ANÁLISES DE CROMOSSOMOS MITÓTICOS

Histórico dos Estudos em Cromossomos

• Fim Século XIX 1º idéias cromossomos: estudos mitose (divisão celular).

• Flemming (1882) termo mitose, divisão mitótica foi mais bem estudada em animais e vegetais.

• Weismann (1887) a partir de seus trabalho, relação com a herança

• Redescobrimento das leis de Mendel (1900), “Teoria cromossômica da herança” por Sutton e Boveri em 1902.

• Conseqüência: citologia e a genética sobrepõem seus conhecimentos na área denominada CITOGENÉTICA.

CITOGENÉTICA: compreende todo e qualquer estudo relativo ao cromossomo isolado ou em conjunto, condensado ou distendido, tanto no que diz respeito a sua morfologia, organização, função e replicação, quanto a sua variação e evolução.

(Guerra, 1988)

Análise de Cromossomos

• Células em divisão → Mitose

• Metáfase → cromossomos com grau máximo de condensação

• Tecidos de crescimento rápido → sangue, medula óssea, rins, etc.

Técnica de Obtenção de Cromossomos

• Obtenção Direta → extração do tecido

• Obtenção Indireta → cultura de células

TÉCNICA IN VITRO:

Cultura de linfócitos

Coleta do sangue

- Separação do sangue em 3 fases:

Hemáceas

Papa leucocitária

Região Líquida

Sangue semeado no meio de cultura

- Aplicar a papa leucocitária - Meio de cultura contendo fitohemaglutinina- Estimula crescimento de linfócitos T

Meio + sangue naestufa

- 3 dias de crescimento em estufa a 37ºC- Estímula divisão celular

Material na estufa 37oC

Aplicação de Colchicina:- “Antimitótico”- Impede ligação do fuso mitótico- Célula não sofre divisão

Aplicação de Solução Hipotônica:

- Osmose- Aumenta tamanho da célula- Mais fácil de espalhar e visualizar o material

Preparo do material para centrifugação

Fixação:

- Solução de álcool + ácido acético = FIXADOR

- Limpa o material

- Fixa a célula na fase desejada

Montagem de Cariótipos

a

m

st

sm

Cariótipo – grego = cerne (conteúdo do núcleo)- Disposição dos cromossomos recortados

OrdemTamanhoFormato dos cromossomos

Formato dos Cromossomos

Centrômero

Braço curto (p)Francês - petite

Braço longo (q)Letra seguinte do alfabeto

Classificação dos Cromossomos

TIPO CROMOSSÔMICO RAZÃO DE BRAÇOS

Metacêntrico (m) RB = 1,00 – 1,70

Submetacêntrico (sm) RB = 1,71 – 3,00

Acrocêntrico (a) RB = 3,01 – 7,00

Telocêntrico (t) RB > 7,01

Razão de braços – q/p

Classificação dos Cromossomos

- Metacêntrico: possui braços aproximadamente do mesmo tamanho; - Submetacêntrico: possui um dos braços menor que o outro;- Acrocêntrico: possui um dos braços muito pequeno em relação ao outro;- Telocêntrico: possui apenas um braço, pois o centrômero se localiza na

extremidade do filamento do cromossomo.

Avestruz : 2n= 22

Sapo: 2n = 26

Peixe : 2n = 56

Vegetal 2n = 16

Cariótipo Humano

Grupo A: (cromossomos 1, 2 e 3), meta e submetacêntricos

Grupo B: (cromossomos 4 e 5), submetacêntricos

Grupo C: (cromossomos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 e cromossomo  X), submetacêntricos

Grupo D: (cromossomos 13, 14 e 15), acrocêntricos

Grupo E: (cromossomos 16, 17 e 18) submetacêntricos

Grupo F: (cromossomos 19e 20), metacêntricos

Grupo G: (cromossomos 21, 22 e cromossomo Y), acrocêntricos

BANDAMENTOS

CROMOSSÔMICOS

Qual a importância dos bandamentos cromossômicos?

• Os bandamentos cromossômicos ampliaram em muito os horizontes da citogenética, sendo primeiramente utilizados para auxiliar no pareamento.

• Em um segundo momento, as diferentes técnicas de bandamento passaram a auxiliar na detecção de rearranjos (duplicações, deleções, inversões, translocações) que dificilmente seriam detectados com a técnica convencional.

Por exemplo:- Humano: identificar alterações entre cromossomos do grupo D distinguir a trissomia do 21 da trissomia do 22

- Evolução: Cariótipo Humano X Primatas (chimpanzé, gorila e orangotango)

• Bandamento NOR

• Bandamento – C

• Bandamento – G

• Bandamento – R

• Bandamento – Q

Colocação Convencional por Giemsa

- Gustav Giemsa

- Tipo de coloração mais comum

- Não é intercalante de DNA, cora na sua totalidade

- Técnica utilizada para visualizar forma e número de cromossomos

Bandamento - G

- Corante Giemsa

- Essa técnica é a mais utilizada entre os bandamentos

Permite visualizar as regiões que se condensam mais cedo durante a prófase (regiões escuras) e possuem uma constituição AT-rica, enquanto os segmentos negativos para banda-G (regiões claras) são condensados tardiamente na prófase e são ricos em bases GC.

Genes Housekeeping X Genes Tecido-específicos

Cariótipo G – bandado

Banda G - morcego

Bandamento - Q

- Essa foi a primeira técnica de bandeamento, a qual foi descrita por Caspersson et al. (1968) para cromossomos humanos

- Essa técnica utiliza corantes fluorescentes para induzir o bandeamento

- O primeiro fluorocromo utilizado foi a quinacrina mostarda, o qual deu o nome para a técnica

- O padrão de bandas – Q está relacionado ao padrão de replicação do DNA - SEMICONSERVATIVO

Cariótipo Q – bandado

Bandamento - R

-Também conhecido por Banda Reversa

- Esse bandeamento ocorre devido ao tratamento do material em alta temperatura, o que induz a desnaturação de proteínas e do DNA de constituição AT-rica, mantendo o DNA GC-rico com a configuração original

- O padrão de bandamento é revelado devido a maior interação do corante às regiões desnaturadas (AT-rica)

- Pode ocorrer a utilização tanto de corantes fluorocromos (acridina laranja) como de convencional (Giemsa)

Bandamento - NOR

- As regiões cromossômicas associadas ao nucléolo.

- Cada organizador nucleolar corresponde a um agrupamento de genes de rRNA repetidos em tandem em um cromossomo.

- A concentração dos genes de rRNAs em tandem, juntamente com a transcrição intensiva dos mesmos, são responsáveis pela criação da morfologia característica dos nucléolos

RONs: impregnação pelo nitrato de prata, não é específico ao DNAr, mas às proteínas acídicas (pré-rRNA) Atividade gênica

Impregnação pelo nitrato de prata - Humano

RON - roedor

RON - Morcego

Bandamento - C

- Este tipo de Bandamento mexe com a estrutura dos cromossomos, devido a uma série de banhos que são feitos na lâmina.

- O padrão de bandas evidencia as regiões de heterocromatina constitutiva presente na espécie.

• Banda C de cariótipo humano

Cariótipos de Astyanax fasciatus submetido ao bandamento C

Fluorocromos

- Corantes fluorescentes.

- Corantes podem marcar regiões específicas; utilizar sondas específicas, etc.

- Visualizados em comprimentos de onda específicos.

Eyprepocnemis plorans – gafanhoto (DAPI)

CromomicinaA3

DAPI

Rineloricaria latirostris – 12 cm

• Sonda Telomérica em humanos