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ANDRESSA REGINATO

“MODULAÇÃO DE AUTOFAGIA NA PROLE DE ANIMAIS

SUBMETIDOS À DIETA HIPERLIPÍDICA NA VIDA

INTRAUTERINA, LACTAÇÃO E VIDA ADULTA”

LIMEIRA

2015

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Este e todos os outros trabalhos que farei em minha vida sempre serão dedicados a

minha amada mãe e amado namorado que me amam e apoiam incondicionalmente em

todos os momentos de minha vida.

DEDICAÇÃO

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AGRADECIMENTOS

Seres humanos são especiais e únicos, e apesar de todas as transgressões que

existem no mundo, eu sou uma pessoa muito abençoada por estar rodeada de pessoas boas

que me influenciam de maneira positiva seja me alegrando, me apoiando, me amando e me

inspirando. E são todas essas pessoas que eu agradeço todos os dias, pois a vida sem elas

não faria sentido. Qual o sentido de uma alegria se você não pode compartilha-la? Como

sair da tristeza sem aquele ombro amigo ou apoio? Como divulgar os conhecimentos que a

ciência proporciona sem estudantes e pacientes que dão sentido a tudo?

Quando escolhi a nutrição como profissão eu jamais imaginaria a imensidão de

satisfação que essa profissão me traria toda vez que vejo o olho de alguém brilhar com

algum conceito que ensino, ou quando o meu olho brilha toda vez que aprendo coisas

novas a respeito da maravilhosa máquina eficiente que é o corpo humano. E, por isso eu

agradeço todas as pessoas que contribuíram para que meu caminho chegasse até aqui e

também para que eu continue tendo forças para traçá-lo.

À minha mãe que me deu a vida e que é capaz de me amar incondicionalmente eu

sou grata todos os dias! Como toda mãe, ela me apoia quando sorrio ou choro, me consola,

me faz rir... Sua dedicação e preocupação me tornou o que sou hoje, e me influencia a criar

o que serei amanhã. Por isso me esforço tanto para nunca descontentá-la e fazê-la feliz!! Te

amo mãe! Agradeço também por você possuir irmãos maravilhosos que sempre me

apoiaram como tios dedicados que me inspiram e apoiam! Ao meu pai agradeço pelas

lembranças de uma infância feliz, pelo carinho e diversão, e também por toda refeição

deliciosa quando vou à sua casa!

Ao meu amado namorado que já está comigo há mais de 7 anos, agradeço por me

apoiar e estar sempre ao meu lado nos momentos bons e ruins. Você participou do meu

crescimento como pessoa e isso me possibilitou correr atrás do que eu acho que seja

importante para mim. Todas as vezes que entro em conflito, é com você que eu conto! Te

amo muito! Sou muito grata por você ter surgido em meu caminho nesse mundo, e, por

dividir a vida comigo e minha mãe daqui para até quando Deus permitir.

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A vida me presenteou também com amigos que transformam a minha vida em

alegria quando estamos juntos (e mesmo separados!). À querida “primamiga” que na

verdade é uma irmã, Karina, agradeço por ter feito a minha infância e adolescência

completa de risadas, e por me fazer sentir que mesmo longe, somos uma só! As queridas

amigas que a faculdade de nutrição me trouxe, Ariadne Cecílio, Mariana Tavares, Thais

Cardenuto e Thaís Crivello, nem tenho palavras a não ser dizer o quanto amo vocês. Vocês

transformaram a minha graduação em uma aventura, e, vocês foram fonte de risos e apoio

nessa nova fase de amadurecimento profissional e pessoal que foi o mestrado! Mari,

obrigada por se tornar a minha salvadora de insetos oficial, e, por entender que eu durmo

cedo e por me ensinar a ter esperança no fim do dia para encarar o amanhã! Aliás, Yura,

obrigada pelas risadas à noite e por me ensinar a fazer a reciclagem, rs!

Um agradecimento especial vai para a Thaís de Fante. Você se tornou uma segunda

irmã que não tive também! Desde a graduação ao meu lado, fazendo aquelas piadas que só

você sabe fazer e que quem escuta não imagina que saiu de você. Compartilhando todos os

principais momentos e angústias da minha vida, sempre falo a você, e hoje falo mais uma

vez, você é uma das pessoas que me faz seguir em frente! Tha, enfim muito obrigada por

estar ao meu lado sempre ok? E nossa já está bem extenso o seu parágrafo, mas eu não

posso deixar de agradecer você e sua mãe pelo meu quartinho e pelas comidas enquanto eu

não tinha um lar em Limeira!

Aos queridos colegas do laboratório LABDIME! Aos que já se foram do laboratório,

aos que ainda estão no laboratório, e aos que virão! O nosso laboratório repleto de presença

feminina é uma família que nos proporciona muito crescimento profissional e pessoal

também! Aquela recém- formada que entrou há 2 anos não é a mesma de hoje e nem será a

mesma amanhã. Toda a experiência no dia a dia com os projetos, aulas e reuniões

contribuíram (e contribuem) para a formação do meu caráter e amadurecimento

profissional e pessoal! Por isso agradeço a todos pela contribuição!

Tenho uma imensa admiração pela educação; por todos os educadores em geral. O

professor é quem ajuda a formar o caráter do aluno; é o professor que transmite o

conhecimento para que esse aluno decida a profissão; o professor da área da saúde ensina

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ao aluno como ensinar e tratar o futuro paciente, e, também ensina como esse aluno pode

melhorar o seu dia a dia com escolhas saudáveis! E, isso é um ciclo que deveria ser mais

valorizado! Pois os professores são aqueles que inspiram os alunos, e, inspiração essa que

eu carreguei comigo desde criança por todos os professores principalmente os de ciências,

biologia e história que passaram por meu caminho. E, isso não foi diferente quando cheguei

à graduação e pós- graduação! Agradeço com muito carinho a inspiração que vocês me

trouxeram caros queridos professores: Adriane Antunes, Adriana Torsoni, Dennys Cintra,

Fernando Simabuco, Josely Rimoli, Márcio Torsoni, Marciane Milanski, Maria Carolina

Mendes, Patrícia Prada, Rosângela Bezerra, e, todos os outros que trilharam o meu

caminho!

Por fim, mas não menos importante, eu agradeço à minha querida orientadora

Marciane Milanski pela oportunidade que me concedeu para seguir um caminho tão

importante em minha vida desde o TCC e também da supervisão de estágio, só ela sabe o

quão importante ela se tornou para mim desde aquele período! Possui personalidade

animada que contagia todos ao redor, e que motiva você a seguir em frente sempre. Uma

pessoa muito boa com o próximo, que esbanja gentileza e educação! Por isso, tenho certeza

que tive (e tenho) influência positiva o suficiente para estar sempre em busca de novos

conhecimentos e experiências que me realizem profissionalmente e pessoalmente!

Aos órgãos de fomento Faepex e Fapesp, agradeço por possibilitarem a realização

da pesquisa.

Obrigada!

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“Ensinar exige compreender que a educação é uma

forma de intervenção no mundo”

(Paulo Freire, 1968)

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RESUMO:

Na última década estudos em modelos animais na vida adulta retrataram que obesidade

e a sobrecarga de lipídeos são fatores que resultam no comprometimento da autofagia,

um processo de degradação lisossomal essencial para a manutenção da homeostase

celular. A autofagia é, portanto, responsável pela degradação e reciclagem de

componentes citoplasmáticos como organelas senescentes, proteínas agregadas ou mal

formadas, microrganismos invasores e macromoléculas. Apesar do conhecimento acerca

do prejuízo na atividade autofágica no contexto da obesidade, alterações na homeostase

deste processo na prole de mães obesas ainda não foram investigadas. Neste estudo, foi

avaliada a hipótese de que a obesidade materna induzida por dieta hiperlipídica (DH)

seria capaz de modular proteínas da via autofágica no hipotálamo e no fígado da prole

de camundongos. Embora sem nenhuma alteração na atividade de autofagia no

hipotálamo, a prole de mães obesas (HFD-O) ao nascimento (d0) apresentou prejuízo

nos marcadores de autofagia no fígado representado por aumento no conteúdo proteico

de p62 e diminuição no conteúdo proteico de LC3-II. Ao desmame (d18), a prole HFD-O

apresentou as mesmas alterações no conteúdo proteico de tais marcadores de autofagia,

porém agora em ambos os tecidos (fígado e hipotálamo) quando comparados à prole de

mães magras (SC-O). Após o desmame, a prole de mãe controle e a prole de mãe obesa

receberam dieta controle até a vida adulta (d82), caracterizando os grupos OC-C e OH-C

respectivamente. Nessa condição não houve modulação dos marcadores de autofagia

em nenhum dos tecidos avaliados, sendo que somente a reexposição à DH (dos 42 dias

até 82 dias) que originou o grupo OH-H foi responsável por alterar o conteúdo proteico

dos marcadores de autofagia tanto em fígado quanto em hipotálamo, quando

comparados aos animais com DH apenas na vida adulta (OC-H). Assim, parece que o

contato direto ou indireto com a DH é essencial para a modulação negativa dos

marcadores de autofagia na prole de mães obesas. Em conclusão, a prole de mãe obesa

apresentou comprometimento precoce de marcadores de autofagia no fígado e no

hipotálamo, o que pode estar associado ao desenvolvimento de distúrbios metabólicos

na prole na idade adulta.

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ABSTRACT:

In adulthood, obesity and lipids overload constitute factors that result in impairment of

autophagy, a lysosomal degradation process essential for maintaining cellular

homeostasis. Thus, autophagy is responsible for degradation and recycling of

cytoplasmic components as senescent organelles, aggregated proteins or proteins poorly

formed, microorganisms invaders and macromolecules. It is known that obesity and the

use of high fat diet (HFD) have a negative impact on cellular homeostasis. However,

modulation of autophagy in the offspring of obese mothers has yet to be investigated.

This study tested the hypothesis that maternal obesity induced by HFD would be able to

modulate proteins of autophagy in the hypothalamus and liver of mice offspring. At birth

(d0), the offspring from obese dams (HFD-O) exhibited prejudice in autophagy markers

represented by an increase in content protein of p62 and decrease in LC3-II, however this

alteration was observed only in the liver. After weaning (d18) both tissues (liver and

hypothalamus) had compromised autophagy markers. The animals receiving control diet

after weaning until adulthood (d82) had no impairment of autophagy proteins in both

tissues examined (OC-C vs. OH-C groups). However, when the animals were re-exposed

to HFD (from 42 days until 82 days) they had alteration in protein content of autophagy,

when compared to animals with high fat diet without re-exposure (OH-H vs. OC-H). Thus,

the use direct or indirect of HFD seems to be essential for negative modulation of

autophagy markers. In conclusion, the offspring of obese mothers presented early

impairment of autophagy proteins in the liver and hypothalamus, which may be

associated with the development of metabolic disorders in the offspring in adulthood.

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LISTA DE ABREVIATURAS

3MA- 3-methyladenine

AgRP- Peptídeo relacionado ao agouti

AKT- Proteína quinase B

AMPK- Proteína quinase ativada por AMP

ARC- Núcleo arqueado

Atgs- Autophagy related genes

CART- Peptídeo regulado por cocaína e anfetamina

CMA- Autofagia mediada por chaperonas

DH- dieta hiperlipídica

DHGNA- Doença hepática gordurosa não alcoólica

DMN- Núcleo dorsomedial

ERE- Estresse de retículo endoplasmático

GLP-1- Glucose-like peptide 1

GLUT-1- Transportador de glicose 1

IKK- Quinase do inibidor kappa B

IL-1- Interleucina 1 ‘beta’

IκB- Inibidor kappa B

LC3- Microtubule-associated protein 1 light chain 3

LHA- Área hipotalâmica lateral

LIR- Domínio de ligação com LC3

mTORC1- Mammalian target of rapamycin (serine/threonine kinase) 1

MVMs- Microvilosidades de membranas plasmáticas

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NPY- Neuropeptídio Y

p62 ou SQSTM- Sequestosome 1

POMC- Pro-opiomelacortina

PVN- Núcleo paraventricular

TLR4- Toll-like receptor 4

TNF- Fator de necrose tumoral ‘alfa’

UBA- Domínio de ligação com proteínas ubiquitinadas

ULK1- proteína treonina-serina quinase 1

VMN- Núcleo ventromedial

Vps34- phosphatidylinositol 3-kinase

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LISTA DE FIGURAS

Figura 01. Etapas da macroautofagia ................................................................... 08

Figura 02. Via de sinalização da macroautofagia ................................................. 11

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SUMÁRIO

INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 01

Autofagia e obesidade .......................................................................................... 07

OBJETIVOS .......................................................................................................... 14

Objetivo Geral ........................................................................................................ 14

Objetivo Específico ................................................................................................ 14

CAPÍTULO 1- Artigo referente à tese ................................................................. 15

DISCUSSÃO E CONCLUSÃO .............................................................................. 44

REFERÊNCIAS ..................................................................................................... 50

ANEXOS ............................................................................................................... 63

xxiv

1

1. INTRODUÇÃO

A modernização trouxe consigo alterações permanentes no estilo de vida

e perfil epidemiológico da sociedade. Diante disso, impulsionado principalmente pelo

crescimento econômico, a dieta e o estilo de vida mudaram significativamente em muitos

países (Monteiro et al. 2004), desencadeando uma pandemia global de obesidade

(Caballero, 2007; Swinburn et al. 2011). Relatório recente publicado pela OMS notificou

que em 2008, 10% dos homens e 14% das mulheres no mundo encontravam-se obesas,

comparado com 5% dos homens e 8% das mulheres em 1980 (WHO, 2012). No Brasil,

essa situação não é diferente sendo que 17,5% dos homens e mulheres na fase adulta

apresentavam IMC ≥ 30 kg/m² em 2013 (Brasil, 2014).

Definida pela presença de índice de massa corporal (IMC) acima de 30

kg/m² e acúmulo excessivo de gordura corporal em nível que compromete a saúde dos

indivíduos (WHO, 2000), a obesidade esta associada a efeitos adversos à saúde uma

vez que há correlação positiva entre o aumento de IMC e desenvolvimento de algumas

doenças como diabetes do tipo 2 (Guilherme et al. 2008), hipertensão (Sowers et al.

2003) e alguns tipos de câncer (Calle & Kaaks, 2004). Assim essas características são

preocupantes tanto do ponto de vista de saúde individual quanto da saúde coletiva e

contribuem para a ampla discussão acerca da gênese desta doença no meio científico.

Na etiologia da obesidade podem ser citados raros casos de defeitos

monogênicos (Farooqi & O’Rahilly, 2006) uma vez que em sua grande maioria a

obesidade se instala após um quadro clínico em que ocorre uma combinação complexa

de múltiplos fatores ambientais e fatores genéticos (Considine et al. 1996) responsáveis

por desencadear uma ruptura anômala na homeostase energética. Diante disso, há o

desequilíbrio entre ingestão alimentar e gasto energético culminando no

comprometimento imunológico e neuroendócrino (Friedman & Halaas 1998; Flier, 2004).

Contudo, na última década tornou-se aparente que o ambiente de desenvolvimento no

início de vida, em especial a nutrição precoce, proporcionam efeitos de longa duração

nas vias metabólicas relacionadas ao balanço energético direcionando o organismo a

uma condição de maior à susceptibilidade ao desenvolvimento de um largo espectro de

condições na vida adulta (Godfrey & Barker, 2001).

2

Assim, períodos críticos de desenvolvimento parecem proporcionar

modificações epigenéticas às quais vêm emergindo no contexto do entendimento acerca

da pandemia global da obesidade. O termo epigenética foi utilizado pela primeira vez

pelo pesquisador Conrad Waddington (1940) (Apud Ozzane, 2015) para definir

“interações entre o ambiente de desenvolvimento com os genes que levam a

modificações no fenótipo”. Os processos que medeiam às interações epigenéticas são

atualmente conhecidos e incluem alterações químicas na estrutura do DNA e histonas, e

envolvem mecanismos como metilação, modificações pós traducionais de histonas

(metilação, fosforilação, acetilação e ubiquitinação) e modulação da expressão de

pequenos RNAs não codificantes (microRNAs) (Vaiserman, 2014).

Diante a isso, estudos epidemiológicos e em modelos experimentais

reforçam que a composição corporal e a dieta materna são fatores determinantes nas

características dos filhos (Guo & Jen, 1995; Godfrey & Barker, 2001). A presença de

estresse ou estímulo negativo experimentado durante o desenvolvimento pode provocar

alterações permanentes na organização dos tecidos e órgãos, consequentemente

levando ao comprometimento irreversível na estrutura e função dos mesmos no

organismo (Godfrey & Barker, 2001; Martin-Gronert & Ozanne, 2013).

Neste contexto, tem-se que o conceito de “programação metabólica”

relaciona que as doenças metabólicas também têm sua origem no início da vida

intrauterina e pós-natal por meio da dieta consumida durante os períodos de gestação e

lactação. Assim, ambos os estados nutricionais da mãe (desnutrição e obesidade) podem

desempenhar um papel direto na transmissão de traços obesogênicos e diabetogênicos

de geração em geração (Hales & Baker, 2001).

Os primeiros relatos de estudos de programação metabólica envolveram

indivíduos na fase adulta nascidos nos anos 1944-45 durante o período de inverno na

Holanda em que a população de diferentes classes sociais da região oeste do país

vivenciou um período de escassez de alimentos. Com essa situação, cientistas tiveram

uma oportunidade única para estudar o efeito da desnutrição durante a gestação em

humanos (Roseboom et al. 2001). A exposição à fome durante qualquer estágio da

gestação foi associada com intolerância a glicose, entretanto, quando essa exposição

3

ocorreu no início da gestação, houve maior prevalência de doenças coronárias,

alterações no perfil lipídico e incidência de obesidade na vida adulta (Roseboom et al.

2006). Frente a tais achados, acredita-se que o início da gestação em humanos é um

período importante e vulnerável para os efeitos da desnutrição na saúde dos filhos

(Roseboom et al. 2006).

Os modelos animais fornecem uma ferramenta valiosa para estudar os

mecanismos subjacentes envolvidos na programação metabólica. Roedores e primatas

não humanos (NHP) são mamíferos com sistemas de embriologia, anatomia e fisiologia

semelhantes aos seres humanos o que possibilita maior compreensão dos mecanismos

envolvidos na programação fetal (Williamns et al. 2013).

Assim, para simular a restrição alimentar em períodos críticos ao

desenvolvimento, muitos estudos utilizaram extensivamente modelos experimentais de

ingestão materna pobre em proteínas (Ozanne & Hales, 1999) sendo que já foram

encontrados aumento de gotículas de lipídeos no fígado durante a vida fetal e após o

nascimento da prole de ratos. Acompanhando tais resultados, houve também aumento

na expressão de enzimas lipogênicas, induzindo a hipótese de que a esteatose na vida

adulta é programada durante a gestação (Yamada et al., 2011). Latorraca e

colaboradores (1998) verificaram que a prole de mães desnutridas apresentou

diminuição no peso do pâncreas e na secreção de insulina em resposta a glicose, o que

contribuiu para o desenvolvimento de alterações metabólicas como aumento de ácidos

graxos livres no soro desses animais.

Entretanto, ao analisar o perfil epidemiológico da população mundial nos

dias atuais, é possível verificar o significante aumento na prevalência da obesidade e

diminuição da prevalência da desnutrição em grande parte dos países desenvolvidos e

em desenvolvimento. Conforme descrito acima, isso pode ser uma consequência

metabólica do desenvolvimento em condições intrauterinas adversas aliadas ao

frequente consumo na sociedade ocidental de dietas hipercalóricas, ricas em gordura

saturada, carboidratos simples e altamente palatáveis, qualificando-se como outro

importante fator epidemiológico na predisposição para a obesidade (Galgani & Ravussin,

2008).

No Brasil, 16,9% das mulheres com 20 ou mais anos de idade

4

apresentavam-se obesas entre os anos de 2008 a 2009 (Brasil, 2010), evidenciando que

a prevalência da obesidade em mulheres em idade reprodutiva aumenta a cada ano

(Guelinckx et al. 2008). Assim, a obesidade materna é alvo importante de atenção para

os planejamentos em saúde pública em nível nacional e internacional já que esse

excesso nutricional representa grande impacto ao sistema de saúde.

Do ponto de vista clínico, as gestantes com sobrepeso e obesidade

apresentam alto risco para o desenvolvimento de complicações médicas e obstetrícias

(Yogev et al. 2009; Triunfo & Lanzone, 2014). Pesquisas revelaram que 15- 40% das

gestações são complicadas pela obesidade materna, com destaque para o aumento na

frequência de situações como a diminuição na detecção de má formação fetal em

exames de imagem devido a menor visibilidade proporcionada pelo excesso de tecido

adiposo materno; defeitos na formação do tubo neural; maior probabilidade de

nascimento precoce em adição ao aumento na mortalidade materno-fetal (ACOG, 2013;

Flenady et al. 2011).

Adicionalmente, o ambiente obesogênico materno representa outra

condição adversa que contribui para o surgimento do fenótipo obeso na prole.

Corroborando essas ideias, Samuelsson e colaboradores (2008) encontraram que a

obesidade materna durante a gestação em camundongos foi responsável por alterações

em parâmetros metabólicos na prole como hiperfagia e aumento na adiposidade, além

da diminuição na atividade locomotora acompanhada por aumento na glicose de jejum

quando comparados aos animais controle. Outros estudos apontaram que o uso de dieta

hiperlipídica (DH) durante a gestação e a lactação proporcionou efeitos adversos na

prole independente da presença ou não da obesidade da mãe (Williamns et al, 2013).

Ressalta-se que os mecanismos moleculares envolvidos no

comprometimento dos parâmetros metabólicos em modelos experimentais de obesidade

materna induzida por DH ainda são pouco conhecidos. O transporte de nutrientes por

meio da placenta parece ser um dos primeiros fatores envolvidos no surgimento do

fenótipo obeso na prole. De fato, Jones e colaboradores (2009) verificaram que o uso de

DH antes e durante a gestação de camundongos foi responsável pela super-regulação

do transportador de glicose 1 (GLUT1) em microvilosidades de membranas plasmáticas

(MVMs) isoladas da placenta (Jones et al. 2009). Estudo em humanos, estudo conduzido

5

por Jansson e colaboradores (2013) encontrou que as MVMs isoladas da placenta

também apresentaram aumento na permeabilidade de nutrientes representado pela

super-regulação de isoformas específicas de transportadores de aminoácidos, o que

pareceu contribuir para o aumento do peso do neonato.

Em roedores na fase adulta, houve aumento de marcadores inflamatórios

como p-IKK acompanhado pela diminuição na fosforilação da proteína AKT em tecido

hepático na prole de mães obesas quando comparados à prole controle (Ashino et al.

2012). Em adição, tem-se que o sistema nervoso central também está comprometido na

prole de mães obesas, o que evidencia o papel da nutrição neonatal na programação das

redes hipotalâmicas ligadas ao controle da ingestão alimentar e gasto energético na vida

adulta (Bouret, 2009).

O peso corporal é regulado por uma interação complexa entre hormônios

e neuropeptídeos, sob o controle principal do hipotálamo (Woods et al. 1998; Schwartz et

al. 2000), região do sistema nervoso central responsável por receber e integrar

informações periféricas sobre o estatus energético corporal. Por sua vez, o hipotálamo é

subdividido em núcleos de interconexão, incluindo o núcleo arqueado (ARC), núcleo

paraventricular (PVN), núcleo ventromedial (VMN), núcleo dorsomedial (DMN) e área

hipotalâmica lateral (LHA) (Schwartz et al. 2000).

A região do ARC no hipotálamo merece destaque para as funções de

controle de ingestão alimentar, balanço energético e metabolismo (Elmquist et al. 2005;

Velloso, 2009). Duas grandes populações neuronais do ARC estão implicadas nessa

regulação. A primeira composta por neurônios tipo NPY (neuropeptídio Y) e AgRP

(peptídeo relacionado ao agouti) esta relacionada com o aumento da ingestão de

alimentos. A segunda população engloba neurônios do tipo POMC (pro-opiomelacortina)

e CART (Peptídeo regulado por cocaína e anfetamina), e, esta relacionada com a

diminuição da ingestão alimentar (Flier, 2004; Elmquist et al. 2005, Araújo et al, 2010).

Os hormônios insulina e leptina ao atravessarem a barreira

hematoencefálica agem de forma combinada ao incitar receptores dos núcleos

hipotalâmicos na sinalização da ingestão alimentar (Velloso, 2009). A leptina possui

características estruturais de citocina, sendo produzida pelo tecido adiposo branco em

resposta ao armazenamento de gordura ou ao excesso de ingestão alimentar, e,

6

representa também um importante marcador da quantidade de tecido adiposo (Elmquist

et al, 2005). A insulina é produzida pelas células beta do pâncreas, e a sua concentração

sérica aumenta, principalmente, em resposta aos níveis crescentes de glicose plasmática

(Woods et al. 1998).

Os sinais de outros hormônios gastrointestinais (como colecistocinina e

grelina) representam importantes sinalizadores periféricos da disponibilidade de

nutrientes e interagem com as vias de sinalização celular da leptina e insulina,

completando a regulação do comportamento alimentar (Fonseca-Alaniz et al. 2006).

Conforme citado acima, dados de diferentes modelos animais suportam a

ideia de que o ambiente pré-natal é crítico ao balanço energético (Levin, 2006; Bouret et

al. 2009). O desenvolvimento dos circuitos hipotalâmicos em roedores acontece

principalmente em dois períodos críticos que englobam a metade da gestação e o início

da vida pós-natal durante as duas primeiras semanas de vida. Em contrapartida, em

primatas, grande parte do conhecimento do desenvolvimento das vias neurais vem

sendo baseado em estudos de primatas não humanos, sendo que esses circuitos

parecem se desenvolver ainda durante a vida intrauterina (Bouret et al. 2009).

Os níveis circulantes de hormônios como insulina e leptina parecem ser

fatores chave para esse evento (Bouret et al. 2009) sendo que, por exemplo, injeções

maternas de insulina em animais magros durante o terceiro semestre de gestação

induziram aumento na massa corporal na prole a partir de sete semanas de idade

quando comparado a prole controle que recebeu injeções de salina. Interessantemente,

ao nascer e durante a lactação a massa corporal desses animais não diferiu dos animais

controle (Jones et al. 1990).

Em adição, a indução de deficiência materna de insulina por meio de

injeções de streptozotocina durante a gestação provocou na prole alterações como

aumento na massa corporal, aumento na ingestão alimentar, alterações dos níveis de

glicose de jejum acompanhado por aumento de insulina e leptina séricas, porém com

redução na habilidade da leptina em ativar a sinalização intracelular no ARC. Houve

também redução nas projeções neuronais a partir do ARC para o PVN durante a vida

adulta da prole (Steculorum & Bouret, 2011). Complementarmente, a leptina neonatal

parece ser importante fator trópico de regulação na homeostase energética sendo que

7

animais com deficiência desse hormônio apresentaram interrupção nas projeções

neuronais a partir do núcleo arqueado o que prejudicou a regulação do peso corporal na

vida adulta (Bouret et al. 2004).

O período pós-natal precoce rico em nutrientes caracteriza-se como

outro importante interferente para as modificações nas regiões regulatórias do

hipotálamo, sendo que a redução de ninhada em ratos após o nascimento ampliou o

acesso à alimentação, resultando em superalimentação pós-natal e além de interferir no

desenvolvimento de características como hiperfagia, hiperleptinemia e hiperinsulinemia

na prole em sua vida adulta (Davidowa & Plagemann, 2007).

A manutenção da homeostase energética exercida pelo hipotálamo

parece receber influência direta de outra importante via celular conhecida como

autofagia. No contexto da obesidade materna e do aumento na permeabilidade de

nutrientes na placenta em resposta à DH, destacamos que a modulação de autofagia na

prole caracteriza-se como uma importante questão a ser explorada.

A autofagia e obesidade

O termo autofagia foi primeiramente definido pelo pesquisador Cristian

de Duve há mais de 50 anos quando o mesmo foi ganhador do prêmio Nobel pela

descoberta dos lisossomos. Os lisossomos são organelas responsáveis pela maior parte

da degradação celular nos organismos eucarióticos, sendo que essa degradação é feita

por três vias distintas: fagociotose, endociotose e autofagia (De Duve, 1983).

Por sua vez, a autofagia é responsável pela degradação e reciclagem de

componentes citoplasmáticos como organelas senescentes, proteínas agregadas ou mal

formadas, microrganismos invasores e macromoléculas (Yorimitsu & Kliosnky, 2005;

Mizushima & Komatsu, 2011). Existem três formas de autofagia: macroautofagia,

microautofagia e autofagia mediada por chaperonas (CMA) (Glick et al. 2010; Mizushima

& Komatsu, 2011) sendo que elas se diferem quanto as suas funções fisiológicas e a

maneira de transportar o material a ser degradado para o interior do lisossomo

(Mizushima & Komatsu, 2011).

A macroautofagia (a partir daqui citada apenas como autofagia) é

8

responsável por mais de 90% da autofagia celular, sendo por isso a mais estudada e

conhecida (Behrends, 2010). Nela há a formação de uma dupla membrana que circunda

o conteúdo a ser degradado, dando origem à estrutura conhecida por autofagossomo, o

qual posteriormente se fundirá ao lisossomo, que por sua vez será denominado

autofagolisossomo. No autofagolisossomo as macromoléculas, organelas e

microrganismos são degradados pelas enzimas lisossomais (Glick et al. 2010) e ocorre o

fim do processo (Mizushima & Komatsu, 2011) (Figura 01).

Figura 01. Etapas da macroautofagia. Adaptado Lavallard & Philippe Gual, 2014.

Existem evidências de que a autofagia seja regulada por mais de 30

genes Atgs (autophagy related genes) os quais em sua maioria são evolutivamente

conservados entre diferentes espécies (Yordy et al, 2012; Mizushima & Komatsu, 2011).

Ela ocorre em níveis basais na maioria dos tecidos de eucariontes (cataboliza 1,5% de

todas as proteínas celulares por hora) de modo a contribuir para a viabilidade celular e

possibilitar o adequado turnover dos componentes citoplasmáticos (Ameeta, 2005).

Entretanto, a autofagia é largamente reconhecida como um processo induzível em

9

resposta à inanição, fatores de crescimento ou invasão patogênica (Levine, 2005).

Os sinais capazes de levar à indução de autofagia ainda não estão

completamente entendidos (Klionsky, 2005), mas classicamente a via autofágica é

ativada pelo aumento nos níveis circulantes de glucagon ou depleção de aminoácidos

durante a inanição, porém é inibida por aminoácidos e insulina por meio da regulação

negativa exercida pelo complexo mTORC1 e AKT, após a ingestão alimentar (Arsham,

2006). Assim a atividade autofágica flutua conforme os períodos de ingestão alimentar e

inanição (Arsham, 2006). Adicionalmente temos que os níveis intracelulares de nutrientes

como os aminoácidos e glicose podem atuar também diretamente na transcrição de

genes Atgs ou pelo aumento nos níveis de AMPK (proteína quinase ativada por AMP)

respectivamente (Kim & Lee, 2014).

A formação da estrutura do autofagossomo requer ação complexa e

concisa das proteínas Atgs, sendo que o processo é divido nas etapas de indução,

nucleação e alongamento de vesículas autofágicas além de sua fusão com o lisossomo

(Kim & Lee, 2014). A etapa inicial acontece concomitantemente à desfosforilação e

ativação da proteína treonina-serina quinase 1 (ULK1), que por sua vez recruta o

complexo Beclin-1/ Vps34 por meio da fosforilação da proteína Ambra1, desencadeando

a formação do fagófaro (a porção inicial da membrana do autofagossomo) (Mizushima &

Komatsu, 2011; Kim & Lee, 2014). A continuidade na expansão do fagófaro é mediada

pelas proteínas Atgs em dois sistemas principais de conjugação com reações

enzimáticas similares a ubiquitinação de proteínas. Inicialmente, Atg12 é conjugada à

Atg5 por meio da ação de Atg7 (que age como uma enzima de ativação semelhante a

E1) e Atg10 (que age como uma enzima de conjugação semelhante a E2) (Tanida et al,

2001). Posteriormente, o conjugado Atg12- Atg5 se liga à Atg16L para formar o complexo

Atg12-Atg5-Atg16L que participa da conjugação de LC3 (microtubule-associated protein

1 light chain 3) (Fujita et al, 2008).

A proteína LC3, gerada a partir da proteína pró-LC3 citosólica pela ação

da protease Atg4, é conjugada a fosfatidiletanolamida por meio da ação de Atg3, Atg7 e

do complexo Atg12-Atg5-Atg16L. Depois da conjugação, LC3- PE ou LC3-II localiza-se

na membrana do autofagossomo e participa da expansão do mesmo, correlacionando-se

diretamente com o número de autofagossomos formados o que a retrata como um dos

10

principais marcadores de atividade de autofagia celular. Após o término na formação da

estrutura do autofagossomo, o complexo Atg12-Atg5-Atg16L é desfeito e separa-se da

vesícula (Fujita et al, 2008; Mizushima & Komatsu, 2011) (Figura 02A).

Os componentes celulares alvos para a degradação autofágica são

reconhecidos e transportados para a degradação por meio de proteínas adaptadoras

responsáveis pela conexão entre essas duas etapas. A primeira proteína com função

adaptadora identificada foi a proteína p62 (SQSTM1), que possui até o momento

identificados seis domínios necessários para a interação com a maquinaria autofágica e

outras vias de sinalização (Figura 02B).

Assim, a proteína p62 apresenta um domínio UBA (domínio de ligação

com proteínas ubiquitinadas) que se liga aos alvos de degradação e o domínio LIR

(domínio de ligação com LC3), responsável por entregar os alvos à degradação,

desempenhando um papel importante para o fluxo autofágico (Maloney et al. 2013).

Evidências demonstraram que os níveis de p62 são inversamente correlacionados com a

degradação de autofagia, sendo que a perda de genes Atgs ou outros fatores requeridos

para a fusão do autofagossomo com o lisossomo resultam em acúmulo de agregados

marcados por p62 (Maloney et al. 2013).

Por fim, a degradação autofágica finaliza quando o autofagossomo se

funde aos lisossomos de modo dependente à presença da proteína de membrana

lisossomal LAMP2. Neste momento, as enzimas lisossomais proporcionam o ambiente

de degradação e reciclagem do conteúdo entregue (Mizushima & Komatsu, 2011).

11

Figura 02. Sinalização intracelular da macroautofagia. Adaptado Lavallard & Philippe

Gual, 2014; Maloney, 2013).

No contexto do desenvolvimento embrionário é crescente o número de

evidências que descrevem a autofagia como via celular essencial para tal período devido

a sua capacidade em direcionar rápidas mudanças celulares permitindo condições

apropriadas para a diferenciação e desenvolvimento (Mizushima & Levine, 2010). De

fato, a ausência de Beclin-1 leva a letalidade precoce (dia embrionário 7.5) (Yue et al.

2003) e a deficiência de Ambra-1 desencadeia defeitos na formação do tubo neural

(Fimia et al. 2007).

Adicionalmente, modelos de knockout para a proteína Atg5 em oócitos

falham em se desenvolver além das fases de 4 a 8 células caso não sejam fertilizados

por espermatozoide de camundongos controle, confirmando que a autofagia é essencial

para a fase de transição de oócito para embrião (Tsukamoto et al. 2008).

Lee e colaboradores (2011) investigaram os efeitos da inibição por 3MA

(3-methyladenine) e indução por rapamicina na atividade de autofagia no

desenvolvimento embrionário in vitro durante o estágio de uma célula até a evolução

12

para blastocisto. Inicialmente encontraram que a expressão de LC3 é abundante no

zigoto e permanece presente em todos os estágios do desenvolvimento. Após o

tratamento com 3MA houve diminuição significativa nas taxas de desenvolvimento e no

número total de células, aliado ao aumento nas taxas de apoptose. Entretanto, apesar do

tratamento com rapamicina não afetar as taxas de desenvolvimento houve redução no

número de células e também aumento nas taxas de apoptose, reafirmando o papel da

modulação de autofagia durante o desenvolvimento embrionário.

Além do papel no desenvolvimento, a autofagia também atua na

homeostase energética, sendo que a privação de nutrientes ativa a autofagia em

neurônios AgRP para a regulação da ingestão e balanço energético, especificamente na

região do ARC (Kaushik et al. 2011). Adicionalmente, tem se que a inibição de autofagia

em neurônios POMC foi responsável por induzir aumento no peso corporal, ingestão

alimentar e diminuição no gasto energético. Além disso, esses animais apresentaram

prejuízos na via de sinalização de leptina (Quan et al. 2012). Ressaltamos assim, que

esses achados demonstram o papel essencial da autofagia para o funcionamento de

neurônios responsáveis pelo controle da ingestão alimentar e gasto energético.

Durante a vida adulta, dados recentes retrataram o comprometimento da

atividade de autofagia nos modelos experimentais de obesidade induzida pelo uso de

DH, fato esse que vêm motivando nos últimos anos os cientistas a investigarem a

modulação da autofagia no contexto da gênese da obesidade. A exposição à DH por

doze semanas levou à indução de inflamação hipotalâmica por meio da ativação de IkB

(inibidor kappa B), interferindo no controle do balanço energético e acelerando o

desenvolvimento da obesidade e co-morbidades associado à diminuição de marcadores

de autofagia no hipotálamo médio basal (Meng & Cai, 2011). Portovedo e colaboradores

(2015) demonstraram que a disfunção na autofagia hipotalâmica após o uso crônico de

DH se deu por efeito direto de ácidos graxos saturados.

Em tecidos periféricos como o fígado, a homeostase na modulação de

autofagia também é crucial para a função normal e prevenção do desenvolvimento de

doenças hepáticas (Czaja et al. 2013). Ezaki e colaboradores (2011) relataram que a

inanição e consequente ativação de autofagia são capazes de liberar aminoácidos no

fígado para serem metabolizados, em parte, pela gliconeogênese o que contribui para a

13

manutenção da concentração de glicose circulante. A autofagia também atua no

metabolismo lipídico hepático ao regular os estoques de lipídeos intracelulares e eliminar

triglicerídeos, o que previne o desenvolvimento de esteatose hepática (Signh et al. 2009).

Já foi demonstrado em hepatócitos que ácidos graxos saturados

suprimem a atividade de autofagia e induzem a apoptose ao passo que ácidos graxos

insaturados parecem induzir a autofagia com mínimos efeitos na indução de apoptose

(Mei et al. 2011).

Outros dados em animais, o experimento de time course durante a

indução de obesidade por DH resultou em comprometimento da autofagia após 16

semanas sendo que ela encontrava-se completamente abolida após 22 semanas. Os

pesquisadores verificaram nesse modelo aumento na protease dependente de cálcio

(Calpain-2), importante para a degradação das proteínas Atg7, Atg5 e Beclin-1, fato este

que culminou na hipótese de que esse mecanismo possa ser importante para a

diminuição da autofagia durante a obesidade (Yang et al. 2010). Adicionalmente, em

modelos experimentais in vivo a DH (60% do total de calorias) também reduziu em 70%

a fusão do autofagossomo com o lisossomo no tecido hepático, levando os autores a

acreditarem que alterações na composição da membrana lipídica tenham influenciado na

redução da autofagia (Koga et al. 2010). Assim, a modulação de autofagia hepática

poderia ser considerada para ser um novo alvo terapêutico no tratamento de doenças

hepáticas relacionadas à obesidade.

Diante do exposto, fica evidente que a obesidade tornou-se um problema

de difícil solução já que os fatores moleculares envolvidos em sua gênese são

complexos e ainda pouco conhecidos. Além disso, a obesidade materna e/ou o excesso

de nutrientes durante períodos críticos de desenvolvimento influenciam negativamente

no fenótipo da prole na vida adulta. Tendo em vista que a autofagia tem sido considerada

como importante sistema para a homeostase celular e para a manutenção das funções

hipotalâmicas e hepáticas na vida adulta, aventou-se a hipótese de que o ambiente

obesogênico durante a gestação e lactação poderiam comprometer marcadores de

autofagia nesses tecidos na prole. Portanto, o nosso objetivo foi avaliar a modulação de

marcadores de autofagia em hipotálamo e fígado da prole de animais submetidos à DH

durante a gestação, lactação e reexposição à DH na vida adulta.

14

1. OBJETIVOS:

2.1 Objetivo Geral:

Avaliar a modulação de autofagia em hipotálamo e fígado da prole de animais da

linhagem Swiss, cujas mães foram submetidas à dieta hiperlipídica na gestação e

lactação.

2.2 Objetivos Específicos:

Avaliar o ganho de peso e adiposidade das mães controles (SC) e mães obesas

(HFD).

Avaliar os parâmetros metabólicos da prole (SC-O e HFD-O) ao nascer (d0) bem

como o conteúdo proteico de marcadores da autofagia no hipotálamo e fígado dos

animais em d0.

Avaliar os parâmetros metabólicos da prole (SC-O e HFD-O) após o desmame

(d18) bem como o conteúdo proteico de marcadores da autofagia no hipotálamo e

fígado dos animais em d18.

Avaliar os parâmetros metabólicos da prole (OC-C vs.OH-C; OC-H vs. OH-H) na

vida adulta (d82) bem como o conteúdo proteico de marcadores da autofagia no

hipotálamo e fígado dos animais em d82.

15

2. Capítulo 01- Artigo Científico

1. TITLE PAGE

Autophagy proteins are modulated in liver and hypothalamus of offspring

from mice with diet-induced obesity

Andressa Reginato¹, Thaís de Fante¹, Mariana Portovedo¹, Natália Ferreira da Costa¹,

Tanyara da Silva Baliani¹, Letícia M. Ignácio-Souza², Lício A. Velloso³, Márcio A. Torsoni¹,

Adriana S. Torsoni¹, Marciane Milanski¹.

¹Faculty of Applied Sciences, State University of Campinas, Campinas, SP, Brazil.

²Faculty of Nutrition, Federal University of Mato Grosso - UFMT - MT, Brazil.

³Departament of Clinical Medicine, State University of Campinas, Campinas, SP, Brazil.

A.R contributed to design research, conduct research, reviewed the literature, conducted

the statistical analysis and wrote the manuscript. T. F; M.P; N.F.C and T.S.B, contributed

to experimental planning and discusses of results. L. M. I.-S.; L. A. V.; M. A. T.; A.S.T and

M.M provided essential reagents, materials and others financial support besides provided

advice regarding about interpretation of the results. L. M. I.-S edited the manuscript. M.

M. was responsible for design research, conduct research, data collection, provided

advice regarding and edited the manuscript.

Abreviated title: Autophagy modulation in hypothalamus and liver offspring

*Corresponding author and person to who reprint requests should be addressed:

Marciane Milanski, PhD. Laboratório de Distúrbios do Metabolismo, Faculdade de Ciências

Aplicadas. Universidade Estadual de Campinas. Pedro Zaccarias, 13484-350, Limeira SP –

Brazil. Telephone: +5519 37016705.

Email: marciane.milanski@fca.unicamp.br

16

2. ABSTRACT

The nutritional excess during pregnancy and lactation has a negative impact on offspring

phenotype. In adulthood, obesity and lipid overload represent factors that compromise

autophagy, a process of lysosomal degradation that is essential for the maintenance of

cellular homeostasis. Despite knowledge of the impact of obesity on autophagy cellular

homeostasis, changes in offspring autophagy from obese dams have yet to be

investigated. In this study, we tested the hypothesis that maternal obesity induced by a

high fat diet modulates autophagy proteins in the hypothalamus and liver of mouse

offspring. At birth (d0), offspring of obese dams showed impaired liver autophagy and

after weaning (d18) both tissues had impairment of autophagy markers. Animals that

received control diet after weaning until adulthood (d82) had no impairment of autophagy

proteins in both tissues analyzed. Overall, this study demonstrates that offspring

autophagy markers are also highly associated with exposure to lipids. In conclusion,

mouse offspring from obese dams show early impairment of altered autophagy proteins in

the liver and hypothalamus which can be associated with metabolic disorders in the

offspring during adulthood.

3. KEYWORDS

High-fat diet, obesity, offspring, autophagy, hypothalamus, liver.

17

4. INTRODUCTION

Despite the knowledge that obesity (body mass index ≥ 30 kg/m²) is a global

pandemic health problem, its worldwide prevalence almost doubled between the years

1980 and 2008 (43). Several studies in recent years describe that prenatal obesity or

malnutrition are highly recognized risk factors for development of chronic diseases in

offspring, creating to the concept of “metabolic programming” (13, 14). This occurs when

an abnormal metabolic environment occur at critical or sensitive periods of development.

During these early periods of "plasticity”, fetal metabolic changes that promote survival in

an inappropriate environment can remain permanent in adulthood. Thus, in adulthood,

after nutritional abundance promoted by consumption of a western diet (which is very

common nowadays), the organism may respond negatively, leading to metabolic

disturbances that promote the development of diseases, such as hypertension, obesity

and diabetes (14, 34, 25).

Autophagy, an important cellular pathway has emerged with implications in the

development of chronic disease. Autophagy is one of the most powerful cell cleaning

systems in which cellular organelles, proteins, and invading microorganisms are

degraded by lysosomes; this maintains a balance between the synthesis, degradation,

and subsequent recycling of cellular components, providing homeostasis and cell survival

(11, 30). Has been shown that autophagy is divided into three types: macroautophagy,

microautophagy and chaperone-mediated autophagy, depending of physiological

functions and the molecular components involved in each of these steps (30, 29, 12, 37).

Macroautophagy (hereafter referred to as autophagy) is responsible more than 90% of

cellular autophagy (3); thus, this paper focuses on this mechanism.

Recent studies have also highlighted the importance of the association between

autophagy and lipid content. High-fat diet (HFD) is responsible for the reduction of

autophagosomes with lysosome fusion suggesting that the lipid composition of

membranes is important in the homeostasis of autophagy (19). Other animal experiments

show that chronic exposure to HFD is associated with inflammation and impairment in

autophagy activity in the region of the basal medium hypothalamus, resulting in changes

in the control of energy balance that is responsible for accelerating the development of

obesity and other associated metabolic disorders (28). Additionally, our group recently

18

reported that hypothalamic autophagy dysfunction occurs after chronic exposure to HFD

by the direct effects of saturated fatty acids (32).

In peripheral tissues, such the liver, autophagy is also crucial for normal function in

addition to preventing the development of liver diseases, such as steatosis and

nonalcoholic fatty liver disease (9). Autophagy inhibition in both hepatocytes and mouse

liver leads to increased triglyceride storage in lipid droplets, demonstrating that autophagy

has a critical function in lipid metabolism with important implications for human diseases

characterized by lipid over-accumulation such as those that comprise the metabolic

syndrome (38). Consistent with this idea, other researchers have found a decrease in

liver autophagy accompanied by an increase in Beclin-1, Atg7, and Atg5 protein

degradation, which may be an important mechanism that explains the impairment of

autophagy during the development of obesity after exposure to HFD (44).

Then, we hypothesized that intrauterine and lactation environments have a

negative impact on autophagy modulation. Therefore, we investigated for the first time if

exposure to HFD in utero, during lactation and adulthood can alter autophagy proteins in

mouse offspring. Our results showed that at birth (d0) the animals presented changes in

autophagy markers in the liver. After weaning (d18), we found modulation of autophagy

markers in both the hypothalamus and liver. Animals that received control diet after

weaning until adulthood (d82) had no impairment of autophagy proteins in both tissues

analyzed. At this age, animals with re-exposure to HFD had impaired of autophagy

proteins when compared with their control. Thus, the changes observed in offspring

autophagy modulation, as well as experimental models in adulthood as previously

reported; also appear to be mainly linked to exposure to HFD.

5. MATERIALS AND METHODS

5.1 Animals Procedures

All experiments were approved by the Ethical Committee for Animal Use (ECAU)

(ID protocol: 3383-1) of the Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), Campinas,

São Paulo, Brazil, following all the recommendations of the Brazilian College of Animal

Experimentation (COBEA) guidelines. Virgin female and male (5-week-old) Swiss mice

19

were obtained from the breeding colony at UNICAMP and maintained in individual

polypropylene cages in a room at 22°C ± 1°C with lights on from 6:00 a.m. to 6:00 p.m.

Before mating, the females were randomly divided into two groups: females fed with

standard chow (SC) or HFD; both groups had free access to food and water for 3 weeks

to allow adaptation. HFD was prepared according to the AIN-93G modified for high-fat

(45%) content based on a protocol previously published by our group (4, 27). Mating was

performed by housing females with adult males (fed with SC) for 1 week. Pregnancy was

confirmed by monitoring the weight. Pregnant females were separated again into

individual cages and received the same diet (SC or HFD) ad libitum during pregnancy and

lactation. On the first day after birth (d0), the litter size of both groups was adjusted to 8

animals (preferably males) per litter. Some animals were sacrificed for experimental

analyzes (d0 group). The male offspring were weaning and sacrificed at 18 days

representing the second experimental group (d18). At both time points, the hypothalamus

and liver were extracted, whereas at 18 days adipose tissue was also extracted adipose

from both groups (SC-O and HFD-O). After weaning, male offspring were fed with SC

until 42 days old; on this day of adulthood, the animals were divided into four groups:

offspring of dams control-fed with SC (OC-C), offspring of dams control-fed with HFD

(OC-H), offspring of dams HFD-fed with SC (OH-C), and offspring of dams HFD-fed with

HFD (OH-H). The animals received each type of diet until they completed 82 days of life.

At the end of the experimental period, all male mice were sacrificed, and the

hypothalamus, liver, and adipose tissue were extracted, representing the third

experimental group (d82). Data of adipose tissue fat weight in all the experimental groups

were expressed as a percentage, adjusted by animal weight.

5.2 Metabolic Assessments

Maternal weight was measured during all experimental period. After lactation we

also measured adiposity of dams. Offspring fasting glucose was measured at 18 and 82

days by using an Accu-Chek Performa glucometer. To obtain the Lee Index [from the ratio

of BW(g)1/3/ nasoanal length (cm) x 1000], were measured body weight (BW), and length

of offspring at birth (d0) and at weaning (d18) (22). The consumption of breast milk was

20

obtained on the basis of fasted and fed pups’ weight gain at 16 days of age, following the

procedure previously described (36). In adulthood (d82), food intake was evaluated after

2 weeks of adaptation by the difference between the initial and final weight of the food

during 5 days. Values of food intake were expressed as a percentage by calories

corrected by animal weight. Commercial kits were used according to the manufacturer’s

instructions for the quantification of serum cholesterol (CHOD-PAP/ Roche Diagnostics),

serum triglycerides (GPO-PAP, Roche Diagnostics), and serum or plasma TNF-α (Mouse

TNF- α, DY410-05, R&D Systems).

5.3 Immunoblotting

After extraction, tissue samples of the hypothalamus and liver (d0, d18, d82) were

homogenized in freshly prepared ice-cold buffer [1% (v/v) Triton X-100, 0.1 mol L−1 Tris,

pH 7.4, 0.1 mol L−1 sodium pyrophosphate, 0.1 mol L−1 sodium fluoride, 0.01 mol L−1

EDTA, 0.01 mol L−1 sodium vanadate, 0.002 mol L−1 PMSF and 0.01 mg aprotinin/mL].

Insoluble material was removed by centrifugation (10,000 × g) for 25 min at 4°C. The

protein concentration of the supernatant was determined by the Bradford dye-binding

method (hypothalamus) or Biuret (liver). The supernatant was suspended in Laemmli

sample buffer and boiled for 5 min before separation by SDS-PAGE using a miniature gel

apparatus (Bio Rad, Richmond, CA, USA). Following electrophoresis, the proteins were

transferred to nitrocellulose membranes. The membranes were treated with blocking

buffer (5% non-fat dried milk, 10 mM Tris, 150 nM NaCl and 0,02% Tween 20) and were

subsequently incubated overnight at 4° with specific antibodies (anti-SQSTM1/ ab91526;

anti-LC3B/ ab48394). Posteriorly, the membranes were incubated with HRP-conjugated

secondary antibodies (KPL, Gaithersburg, MD, USA). The proteins recognized by the

secondary antibodies were detected by chemiluminescence (Amersham ECL, kit RPN

2232, Buckinghamshire, UK) as visualized by exposure of the blot to Kodak XAR film.

Band intensities were quantified by optical densitometry of developed autoradiographs

(Scion Image software, ScionCorp, MD, USA), and the intensities of the bands were

normalized to the loading control β-actin (ab8227) or α-tubulin (T5168, Sigma-Aldrich,

MO, USA).

21

5.4 Real- time Quantitative PCR

Real-time quantitative PCR was performed to measure mRNA levels of TNF-α.

Hypothalamic and liver total RNA was extracted using Trizol reagent according to the

manufacturer’s instructions (Invitrogen Corporation, CA, USA). Total RNA was quantified

on a Nanodrop ND-2000 (Thermo Electron, WI, USA). Reverse transcription was

performed using total RNA from hypothalamic and liver samples. Real-time PCR analysis

of gene expression was performed in an ABI Prism 7500 Fast Sequence Detection

System (Applied Biosystems). The primers used were obtained from Applied Biosystems:

TNF-α (Mm00443258_m1) and GAPDH as the endogenous control (4352339E mouse

GAPDH, Life Technologies Corporation). Each PCR contained 20 ng of reverse-

transcribed RNA and was run according to the manufacturer’s recommendation using the

TaqMan PCR Master Mix (Applied Biosystems). Target mRNA expression was normalized

to GAPDH expression and expressed as a relative value using the comparative threshold

cycle (Ct) method (2 − ΔΔCt) according to the manufacturer’s instructions.

5.5 Statistical Analysis

The results are expressed as the mean ± SE of the indicated number of

experiments. Blot results are presented as direct band comparisons in autoradiographs

and quantified by densitometry using Scion Image software. The statistical analyses were

carried out using Student’s t tests of unpaired samples or ANOVA for multiple

comparisons, and the level of significance was set at p < 0.05.

6. RESULTS

6.1. HFD alters weight and adiposity of dams

To examine the effects of maternal obesity induced by diet (DIO) in hypothalamus

and liver autophagy of offspring, female mice were fed with HFD (45%). As expected, the

dams fed HFD showed an increase in body mass after 2 weeks of exposure, maintaining

22

the difference throughout pregnancy compared with control dams (56.93 ± 3.93 vs. 30.63

± 2.91, respectively) and lactation (50.33 ± 1.18 vs 30.63 ± 2.91, respectively ) (Fig. 1A).

The increase in body mass was accompanied by increased gonadal adipose tissue (1.55

± 0.20 g in SC dams vs. 3.54 ± 0.39 g in HFD dams) and rWAT (0.74 ± 0.13 g in SC

dams vs. 0.25 ± 0.04 g in HFD dams) (Figure 1B).

6.2 Metabolic parameters and autophagy evaluation of offspring on day of birth

The weight of offspring from obese dams was significantly lower (11%) than those

from lean dams (Figure 2A). This result of body mass was accompanied by decrease in

the Lee Index (Figure 2B), although no differences were observed in TNF-α plasma

levels, cholesterol, and triglycerides serum levels (Figure 2C–E). After assessing

metabolic parameters, we investigated the modulation of autophagy on the first day of

birth. No differences in autophagy markers in the hypothalamus between the groups were

observed (Figure 3B and 3C). Because of this, we decided to investigate whether the liver

showed any change in autophagy. Interestingly, we observed an increase in protein

content of p62 (Figure 3E) and decrease in conversion of LC3-I to LC3-II (Figure 3F),

suggesting a decreased autophagy process in the liver of offspring from obese dams at

birth. The gene expression of TNF-α did not differ in any of the tissues analyzed (Figure

3A and 3D).

6.3 Metabolic parameters of male offspring after lactation

Next, we evaluate the metabolic characteristics of the offspring during lactation.

The offspring of obese dams had differences in body weight from the 14th day until 18th

day, when compared with control mice (1.4 fold in both ages) (Figure 4A). This was

accompanied by an increase in Lee Index (Figure 4B) and increase in eWAT (0.18 ± 0.08

g in SC-O mice vs. 1.42 ± 0.26 g in HFD-O mice), rWAT (0.10 ± 0.12 g in SC-O mice vs.

0.41 ± 0.10 g in HFD-O mice), and BAT (0.49 ± 0.07 g in SC-O mice vs. 0.69 ± 0.13 g in

HFD-O mice) tissues (Figure 4C). We also observed an increase in fasting glucose,

serum cholesterol, and triglycerides (Figure 4D–4F). No difference in serum TNF- α was

23

found (Figure 4G). In addition, the consumption of breast milk from the offspring of obese

mothers was higher compared with the control (Figure 4H). Animals with 18 days didn’t

show any differences in energy expenditure measured by indirect calorimetry (data not

show).

6.4. Autophagy evaluation of male offspring after weaning

After weaning, the modulation of autophagy in the hypothalamus and liver were

evaluated. As observed at birth, the liver autophagy remained decreased in the HFD-O

group compared to SC-O. In addition, lactation resulted in negative regulation in the

hypothalamic autophagy, which was demonstrated by an increase in the content of p62

protein (Figure 5B) and decrease of LC3-II (Figure 5C) in the offspring HFD-O when

compared with SC-O. We observed an increase in gene expression of TNF-α in

hypothalamus and no differences in gene expression of TNF-α in the liver (Figure 5A and

5D, respectively).

6.5. Metabolic parameters and autophagy evaluation of offspring in adult life

To evaluate the effects of HFD re-exposure in the modulation of autophagy in

adulthood of the offspring from SC- and HFD-fed dams, the animals were fed with SC or

HFD diet from day 42 until day 82. At 42 days, offspring from obese dams remained with

higher body mass (p<0.0001), which was developed during lactation. By using the

ANOVA variance analysis, we found that the re-exposure to HFD was effective in

increasing the body mass of offspring in adulthood. After this analysis, we performed

comparisons between groups remained the same diet in adulthood. Thus, HFD offspring

(OH-C) maintained with SC exhibit an increased body mass (11, 3%) (Figure 6A), fasting

glucose (1.4 fold) (Figure 6C) and adiposity (eWAT: 1.3 fold; rWAT: 1.4 fold and BAT: 1.3

fold) (Figure 6D) when compared with OC-C, although the groups did not show any

difference in the relative caloric intake (Figure 6B). Interestingly, these animals did not

show any modulation in autophagy markers in the hypothalamus (Figure 7A and 7B) and

liver (Figure 7C and 7D) tissues. When the groups SC-O and HFD-O were exposed to

24

HFD (OC-H and OH-H groups), the comparison between these groups showed an

increase in body mass (11%) (Figure 6E), accompanied by an increase in caloric intake

(1.2 fold) (Figure 6F) in addition an increase in fasting glucose (1.5 fold) (Figure 6G) and

adiposity (eWAT: 1.2 fold and rWAT: 1.3 fold) (Figure 6H). Regarding autophagy markers,

we saw an increase in protein content of p62 in hypothalamus (Figure 8A) and liver

(Figure 8B) tissues in OH-H compared with OC-H group. However, the protein content of

LC3-II decreased only in the hypothalamus between these groups (Figure 8D).

7. DISCUSSION

It is well documented that autophagy has several physiological and pathological

proprieties, including the adaptive response to starvation, quality control of intracellular

proteins and organelles, anti-aging, suppression of tumor formation, elimination of

intracellular pathogens, and antigen presentation (23, 29),. In the context of obesity some

studies show that autophagy is often compromised in the central nervous system (28) and

in peripheral tissues (22, 44), probably contributing to the progression of this disease.

This present study investigated the hypothesis that maternal obesity induced by HFD

modulates autophagy proteins in the hypothalamus and liver of mouse offspring.

In physiological conditions, autophagy has important roles during development by

its ability to drive fast cellular changes. Thereafter, the autophagy process provides a

favorable environment for differentiation and development (31). When autophagy is

defective in these periods, some abnormalities in various organisms such as fungi (41),

protozoa (1), and insects (18) were reported.

Our first result demonstrated that offspring from obese dams had reduced body

mass, accordingly previous report (27, 35) and presented a decrease in Lee Index, even

without any change in other metabolic parameter evaluated. Although the reason for the

reduced body size is unclear, we hypothesize that the placental function or the inefficient

reutilization of nutrients during embryogenesis may be important situations in maternal

obesity. Interestingly, animals with ablation of some Atgs genes, essential to the

autophagy pathway, were born with a similar phenotype in body mass (20, 21).

Furthermore, we also observed down-regulation of autophagy in the liver of offspring from

25

obese dams but, no differences in hypothalamus tissue at birth. Importantly, the survival

rate of neonates deficient in Atg5 or Atg7 after exposure to starvation is much shorter

when compared to wild-type mice, showing that autophagy is important for the first

moments of mouse neonate’s life (20, 21).

Additionally, it has been reported that autophagy is involved in placenta

development during human pregnancy (15). Maternal obesity during pregnancy

contributes to increased placental permeability by up-regulation of placental amino acid

transporter, resulting in activation of mTOR signaling (16). This activation could

downregulate of autophagy in the liver tissue of neonates because mTOR signaling is an

important negative regulator of this system (45). On the other hand, rodents complete

their development of neural circuits during lactation (5), which may influence the protein

content of hypothalamic autophagy markers at birth.

In accordance with this idea, metabolic parameters were compromised after

weaning, and hepatic autophagy remained decreased in the HFD-O group as well as the

hypothalamus tissue. Indeed, lactation seems to be highly sensitive in rodents, providing

important changes in response to maternal HFD (40). The use of HFD during lactation

also has a negative impact on the development of neuronal projections of offspring, which

results in metabolic alterations, such as food intake and glucose homeostasis (42).

Importantly, deletion of Atg7 in POMC neurons causes higher post-weaning body mass,

increased adiposity, and presented a marked reduction in POMC fiber density; thus, the

authors suggested that autophagy is an important mechanism for the normal

development of neuron projection (8).

Because there were no differences in energy expenditure between the groups in

d18 (data not shown), we suggest that higher body mass of HFD-O animals can be

explained by breast milk caloric intake, but this modification should be confirmed by direct

measurement of milk intake. In addition, it would be interesting to evaluate the

composition of breast milk in our model because the maternal dietary source of fat can

affect the amount and the composition of fatty acid in breast milk of rats (33).

Several reports described an important highlight crosstalk between lipids and

autophagy. In addition to other interactions, the lipid profile can directly affect the

physicochemical properties of lipid bilayers interfering with its fluidity and in the

26

remodeling of the cell membrane (19, 33). Thus, even poorly understood it is known that

lipids can influence various steps of autophagy including initiation, autophagosome

biogenesis and maturation (7, 10). Accordingly, we suspect that altered milk from obese

dams can alter lipid membrane composition, which leads to impairment on the

autophagossome-lysosome fusion (7, 19). Then, the future study of lipid composition of

membranes may be interesting in our experimental model.

Recently was demonstrated that offspring from obese dams after 10 days of

weaning present some metabolic changes accompanied by activation of inflammatory

pathways, insulin resistance and modulation in endoplasmatic reticulum stress in the

hypothalamus (27). These animals also had hepatic steatosis and maternal consumption

of HFD was responsible to affect the early lipid metabolism of offspring by modulating the

expression of hepatic β-oxidation-related genes and microRNA (4). Taking into account

that autophagy has an important link with hepatic lipid metabolism we believe that the

origin of this alteration is associated with down-regulation of liver autophagy found here in

our study. This hypothesis is consistent with studies that show mice with hepatocyte-

specific knockout of Atg7 that were fed with HFD developed markedly increased liver

triglycerides and cholesterol content (44); this indicate that defects in autophagy can

promote hepatic steatosis (38, 44) and that autophagy induction by rapamycin treatment

protects the liver from HFD-induced lipotoxicity and may be an important therapeutic

target for liver disease associated with obesity (26).

In addition, some studies reported that the suppression of autophagy increases

inflammation in metabolic tissues, with the overexpression of certain types of cytokines;

however, the exact mechanisms by which cytokines mediate autophagy regulation and

immune cell function remain unknown (17). TNF-α content is not different in most of our

analyses, similar to data published by our group (4, 27). Perhaps the levels were below of

detection by methods used in this work. Thus, at least in part, the inability of methods

used may explain our results of TNF-α between the groups.

During adulthood, both groups (SC or HFD) exhibited significant alterations in

metabolic parameters, reproducing data of other studies (2, 6, 39). Nevertheless, the

comparison between groups OCC and OHC revealed that maternal DIO during

pregnancy and lactation appear not to be sufficient to negatively modulate the autophagy

27

proteins in adulthood. Therewith, we suspect that HFD during adult life is responsible for

enhancing possible epigenetic changes in our experimental model. However, additional

studies such as evaluation microRNAs that can modulate the autophagy pathway or

acetylation and methylation of autophagy genes, should be conducted to confirm this

idea. We also suspect that the impairment of autophagy markers in the hypothalamus and

liver during initial life and after re-exposure to HFD may contribute to metabolic

disturbances and an obese phenotype of offspring, therefore being another point to be

studied in our future research.

In summary, results from this study demonstrate that offspring from obese dams

have impairment of liver autophagy proteins at birth and after lactation both in

hypothalamus and liver tissues, which show down-regulation of autophagy. Surprisingly,

the offspring from obese dams receiving control diet after weaning until adulthood have

no impairment of autophagy’s protein in both tissues analyzed. Thus, exposure to lipids is

likely to be an essential condition for enhancing modulation of autophagy proteins in our

experimental model. However, we highlight the importance of further studies using

additional techniques for measuring autophagy activity, especially in hypothalamus and

liver lipid membrane composition of the offspring of obese dams.

8. ACKNOWLEGEMENTS

The present study was supported by São Paulo Research Foundation (FAPESP)

process 2011/51205-6. The funders had no direct influence over the present study. The

authors don’t have any conflict of interest to declare.

28

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33

10. FIGURES

Figure 1. Body weight and adiposity of dams (SC or HFD) during pregnancy and

after weaning. (A) Weight of dams since exposure to SC or HFD until the weaning.

(B) Adiposity (%) of dams after weaning (gWAT, gonadal white adipose tissue;

rWAT, retroperitoneal white adipose tissue; BAT, brown adipose tissue). Values are

means ± SEM, n = 5-7 dams/group. *p < 0.05 *SC vs HFD

34

Figure 2. Metabolic characterization of male offspring (SC-O or HFD-O) at birth (d0).

(A) and (B) body weight and Lee Index, respectively (n = 30 pups/group). (C) Plasma

TNF-α (n = 6 per group). (D) Serum cholesterol (n = 6 per group). (E) Serum

triglycerides (n = 6 per group). Values are means ± SEM, *p < 0.05; *SC-O x HFD-O.

35

Figure 3. Inflammatory marker and protein content of autophagy markers in hypothalamus

and liver of male offspring (SC-O or HFD-O) at birth (d0). (A) and (D) hypothalamus and liver

relative gene expression of TNF-α. Representative western blotting of hypothalamus (B)

p62/β-actin. (C) LC3-II/LC3- I. Representative western blotting of liver (E) p62/β-actin. (F)

LC3-II/LC3- I. Values are means ± SEM, n = 4-6 pups per group. *p <0.05; *SC-O x HFD-O.

36

Figure 4. Metabolic parameters of male offspring (SC-O or HFD-O) during lactation until

weaning (d18). (A) Weight during lactation (n = 30 per group). (B) Lee Index during

lactation (n = 30 per group). (C) Adiposity corrected by weight at day 18 (n =14 per group)

(eWAT, epididymal white adipose tissue; rWAT, retroperitoneal white adipose tissue; BAT,

brown adipose tissue). (D) Fasting glucose at day 18 (n = 16 per group). (E) Serum

cholesterol at day 18, (F) serum triglycerides at day 18 and (G) serum TNF-α at day 18 (n =

5-6 per group). (H) Milk production at day 16 (n = 20 per group). Values are means ± SEM,

*p < 0.05; *SC-O x HFD-O.

37

Figure 5. Inflammatory marker and protein content of autophagy markers in hypothalamus

and liver of male offspring (SC-O or HFD-O) at weaning (d18). (A) and (D) Hypothalamus and

liver, respectively, mRNA to TNF-α. Representative western blotting of hypothalamus on d18

(B) p62/β-actin. (C) LC3-II/LC3- I. Representative western blotting of liver (E) p62/β-actin. (F)

LC3-II/LC3- I. Values are means ± SEM, n = 4–6 pups per group. *p < 0.05; *SC-O x HFD-O.

38

Figure 6. Metabolic characterization of male offspring at adulthood (d82). (A) Weight of OC-C

and OH-C mice. (B) Food Intake corrected by weight of OC-C and OH-C mice. (C) Fasting

glucose of OC-C and OH-C mice. (D) Adiposity correct by weight (eWAT, epididymal white

adipose tissue; rWAT, retroperitoneal white adipose tissue; BAT, brown adipose tissue) of OC-C

and OH-C mice. (E) Weight of OC-H and OH-H mice. (F) Food Intake corrected by weight of

OC-H and OH-H mice. (G) Fasting glucose of OC-H and OH-H mice. (H) Adiposity correct by

weight of OC-H and OH-H mice. Values are means ± SEM, n = 5–15 pups per group. *p < 0.05;

*OC-C x OH-C or *OC-H x OH-H.

39

Figure 7. Protein content of autophagy markers in hypothalamus and liver of male

offspring (OC-C or OH-C) at adulthood (d82). Representative western blotting of

hypothalamus. (A) p62/β-actin. (B) LC3-II/LC3-I. Representative western blotting of

liver. (C) p62/β-actin. (D) LC3II/LC3I. Values are means ± SEM, n = 4–6 pups per

group. *p < 0.05; *OC-C x OH-C.

40

Figure 8. Protein content of autophagy markers in hypothalamus and liver of male

offspring (OC-H or OH-H) at adulthood (d82). Representative western blotting of

hypothalamus. (A) p62/Tubulin. (B) LC3-II/LC3-I. Representative western blotting of

liver. (C) p62/β-actin. (D) LC3-II/LC3-I. Values are means ± SEM, n = 4–6 pups per

group. *p < 0.05; *OC-H x OH-H.

41

Supplementary 01. Indirect Calorimetry of animals at weaning (d18). (A) VO2

corrected by weight. (B) VC02 corrected by weight. (C) Energy expenditure corrected

by weight. (D) Respiratory Quotient. Values are means ± SEM, n = 4 pups per group.

*p < 0.05; *OC-H x OH-H.

42

Supplementary 2. Protein content of autophagy markers in hypothalamus and liver of

male offspring ten days after weaning (d28). Representative western blotting of

hypothalamus. (A) p62/β-actin. (B) LC3-II/LC3-I. Representative western blotting of

liver. (C) p62/β-actin. (D) LC3-II/LC3-I. Values are means ± SEM, n = 4 pups per

group. *p < 0.05; *OC-H x OH-H

43

Supplementary 3. Metabolic parameters and protein content of autophagy markers in

hypothalamus and liver of male offspring at 42 days. (A) Weight of SC-O and HFD-O

mice. (B) Adiposity correct by weight (eWAT, epididymal white adipose tissue; rWAT,

retroperitoneal white adipose tissue). (C) Food Intake corrected by weight of SC-O and

HFD-O mice. (D) Fasting glucose of SC-O and HFD-O mice. Representative western

blotting of hypothalamus. (E) p62/β-actin. (F) LC3-II/LC3-I. Representative western

blotting of liver. (G) p62/β-actin. Values are means ± SEM, n = 4 pups per group (WB)

and 4-8 pups per group (metabolic parameters). *p < 0.05; *OC-H x OH-H

44

3. DISCUSSÃO E CONCLUSÃO

A autofagia celular é essencial para diferentes funções fisiológicas do

organismo como, por exemplo, resposta adaptativa à inanição e consequente

fornecimento de energia à célula; controle de qualidade celular devido à eliminação de

agregados proteicos, organelas senescentes e patógenos invasores; além da supressão

da formação de tumores e apresentação de antígenos (Levine & Kroemer, 2008;

Mizushima et al. 2008).

Em patologias como a obesidade, alguns estudos prévios demonstraram

que a autofagia está frequentemente comprometida tanto no sistema nervoso central

(Meng & Cai, 2011) quanto em tecidos periféricos (Liu et al. 2009; Yang et al. 2010)

provavelmente contribuindo para a progressão e piora do quadro clínico dessa doença.

Frente a esse contexto, este estudo teve como objetivo avaliar a modulação de autofagia

na prole de animais submetidos a um ambiente de desenvolvimento adverso

proporcionado pelo uso de DH durante a gestação e lactação bem como o impacto na

modulação de autofagia nesses animais na vida adulta após reexposição à DH.

Em condições fisiológicas durante o desenvolvimento embrionário a

autofagia é super-regulada após a fertilização (Tsukamoto, 2008) sendo essencial para a

fase pré-implantação devido à capacidade em direcionar rápidas modificações celulares

que favorecem a diferenciação celular (Mizushima & Levine, 2010). No entanto, quando

a autofagia está comprometida nesses períodos, é possível encontrar algumas

anormalidades em organismos como fungos (Tsukad et al, 1993), protozoários (Alvarez

et al, 2008) e insetos (Juhász et al, 2003).

Similarmente a dados previamente publicados (Melo et al, 2014;

Reynolds et al, 2014), os primeiros resultados mostrados revelaram que a prole de mãe

obesa ao nascer apresentou menor massa corporal bem como diminuição no índice de

Lee, apesar de nenhuma outra alteração nos parâmetros metabólicos avaliados.

Sabe-se que durante a gestação os nutrientes necessários ao

desenvolvimento neonatal são ofertados pela placenta, porém ao nascer esse

suprimento é interrompido o que faz com que o neonato vivencie um período de inanição

até a ingestão do leite materno (Kuma et al. 2004). Assim, embora ainda não seja claro o

45

motivo pelo qual os animais tenham apresentado menor massa corporal ao nascimento,

acreditamos que a função placentária de transporte de nutrientes possa estar

comprometida em modelos experimentais de obesidade, o que possivelmente impactou

de modo negativo no fenótipo de nosso modelo experimental.

De fato, segundo Zhou e colaboradores (2015), o prejuízo na função da

placenta está dentre as maiores causas de doenças fetais. Particularmente, o consumo

de DH, independente da obesidade materna, foi responsável por aumentar a expressão

de citocinas pró- inflamatórias e a expressão de TLR4 (toll-like receptor 4) na placenta de

primatas não humanos. Isso foi correlacionado com a diminuição de fluxo sanguíneo

intrauterino nos animais DH e com aumento na frequência de fetos natimortos (Frias et

al. 2011).

Em outro estudo, foram utilizadas fêmeas de camundongo knockout

para o receptor de insulina no fígado, o que foi responsável por desencadear

hiperinsulinemia. Sabe-se que a insulina não atravessa a barreira transplacentária, mas o

excesso desse hormônio na circulação materna pode alterar o crescimento e

desenvolvimento da placenta devido a modificações na expressão de receptores de

insulina, assim, a prole destes animais também apresentou menor massa corporal ao

nascer quando comparada ao controle (Karaman, 2014).

A homeostase na atividade de autofagia celular também é outra condição

essencial ao neonato. Importantes marcadores de autofagia, como Atg5 e Atg7, ao serem

deletados em modelos experimentais, induzem a morte de camundongos com

aproximadamente 13 horas enquanto que os animais controle morrem após um período

de 21 horas (Kuma et al. 2004; Komatsu et al. 2005). Os dados mostraram

comprometimento do conteúdo proteico de marcadores de autofagia no fígado da prole

de mãe obesa induzida por DH (tabela 01- anexo) ao nascer, embora sem nenhuma

alteração na atividade de autofagia hipotalâmica. Devido ao comprometimento presente

no fígado, acreditamos que a avalição da taxa de sobrevivência neonatal da prole de

mãe obesa comparada a prole de mãe controle, se caracterize como importante alvo

para futuros estudos.

Adicionalmente, Hung e colaboradores (2013) demonstraram que a

autofagia está presente durante o desenvolvimento da placenta humana sendo que a

46

obesidade materna parece proporcionar uma super-regulação em tipos específicos do

transporte de aminoácidos resultando na ativação da via de sinalização de mTOR

(Jansson et al. 2013), sendo a mTORC1 um importante regulador negativo da autofagia

(Yang et al, 2010), o que poderia explicar, pelo menos em parte, a modulação dos

marcadores de autofagia no fígado da prole ao nascer. Por outro lado, acredita-se

também que a modulação de autofagia no hipotálamo sofra influência direta do estágio

de maturação das conexões hipotalâmicas, as quais em roedores se dão após o

nascimento durante as duas primeiras semanas de vida (Bouret et al, 2009).

Corroborando tais ideias, após o desmame, foi encontrado

comprometimento dos parâmetros metabólicos mensurados sendo que a autofagia

apresentou-se comprometida tanto no hipotálamo quanto no fígado. De fato, o período

da lactação em roedores é altamente sensível frente às adversidades desencadeadas

pela ingestão DH materna (Sun et al. 2012) com efeitos negativos, por exemplo, no

desenvolvimento das projeções neuronais e consequente prejuízo na homeostase da

glicose e ingestão alimentar (Voght et al. 2014). Copé e colaboradores (2012)

descreveram que a homeostase na autofagia também é essencial ao desenvolvimento

das projeções neuronais já que a deleção de Atg7 em neurônios POMC levou ao

aumento na massa corporal, adiposidade e redução na densidade das fibras neuronais

nos modelo experimental após o desmame.

Durante a lactação a prole de mãe obesa (HFD-O) apresentou aumento

na massa corporal sem nenhuma diferença na calorimetria indireta quando comparada à

prole de mãe controle (SC-O), levando-nos a acreditar que esse fenótipo pode ser

explicado possivelmente pelo aumento na ingestão alimentar. No entanto, destacamos

que outras técnicas de avaliação direta do consumo de leite materno deveriam ser

exploradas para a confirmação deste dado. Adicionalmente, seria interessante avaliar o

perfil lipídico do leite materno no nosso modelo experimental, tendo em vista que em

ratos, já foram reportados que as fontes de lipídeos da dieta materna afetam diretamente

a composição do leite materno bem como o perfil de ácidos graxos circulantes na prole

(Priego et al. 2013).

Além de outras interações, o perfil de lipídeos circulantes pode afetar

diretamente propriedades físico-químicas da bicamada lipídica interferindo na fluidez e

47

no remodelamento da membrana celular (Koga et al. 2010; Dall'Armi et al. 2013). Tal

conhecimento intensifica a discussão a respeito da presença de um importante crosstalk

entre autofagia e a quantidade e qualidade de lipídeos na célula. Assim, ainda que pouco

estudado, sugere-se que os lipídeos influenciem nas várias etapas da autofagia incluindo

a iniciação, a biogênese da membrana autofagossomo e sua maturação. Acreditamos

que as possíveis alterações na composição da membrana lipídica frente à ingestão de

DH materna possam também resultar em prejuízos na autofagia, sendo que, por

exemplo, a etapa de fusão do autofagossomo com o lisossomo de nosso modelo

experimental, torna-se outro alvo importante para futuros estudos (Dall Armi, Carlsonn,

Koga).

O experimento adicional feito nos animais aos 28 dias de vida, quando os

mesmos receberam dieta controle durante o período de 10 dias após o desmame,

demonstrou que os animais apresentaram aumento na atividade de autofagia

hipotalâmica (Figura Suplementar 02). Destacamos que a autofagia é um processo

altamente dinâmico, o qual pode ser ativado em situações como estresse de retículo

endoplasmático (ERE) severo (Ogata et al., 2006). Acredita-se que a autofagia atue

como um mecanismo de sobrevivência frente ao acúmulo de proteínas incorretamente

dobradas e/ou que excederam a capacidade do retículo endoplasmático (Ogata et al.,

2006). Interessantemente, Melo e colaboradores, 2014 ao utilizar o mesmo modelo

experimental de nosso estudo, encontraram aumento no conteúdo proteico de

marcadores do ERE em hipotálamo, o que poderia estar relacionado aos nossos

resultados de marcadores de autofagia neste tecido.

Entretanto, apesar do também aumento de marcadores do ERE no

fígado, houve diminuição da autofagia, assim como ao desmame. Nota-se que outros

estudos já apontaram que a diminuição de autofagia também pode implicar em ERE

(Zhang et al, 2015) devido ao acúmulo de proteínas ubiquitinadas, sendo que os

mecanismos relacionados ao crosstalk entre essas duas vias celulares ainda

permanecem pouco compreendidos.

Com o mesmo modelo experimental aos 28 dias de vida, Benatti e

colaboradores (2014) demonstraram que o consumo materno de DH foi responsável por

induzir esteatose hepática acompanhada por alterações na expressão gênica de genes

48

relacionados à β-oxidação e alteração na expressão de microRNA-122. Sabendo que a

autofagia atua no metabolismo hepático de lipídios, acreditamos que o prejuízo na

autofagia hepática encontrado na prole de mãe obesa tanto ao nascer como após a

lactação podem contribuir negativamente para o fenótipo obeso bem como para as

alterações metabólicas relacionadas ao metabolismo de lipídeos.

Em acordo com essa hipótese citada acima, temos que a autofagia atua

no desenvolvimento e progressão de doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA).

Por exemplo, animais com deleção específica de Atg7 que foram alimentados com DH

desenvolveram aumento no conteúdo de triglicerídeos e colesterol hepático indicando

que prejuízos na autofagia hepática podem promover quadros de esteatose (Singh et al.

2009; Yang et al. 2010). Outro estudo retratou que uso de rapamicina, um importante

indutor de autofagia, resultou em diminuição no conteúdo de triglicerídeos nos

hepatócitos, sugerindo que a indução de autofagia pode proteger contra a lipotoxicidade

induzida por DH e que a autofagia nesse tecido pode ser um importante alvo terapêutico

para doenças hepáticas associadas à obesidade (Mei et al, 2011).

Algumas citocinas regulam a resposta imune celular e a atividade de

autofagia por mecanismos ainda não totalmente esclarecidos. Sabendo que alguns tipos

de citocinas aumentam a autofagia, enquanto que outros a inibem, nós avaliamos a

expressão gênica de TNF-α bem como o seu conteúdo no soro e plasma dos animais ao

nascer e após a lactação. Similarmente a dados previamente publicados por nosso grupo

(Melo et al. 2014; Benatti et al. 2014), em grande parte das análises, não encontramos

nenhuma correlação com a atividade de autofagia. Assim, parece que a baixa

sensibilidade de nossos métodos em detectar pequenas modificações entre os grupos,

explique, pelo menos em parte, os nossos resultados referentes a esta citocina.

Ao caracterizar a atividade de autofagia na prole aos 42 dias de vida,

antes de receberem a reexposição à DH, encontramos que apensar do

comprometimento em parâmetros metabólicos como maior massa corpórea, adiposidade

e glicemia de jejum, somente o fígado apresentou acúmulo da proteína p62 (Figura

Suplementar 03). Assim, temos a hipótese de que a renovação na composição da

membrana lipídica possa interferir na modulação dos marcadores de autofagia nos

tecidos avaliados.

49

Aos 82 dias de vida, os grupos com dieta controle ou reexpostos à DH

ainda exibiram importantes alterações nos parâmetros metabólicos, reproduzindo dados

já publicados em literatura. Por exemplo, a obesidade materna e o uso de DH aumentou

a enzima ácido graxo sintase e diminuiu a enzima superóxido dismutase na prole ao

nascer (Bringhenti et al. 2014). Na vida adulta, a prole de ratos apresentou intolerância a

glicose, aumento na sinalização de NPY e resistência à leptina no hipotálamo (Chen et

al, 2009). Adicionalmente, Ashino e colaboradores (2009) revelaram que na vida adulta o

fígado da prole de mãe obesa apresentou aumento na modulação p-JNK acompanhado

por resistência à ação da insulina e aumento no conteúdo de triglicérides hepático.

Em relação à atividade de autofagia, temos que a comparação entre os

grupos que receberam dieta controle na vida adulta (OCC x OHC) demonstrou que a

obesidade materna induzida por DH durante a gestação e lactação pareceu não ser

suficiente para modular negativamente o conteúdo proteico de marcadores de autofagia

nessa faixa etária. Com isso, nos suspeitamos que a DH durante a vida adulta seja

responsável por potencializar as possíveis alterações epigenéticas no nosso modelo

experimental. No entanto, estudos adicionais como a avaliação de microRNAs que são

capazes de modular a autofagia celular e a metilação de genes essenciais a via, devem

ser conduzidos para confirmar tais ideias. Acreditamos também o comprometimento da

autofagia pode contribuir para o desenvolvimento do fenótipo obeso do nosso modelo

experimental.

Em resumo, os resultados deste estudo demonstraram que a prole de

mães obesas apresentou comprometimento no conteúdo proteico de proteínas da

autofagia no fígado ao nascer. Após a lactação ambos os tecidos estudados (hipotálamo

e fígado) apresentaram prejuízos nos marcadores de autofagia. De modo interessante, a

prole de mãe obesa na vida adulta ao receber dieta controle não teve comprometimento

da autofagia em nenhum tecido analisado. Por outro lado, a reexposição aos lipídios

pareceu ser essencial ao prejuízo na modulação negativa de proteínas da autofagia em

nosso modelo experimental. No entanto, destacamos a importância de outros estudos

que utilizem técnicas adicionais para a avaliação da autofagia celular, especialmente nos

tecidos aqui estudados.

50

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63

6. Anexos:

A) Tabela 01. Composição Nutricional da Dieta Hiperlipídica (DH).

Ingrediente

CRESCIMENTO MANUTENÇÃO

Quantidade Kcal % do total

calórico Quantidade Kcal

% do total

calórico

Amido 95 380

35,53

167,1 668,4

41,61

Maltodextrina 125 500 125 500

Sacarose 201 804 201 804

Caseína 233 932 19,66 167 668 14,09

Óleo de soja 40 360

45,57

40 360

45,57

Banha 200 1800 200 1800

Minerais 35 0 35 0

Vitaminas 10 0 10 0

Fibras 55,5 0 50 0

L-cistina 3 0 2,4 0

Butirato de

colina 2,5 0 2,5 0

TOTAL 1000 4776 100,76 1000 4800,4 101,27

64

B) Comitê de Ética.

65

C) Comprovante de submissão.