool isoamílico (49:1, 196µL: 4µL);
15- Vortexar a suspensão por 10 segundos e distribuir a mistura em tubos de 2,0mL (nomear
cada tubo). Colocar no gelo por 15 minutos;
16- Centrifugar a amostra por 15 minutos a 12.000g a 4°C;
17- Após centrifugar, transferir no máximo 1,0 mL da fase aquosa para cada microtubo de 2mL
e adicionar cerca de 750µL de isopropanol gelado e manter a -20ºC (freezer) – Deixar
overnight (mínimo 4 horas);
18- Centrifugar a 12.000g por 15 min a 4°C e descartar o álcool com cuidado;
19- Lavar com 1,0mL de Etanol 75% e descartar o sobrenadante;
Deixar o RNA secando por 15 minutos e ressuspender o pellet em 25µL de água
Mesmo dia
103
ANEXO 4
Precipitação e Purificação dos produtos de gel de agarose
1- Adicionar 2µL de acetato de amônio (7,5M) para cada 8µL de produto
2- Coletar em tubo novo, acrescentar 30µL de etanol absoluto (ou Isopropanol) gelado, para
cada 10µL de produto com acetato. Cuidadosamente homogeneizar como no vortex;
3- Incubar overnight a -20o C;
4- Centrifugar 13.000 rpm por 15 minutos, -4o C;
5- Remover o sobrenadante e adicionar 250µL de etanol 70% (175µL etanol + 75µL água);
6- Centrifugar 13.000rpm por 7 minutos, -4oC. Descartar o sobrenadante e secar por 15
minutos;
7- Ressuspender em água ou TE (20µL). Se o pellet for pequeno ressuspendê-lo em 15µL
de água;
8- Incubar 15 minutos no banho-maria a 37o C;
9- Aplicar 3µL de produto em gel de agarose 1,5%.
104
ANEXO 5
105
ANEXO 6
Termo de Consentimento
Projeto de Pesquisa em Câncer de Tireóide
Pesquisador: Prof. Dra. Laura Sterian Ward
Prof. Dr. Luiz Ricardo Goulart
Paciente ou Responsável pelo paciente
Sr (a) _______________________________________________________________
_______ anos RG:_____________ HC:____________________
Endereço:___________________________________________________________
Telefone:___________________________________________________________
Concordo em doar sangue, saliva e biópsia de tecido (provenientes dos procedimentos
rotineiros do centro cirúrgico do HC/UFU), para pesquisa de ácidos nucléicos e proteínas que
podem estar envolvidas em doenças malignas e benignas da tireóide. Sei que se trata de uma
pesquisa científica e concordo em que os dados de meu caso, registrados no meu prontuário
médico, sejam utilizados na pesquisa, sabendo que meu nome assim como meus dados clínicos
e de laboratório não serão individualmente citados e que em nenhum momento meu diagnóstico
ou tratamento serão prejudicados por tal doação. Também sei que esta pesquisa pode trazer
benefícios para a cura ou tratamento das doenças tireoidianas no futuro, mesmo que eu não me
beneficie disso agora. Não terei nenhum gasto com a doação do meu material para esta pesquisa
e sei que poderei cancelar minha decisão e deixar de participar em qualquer momento. Também
não serei submetido a qualquer procedimento que não faça parte da rotina de meu tratamento
normal, sob a orientação de meu médico habitual.
Estou consciente da importância de minha participação da qual posso desistir em
qualquer momento. Fui informado de que este projeto está aprovado pelo Comitê de Ética em
Pesquisa e sei que poderei obter todas as informações que desejar e necessitar no fone: (34)
3218-2478.
Assinatura do Paciente
Assinatura do Pesquisador
Prof. Dr. Luiz Ricardo Goulart - Coordenador do Laboratório de Nanobiotecnologia
Bloco 2E, sala 24, Universidade Federal de Uberlândia-UFU
CEP: 38.400-920. Uberlândia, Minas Gerais
(34) 3218-2478
106
ANEXO 7
Questionário de Avaliação Câncer de Tireóide Data da avaliação:_________________
Número do prontuário do paciente: ______________________________
Iniciais do nome do paciente:___________________________________
Identificação
1.Nome:___________________________________________________
2.Sexo: ( ) M ( ) F 3. Cor: _______________
4.Idade:_______________ Data Nascimento:____________
5.Estado civil:_____________
6.Residência atual: ___________________________________N°______
Bairro:______________________________ Cidade:________________
Telefone: _________________
7. Diagnóstico: ________________________________________________
8. Procedimento realizado:
__________________________________________________________________
______________________________________________________
História clínica
1.Fumante: ( ) não ( ) sim
Há quanto tempo e com que freqüência?
__________________________________________________________________
___________________________________________________
2. Faz uso de bebidas alcoólicas? : ( ) não ( ) sim
Há quanto tempo e com que freqüência?
__________________________________________________________________
______________________________________________________
3. Tem outra doença relacionada à tireóide?Qual?
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
________________________________________________
4. História pessoal prévia de câncer de tireóide? ( )Não ( )Sim
( ) Benigna ( ) Maligna
Procedimentos realizados : _____________________________________
5. Já fez algum tratamento para o câncer? ( )Não ( )Sim
107
6. História pessoal de outros tipos de câncer? ( ) Não ( )Sim
( ) Benigno ( ) Maligno. Local _______________________________
7. História familiar de câncer? ( ) Não ( ) Sim
( ) Benigno ( ) Maligno
Local:_____________________ Grau de parentesco __________________
Local:_____________________ Grau de parentesco __________________
8. História familiar de outro câncer? ( ) Não ( ) Sim
( ) Benigno ( ) Maligno
Local:_____________________ Grau de parentesco __________________
Local:_____________________ Grau de parentesco __________________
9. Tem alguma doença crônica (Toma alguma medicação diária)?
Infecciosas: __________________________________________________
Hormonais: __________________________________________________
Metabólicas: _________________________________________________
Psicológicas: _________________________________________________
Crônico - degenerativa: ________________________________________
Alergia: ____________________________________________________
Outros tipos de câncer:_________________________________________
10. Informações adicionais:
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
_____________________________________________