Análise da Quantidade de Ferro na Ferritina.docx

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Anlise da Quantidade de Ferro na Ferritina

Trabalho Prtico A

Qumica Bioinorgnica

Autores: Henrique Fernandes e Joo RodriguesTurma: P1Data da Realizao: 18 de maro de 2013, Data do relatrio: 16 de maro de 2013

2012/2013


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Qumica Bioinorgnica2012/2013

Autores: Henrique Fernandes e Joo Rodrigues 1

ndice

RESUMO ........................................................................................................................................ 2

REAGENTES E INSTRUMENTOS ............................................................................................ 2REAGENTES................................................................................................................................................ 2INSTRUMENTOS ......................................................................................................................................... 3

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL ....................................................................................... 4

RESULTADOS EXPERIMENTAIS ............................................................................................ 4[FE(O-FENANTROLINA)3]2+ .................................................................................................................... 4[FE(FERROZINA)3]4-................................................................................................................................. 7

DISCUSSO DOS RESULTADOS E CONCLUSES .............................................................10

BIBLIOGRAFIA ..........................................................................................................................12

ANEXOS .......................................................................................................................................13


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Resumo

Com este trabalho pretende-se determinar a quantidade de ferro presente naferritina, uma das protenas com a funo de armazenar o ferro que no est a ser usadopelas clulas, atravs de espectroscopia de UV-Visvel. A tcnica de espectroscopia podeser usada aps previa desnaturao da protena (ferritina), seguida da reduo do Fe3+ a

Fe2+ e complexao. A formao dos complexos que permitem a anlise porespectroscopia feita com o-fenantrolina, num dos ensaios, e com ferrozina em outroensaio. Estes compostos tm capacidade de formar complexos com o Fe2+ de modo a sepoder determinar a sua concentrao pela aplicao da lei de Lambert-Beer.

Os resultados obtidos evidenciam que a ferritina tem a capacidade de acomodar 284tomos de Fe3+ por molcula de ferritina, isto pela determinao feita recorrendo a o-fenantrolina. Quando se recorreu ferrozina o valor superior, 430 tomos de Fe2+ pormolcula de ferritina.

Reagentes e Instrumentos

Reagentes

Ferritina [1]Perigosidade:

Muito txico por ingesto. O contato com cidos desenvolve gasestxicos. Muito txico para os organismos aquticos.

Armazenamento:Deve ser armazenado hermeticamente e a uma temperatura entre 2 a

8C.Consultar MSDS completa em anexo (ANEXO A)

o-fenantrolina [2]Marca:

Sigma-AldrichNome IUPAC:

1, 10-fenantrolina (C12H2N2)Perigosidade:

Precaues:Txico por ingesto.

Eliminao:

Este produto e o seu recipiente devem ser eliminados como resduosperigosos. Evitar a libertao para o ambiente.Consultar MSDS completa em anexo (ANEXO B)

Ferrozina [3]

Marca:Sigma-Aldrich

Nome IUPAC:4,4'-(3-(2-piridil)-trazina-5,6-diil)difenilsulfonato de sdio(C20H13N4O6S2Na2)

Consultar MSDS completa em anexo (ANEXO C)


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Acetato de Sdio [4]

Marca: Carlo ERBA ReagentsNome IUPAC:

Acetato de Sdio (CH3COONa)Eliminao:

Ligeiro contaminante da gua.Consultar MSDS completa em anexo (ANEXO D)

Soluo de Ferro(II) [5]

Marca:Sigma-Aldrich

Nome IUPAC:Sulfato de amnio e ferro(II) hexahidratado ((NH4)2Fe(SO4)2 * 6H2O)

Perigosidade:

Provoca irritao cutnea e ocular grave.Eliminao:

Ligeiro contaminante da gua.Consultar MSDS completa em anexo (ANEXO E)

cido diidroxifumrico [6]

Marca:Sigma-Aldrich

Nome IUPAC:cido (E)-2,3-diidroxibut-2-enico (C4H4O6)

Massa Molecular:148,07 g mol-1

Consultar MSDS completa em anexo (ANEXO F)

Instrumentos

Balana analticaMarca e Modelo: Mettler AE260 DeltrangeAlcance e Incerteza:

Massas superiores a 60g: 205,0000,001gMassas inferiores a 60g: 60,00000,0001g

Espectrofotmetro

Marca e Modelo: Unicam UV/Vis SpetrometerIntervalo de leitura de comprimentos de onda:190,0 a 1100,0 0,1 nm

Incerteza na medida da absorvncia: 0,001


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Procedimento Experimental

O procedimento experimental est disponvel no protocolo fornecido. Asalteraes a esse procedimento aparecem sub-citadas.

A concentrao da soluo padro de Fe(NH4)2(SO4)2 . 6H2O usada foi de1,00X10-4 mol dm-3 em vez dos 2,25X10-4 mol dm-3 citados no protocolo.

Preparao da soluo de cido diidroxifumrico (DHF):Medir a massa de 0,0185g de DHF, dissolver o slido em guadesionizada, transferir para um balo volumtrico de 25,00cm3 ecompletar o volume. Homogeneizar e rotular.

Resultados Experimentais

[Fe(o-fenantrolina)3]2+

Os valores usados para a construo do espectro encontram-se em tabela anexo a estedocumento (ANEXO G).

||(mol dm-3)

(cm3)

Vfinal (cm3)||

(mol dm-3)A509,0

1,00X10-4

0,00

25,00

0,00 0,0002,00 8,00X10-6 0,1153,00 1,20X10-5 0,1664,00 1,60X10-5 0,2205,00 2,00X10-5 0,2826,00 2,40X10-5 0,331

Amostra 1 0,177Amostra 2 0,139

Mdia das Amostras 1 e 2 0,158

0.0000

0.0500

0.1000

0.1500

0.2000

0.2500

0.3000

0.3500

400.0 450.0 500.0 550.0 600.0 650.0 700.0 750.0 800.0

A

/nm

Espectro de Absorvncia [Fe(o-fenantrolina)3]2+

509,0nm


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Clculo da concentrao de Fe2+

|| ||

Exemplo de clculo:

||

||

||

()

||

||

Clculo da quantidade de Ferro na Ferritina

||

() ||

()

() ()

()

()

A509,0 = 1,38E+04 |Fe2+|+ 0,001R = 0,99943

0.000

0.050

0.100

0.150

0.200

0.250

0.300

0.350

0.00E+00 5.00E-06 1.00E-05 1.50E-05 2.00E-05 2.50E-05 3.00E-05

A509,0

c (mol dm-3)

Reta de Calibrao A509,0 =f(cFe(II))


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()

()

()


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[Fe(ferrozina)3]4-

Os valores usados para a construo do espectro encontram-se em tabela anexo a estedocumento (ANEXO H).

||(mol dm-3)

(cm3)

Vfinal (cm3)||

(mol dm-3)A560,0

1,00X10-4

0,000

1,50

0,00 0,0000,120 8,00X10-6 0,2490,180 1,20X10-5 0,3700,240 1,60X10-5 0,5200,300 2,00X10-5 0,6110,360 2,40X10-5 0,723

Amostra 1 0,286Amostra 2 0,301

Mdia das Amostras 1 e 2 0,294

Clculo da concentrao de Fe2+

|| ||

Exemplo de clculo:

||

||

0.0000

0.1000

0.2000

0.3000

0.4000

0.5000

0.6000

0.7000

400.0 450.0 500.0 550.0 600.0 650.0 700.0 750.0 800.0

A

/nm

Espectro de Absorvncia [Fe(ferrozina)3]4-

560,0nm


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||

()

||

||

Clculo da quantidade de Ferro na Ferritina

||

() ||

()

() ()

()

()

A560,0 = 3,02E+04 c + 0,0044R = 0,99975

0.000

0.100

0.200

0.300

0.400

0.500

0.600

0.700

0.800

0.00E+00 5.00E-06 1.00E-05 1.50E-05 2.00E-05 2.50E-05 3.00E-05

A560,0

c (mol dm-3)

Reta de Calibrao A560,0 =f(cFe(II))


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()

()

()


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Discusso dos resultados e concluses

Os valores obtidos para o nmero de tomos de Ferro que so coordenados pelaferritina so bastante diferentes, quando se determinam por complexao com aferrozina e com a o-fenantrolina. Quando se recorreu ferrozina, o resultado foram 430tomos de Ferro que so coordenados por uma nica molcula de ferritina, j com

recurso o-fenantrolina, o valor bastante inferior, 284 tomos de Ferro por molculade ferritina.

Uma boa medida da qualidade e validade das retas de calibrao traadas, quepermite selecionar um dos valores obtidos em detrimento do outro o valor docoeficiente de extino molar para cada um dos mtodos. O coeficiente de extinomolar obtido para o complexo de [Fe(ferrozina)3]4- foi de , valor este que superior ao descrito pelaliteratura (27900 dm3 mol-1 cm-1). [7] Ora, isto faz com que a concentrao determinadapor interpolao grfica seja inferior quela que seria de esperar e portanto o nmerode tomos e Ferro por molcula de ferritina seja inferior ao descrito nesta mesma fontebibliogrfica. J, para o experimento com [Fe(o-fenantrolina)3]2+, o valor do coeficiente

de extino molar obtido foi de

, um valorprximo do que est descrito na literatura, 11500 dm3 mol-1 cm-1. [8] Fazendo o clculodos desvios ao valor estabelecido na literatura, verifica-se que os ensaios com [Fe(o-fenantrolina)3]2+ se afastam mais do que os com [Fe(ferrozina)3]4-, com erros deaproximadamente 20% e 8%, respectivamente. Assim podemos ter mais garantias dovalor obtido experimentalmente com a ferrozina, do qual resultou o valor de 430tomos de Ferro por molcula de ferritina, como supracitado.

Os valores para o coeficiente de extino molar, para os dois complexos formados([Fe(o-fenantrolina)3]2+ e [Fe(ferrozina)3]4-) apresentam valores elevados, superiores a1000 dm3 mol-1 cm-1, pelo que as transies envolvidas no aparecimento de bandas de

absoro aos comprimentos de onda utilizados

devem-se a transferncia de carga metal-ligando,que do origem a riscas de absoro na zonavisvel do espectro electromagntico, conferindo

cor s solues. Este fenmeno acontecequando estamos na presena de elementosmetlicos com baixo nmero de oxidao,

como o caso do Fe2+ e quando os ligandos sobons aceitadores . Pela anlise das estruturas

dos dois ligandos percebe-se que so bidentados e coordenam atravs dos seus tomosde Azoto, assinalados a vermelho. Ambos os ligandos so bons aceitadores , porquecoordenam pelos tomos de Azoto e possuem orbitais vazias que podem receberdensidade electrnica que , inclusive, estabilizada por ressonncia. Daqui verifica-seque que o coeficiente de extino molar para a o complexo de ferrozina seja superior ao

Imagem 1 Estrutura da Ferrozina

Imagem 2 Estrutura da o-fenantrolina


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da o-fenantrolina, pois para a mesma estrutura, a densidade electrnica que a ferrozina capaz de aceitar pelas orbitais muito mais estabilizada por ressonncia, dada omaior nmero de anis capazes de aumentar o nmero de estruturas de ressonnciaque promovem a deslocalizao da carga. Isto faz com que a probabilidade de ocorremtransferncia de carga metal-ligando seja maior para o complexo de ferrozina, e

portanto o coeficiente de absortividade tambm sejam maior, pois este uma medida daprobabilidade de ocorrer a transferncia de carga.

Mesmo dando nfase ao valor de tomos de Ferro coordenados pela ferritina obtidocom ferrozina, o valor inferior ao descrito na literatura e ao valor mximo que aprotena capaz de acomodar, isto pode ser explicado por alguns fatores nocontrolveis durante a realizao do trabalho, como a quantidade insuficiente de cido,que possa no ter desnaturado toda a protena; insuficiente quantidade de DHF (cidodihidroxifumrico) foi insuficiente para reduzir todo Fe3+ a Fe2+, que seriaposteriormente coordenado para doseamento espectroscpico. Para alm disso, no sesabe qual o grau de saturao da soluo de ferritina usada, pois caso a concentrao deFe3+ na soluo de ferritina seja baixa, o nmero de tomos de Ferro determinado ser

incondicionalmente inferior. Um forma de optimizar esta tcnica era recorrer a uma fasede saturao da protena com Fe3+, seguindo-se a adio de quantidades em largoexcesso de cido para desnaturar e reduzir o Ferro.


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Bibliografia

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[2] 1,10-Fenantrolina 99+%; 131377 [Online]; Sigma-Aldrich: Portugal, 16 de fevereirode 2013.http://www.sigmaaldrich.com/MSDS/MSDS/DisplayMSDSPage.do?country=PT&language=pt&productNumber=131377&brand=ALDRICH&PageToGoToURL=http%3A%2F%2Fwww.sigmaaldrich.com%2Fcatalog%2Fproduct%2Faldrich%2F131377%3Flang%3Dpt

[3] cido 3-(2-piridil)5, 6-difenil.-1,2,4-triazina-4,4-dissulfnio, sal sdico; 82950[Online]; Sigma Aldrich: Portugal, 16 de fevereiro de 2013.

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[4]Acetato de Sdio; 1270903 [Online]; Carlo ERBA Reagents: Portugal, 16 de fevereirode 2013.http://www.carloerbareagents.com/ChemicalsPrices.aspx?id=478167

[5] Sulfato de Amnio e ferro(II) hexahidratado; 215406 [Online]; Sigma-Aldrich:Portugal, 16 de fevereiro de 2013.http://www.sigmaaldrich.com/MSDS/MSDS/DisplayMSDSPage.do?country=PT&language=pt&productNumber=215406&brand=SIAL&PageToGoToURL=http%3A%2F%2Fww

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[6] Dihydroxyfumaric acid hydrate; D113204 [Online]; Sigma-Aldrich: Portugal, 16 defevereiro de 2013.http://www.sigmaaldrich.com/MSDS/MSDS/DisplayMSDSPage.do?country=PT&language=pt&productNumber=D113204&brand=ALDRICH&PageToGoToURL=http%3A%2F%2Fwww.sigmaaldrich.com%2Fcatalog%2Fproduct%2Faldrich%2Fd113204%3Flang%3Dpt

[7] Maureen J. Donlin; Regina F. Frey; Christopher Putman; Jody K. Proctor; James K.Bashkin. Analysis of Iron in Ferritin, the Iron-Storage Protein. Journal of Chemical

Education 1998, 75, 437-441

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[9] Microsoft Excel Mac 2011, 14.3.2; Microsoft Corporation, 2010

[10] StatPlus Mac LE 2009, 5.8.2.0; AnalystSoft, Inc., 2009

[11] ChemBioDraw, 12.0.3.1216; CambridgeSoft, 2010
http://www.sigmaaldrich.com/MSDS/MSDS/DisplayMSDSPage.do?country=PT&language=pt&productNumber=82950&brand=FLUKA&PageToGoToURL=http%3A%2F%2Fwww.sigmaaldrich.com%2Fcatalog%2Fproduct%2Ffluka%2F82950%3Flang%3Dpthttp://www.sigmaaldrich.com/MSDS/MSDS/DisplayMSDSPage.do?country=PT&language=pt&productNumber=82950&brand=FLUKA&PageToGoToURL=http%3A%2F%2Fwww.sigmaaldrich.com%2Fcatalog%2Fproduct%2Ffluka%2F82950%3Flang%3Dpthttp://www.sigmaaldrich.com/MSDS/MSDS/DisplayMSDSPage.do?country=PT&language=pt&productNumber=82950&brand=FLUKA&PageToGoToURL=http%3A%2F%2Fwww.sigmaaldrich.com%2Fcatalog%2Fproduct%2Ffluka%2F82950%3Flang%3Dpthttp://www.sigmaaldrich.com/MSDS/MSDS/DisplayMSDSPage.do?country=PT&language=pt&productNumber=82950&brand=FLUKA&PageToGoToURL=http%3A%2F%2Fwww.sigmaaldrich.com%2Fcatalog%2Fproduct%2Ffluka%2F82950%3Flang%3Dpthttp://www.sigmaaldrich.com/MSDS/MSDS/DisplayMSDSPage.do?country=PT&language=pt&productNumber=82950&brand=FLUKA&PageToGoToURL=http%3A%2F%2Fwww.sigmaaldrich.com%2Fcatalog%2Fproduct%2Ffluka%2F82950%3Flang%3Dpthttp://www.sigmaaldrich.com/MSDS/MSDS/DisplayMSDSPage.do?country=PT&language=pt&productNumber=82950&brand=FLUKA&PageToGoToURL=http%3A%2F%2Fwww.sigmaaldrich.com%2Fcatalog%2Fproduct%2Ffluka%2F82950%3Flang%3Dpt


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Anexos

Anexo A

MSDS da Ferritina

Anexo BMSDS da 1,10-Fenantrolina

Anexo CMSDS da Ferrozina

Anexo DMSDS do Acetato de Sdio

Anexo EMSDS do Sulfato de Amnio e Ferro (II) Hexaidratado

Anexo FMSDS do cido dihidroxifumrico

Anexo GTabela de resultados utilizados na construo do espectro de absorvncia do

complexo com o-fenantrolina

Anexo HTabela de resultados utilizados na construo do espectro de absorvncia do

complexo com ferrozina

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