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Análise Imuno-histológica de tumores da mama, induzidos

quimicamente com N-metil-N-nitrosureia, em ratos

Sprague-Dawley.

Ruben Miguel Maia Soares

Dissertação de Mestrado em Oncologia

2012

Ruben Miguel Maia Soares

Análise Imuno-histológica de tumores da mama induzidos

quimicamente com N-metil-N-nitrosureia, em ratos Sprague-Dawley.

Dissertação de Candidatura ao grau de Mestre

em Oncologia submetida ao Instituto de Ciências

Biomédicas de Abel Salazar da Universidade do

Porto.

Orientador – Professor Doutor Carlos Lopes

Categoria – Professor Catedrático Jubilado

Afiliação – Instituto de Ciências Biomédicas Abel

Salazar da Universidade do Porto.

Coorientador – Professora Paula Oliveira

Categoria – Professor Auxiliar com agregação

Afiliação – Universidade de Trás-os-Montes e

Alto Douro

I

A todos aqueles que comigo

estão ….

…… Aos que já me deixaram.

II

Agradecimentos

Gostaria de iniciar o presente trabalho agradecendo a algumas pessoas e

entidades, que foram importantes para a elaboração do mesmo, e sem elas tal não

poderia ser feito.

Ao Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar, ICBAS, pela elaboração do

mestrado em Oncologia. Por me ter recebido e ter ajudado a que o projeto fosse

elaborado.

À Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, UTAD, pelo acolhimento e

disponibilização de todo o material necessário para a realização, de umas das etapas, do

projeto.

À Fundação para a Ciência e Tecnologia, FCT, pelo financiamento do projeto.

Ao Professor Doutor Carlos Lopes, pela orientação, ajuda prestada,

disponibilidade, transmissão de conhecimento e compreensão durante todo o trabalho.

À Professora Paula Oliveira, por me ter recebido num dos seus projetos, pela sua

disponibilidade, simpatia, conhecimentos transmitidos e por toda a ajuda que me deu

durante todo o processo.

À Ana Faustino, à Catarina Teixeira e à Jacinta Oliveira pelo companheirismo,

disponibilidade, ajuda e acolhimento em Vila Real.

Às Dras. Fátima Faria e Alexandra Rama do Laboratório de Patologia do

Departamento de Patologia e Imunologia molecular do ICBAS.

À Francisca Reis, por me ter incentivado a integrar no mestrado, e pelo apoio,

ajuda e amizade prestada, durante todo o meu percurso académico, mesmo nos

momentos mais controversos.

A todos os meus amigos, que sempre me apoiaram durante a elaboração do

trabalho.

À Rita Oliveira, pela amizade, carinho e atenção.

A todos os meus familiares, que se preocuparam e me ajudaram a atingir os meus

objetivos.

III

Aos meus irmãos, Gabriel Soares e Carolina Soares, pelo apoio, alegria, carinho,

compreensão nos momentos mais difíceis.

Aos meus pais, Inácio Soares e Maria Celina, que da união dos seus gâmetas,

originou a minha pessoa. Pelo financiamento do projeto em tempos financeiramente

complexos. Por sempre acreditarem em mim e me fazer acreditar.

E a todos aqueles que indireta ou diretamente ajudam-me todos os dias, e que eu

não sei da sua existência, apenas da sua contribuição.

Obrigado!

IV

Resumo

A glândula mamária do rato apresenta características únicas, em muito, semelhantes à

do Homem, o que os torna, um modelo animal de excelência para o estudo do cancro da

mama. A N-metil-N-nitrosureia (MNU), é um carcinogéneo que não necessita de ativação

metabólica e apresenta alta especificidade para a indução de tumores na glândula

mamária, levando, também, à formação de neoplasias com características idênticas às

humanas. Neste estudo foram utilizados 14 amostras de tumores da mama de animais

induzidos quimicamente com o MNU. Através da análise Imuno-histológica verificou-se a

existência de quatro padrões fundamentais: papilar, adenóide, sólido e fusocelular. Sendo

os mais presentes o padrão papilar e adenoide. Os tumores apresentavam bastante

reatividade para a marcação pelos recetores de estrogénio, e altos índices mitóticos,

contudo a marcação pelo ki-67 foi fraca. Pela marcação da actina do músculo liso

verificou-se que todos os tumores apresentaram dois tipos celulares: epitelial e

mioepitelial, sendo de destacar a maior proliferação da componente epitelial. A indução

de tumores da mama pelo MNU é eficaz, levando à formação de neoplasias, agressivas,

mistas, com elevada expressão dos recetores de estrogénio e elevado índice mitótico.

Palavras-chave: Cancro da mama, modelo animal, MNU, Ki-67, recetores de estrogénio,

actina do músculo liso, rato Sprague-Dawley.

Abstract

The rat mammary gland has unique characteristics, much similar to that of humans, which

makes them, an animal model of excellence for the study of breast cancer. The N-methyl-

N-nitrosorea (MNU) is a carcinogen that does not require metabolic activation and high

specificity features for induction of tumors, in the mammary gland, leading also to the

formation of tumors with characteristics similar to human. This study employed 14

samples of breast tumors, from animals chemically induced by MNU. Through Immuno-

histological analysis verified the existence of four patterns: papillary, adenoid, solid and

spindle cell. Being more present papillary and adenoid patterns. The tumors showed high

reactivity for estrogen receptor, and high mitotic index, however by Ki-67 labeling was

weak. By marking smooth muscle actin was found that all tumors showed two cell types:

epithelial and myoepithelial, most notably the greater proliferation of epithelial component.

Induction of mammary tumors by MNU is effective, leading to the formation of aggressive,

mixed neoplasias, high expression of estrogen receptor, and high mitotic index.

Keywords: Breast cancer, animal model, MNU, Ki-67, estrogen receptor, smooth muscle

actin, Sprague-Dawley rat.

V

Índice Índice de figuras ........................................................................................................................... VI

Índice de tabelas ......................................................................................................................... VII

Lista de abreviaturas e símbolos .............................................................................................. VIII

1. Introdução ................................................................................................................................... 1

1.1. Epidemiologia do cancro da mama .................................................................................. 1

1.2. Anatomia da mama............................................................................................................. 3

1.3. Transformação neoplásica: noções básicas ................................................................... 5

1.4. Neoplasia da mama ............................................................................................................ 6

1.4.1. Cancro da mama hereditário ...................................................................................... 6

1.4.2. Cancro da mama esporádico ..................................................................................... 7

1.5. Classificação dos Carcinomas da Mama......................................................................... 8

1.5.1. Carcinoma in situ ......................................................................................................... 9

1.5.2. Carcinoma Invasivo ................................................................................................... 10

1.5.3. Tumores do estroma ................................................................................................. 14

1.6.1. Anatomia da glândula mamária do rato .................................................................. 16

1.7. Indução de neoplasias da mama através da N-metil-N-nitrosureia (MNU) .............. 19

2.Material e métodos ................................................................................................................... 22

2.1.Animais ................................................................................................................................ 22

2.2. Agente Carcinogénico ...................................................................................................... 22

2.3.Protocolo Experimental ..................................................................................................... 22

2.4.Recolha de órgãos e seu processamento ...................................................................... 23

2.5. Imunohistoquímica ............................................................................................................ 23

3. Resultados ................................................................................................................................ 26

4. Discussão .................................................................................................................................. 40

5.Conclusão .................................................................................................................................. 46

6. Referências Bibliográficas ...................................................................................................... 48

VI

Índice de figuras

FIGURA 1- GLOBOCAN 2008, INCIDÊNCIA E MORTALIDADE DOS DIFERENTES TIPOS TUMORAIS. 1

FIGURA 2- ESQUEMATIZAÇÃO DA INCIDÊNCIA TUMORAL, HOMEM E MULHER, NA REGIÃO NORTE

........................................................................................................................................ 2

FIGURA 3- ILUSTRAÇÃO ANATÓMICA DA MAMA DA MULHER. .................................................... 3

FIGURA 4- ESQUEMATIZAÇÃO DA DISTRIBUIÇÃO DAS GLÂNDULAS MAMÁRIAS DO RATO. ........ 16

FIGURA 5- DESENVOLVIMENTO DA QUARTA GLÂNDULA MAMÁRIA (ABDOMINAL) DE UMA FÊMEA

SPRAGUE-DAWLEY. ....................................................................................................... 17

FIGURA 6- REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DA QUARTA GLÂNDULA MAMÁRIA (ABDOMINAL),

DE UM RATO FÊMEA, COM 55 DIAS DE IDADE, VIRGEM. .................................................... 18

FIGURA 7- CORTES HISTOLÓGICOS DOS PADRÕES FUNDAMENTAIS (H&E) ............................. 27

FIGURA 8- EXEMPLOS DE CORTES HISTOLÓGICOS DO PADRÃO PAPILAR (H&E) ..................... 29

FIGURA 9- EXEMPLOS DE CORTES HISTOLÓGICOS DO PADRÃO PAPILAR (H&E). .................... 30

FIGURA 10- EXEMPLOS DE CORTES HISTOLÓGICOS DO PADRÃO ADENOIDE (H&E). ............... 31

FIGURA 11- EXEMPLOS DE CORTES HISTOLÓGICOS DO PADRÃO SÓLIDO (H&E)..................... 32

FIGURA 12- EXEMPLO DE CORTE HISTOLÓGICO DO PADRÃO FUSOCELULAR (H&E) ............... 33

FIGURA 13- VISUALIZAÇÃO DE MASTÓCITOS.......................................................................... 34

FIGURA 14- POSITIVIDADE PARA A EXPRESSÃO DOS RECETORES DE ESTROGÉNIO ................ 36

FIGURA 15 - IMUNORREATIVIDADE PARA ACTINA DO MÚSCULO LISO (AML) ........................... 38

FIGURA 16- IMUNORREATIVIDADE PARA O KI-67.................................................................... 39

VII

Índice de tabelas

TABELA 1- DISTRIBUIÇÃO DOS TIPOS HISTOLÓGICOS DE CANCRO DA MAMA. ADAPTADO [12].

...................................................................................................................................... 14

TABELA 2- INFORMAÇÃO ADICIONAL PARA O PROCEDIMENTO DA TÉCNICA DE

IMUNOHISTOQUÍMICA. ..................................................................................................... 25

TABELA 3- ESQUEMATIZAÇÃO DA OBSERVAÇÃO HISTOLÓGICA DOS TUMORES DA MAMA

OBTIDOS PELA INDUÇÃO PELO AGENTE MNU. ................................................................ 26

TABELA 4- DESCRIÇÃO DA IMUNORREATIVIDADE DOS RECETORES DE ESTROGÉNIO (RE). ..... 37

VIII

Lista de abreviaturas e símbolos

ACC- carcinoma adenóide cístico

ADN- ácido desoxirribonucleico

AML -actina do músculo liso

AR- recetores de androgénios

ASR (W) - Age-standardised rate

EGFR- fator de crescimento epidermal

HER2- human epidermal growth factor receptor 2

HRP- horseradish peroxidase

IL- interleucina

mApo -molecular apocrine

MNU- N-metil-N-nitrosureia

NST- Carcinomas sem tipo específico

PAR 2- recetor de protéases 2

PgR- recetor de progesterona

RE- recetor de estrogénio

RNI- intermediários reativos de nitrogénio

ROS- espécies reativas de oxigénio

TBS – Tris –buffered saline

TGF- transforming growth factor

VEGF- Vascular endothelial growth factor

α- alfa

β-beta

Ruben Soares Página | 1

1. Introdução

1.1. Epidemiologia do cancro da mama

O cancro da mama é o tipo tumoral mais frequentemente diagnosticado no

sexo feminino (figura 1) sendo a principal causa de morte por cancro na mulher em

todo o mundo. Anualmente conta com cerca de 1.38 milhões de

Figura 1- Globocan 2008, incidência e mortalidade dos diferentes tipos tumorais. [1]

novos casos, 23% do total de cancros , e com 458400 mortes por cancro em 2008,

14% do total de mortes por cancro [2]. A incidência do cancro da mama tem vindo a

aumentar, cerca de 5% ao ano, em alguns países em desenvolvimento [3], como por

exemplo, no Japão e Corea que nos últimos 40 anos dobrou ou triplicou.


Nas zonas urbanas da China tem sido documentada, na última década, um

aumento na ordem dos 20 a 30% [4, 5], havendo uma similaridade com o que

acontece nas zonas urbanas da Índia [6]. Isto demonstra que esta doença, dita de

países ocidentais tornou-se um problema de saúde mundial [7].

Portugal tem uma população de cerca de cinco milhões de mulheres, onde

surgem cerca de 4500 novos casos de cancro da mama, todos os anos, levando à

morte pela doença 1500 mulheres por ano. No homem este tipo tumoral é pouco

frequente, cerca de 1 em 100 desenvolvem cancro da mama [8].

Relativamente à zona norte do país (figura 2) o cancro da mama na mulher foi

o mais frequente, em 2009, representando 38,4% do total de cancros na mulher [9].

Figura 2- Esquematização da incidência tumoral, homem e mulher, na região norte.[9]


1.2. Anatomia da mama

Figura 3- ilustração anatómica da mama da mulher. 1:Parede torácica; 2:músculos peitorais;

3:lóbulo; 4:mamilo; 5:aréola; 6:ductos lactíferos; 7:tecido adiposo; 8:pele.[10]

A mama feminina adulta (figura 3) encontra-se entre a segunda e a sexta

costela, e entre o externo e a linha axilar média [11]. A mama é composta por seis a

dez principais sistemas ductais, revestida por um epitélio cubóide duplo até junto do

mamilo, onde se torna um epitélio escamoso queratinizado. Os ductos ramificam-se

até a unidade ducto lobular terminal, nesta zona é onde se originam os lóbulos. Em

algumas mulheres, os ductos estendem-se ao tecido subcutâneo da parede torácica e

da axila [12]. Cada mama é composta por cerca de 15 a 20 lóbulos de tecido

glandular, suportada por tecido fibroso [11]. Existem dois tipos celulares nos lóbulos e

ductos. Células mioepiteliais contrateis, que contêm miofilamentos que formam um

padrão na membrana basal, estas células são importantes para a ejeção do leite,

durante o aleitamento, e para suporte dos ductos e células lumio epiteliais que

sobrepõem as mioepiteliais. Apenas as células lumio epiteliais são capazes de gerar

leite, havendo um conjunto de “stem cells”, na porção terminal do ducto que são

responsáveis pela produção, tanto das células mioepiteliais, como as lumiais [13].


Existe dois tipos de estroma, o estroma lobular e o interlobular. O estroma

interlobular consiste em tecido conjuntivo fibroso denso, misturado com tecido

adiposo. Este estroma envolve os acini dos lóbulos, formando um tecido com células

tipo fibroblastos e linfócitos dispersos, capaz de responder ao efeito hormonal. A

comunicação entre o epitélio e o estroma é importante para que seja mantida a função

e estrutura da mama [14]. O espaço entre os lóbulos é preenchido com tecido adiposo.

Após a terceira década de idade, muito antes da menopausa, os lóbulos e o estroma

interlobular começam a regredir, isto é, o estroma fibrosamente denso começa a ser

gradualmente substituído por tecido adiposo. Ocorre atrofia lobular, que em mulheres

idosas pode ser completa [12]. O aporte sanguíneo é efetuado pela artéria mamária

interna e pela torácica externa. A drenagem linfática ocorre pelo plexo linfático

profundo e superficial, sendo 95% desta drenagem efetuada pelos nódulos linfáticos

axilares. Os nódulos axilares são variáveis, em número, e estão tradicionalmente

divididos em três níveis, de acordo como seu relacionamento com o músculo peitoral

menor. Os nódulos mamários internos estão localizados nos primeiros seis espaços

intercostais a 3 cm, da borda do externo, com maior concentração destes nos três

primeiros espaços intercostais [11].


1.3. Transformação neoplásica: noções básicas

A diversidade histológica dos carcinomas, bem como, as suas lesões

percursoras são as manifestações visíveis de todo um processo genético e

epigenético que conduz à carcinogénese. Um modelo de carcinogénese sugere, que

uma célula normal deverá adquirir determinadas características, que a torne maligna,

como evasão à apoptose, poder replicativo ilimitado, insensibilidade a fatores anti-

crescimento, autossuficiência em fatores de crescimento, angiogénese, invasão de

tecidos e metastização, em que cada uma delas poderá ser conseguida através de

alterações nos genes que as controlam [15, 16]

As populações celulares que albergaram algumas dessas alterações, genéticas

e epigenéticas, necessárias para o processo de cancerização, poderão originar lesões

da mama que aumentam o risco para o desenvolvimento da neoplasia mamária. As

alterações mais precoces são as alterações proliferativas, resultantes de um

desequilíbrio entre os fatores que promovem a proliferação com aqueles que a inibem,

ou um decréscimo da apoptose [12].

A célula de origem das neoplasias da mama é um ponto fundamental, tendo

implicações na etiologia e no tratamento. A teoria das “cancer stem cells” (células

pluripotentes) diz-nos que estas alterações malignas ocorrem em populações celulares

que têm propriedades únicas, diferentes das células diferenciadas [17, 18]. Contudo a

origem dos tumores da mama não parece estar associado a este tipo de células [12].

A maioria dos cancros da mama tem origem em células luminais com expressão de

recetores de estrogénio (RE), sendo a maioria das neoplasias RE positivo e as suas

lesões percursoras partilham esta caraterística. Os carcinomas RE negativos podem

surgir a partir de células mioepiteliais com RE negativo [19, 20], o que explica o fato de

muitas proteínas encontradas em células mioepiteliais estarem também presentes em

cancros denominados de “triplo negativo” ou basais. Uma outra explicação para o

surgimento de neoplasias com RE negativo pode ser pela perda de expressão dos

recetores de estrogénio [21, 22], contudo a origem destes tumores é algo controversa.

O passo final, neste processo, é a passagem de um carcinoma in situ para um

carcinoma com propriedades invasivas, sendo o mais importante é também o menos

compreendido. A estrutura e funcionamento da mama, não neoplásica, dependem de

uma complexa interação entre as células epiteliais, mioepiteliais e do estroma. Alguns

eventos moleculares que se traduzem em ocorrências fisiológicas, como destruição da

membrana basal, aumento da proliferação, angiogénese, não responder a fatores anti-


crescimento ou a invasão do estroma, que ocorrem, na mama, durante a puberdade e

a gravidez, como a formação dos ductos ou o surgimento de novos pontos de

ramificação, surgem também no processo de carcinogénese [23, 24]. Com isto

podemos afirmar que a neoplasia da mama não é apenas uma doença, mas um

conjunto de várias [12].

1.4. Neoplasia da mama

O fator de risco mais importante para o desenvolvimento de cancro da mama é

o género, visto que apenas 1% dos homens desenvolve a neoplasia. Os principais

fatores de risco para as mulheres são: idade, idade da menarca, idade na qual teve o

primeiro filho, familiares de primeiro grau que tiveram cancro da mama, raça/etnia,

exposição a estrogénios, densidade da mama, exposição a radiação, influência

geográfica, dieta, desenvolvimento de carcinoma contralateral da mama ou do

endométrio, obesidade, exercício, aleitamento, toxinas ambientais, tabaco. Contudo os

fatores de maior risco e importância para o desenvolvimento de cancro da mama são

genéticos e hormonais. Os cancros da mama podem ser divididos em esporádicos e

hereditários [11, 12].

1.4.1. Cancro da mama hereditário

A herança genética é a principal causa de cerca de 12% dos casos de cancro

da mama [25, 26]. Em algumas famílias o risco aumentado, para cancro da mama, é

resultado de mutações em genes de alta penetrância, como o BRCA1 e o BRCA2. A

penetrância nestes genes varia de 30 a 90%, dependendo da mutação. Mutações no

BRCA1 aumentam o risco para o desenvolvimento de cancro do ovário, entre 20% a

40%, para os portadores da mutação. No que diz respeito ao BRCA2, este risco é

menor, cerca de 10 a 20%. Portadores de mutações no BRCA1 e BRCA2 têm também

um risco aumentado para o desenvolvimento de outros tumores epiteliais como

carcinomas prostáticos e pancreáticos [12]. Mais de mil mutações foram identificadas

nos genes BRCA1 e BRCA2, resultando a maioria delas em proteínas truncadas [27].

Apenas 0,1 a 0,2% destas mutações é que aumentam o risco para o desenvolvimento

do cancro da mama [12].Estas mutações causam instabilidade genómica que por sua

vez levam a alterações fundamentais no funcionamento dos genes supressores

tumorais ou de oncogenes [11].


Tumores da mama com mutações no BRCA1 são agressivos, mal

diferenciados, surgem relativamente cedo, RE e recetores de progesterona (PgR)

negativos e elevado índice proliferativo [28-30]. O fenótipo dos tumores com mutações

no BRCA1 é definido por marcadores dos tumores tipo basal ou “triplo negativo”, que

são tumores com sobre expressão de certos oncogenes como o C-MYC e C-MYB e

proteínas do ciclo celular como a ciclina E. Imunohistoquimicamente apresentam

marcadores de carácter basal epitelial, como citoqueratinas basais, recetor de fator de

crescimento epidermal (EGFR) e P-caderina. Outra característica importante é a perda

da expressão do TP53, a regulação a montante do p27 e a ausência de expressão do

HER2 [11]. Os tumores BRCA1 estão frequentemente associados com a perda do

cromossoma X inativo, e com a duplicação do cromossoma X ativo, resultando na

perda do crepúsculo de Barr [31]. Tumores da mama com mutações no BRCA2 são

pouco diferenciados, apresentando-se geralmente como recetores de estrogénio e

progesterona positivos [11].

1.4.2. Cancro da mama esporádico

O principal fator de risco para o desenvolvimento de cancro da mama

esporádico está relacionado com a exposição hormonal, contudo existem outros

fatores de risco, mencionados acima, como a idade da menarca, idade da menopausa,

história reprodutiva, aleitamento, estrogénios exógenos, que contribuem para o

aumento do risco do desenvolvimento da neoplasia da mama. A maioria dos cancros

da mama esporádicos ocorre em mulheres pós-menopausa e são tipicamente RE

positivo.

O estrogénio é importante para o adequado funcionamento, manutenção e

maturação de todo o tecido reprodutivo da mulher. Durante a puberdade, o estrogénio

é importante para o desenvolvimento apropriado da glândula mamária e do útero.

Após a iniciação do ciclo menstrual, o estrogénio tem um papel importante no

crescimento do endométrio, pela promoção da proliferação do estroma e das células

endoteliais durante a fase folicular. A principal fonte de estrogénio circulante, nas

mulheres em pré-menopausa, são os ovários, contudo existem outros locais onde este

pode ser produzido como nas glândulas adernais e no tecido adiposo. Para além da

importância no sistema reprodutivo, os estrogénios apresentam importância biologia e

fisiológica no sistema cardiovascular, imune, esquelético e nervoso [32].

A atuação do estrogénio é mediada pela ligação deste a recetores que

funcionam como fatores de transcrição dependentes de ligando, que levam à


dimerização do recetor, translocação nuclear e subsequente formação de um

complexo com vários cofatores de transcrição [33]. Existem dois recetores de

estrogénios conhecidos, REα e REβ. Através da ligação do ligando, ambos os

recetores, podem homo- ou heterodimerizar, resultando numa alteração de

conformação que facilita a interação com os co-activadores ou co-repressores que,

atuam junto da região promotora, controlando assim, a expressão génica [32].

Os estrogénios poderão ter um papel mais ativo no processo de

carcinogénese, visto que os seus metabólitos poderão causar mutações, ou danos, a

nível do ácido desoxirribonucleico (ADN) [34]. Com o aumento do número de ciclos

celulares, aumenta também a possibilidade de introdução de erros no ADN, podendo

levar ao aparecimento de células pré-malignas ou malignas, que poderão ser

estimuladas hormonalmente levando à sua proliferação, bem como o crescimento e

desenvolvimento das células epiteliais e do estroma, que podem estimular o

desenvolvimento tumoral [12]. Algumas variantes de genes envolvidos na síntese e

metabolização do estrogénio podem aumentar o risco para cancro da mama. Algumas

dessas variantes são análogas ao citocromo P-450 que altera o metabolismo do

tamoxifeno em algumas mulheres [35]. Cerca de 60 a 75 %, de todos os tumores da

mama, expressam RE e 55 a 70% PgR [36].

1.5. Classificação dos Carcinomas da Mama

A glândula mamária da mulher contém dois tipos distintos de células: epiteliais

(luminais) e mioepiteliais (basais). Estas podem ser facilmente distinguidas pela

expressão de certas citoqueratinas (células basais citoqueratinas 5, 5/6 e células

luminais citoqueratinas 8/18) [37]. Apesar da transformação neoplásica, estas

permanecem bem conservadas, permitindo assim averiguar o tipo celular que originou

o tumor. A maioria dos tumores da mama tem origem nas células epiteliais, contudo

cerca de 3 a 15% de todos os cancros da mama têm origem em células basais, sendo

estes um grupo de tumores mais agressivo [11]. Cerca de 95% dos cancros de mama

são adenocarcinomas, que podem ser divididos em carcinomas in situ e carcinomas

invasivos. O carcinoma in situ refere-se a uma proliferação neoplásica que está

limitada aos ductos ou aos lóbulos pela membrana basal. Os carcinomas invasivos

penetram pela membrana basal para o estroma, havendo potencial para invasão da

vasculatura e assim, chegar aos nódulos linfáticos e a outros órgãos [12]. A maioria

dos tumores invasivos da mama, bem como os seus percursores in situ, são oriundos

dos terminais ducto-lobulares e independentes do tipo histológico. É importante


mencionar que o termo carcinoma lobular ou ductal não implica por si só histogénese

ou local de origem no sistema mamário, em vez disso, estas entidades são definidas

com base na sua arquitetura, citologia e perfil imunohistoquímico [38, 39].

1.5.1. Carcinoma in situ

1.5.1.1. Carcinoma ductal in situ

O carcinoma ductal in situ consiste numa população de células malignas

limitada aos ductos, ou lóbulos, pela membrana basal. As células mioepiteliais são

preservadas, contudo o seu número é mais reduzido. A maioria destes tumores são

detetados por mamografia, sendo visíveis calcificações. Menos comummente é

observada fibrose periductal e raramente surge uma desobstrução do mamilo [12].

A falta de conhecimento sobre a história natural do carcinoma ductal in situ leva

a que seja difícil de avaliar, quais os que se poderão tornar invasivos [11] se não forem

tratados, pois mesmo carcinomas in situ pequenos e de baixo grau tornam-se

invasivos em cerca de 1% dos cassos [15]. O carcinoma ductal in situ pode ser

dividido em cinco subtipos: comedocarcinoma, sólido, cribriforme, papilar e

micropapilar, contudo esta classificação poderá não ser a melhor, pois em cerca de

30% a 60% dos carcinomas ductais in situ é possível identificar mais do que um

padrão [11, 12].

1.5.1.2. Carcinoma lobular in situ

O carcinoma lobular in situ é muito comum em mulheres jovens, ocorrendo

80% a 90% dos casos antes da menopausa [40]. Neste tipo tumoral, normalmente

ocorre a perda de expressão da caderina E, proteína transmenbranar que contribui

para a coesão das células epiteliais, são mucinosos, células em anel de cinete estão

usualmente presentes. Não ocorrem alterações na estrutura acinar, permanecendo os

lóbulos reconhecíveis. Os carcinomas lobulares in situ quase sempre expressam RE e

PgR, mas não é observada a expressão do Human Epidermal growth factor Receptor2

(HER2) [11, 12].


1.5.2. Carcinoma Invasivo

1.5.2.1. Carcinoma lobular

Carcinomas lobulares bem a moderadamente diferenciados, são usualmente

diplóides, RE positivo, e com rara expressão do HER2. Este tipo tumoral tem um perfil

genético idêntico a tumores luminal A. Por sua vez, os carcinomas lobulares pouco

diferenciados são, geralmente aneuplóides, com ausência de recetores hormonais e

com sobre expressão do HER2 [12].

Os carcinomas lobulares tendem a ter um padrão de metastização diferente

dos outros tipos de cancro da mama. Geralmente, este metastiza para o peritoneu e

retro peritoneu, trato gastrointestinal, ovário e útero [41]. Em alguns casos o carcinoma

lobular metastático poderá ser confundido com o carcinoma em anel de cinete do trato

gastrointestinal, pois, ambos partilham a perda da expressão da caderina-E [42, 43]

1.5.2.2. Carcinoma tubular

A definição de carcinoma tubular requer uma pureza tumoral com 90% da

arquitetura tubular. Histologicamente é composto por uma única camada de células

epiteliais e por um estroma desmoplásico. Este tipo tumoral representa cerca de 0,7%

a 10,3% dos tumores de mama invasivos e ocorre essencialmente em mulheres pós-

menopausa. Frequentemente são encontradas micrometastases nos nódulos axilares

[44]. A maioria dos casos são RE (>90%) e PgR positivos com um baixo índice

proliferativos. O HER2 e EGFR são negativos [45].

1.5.2.3. Carcinoma mucinóide

Este tipo de neoplasia é caracterizada pela produção abundante, tanto extra

como intracelularmente, de mucina, sendo necessário um componente mucinoso

superior a 50% da lesão, para que esta seja reconhecida como carcinoma mucinóide.

A organização mundial de saúde divide, este tipo tumoral, em três subtipos: carcinoma

mucinoso, cistadenocarcinoma e carcinoma mucinoso de células colunares [46].

Ocorre principalmente em mulheres com idade avançada (idade média 71 anos),

tendo um crescimento lento ao longo dos anos, sendo raro o envolvimento dos

nódulos linfáticos [12, 47]. São tumores bem diferenciados com RE (>90%) e

PgR(81,5%) positivo e HER2 negativo [12, 44].


1.5.2.4. Carcinoma medular

O carcinoma medular é comum em mulheres a partir dos 60 anos, surgindo

como uma massa bem circunscrita, radiologicamente idêntica a uma lesão benigna

[2,24,25].

Este carcinoma e composto por células pouco diferenciadas, sem estruturas

glandulares, um estroma escasso, com margens circunscritas e infiltrações

linfoplasmocíticas. Se a maioria destas características estiverem presentes, mas não

todas, o tumor é identificado como “carcinoma medular atípico” [46].

O carcinoma medular tem um perfil genético idêntico aos tumores tipo basal,

sendo recetores hormonais negativos e HER2 negativo e positivo para as

citoqueratinas 5 e 6 [48, 49].

1.5.2.5. Carcinoma micropapilar

Este tipo tumoral é extremamente raro, sendo tipicamente composto por

agregados ocos de células malignas e por uma invasão linfática [50].

Mais de metade dos casos apresenta positividade para RE, PgR e HER2.

Normalmente têm uma sobre expressão de p53, em 48% dos casos, e o B-cell

lymphoma 2 (Bcl-2), gene responsável pela produção proteínas reguladoras da

apoptose, também está presente [50, 51].

1.5.2.6. Carcinoma metaplásico

O termo carcinoma metaplásico é utilizado para descrever um adenocarcinoma

com uma componente envolventemente dominante metaplásica, que poderá ser de

origem epitelial, como o carcinoma espinocelular ou adenocarcinoma com

diferenciação fusocelular ou de origem mesenquimal. A maioria é de elevado grau

[46].

A maioria destas neoplasias apresenta um fenótipo de carcinoma tipo basal,

não havendo expressão de RE, PgR e HER2, expressando frequentemente proteínas

mioepiteliais [52, 53]


1.5.2.7. Carcinomas sem tipo específico, “ductal invasivo” (NST)

Através de estudos de cDNA microarrais e de imunohistoquímica (IHC) foi

possível elaborar uma classificação molecular para este grupo de tumores da mama.

São reconhecidos pelo menos cinco grupos distintos: Luminal A, Luminal B,normal

,tipo basal e HER2 positivo[11, 54]. Nesta classificação o fator mais discriminador é a

expressão do RE:

Luminal A – grupo bastante vasto de tumores, englobando tumores RE

positivo, HER2 negativo e de baixo grau, apresenta também elevada

expressão da proteína de ligação GATA3, proteína 1 de ligação a X-box,

trefoil fator 3, α hepatócito nuclear e do regulador de estrogénios LIV-1 [54].

A maioria é bem, ou moderadamente, diferenciado, ocorrendo

especialmente em mulheres pós-menopausa. Apresentam um crescimento

lento e respondem bem a tratamentos hormonais [12].

Luminal B – são RE positivo, normalmente apresentam um alto grau, alta

taxa proliferativa, uma sobre expressão do HER2. São por vezes

referenciados como “triplo positivo”. São o maior grupo de tumores RE

positivo e os mais prováveis de levar à formação de metástases nos

nódulos linfáticos [12, 54].

Tipo normal – são RE positivo bem diferenciados, HER2 negativo, com

uma similaridade genética com o tecido normal [12].

Tipo basal- também denominado de “triplo negativo” pela ausência da

expressão de ER, PR e Her2, e pela expressão de marcadores de células

mioepiteliais como, queratinas basais, P-caderina, p63, laminina, EGFR e

citoqueratinas 5, 5/6, 14 e 17. Este grupo tumoral apresenta uma elevada

heterogeneidade, incluindo carcinomas medulares, metaplásicos e

carcinomas com um foco central fibrótico [54, 55].

Muitos tumores com mutações germinativas no BRCA1 têm características de

tumores tipo basal ou “triplo negativo”. Reciprocamente, alguns tumores tipo basal têm

disfunções no BRCA1 [56]. Geralmente estes tumores têm um elevado grau e um alto

índice proliferativo, sendo agressivos, frequentemente metastizam para as vísceras e

para o cérebro, sendo de mau prognóstico [12].


HER2 positivo – este grupo tumoral engloba carcinomas RE negativo com

uma sobre expressão de HER2. Este tipo tumoral é pouco diferenciado,

apresentando uma elevada taxa de proliferação, estando frequentemente

associados à ocorrência de metástases pulmonares [12].

Preferencialmente são utilizadas três classes de tumores da mama tendo em

conta a expressão de RE, PgR e HER2:

o RE-/PgR-/HER2 -, denominados de “triplo negativo”, ou basais;

o RE+/PgR+/HER2+, denominados de luminais;

o HER2+ que é independente da expressão do RE.

Contudo, esta classificação apesar de simples tem classes muito amplas e

heterogéneas, sendo alvo de pouca credibilidade. Em particular, a correspondência do

“triplo negativo” com os tumores da mama tipo basal, e a heterogeneidade no grande

grupo que é ER+/PgR+ [56, 57]. Com isto, surge a necessidade de uma classificação

mais refinada em que se obtenham grupos mais homogéneos.

Recentemente, Guedj e seus colaboradores [58] elaboraram, uma robusta e

mais homogénea classificação, tendo por base classificações anteriores, obtendo seis

diferentes grupos, que serão abaixo listados por ordem de similaridade, decrescente

na expressão do RE, diferenciação e mutações no TP53, grau ascendente: Luminal A,

tipo normal, Luminal B, Luminal C (RE+/PgR+/RA+), molecular apocrine (mApo) (ER-

/PgR-/RA+) e tipo basal (ER-/PR-/RA-). O que fortemente descrimina esta

classificação são RE, PgR e a proliferação celular [58].


Tabela 1- Distribuição dos tipos histológicos de cancro da mama. Adaptado [12].

Neoplasia Incidência

Carcinoma in Situ 15 a 30% do total de tumores da mama

Ductal carcinoma in situ 80% do total dos carcinomas in situ

Lobular carcinoma in situ 20%do total dos carcinomas in situ

Carcinoma Invasivo 70 a 80% do total dos tumores da mama

Carcinomas sem tipo específico (NST) 79% do total dos carcinomas invasivos

Carcinoma lobular 10% do total dos carcinomas invasivos

Carcinoma tubular 6% do total dos carcinomas invasivos

Carcinoma mucinoide 2% do total dos carcinomas invasivos

Carcinoma medular 2% do total dos carcinomas invasivos

Carcinoma metaplásico <1% do total dos carcinomas invasivos

1.5.3. Tumores do estroma

Existem dois tipos de estroma na mama, introlobular e o interlobular, originando

diferentes tipos de neoplasias. Tumores bifásicos específicos da mama, fibroadenoma

e o tumor filoide surgem a partir do estroma intralobular. Este contém fatores de

crescimento para as células epiteliais, levando à proliferação da componente não

neoplásica destes tumores. O estroma interlobular é o local de aparecimento do

mesmo tipo de lesões que surgem noutros locais do corpo, no tecido conjuntivo, por

exemplo, lipomas e angiossarcomas [12].

1.5.3.1. Tumores benignos do estroma

O fibroadenoma é o tumor benigno mais comum na mulher, com origem no

estroma intralobular. Ocorre essencialmente em mulheres jovens, na casa dos 20 a 30

anos, podendo ser múltiplo e bilateral. Em mulheres jovens surge como uma massa

palpável, e nas mais velhas como uma massa mamograficamente densa ou com

calcificações. Morfologicamente cresce como um nódulo esférico, usualmente bem

circunscrito e móvel. Tem um tamanho variável que pode ir desde 1cm até ocupação

de toda a mama [12].

O tumor filóide tem origem no estroma intralobular, como o fibroadenoma,

contudo pode ocorrer em qualquer idade, sendo mais incidente a partir da sexta

década de vida da mulher. A maioria das lesões é detetada como uma massa


palpável, sendo algumas apenas detetáveis por mamografia. Morfologicamente, os

tumores podem variar de tamanho, desde lesões com alguns centímetros até lesões

maciças englobando toda a mama. As lesões maiores têm por vezes saliências

bulbosas, devido à proliferação do estroma envolvido pelo epitélio. Estes tumores são

distinguíveis dos fibroadenomas, pela taxa mitótica, pleomorfismo nuclear, proliferação

massiva do estroma, limites imprecisos e tipo celular envolvido.

Este tumor deve ser excisado com margens ou por mastectomia para evitar a

recidiva local [12].

1.5.3.2. Tumores malignos do estroma

Nos tumores malignos do estroma incluem-se os angiossarcomas,

rabdomiossarcoma, liposarcoma, leiomiosarcoma, condrosarcoma e o osteossarcoma.

Os angiossarcomas da mama podem surgir espontaneamente ou por complicações

com a radioterapia[59].A maioria dos angiossarcomas esporádicos ocorre em

mulheres na casa dos 35 anos, sendo estes de elevado grau e de mau prognóstico

[12].


1.6. Glândula mamária do Rato

A utilização de roedores, como modelos animais de cancro da mama, tem sido

largamente explorada para o estudo da etiologia e biologia tumoral da neoplasia

mamária, mas não só, também apresenta importância ao nível do desenvolvimento e

avaliação de vários tratamentos e prevenção. A glândula mamária dos roedores

apresenta características únicas, em muito semelhantes às da mulher, o que os torna

um modelo animal de excelência para o estudo do cancro da mama [60, 61].

1.6.1. Anatomia da glândula mamária do rato

A glândula mamária tem como função a secreção de leite para nutrição da

descendência, existindo uma evolução adaptativa no que se refere ao número de

glândulas, para que seja possível a sustentação dos recém-nascidos, algo

característico de cada espécie [62].

No rato, as glândulas mamárias, estão alinhadas ventro-lateralmente ao longo

da linha mamária, desde a região cervical até à região inguinal (figura 4).

Figura 4- Esquematização da distribuição das glândulas mamárias do rato. 1:glândula cervical; 2 e

3 glândulas torácicas; 4: glândula abdominal; 5 e 6: glândulas inguinais. O cinzento mais escuro

representa a abrangência das glândulas subcutaneamente. Adaptado [63].

1

2

3

4

5

6


A única porção de glândula mamária visível, nos ratos, é o mamilo, a partir do

qual a restante glândula se estende dorso lateral e subcutaneamente, como folhas de

tecido fibro-adiposo [62].

Os ratos fêmea, têm seis pares de glândulas mamárias, em que o seu tamanho

e distribuição varia com a idade (figura 5), estimulação hormonal e estado reprodutivo.

Figura 5- Desenvolvimento da quarta glândula mamária (abdominal) de uma fêmea Sprague-

Dawley. Comparação da área da glândula com o número e a complexidade das ramificações aos 15

(x3.9), 30 (x3.4) e 55 (x5.6) dias de idade. n: mamilo. As preparações foram coradas com azul de

toluidina. Extraído de [62].

A descrição clássica da distribuição da glândula mamária é efetuada com

glândulas completamente maturadas, em que o primeiro par ou glândulas mamárias

cervicais, estende-se cranialmente para a glândula salivar da mandibula e para a

glândula parótida e lateralmente à zona média do membro anterior, atingindo a zona

interescapular. O segundo e terceiro par de glândulas estão situados na região

torácica, estendendo-se lateral e dorsalmente a partir do mamilo, que se situa na zona

média. Os restantes três pares situam-se na região abdominal – inguinal, estando em

continuidade estendendo-se medialmente para a região púbica, caudalmente à região

perianal e lateralmente à zona média dos membros inferiores [62, 64].

A compreensão da estrutura da glândula requer o estudo de todo o órgão,

analisando-o macroscopicamente e com apoio de cortes histológicos de áreas

representativas de zonas específicas da mesma glândula, porque as áreas


topográficas diferem entre si na morfologia, cinética celular, resposta hormonal e

potencial carcinogénico [65].

A glândula mamária é composta por parênquima e estroma. O parênquima é

composto por um ou dois ductos lactíferos que crescem a partir do mamilo (figura 6).

O crescimento da glândula mamária ocorre como um processo combinado de

alongamento dos ductos, em linha reta. A ramificação dos ductos principais em ductos

menores e lóbulos laterais ocorre no terço médio da glândula. A zona oposta ao

mamilo contem os ductos terminais que estão em constante crescimento e os lóbulos

terminais [62].

Figura 6- Representação esquemática da quarta glândula mamária (abdominal), de um rato fêmea,

com 55 dias de idade, virgem. A glândula está dividida em três zonas: A: proximal do mamilo (n);

B: medial; C: zona distal do mamilo que contém a maioria dos terminais ducto lobulares (TEB) em

ativo crescimento; Lob: lóbulos; AB: lóbulos alveolares; ductos terminais (TD); n:mamilo; LN:

nodulo linfático. Extraído de [62].

Os ductos mamários são estruturas tubulares com paredes revestidas por dois

tipos celulares: uma camada de células epiteliais, mais interna, que revestem todo o

lúmen e uma camada de células mioepitelial, mais externa, e descontinua que

permanece na membrana basal [62].

A espessura da camada epitelial, bem como o seu grau de diferenciação, varia

em função do local em questão. Os ductos maiores tendem a ser revestidos por uma

única camada de células epiteliais colunares baixas ou cubóides, ou por um epitélio


pseudoestratificado. Os lóbulos terminais são revestidos por várias camadas de

células epiteliais cubóides, com elevado índice proliferativo, o que os torna

particularmente suscetíveis à indução tumoral [62, 66].

1.7. Indução de neoplasias da mama através da N-metil-N-

nitrosureia (MNU)

A N-metil-N-nitrosureia (MNU) é um agente carcinogénico que não necessita

de ativação metabólica [67] e apresenta alta especificidade para a indução de tumores

na glândula mamária em roedores, levando à formação de neoplasias com

características idênticas à do Homem no que diz respeito à histopatologia, formação a

partir das células ducto epiteliais, dependência de hormonas sexuais e alterações na

expressão do Transforming growth factorBeta (TGF-β), HER2, ciclina D1 [68].

Os carcinomas mamários induzidos via MNU, levam a uma mutação pontual, no proto-

oncogene c-Ki-ras, no codão 12, G35 - A35, que leva a uma substituição da glicina por

ácido aspártico [69], contudo esta alteração não confere uma assinatura molecular

específica [70], e poderá não ser necessária ou suficiente para a iniciação tumoral,

sendo o estroma o alvo do MNU, pois a transformação neoplasia apenas ocorre em

células epiteliais em que o estroma esteve exposto ao agente carcinogénico [71]. A

incidência, o período de latência e a multiplicidade tumoral são dependentes da idade

e da dose, e independentes da via de administração [67, 72].

Quando se compara a eficácia da administração do MNU, por via subcutânea,

para a formação de tumores da mama em ratos Sprague-Dawley, com a via

intravenosa (via jugular ou veia caudal), não se observam diferenças significativas

relativamente à incidência tumoral, tempo de latência e no tipo de tumor induzido,

sendo ambas altamente específicas para a indução de tumores mamários [73].

Contudo a administração intravenosa requer mais técnica do que a via subcutânea,

mas esta ultima poderá levar à introdução de erros, por perdas de carcinogéneo, que

podem ser minimizados consoante o local escolhido para a administração [72]. Ambas

as formas de administração não são totalmente satisfatórias, surgindo a administração

intraperitoneal como via alternativa. Com resultados similares, comparativamente com

as duas vias de administração acima referidas, mas com uma diferença na variação do

número de tumores por rato, cerca de 20 a 25% inferior. Posto isto, a via

intraperitoneal será, dos três métodos de administração do MNU, o mais rápido,


simples, reprodutível e menos variável, desde que seja preparado e injetado com o

devido cuidado [72].

Uma injeção única de MNU poderá levar a uma incidência tumoral de 100%,

sendo dependente da dose utilizada. Em estudos em que se procura avaliar a dose-

resposta, verifica-se unanimidade no que diz respeito ao tempo de latência. Quanto

maior a dose menor o tempo de latência, sendo o mesmo verificável para a incidência

tumoral [67, 72, 74]. Para uma dose de 50 mg MNU/kg, obtém-se uma incidência

tumoral de 100%, entre os 90 e os 150 dias após administração do agente

carcinogénico, isto para animais com 50 dias de idade [67, 72], pois para animais

injetados com 21 dias de idade ao final de 35 dias após exposição ao MNU será

possível obter uma incidência tumoral de 100% [75]. Para doses inferiores a incidência

estará sempre abaixo dos 100% [67, 72, 74]. O número de tumores por animal

também está relacionado com a dose, quando esta diminui, o número de tumores por

animal também diminui [67, 72]. Para as doses mais baixas, de 10mg/kg ou 20 mg/kg,

o tipo de lesões induzida são essencialmente carcinomas ductais in situ, havendo um

aumento das estruturas acinares e um aumento do número de células epiteliais

descartadas para o lúmen dos ductos epiteliais [74]. As lesões induzidas por doses

superiores, 30 mg/ kg ou 50mg/kg, levam à formação de adenocarcinomas ou

carcinomas papilares [67, 72] sendo a maioria destes invasivos, e apenas uma

pequena percentagem de carcinomas ductais in situ, e adenomas [76].

É possível induzir tanto lesões benignas como malignas, mesmo para doses

baixas como 10 mg/kg, mas para estes a maioria das lesões induzidas são benignas

[67].

A idade com que os animais são expostos ao MNU poderá influenciar os

resultados. Quando se compara resultados obtidos em animais expostos a uma dose

de 50 mg/ kg, mas com idades diferentes, 21 e 50 dias, verificam-se várias

similaridades, na histogénese e a patogénese das lesões induzidas, [75] mas também

são verificadas diferenças. Para ratos fêmea com 21 dias de idade verifica-se um

período de latência mais curto para obtenção de carcinomas, cerca de 35 dias após

exposição [75]. As lesões obtidas são dependentes das hormonas sexuais, mesmo

sendo estes animais sexualmente imaturos [77].

Na generalidade dos estudos as lesões desenvolvidas são maioritariamente

adenocarcinomas [67, 72, 75, 76], mas também é possível verificar a formação de

outro tipo de lesões como, proliferações intraductais, carcinomas ductais in situ [75,


78], adenomas [67, 76], fibromas, fibroadenomas, hiperplasia lobular [67, 72].

O surgimento de metástases é frequente, nomeadamente, no fígado, pulmões e baço

[67, 72, 75, 76, 79].

Quando se avalia a sequência temporal para o aparecimento de lesões como,

proliferações intraductais, carcinomas ductais in situ e adenocarcinoma, em ratos

Sprague-Dawley, com 21 dias de idade, injetados com uma dose de 50mg MNU/kg,

verifica-se que 7 dias após exposição ao carcinogéneo, não é morfologicamente

detetável qualquer tipo de lesão na glândula mamária. Em algum momento entre o 7º

e o 14º dia após exposição, surgem, em cerca de 20% dos animais proliferações

intraductais, mas mais nenhuma lesão é detetada. Ao 21º dia, para além das

proliferações intraductais que se encontram em cerca de 40 % dos animais, temos o

aparecimento de carcinomas ductais in situ e de adenocarcinomas, sendo mais

frequente este último. Ao 35º dia, o tipo de lesão mais frequente é o adenocarcinoma

(94%), seguida das proliferações intraductais (80%) e por último os carcinomas ductais

in situ (40%). A incidência de cada tipo de lesão aumenta com o tempo, após

administração do carcinogéneo, mas o padrão temporal de ocorrência de cada lesão é

diferente, este mesmo padrão sugere que as proliferações intraductais são as lesões

percursoras para os carcinomas ductias in situ e adenocarcinomas [78].

A indução de tumores da mama em modelos animais com ratos, recorrendo ao

MNU, para cancro da mama está bem estabelecida, existindo grandes similaridades

com os tumores da mama no Homem, RE positivo [80]. Contudo, o cancro da mama é

uma doença molecularmente heterogénea, [81] não sendo passível de ser refletida

num único modelo animal, como tal outros modelos devem ser estudados,

nomeadamente os modelos esporádicos de cancro da glândula mamária da gata e da

cadela [82].


2.Material e métodos

Este estudo foi realizado de acordo com a Diretiva Europeia 2010/63 e resulta

de material obtido no âmbito de um projeto FCT com a referência

PTDC/DES/114122/2009.

2.1.Animais

Foram utilizados 11 ratos fêmea, virgens, Sprague-Dawley, obtidos a partir da

empresa Harlan, Barcelona, com 4 semanas de idade. Os animais foram colocados

em gaiolas de policarbonato com superfícies lisas e cantos redondos. A limpeza das

gaiolas e a substituição das camas foi realizada semanalmente. Cada gaiola foi

devidamente identificada com numeração e o respetivo grupo. No interior das gaiolas

foram colocados tubos de plástico duro, de forma a enriquecer o ambiente e a quebrar

monotonia. Os animais foram alojados no biotério do Departamento de Ciências

Veterinárias da Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro (UTAD). O biotério

possui um sistema de luz com temporizador que proporcionou um fotoperíodo de 12

horas luz e 12 horas de escuridão, controlo de temperatura (22 +/- 2 °C) pelo sistema

de ar condicionado. Para a identificação dos animais procedeu-se ao corte da orelha,

a quando da divisão, aleatória dos animais, pelos diferentes grupos.

2.2. Agente Carcinogénico

Os tumores mamários foram induzidos pela N-metil-N-nitrosureia (MNU),

adquirida, à empresa Sigma Chemical Co, Madrid,Espanha, diluído em NaCl a 0.9%e

administrado intraperitonealmente, numa dose de 50 mg/Kg, aos 51 dias de idade.

2.3.Protocolo Experimental

A alimentação foi feita ad libitium, sendo os animais pesados todas as

semanas, bem como a água e a comida consumidas. Após 2 semanas da

administração do MNU as cadeias mamárias foram apalpadas semanalmente.

O protocolo teve uma duração de 35 semanas, no final das quais todos os

animais foram sacrificados.


2.4.Recolha de órgãos e seu processamento

No final das 35 semanas os animais foram sacrificados por overdose de

pentobarbital sódico, sendo todos os órgãos recolhidos, pesados e fixados em formol

tamponado a 10%, durante 12 horas. Após a sua fixação, foram cortados, a sua

superfície foi cuidadosamente avaliada e foram processados para inclusão em

parafina. De seguida realizaram-se vários cortes de 3 µm de espessura num

micrótomo (Leica® 20035) para colorações de rotina hematoxilina e eosina (H&E) e

azul de toluidina, bem como para a realização da imunohistoquímica.

2.5. Imunohistoquímica

Para a realização do estudo da imunohistoquímica foram utilizados os

seguintes anticorpos: ER (6F11 Novocastra, Newcastle), KI-67 (Mib -1 Dako, USA) e

α-actina (HHF35 Dako, Denmark).

Para a execução da imunohistoquímica foi utilizado o kit de deteção NovoLink

Polymer Detection System, Leica microsystems, com o seguinte protocolo:

1. Cortar e montar secções em lâminas adesivadas por silane.

2. Desparafinizar as secções em xileno.

3. Reidratar através de álcoois graduados.

4. Lavar as lâminas em água quente da torneira.

5. Efetuar a recuperação do antigénio.

6. Lavar as lâminas em água desionizada.

7. Neutralizar a peroxidase endógena, empregando para tal Peroxidase

Block (peróxido de hidrogénio a 3%) durante 5 minutos.

8. Lavar duas vezes em TBS durante 5 minutos, em cada uma delas.

9. Incubar as secções em Protein Block (caseína a 0,4% em soro com

tampão fosfato e produtos estabilizadores e surfactantes, bem como

Bronidox L a 0,2% com produto conservante) durante 5 minutos.


11. Incubar o anticorpo primário a uma diluição ótima.



13. Incubar com Post Primary Block (ativador da penetração do polímero

contendo soro animal a 10% (v/v) em soro tamponado com tris /

ProClin™ 950 a 0,09%) durante 30 minutos.


15. Incubar com Polymer (NovoLink Polymer : HRP Poli-IgG de anti

ratinho/coelho( a 8 µg/ml cada um) contendo soro animal a 10% (v/v)

em soro tamponado com tris / ProClin™ 950 a 0,09%) durante 30

minutos.

16. Lavar em tampão TBS duas vezes durante 5 minutos, em cada uma

delas, agitando levemente.

17. Desenvolver a atividade da peroxidase com solução de trabalho DAB

durante 5 minutos.

18. Enxaguar as lâminas com água.

19. Contrastar com Hematoxylin (hematoxilina a 0,02%).

20. Enxaguar as lâminas com água durante 5 minutos.

21. Desidratar, soltar e montar as secções.

Observação e análise da imunorreatividade, ao microscópio ótico composto,

das lâminas.

Registo escrito e fotográfico das observações.


Tabela 2- Informação adicional para o procedimento da técnica de imunohistoquímica.

Marcador Clone Diluição Tempo de

incubação

Recuperação

do antigénio

Recetor de

estrogénio

6F11

Novocastra,

Newcastle

1:100 Durante a noite Panela de

pressão com

tampão citrato,

pH 6, durante 3

minutos

α-actina HHF35 Dako,

USA


pressão com

tampão citrato,

pH 6, durante 3

minutos

Ki-67 Mib -1 Dako

Denmark


pressão com

tampão citrato,

pH 6, durante 3

minutos


3. Resultados

Dos 11 animais aos quais foi administrado o agente MNU, todos

desenvolveram tumores mamários.

O estudo histológico destas neoplasias, quimicamente induzidas, pela MNU,

mostra quatro padrões fundamentais: papilar, adenóide, sólido e fusocelular.

Os padrões papilar e adenóide são os mais frequentes e, claramente, os

dominantes, coexistindo na maioria das neoplasias. Só muito raramente se encontram

isolados. Na nossa série só se encontrou um caso em que só o padrão papilar estava

presente e um caso em que só se evidenciou o padrão adenóide.

Tabela 3- Esquematização da observação histológica dos tumores da mama obtidos pela indução

pelo MNU.

+++: fortemente presente; ++ moderadamente presente; +: fracamente presente; -: ausente.

Mitoses: número de mitoses por 10 campos; 0:ausência de mitoses; 1: 1 a 4 mitoses;2: 5 a 9;

3:mais de 10; ki67: 0:ausência de marcação;1 marcação fraca;2:marcação moderada;3: marcação

forte

Nesta série é ainda de evidenciar a presença, fortemente marcada, de

mastócitos. Ainda a ter em atenção uma baixa imunorreatividade para o ki67

comparativamente com um índice mitótico elevado.

Os padrões sólido e fusocelular são mais raros e ocupam áreas muito limitadas

das neoplasias, sendo portanto relativamente difíceis de identificar e obrigando a uma

pesquisa mais cuidada. Não foram encontrados em formas puras. Estão, portanto,

sempre associados ou ao padrão papilar ou ao padrão adenóide

Caso Papilar Adenóide Sólido Fusocelular Mitoses Mastócitos Ki67

93% 93% 58% 7% 1 +++ +++ - - 1 +++ 1 2 ++ ++ + - 0 +++ 0 3 ++ +++ + - 2 +++ 1 4 + + ++ ++ 3 + 1 5 ++ ++ - - 2 +++ 0 6 +++ +++ - - 2 +++ 0 7 + + ++ - 2 ++ 1 8 +++ - - - 0 +++ 0 9 ++ ++ - - 1 +++ 1 10 +++ + - - 2 +++ 1 11 +++ ++ + - 2 +++ 1 12 ++ +++ + - 2 +++ 1 13 - +++ - - 0 +++ 1 14 +++ + + - 0 ++ 1


Figura 7- Cortes histológicos dos padrões fundamentais (H&E). 1:tecido mamário “normal”, não

neoplásico; 2: padrão papilar; 3: padrão adenóide; 4: padrão sólido; 5: padrão fusocelular.

2 X40 3 X250

X100 X100 4 5

X100 1


No padrão papilar (figura 8 e 9) as neoplasias apresentam dilatações cavitárias

císticas em cujo interior crescem projeções papilares constituídas por eixos conjuntivo-

vasculares revestidas por uma dupla camada de células: a mais interior contém

células achatadas ou fusocelulares, de tipo mioepitelial; a mais externa tem células de

fenótipo epitelial, colunares, por vezes com núcleos de aspeto pluri-estratificado. As

mitoses identificam-se na maioria dos campos embora não sejam muito frequentes e

raramente são atípicas. Nalgumas áreas a densidade células é grande havendo uma

mistura entre células mioepiteliais e epiteliais, o que constitui a base para formação de

focos com padrão sólido. Noutras zonas o tecido conjuntivo do estroma é mais

exuberante e ocupa a maioria do espaço disponível, constituindo a base de uma

evolução cicatricial.


Figura 8- Exemplos de cortes histológicos do padrão papilar (H&E). 1 e 2: padrão papilar; 3:

revestimento do eixo conjuntivo vascular em que se visualiza a dupla camada de células: seta fina

e longa- células epiteliais acinares, seta pequena e grossa- células mioepiteliais; 4: ampliação do

eixo conjuntivo vascular: seta fina e longa- células epiteliais acinares, seta pequena e grossa-

células mioepiteliais, M- Mastócitos.

X40 X40 1

X40

2

X40

X400

X250

X250

X40

X250

X40

3

X40

4

X40

M

X40


Figura 9- Exemplos de cortes histológicos do padrão papilar (H&E). 1:padrão papilar com estroma fibrosado; 2: visualização de mastócitos (setas) em lesão papilar; A: padrão adenoide, B- padrão papilar.

A

B

3

X40

2

X40

1

X40

X100

X40

X100

X40

X100

X40


Figura 10- Exemplos de cortes histológicos do padrão adenoide (H&E). 1: padrão adenoide.

Lumina com material mucoide; 2: visualização de mastócitos em lesão adenoide (setas); 3: A-

padrão adenoide, B- padrão papilar.

A

B

2

X40

1

X40

X250

X40

3

X40

X250

X40

X100

X40


No padrão adenóide (figura 10) as células neoplásicas juntam-se em

agrupamentos glandulares de pequena dimensão, encostados entre si e com pouco

estroma no meio. No interior dessas estruturas adenóides há material de aspeto

mucinoso, o que confere à lesão um aspeto muito semelhante ao que caracteriza, nas

neoplasias humanas, o carcinoma adenóide cístico. Essas glândulas têm, também,

duas camadas de células como no padrão papilar e as mitoses encontram-se com a

mesma frequência. Nalguns casos mais raros, as glândulas dilatam-se e então o

aspeto cístico é mais evidente.

No padrão sólido (figura 11) as células neoplásicas agrupam-se em toalhas

sólidas onde o estroma é muito escasso e, ao mesmo tempo, não se formam nem

cavidades glandulares nem estruturas papilares. Aqui as mitoses tendem a ser mais

frequentes e o aparecimento de células em apoptose e com sinais de necrose é,

também, mais comum. Nos casos de maior grau de malignidade identificaram-se

padrões de necrose de tipo “comedo” no interior dos maciços celulares mais sólidos.

Figura 11- Exemplos de cortes histológicos do padrão sólido (H&E). 1 e 2 :padrão sólido, células neoplásicas agrupadas em toalhas sólidas

1 2 X100 X100


Nas áreas de padrão fusocelular (figura 12) as células neoplásicas agrupam-se

em feixes de células alongadas e fusiformes, de aspeto sarcomatoide. As mitoses são

escassas ou frequentes de acordo com o grau de malignidade do tumor, mas a não se

evidenciar necrose. Nos casos em que este fenótipo é mais abundante e as células

apresentam sinais de malignidade mais acentuados, o padrão assemelha-se ao que é

descrito, em neoplasias humanas, com a designação de carcinossarcoma.

Figura 12- Exemplo de corte histológico do padrão fusocelular (H&E). Visualização dos feixes de

células alongadas e fusiformes.

No estroma das neoplasias existe um infiltrado inflamatório polimorfo onde são

frequentes linfócitos e plasmócitos. Contudo, as células mais frequentes são os

mastócitos (figura 13) que aparecem ou isolados ou agrupados em ilhas de dimensões

variadas, por vezes de tal modo extensas que se assemelham ao que se observa

nalguns mastocitomas. Como seria de esperar estes mastócitos mostram abundantes

grânulos que têm a cor avermelhada quando corados com azul de toluidina.

Caracteristicamente estes mastócitos situam-se no tecido neoplásico, não se

observando no tecido conjuntivo que envolve os nódulos neoplásicos.

De um modo geral as neoplasias assim induzidas são multinodulares e têm

crescimento expansivo. Os vários nódulos estão separados por tecido conjuntivo

normal, quase sempre de natureza fibromuscular e adiposa, onde se encontram vasos

de dimensões variadas e infiltração discreta de linfócitos e plasmócitos.

X100

1

1

1

1

1

1


Figura 13- Visualização de mastócitos. 1: tecido “normal”, não neoplásico, ausência de mastócitos

(H&E); 2: presença de mastócitos (setas) em lesão papilar (H&E); 3:presença de mastócitos (setas)

em lesão adenóide (H&E); 4: Formação de um conglomerado de mastócitos, evidenciados pelo

azul de toluidina; 5: mastócitos isolados e em fila” indiana”, evidenciados pelo azul de toluidina.

1

1

1 X100

2 X100

4

3

5

X250

X400 X250


A natureza maligna destas neoplasias tem como critérios de afirmação,

essencialmente, a multifocalidade, o índice mitótico e o padrão de crescimento

expansivo com que invade os tecidos adjacentes, nomeadamente o músculo-

esquelético envolvente. As atipias citológicas são raras ou inexistentes, o

pleomorfismo nuclear muito escasso e a necrose de células isoladas ou de tipo

comedo só ocorre nos casos em que existem características de malignidade mais

exuberantes e que são raros (apenas 4 nesta série).

O estudo imunohistoquímico, dos recetores de estrogénio (figura 14), mostra

que a positividade ocorre em quase todos os casos, a intensidade de coloração é forte

e a quase totalidade cas células neoplásicas exprime marcação.

Quando comparado com o oque ocorre no tecido mamário não neoplásico.

Existe um aumento significativo da expressão de RE, traduzido essencialmente pelo

número de células marcadas e pela intensidade com que essa marcação ocorre

(tabela 5). Esta forte positividade para RE observou-se tanto no padrão papilar como

no adenoide. Nos padrões sólido e fusocelular a expressão de RE foi habitualmente

menor tanto na intensidade da marcação como no número de células marcadas.


Figura 14- Positividade para a expressão dos recetores de estrogénio 1: positividade intensa e

difusa em mais de 80% das células; 2: A- positividade intensa e difusa em mais de 80%das células,

B- positividade intensa apenas em 20% das células; 3- positividade média em menos de 80% das

células; 4:Negatividade em áreas de padrão fusocelular; 5:tecido mamário “normal”, positividade

em 10% das células.

1 X250 X250

X250 X250

X250

2

3 4

5

A

B


Tabela 4- Descrição da imunorreatividade dos recetores de estrogénio (RE), para cada caso tendo

como termo de comparação o tecido não neoplásico: “normal”.

N:área atingida (%); I: intensidade da cor, varia entre 0 e 3, sendo: 0: ausente; 1: intensidade de

cor fraca; 2: intensidade de cor moderada; 3: intensidade de cor forte.

Caso

Papilar

Adenoide

Sólido

Fusocelular

“Normal”

N (%) I N (%) I N (%) I N (%) I N (%) I

1 100 3 80 3 0 0 0 0 60 30

2 100 3 70 3 70 3 0 0 50 2

3 90 3 90 3 80 2 0 0 30 3

4 80 3 80 3 60 2 50 3 30 2

5 90 3 90 3 0 0 0 0 40 3

6 80 3 80 3 0 0 0 0 50 3

7 100 3 60 3 60 2 0 0 60 3

8 80 3 0 0 0 0 0 0 30 2

9 100 3 60 3 0 0 0 0 50 2

10 80 3 90 3 0 0 0 0 50 2

11 80 3 80 3 30 3 0 0 50 3

12 90 3 90 3 30 3 0 0 50 3

13 0 0 100 3 0 0 0 0 40 3

14 100 3 80 3 30 3 0 0 40 3


Figura 15 - Imunorreatividade para actina do músculo liso (AML) 1-positividade nas células

mioepiteliais e negatividade nas células epiteliais, numa área de padrão papilar; 2: positividade

nas células mioepiteliais e negatividade nas células epiteliais, numa área de padrão adenoide;

3- evidenciação da arquitetura papilar.

X100

X250 X250 1 2

3

33


A imunorreatividade para actina do músculo liso (AML) mostrou que na

totalidade dos tumores existem dois tipos de células (figura 15) - epitelial e mioepitelial

- pelo que se podem considerar tumores mistos ou mioepiteliomas. Contudo, deve

sublinhar-se o maior grau de proliferação do componente epitelial que é também o

que evidencia maior agressividade histológica.

A imunorreatividade para o Ki-67 (figura 16) foi escassa, claramente inferior ao

esperado se considerarmos o índice mitótico. Por isso é de admitir ter havido

problemas de especificidade que impediram a expressão adequada do antigénio.

Figura 16- Imunorreatividade para o Ki-67. Positividade em cerca de 5% das células, numa área de

padrão fusocelular.

X250


4. Discussão

A utilização do rato, como modelo animal, para o estudo das neoplasias da

mama é particularmente importante visto que, a glândula mamária deste leva à

formação de neoplasias hormona-dependentes, sendo em muitos aspetos similares

com as da mulher [61, 83],bem como as lesões neoplásicas quimicamente induzidas

com MNU, no que diz respeito à histopatologia, à génese a partir das células do

epitélio da transição ducto/lobular, à relação com hormonas sexuais – estrogénios e

progesterona; e a alterações na expressão de vários genes, como por exemplo, do

TGFβ, HER2, ciclina D1 [69]. Na generalidade dos estudos, em que se utiliza o MNU

como carcinogéneo, as lesões desenvolvidas são maioritariamente adenocarcinomas

[68, 73, 76, 77] o que está em concordância com o que foi observado na nossa série,

onde identificámos quatro padrões morfológicos diferentes: papilar, adenóide, sólido e

fusocelular. Destes os padrões papilar e adenóide foram os mais comuns, estando

presentes em quase todos os casos e em associação. Os padrões fusocelular e sólido

são esporádicos e muito focais, parecendo indicar áreas de comportamento mais

agressivo, se considerarmos o maior número de mitoses, a maior expressão de Ki-67

e a associação a fenómenos de necrose.

Outros autores com um procedimento semelhante ao nosso descrevem tipos

diferentes de lesão como, proliferações intraductais, carcinomas ductais in situ,

[76, 79] adenomas [68, 77] fibromas, fibroadenomas e hiperplasias lobulares [67, 72].

Estas lesões não foram por nós identificadas, provavelmente porque a nossa série é

pequena e o nosso principal objetivo foi caracterizar os padrões morfológicos mais

comuns para, em estudos posteriores, apreciar que alterações genéticas estão

envolvidas, como respondem aos esquemas de tratamento e, sobretudo, quais os

critérios mais importantes para afirmar a malignidade. O mesmo ocorreu com as

metástases, que não foram objeto de estudo nesta série, mas que o seu surgimento

está descrito, nomeadamente, no fígado, pulmões e baço [67, 72, 75, 76, 79].

Na série apresentada foram identificadas algumas características de

malignidade: atipia citológica, embora escassa, invasão local, nomeadamente o

músculo esquelético envolvente, aumento do número de mitoses, muitifocalidade.

Também se identificou aumento da expressão de RE, como ocorre na mulher, o que

constitui um bom elemento para separar as lesões da mama das que se desenvolviam

noutros órgãos adjacentes, como glândula salivar e glândulas cutâneas anexas.


O padrão papilar levanta os mesmos problemas de interpretação que levanta

na mulher, onde é quase sempre benigno e onde os sinais de malignidade assentam

nos critérios clássicos de invasão do estroma, permeação vascular e metástases.

Relativamente aos nossos casos, as diferenças relativas ao que se passa na mulher

residiram na maior celularidade, maior grau de atipia citológica, invasão estromal e

menor expressão de RE nos casos em o grau de malignidade era mais óbvio.

O carcinoma papilar é uma forma rara de tumor da mama que representa cerca

de 2 a 5% dos carcinomas de mama na mulher. Clinicamente, o carcinoma papilar

afeta predominantemente, mulheres pós-menopausa com uma média de idades

compreendidas entre os 57 e os 75 anos [83].

O carcinoma papilar é o tipo tumoral mais comum, em tumores induzidos pelo

MNU. Caracterizam-se por eliminar a arquitetura da glândula e invadem estruturas

adjacentes. Quando invadem a pele, ulceram ficando sujeitos a uma necrose local,

algo que aconteceu com alguns animais durante a fase de cancerização. Estes

tumores contêm eixos fribrovasculares, que são frequentemente invadidos tanto por

linfócitos como por mastócitos, como é evidenciado na nossa série [84].

O padrão adenóide da nossa série apresenta um aspeto semelhante ao que

caracteriza as neoplasias humanas, o carcinoma adenóide cístico.

O carcinoma adenóide cístico (ACC) da mama é uma neoplasia muito rara,

representando cerca de 0,1% da totalidade dos carcinomas da mama [85], sendo mais

frequentemente encontrado na glândula salivar [86, 87]. Contudo o ACC da mama é

considerado menos agressivo que o da glândula salivar [88] apesar de serem

morfologicamente idênticos, sendo compostos por duas populações de células,

epiteliais e mioepiteliais [89].

O padrão fusocelular apenas é visualizado, na nossa série, uma vez, de uma

forma moderada, associado a um padrão sólido também moderadamente marcado, e

a um padrão adenóide e papilar fraco. Onde o fenótipo é mais abundante e as células

apresentam maior malignidade, o padrão assemelha-se ao que é descrito, em

neoplasias humanas, com a designação de carcinossarcoma.

Os carcinossarcomas da mama são muitas vezes referidos como carcinomas

metaplásicos da mama e são raros, com uma incidência de 0,1% de todos os outros

tipos de tumores da mama [90]. A sua origem é de alguma forma controversa, mas

tudo aponta para que tenham uma origem mioepitelial [90, 91]. De uma forma geral


estes tumores são vistos como “triplo negativo”, pois não apresentam expressão de

RE, PgR e HER2, sendo neoplasias bastante agressivas [92].

No estroma das neoplasias existe um infiltrado inflamatório polimorfo onde são

frequentes linfócitos e plasmócitos. Contudo, as células mais frequentes são os

mastócitos. Os carcinomas mamários induzidos via MNU, levam a uma mutação

pontual, no proto-oncogene c-Ki-ras, no codão 12, G35 - A35, [69] contudo esta

alteração não confere uma assinatura molecular específica [70] podendo não ser

suficiente para a iniciação tumoral, sendo necessárias mutações adicionais. Estas

mutações adicionais podem ser causadas por espécies reativas de oxigénio (ROS) ou

intermediários reativos de nitrogénio (RNI), que são capazes de causar dano no ADN

e instabilidade genómica, pela ativação de células responsáveis pelo processo

inflamatório, em resposta à exposição ao MNU. Estas espécies reativas de oxigénio

afetam genes responsáveis pelo “mismatch repair”, ficando assim o ADN da célula

mais suscetível à introdução de erros [93, 94]. Por outro lado, o processo inflamatório

pode levar à promoção tumoral. Um exemplo disso mesmo é o modelo de carcinoma

hepatocelular induzido pela dietilnitrosamina, em que as lesões ao nível do ADN

contribuem para a morte celular, resultando numa resposta inflamatória que promove o

desenvolvimento tumoral [95, 96].

Na nossa série, os mastócitos surgem, habitualmente, ou isolados ou

agrupados em ilhas de dimensões variadas, por vezes bastante extensas. Este tipo

celular é originário da medula óssea, estando distribuído por vários tecidos como o

tecido conjuntivo e mucosas. É possível encontra-los em circulação, contudo estão

numa forma imatura, sendo no tecido em que por último residem que maturam.

Contrariamente ao que acontece com outras subpopulações mielóides, estes têm a

capacidade de proliferar mesmo após maturação [97]. Nestes tecidos permanecem

como células sentinela, sendo a primeira linha celular na resposta imune inata face à

iniciação tumoral [98].

O processo de inflamação crónica leva à proliferação dos mastócitos residentes

e promove o recrutamento de mastócitos que estejam em circulação. Isto leva a que

estes sejam a maior população de células inflamatórias sendo importantes para a

regulação da inflamação, bem como, a resposta imune no microambiente tumoral [93].

Isto explica o porquê dos mastócitos estarem fortemente presentes na nossa série. As

moléculas por eles libertadas podem promover alterações nos tecidos afetados pela

inflamação, como a degradação ou remodelação estrutural de elementos do tecido,

que poderão estar associados a alterações de função nos órgãos envolvidos. O tipo


molecular libertado depende tanto do mecanismo de ativação e da força do estímulo

[99]. A variedade de moléculas por estes produzida é ampla e com os mais variados

efeitos nível tumoral como heparina, interleucina- 8 (IL-8) e do fator de crescimento da

vasculatura endotelial (VEGF), que promovem a neovascularização; a histamina é

capaz de suprimir a resposta imune; fator de crescimento derivado das plaquetas, fator

de crescimento do nervo, fatores de células estaminais e protéases que são

mitogénicas, sendo estas últimas capazes de promover a metastização [100].

Os mastócitos apresentam grande plasticidade, podendo alterar o seu fenótipo

mediante certas circunstâncias, mesmo células totalmente maturas, havendo uma

relação muito grande entre o processo de maturação e tecido no qual por último

residem [97, 99]. Isto levanta uma questão, visto que as células do estroma são o alvo

do MNU, pois a transformação neoplasia apenas ocorre em células epiteliais em que o

estroma esteve exposto ao carcinogéneo [71] e os mastócitos residem neste, até que

ponto é que a presença do carcinogéneo altera o microambiente e o fenótipo dos

mastócitos?

Contudo, no nosso estudo apenas foi possível detetar a forte presença deles,

não sendo possível fazer outras apreciações, mas uma avaliação mais detalhada

sobre a importância deste tipo celular nos diferentes tipos de neoplasia da mama,

principalmente na forma como o microambiente é afetado e a forma como o MNU

interatua com estas células, são dois pontos para estudos futuros de grande interesse.

A ligação entre todos os tumores não é a mesma e a avaliação dos mastócitos, no

tumor, necessita de ser feita individualmente para cada tipo tumoral e também, para os

diferentes estadios do mesmo tumor.

O índice mitótico foi relativamente elevado, mas não teve correspondência na

expressão do Ki-67. Duas razões podem explicar esta aparente contradição:

especificidade e sensibilidade do anticorpo usado; e a conhecida diminuição da

expressão de Ki67 quando a expressão de RE é grande.

O ki-67 é uma proteína nuclear, que varia a sua expressão consoante as fases

do ciclo celular, estando presente em células em proliferação ativa e ausente em

células quiescentes [101]. Isto confere-lhe uma particularidade interessante como

marcador proliferativo. De uma forma geral observam-se níveis baixos de ki-67

durante a fase G1 do ciclo celular e o início da fase S, havendo um aumento

progressivo da expressão deste, até que atinge o seu auge durante a fase M. Quando

a célula entra em anáfase ou telófase há uma diminuição na expressão deste


marcador [102]. Alguns trabalhos[103, 104] têm verificado uma relação inversa entre a

expressão do ki67 e os recetores de estrogénio.

Shocker et al., [104] procurou verificar qual a relação entre células com

recetores hormonais ativos e células em proliferação, em tecido mamário saudável,

verificando que nos lóbulos menos diferenciados a expressão de RE-α, PgR e Ki-67

são positivas, havendo um decréscimo comparativamente com lóbulos mais

diferenciado. O número de células que expressa RE-α, PgR e Ki-67 são similares,

contudo o que se verifica é que o tipo de células que reage ao ki-67 não é o mesmo

que reage ao RE-α, PgR, sendo muito poucas as células que reagem a uma dupla

marcação. O que sugere a presença de três tipos celulares no epitélio; células que são

RE negativo mas são positivas para o ki-67, e estas têm a capacidade de proliferar,

outras que são RE positivo mas que não proliferam, e uma pequena porção de células

RE positivo que têm capacidade de proliferação, sendo positivas para o ki-67. O

estrogénio irá estimular as células com RE positivo, que por sua vez levam à produção

de fatores de crescimento que estimulam as células RE negativo, sendo estas

capazes de proliferar [104].


5.Conclusão

Com este trabalho verifica-se que a indução de tumores da mama, utilizando o

MNU, é uma forma fiável, levando ao surgimento de neoplasias idênticas às humanas,

sendo maioritariamente adenocarcinomas, onde identificámos quatro padrões

morfológicos diferentes: papilar, adenóide, sólido e fusocelular. As lesões, observadas,

apresentam uma baixa incidência na população, mostrando assim, a importância do

estudo das mesmas em modelos animais, como este, não só com um fim descritivo,

mas também como forma de estudar a biologia tumoral e possível terapêutica. A

evidenciar a forte presença de mastócitos que poderão estar relacionados com uma

resposta inflamatória crónica devido ao dano que o MNU causa no ADN das células do

estroma. Será importante ter em conta que esta forma de indução leva a formação de

tumores mistos ou mioepiteliomoas, pois a componente epitelial e mioepitelial está

presente. A evidenciar a baixa reatividade do ki-67, com um índice mitótico elevado,

indicativo de baixa especificidade por parte do anticorpo utilizado.


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