ANDREZA FABIANA BEGNAMI

Propriedades antinociceptiva, antiedematogênica

e antiulcerogênica da fração acetato de etila das

folhas de Coriandrum sativum L

Piracicaba

2018

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE PIRACICABA

Faculdade de Odontologia de Piracicaba

ANDREZA FABIANA BEGNAMI

Propriedades antinociceptiva, antiedematogênica

e antiulcerogênica da fração acetato de etila das

folhas de Coriandrum sativum L

Tese apresentada à Faculdade de Odontologia de

Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas como

parte dos requisitos exigidos para a obtenção do titulo de

Doutora em Odontologia na Área de Farmacologia,

Anestesiologia e Terapêutica.

Orientador: Prof. Dr. Francisco Carlos Groppo

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE Á VERSÃO

FINAL DA TESE DEFENDIDA PELO ALUNO

ANDREZA FABIANA BEGNAMI ORIENTADA

PELO PROF. DR.FRANCISCO CARLOS

GROPPO.

Piracicaba

2018

“ Você não sabe o quanto eu caminhei

Pra chegar até aqui

Percorri milhas e milhas antes de dormir

Eu não cochilei

Os mais belos montes escalei

Nas noites escuras de

frio chorei, ei , ei

Ei ei ei..uu

Com a fé no dia-a-dia

Encontrar solução

Encontrei a solução....”

A Estrada - Cidade Negra

AGRADECIMENTOS

À Faculdade de Odontologia da Universidade Estadual de Campinas

(FOP/UNICAMP) na pessoa de seu diretor, Prof. Dr. Guilherme Elias Pessanha

Henriques, pela grande oportunidade de realizar este trabalho. À Coordenadoria do

Pós-graduação, representada pela Profa. Dra. Cinthia Pereira Machado Tabchoury e

à equipe de professores adjuntos por viabilizarem a realização da pós-graduação.

A Dra Vera G. Rehder pela orientação inicial e a toda equipe do CPQBA

(Centro Pluridisciplinar de Pesquisa Biológica e Agrária) pelo companheirismo ao

longo dessa jornada.

À Coordenadoria do Programa de Pós-graduação em Odontologia,

representada pelo Prof. Dr. Marcelo de Castro Meneghim e à equipe de professores

adjuntos por viabilizarem a realização da pós-graduação.

Ao Prof. Dr. Francisco Carlos Groppo, onde sou muita grata pela atitude

nobre em me acolher como orientanda e acreditar em mim quando ninguém mais

acreditava nesse trabalho. Agradeço também pela orientação, paciência,

disponibilidade e apoio constante durante a pesquisa.

À minha mãe Januária Silva Bueno Begnami por ser um exemplo de mulher

em minha vida me motivando a nunca desistir de meus sonhos mesmo em situações

adversas. A meu pai José Arnaldo Begnami por me guiar sempre pelas atitudes éticas,

morais e honestas, mas acima de tudo sempre com a doçura fraternal. Ao meu irmão

Arnaldo Begnami agradeço pela serenidade, pelos conselhos e por sempre acreditar

em mim. À minha filha Natalia Begnami Muller, a razão de minha eterna luta nesse

mundo almejando sempre alcançar o melhor e me motivando a sempre buscar o meu

sonho. E ao Cristiano Rodrigo de Queiroz agradeço pelo ininterrupto apoio tanto nos

momentos de alegria quanto nas dificuldades durante essa longa jornada.

O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de

Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior- Brasil (CAPES) – Código de

Financiamento 001.

RESUMO

Coriandrum sativum Linn. (Apiaceae/Umbelliferae), popularmente

conhecido como coentro, é usado tradicionalmente para tratar reumatismo, dor nas

articulações, distúrbios gastrointestinais e ansiedade. Este trabalho avaliou as

propriedades antinociceptivas, anti-edema e antiulcerogênica da fração de acetato de

etila (FAc) das folhas de C. Sativum. Atráves de metódos cromatográficos foi possivel

a separação, identificação e quatificação da Fac, a qual apresentou em sua

constituição di-hidrocoriandrina (34,5%), coriandrina (14,4%), além de vitamina E

(4,6%) e estigmasterol (7,9%). No teste de campo aberto, a FAc na dose de 30 mg/kg

(i.p.) não afetou a atividade locomotora do animal, mas as doses de 100 e 300 mg/kg

diminuiram essa atividade. O teste de contorção abdominal induzida por ácido acético

mostrou que a FAc (30,100 e 300 mg/kg, i.p.) reduziu o número de contorções

abdominais. Houve redução da dor (teste de formalina) de origem neurogênica (fase

I) e inflamatória (fase II) para as doses 30 e 100 mg/kg de FAc (i.p.). A administração

de 30 e 100 mg/kg de FAc (i.p.) reduziu significativamente o edema (teste de edema

da pata induzido por carragenina) na fase inicial (até 6 horas). O tempo de reação à

injecção de capsaicina foi significativamente diminuído pela morfina (20 mg/kg/i.p.) e

pela FAc nas concentrações (i.p.) de 30,100 e 300 mg/kg. O teste de ulcera gástrica

induzida por etanol mostrou atividade antiulcerogênica da FAc somente na maior

concentração (300 mg/kg/v.o.), sugerindo possível citoproteção para a mucosa

gástrica. Nessa dose, também apresentou atividade anti-secretora semelhante à

cimetidina (100 mg/kg/v.o.), reduzindo o volume de secreção gástrica, mas sem alterar

a concentração hidrogeniônica dessa secreção. Foi possível concluir que a FAc

apresentou propriedades antinociceptiva, anti-edema, antiulcerogênica e anti-

inflamatórias e pode ser considerada um agente fitoterápico com potencial para

aplicação em clínica.

Palavras-Chave: Coriandrum sativum. Coentro. Dor. Edema. Úlcera gástrica.

ABSTRACT

Coriandrum sativum Linn. (Apiaceae/Umbelliferae) is popularly known as

coriander and it is traditionally used to treat rheumatism, joint pain, gastrointestinal

disorders and anxiety. This study assessed antinociceptive, anti-edema and

antiulcerogenic properties of the ethyl acetate fraction (FAc) of C. sativum leaves.

Through chromatographic methods it was possible to separate, identify and quantify of

FAc, that was constituted by dihydrocoriandrin (34.5%), coriandrin (14.4%), vitamin E

(4.6%), and stigmasterol (7.9%). In the open field test, 30 mg/kg/i.p. FAc did not affect

the locomotor activity of animals, but 100 and 300 mg/kg doses decreased the activity.

The writhing test induced by acetic acid showed FAc (30,100 and 300 mg/kg, i.p.)

reducing the number of abdominal contortions. In the formalin test, both neurogenic

(phase I) and inflammatory (phase II) pain were reduced by FAc 30 and 100 mg/kg

(i.p.). These concentrations also reduced significantly the swelling (carrageenan-

induced paw edema test) in the initial phase (up to 6 hours). The time of reaction to

the capsaicin injection was significantly reduced by morphine (20 mg/kg/i.p.) and by

30,100 and 300 mg/kg/i.p. FAc. The gastric-ulcer induced by ethanol assay showed

the antiulcerogenic activity of FAc only at the highest concentration (300 mg/kg/v.o.),

suggesting a possible citoprotection of the gastric mucosa. At this dose, it also

presented anti-secretive activity, which was similar to the 100 mg/kg/v.o. cimetidine

activity, reducing the volume of gastric secretion, but without changing the

concentration in this secretion. It was possible to conclude that FAc presented

antinociceptive, antiulcerogenic, anti-inflammatory and anti-edema activities, and it

could be considered a potential phytotherapeutic agent.

Key-words: Coriandrum sativum. Coriander. Pain. Swelling. Stomach ulcer.

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 12

2 REVISÃO DA LITERATURA 13

2.1 Coriandrum sativum 13

2.2 Histórico e Medicina tradicional 13

2.3 Aspecto Nutricional 16

2.4 Atividades Anti-inflamatória, Antinociceptiva e Gastroprotetora 16

2.5 Aspectos Fitoquimicos 19

2.5.1 Cumarinas e furanocumarinas lineares 19

2.5.2 Furanocumarinas e Atividades Biológicas 21

2.5.3 Sistema Nervoso Central e Atividade Antioxidante de C. sativum 23

3 PROPOSIÇÃO 25

4 MATERIAL E MÉTODOS 26

4.1 Ensaios Fitoquímicos 26

4.1.1 Solventes e Reagentes 26

4.1.2 Equipamentos 26

4.1.3 Material vegetal 26

4.1.4 Extração 27

4.2 Métodos de Separaçâo 28

4.2.1 Cromatografia em Coluna Clássica 28

4.2.2 Cromatografia Partição líquido-líquido 29

4.2.3 Cromatografia em Coluna Seca 30

4.2.4 Cromatografia em Coluna Filtrante 30

4.2.5 Cromatografia em Camada Delgada 30

4.3 Métodos de Identificação 31

4.3.1 Análise por Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas 31

4.3.2 Análise por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada a Detetor de

Arranjo de Diodo e de massas CLAE-DAD-EM

31

4.4 Ensaios Farmacológicos In Vivo 32

4.4.1 Material e Métodos 32

4.4.2 Fármacos e reagentes 32

4.4.3 Animais 32

4.4.4 Avaliação de toxicidade aguda (Screening Hipocrático) 33

4.5 Atividades Antinociceptiva e Anti-Inflamatória 34

4.5.1 Avaliação da Atividade locomotora 34

4.5.2 Teste de contorções abdominais induzidas por ácido acético 35

4.5.3 Teste de Formalina 35

4.5.4 Teste de Edema de pata induzido por carragenina 36

4.5.5 Teste de Capsaicina 36

4.6 Atividade Antiulcerogênica 36

4.6.1 Testes de lesão gástrica induzida por etanol absoluto 37

4.6.2 Estudo da participação da prostaglandina na citoproteção gástrica 38

4.6.3 Estudo da participação das substâncias sulfidrílicas não protéicas na

citoproteção gástrica

38

4.6.4 Estudo da atividade anti-secretora 39

4.7 Análise dos Dados 40

5 RESULTADOS 40

5.1 Fitoquímica 40

5.1.1 Obtenção dos Extratos ED e EE 41

5.1.2 Partição líquido- líquido 43

5.1.2.1 Fracionamento da FHA em coluna cromatográfica seca 43

5.1.2.2 Obtenção da Fração Acetato de Etila (FAc) por Cromatografia em

Coluna Filtrante

43

5.1.2.3 Análise por Cromatografia Liquida de Alta Eficiência acoplada aos

detectores de Arranjo de Diodos e Massas

44

5.2 Ensaios Farmacológicos In Vivo 47

5.2.1 Teste de toxicidade aguda (Screening Hipocrático) 47

5.2.2 Avaliação da atividade locomotora 47

5.2.3 Contorções abdominais induzidas por ácido acético 48

5.2.4 Teste de Formalina 50

5.2.5 Edema de pata induzido por carragenina 52

5.2.6 Teste de Capsaicina 53

5.3 Atividade Antiulcerogênica 54

5.3.1 Lesão Gástrica induzida por Etanol 54

5.3.2 Prostaglandina e citoproteção gástrica 55

5.3.3 Substâncias sulfidrílicas não protéicas e citoproteção gástrica 56

5.3.4 Atividade Antisecretora 57

6 DISCUSSÃO 59

7 CONCLUSÃO 68

REFERÊNCIAS 70

APÊNDICE 1 - ETAPAS DAS DIFERENTES FORMAS DE FRACIONAMENTO

DO ED

84

ANEXOS 85

Anexo 1 – Comissão de Ética no Uso de Animais 85

Anexo 2 – Comissão de Ética no Uso de Animais 86

12

1 INTRODUÇÃO

O uso medicinal de plantas tem sido relatado em registros da história da

humanidade como no Papiro de Ebers (3330-2600 a.C), uma compilação de

prescrições contemplando mais de 480 substâncias naturais (Ody, 1995). Nele se

destaca o coentro (Coriandrum sativum L.), uma planta milenar também mencionada

em escritos sânscritos e nos tratados médicos da Idade Média, para o tratamento de

diversas patologias (Pedrosa et al., 1984).

O Coriandrum sativum L. (C. sativum) pertence à família Apiaceae

(Umbelliferae), oriundo nos cerrados áridos do mediterrâneo sendo introduzido na

Europa setentrional pelo Império Romano (Laws, 2013). As folhas frescas e os frutos

secos (erroneamente denominados de sementes) são comumente utilizados na

culinária tradicional de alguns países devido seu sabor e aroma ímpar, além de ser

amplamente empregado na medicina popular como diurético, carminativo, anti-

inflamatório, antidiabético, analgésico e sedativo (Bhattachacharjee, 2001).

Estudos químicos demonstraram a presença de diversos constituintes no

C. sativum, tais como acineol, borneol, cimene, limoneno, ácido linoléico, flavonóides,

carotenos, mircene, ácido palmítico, e β-pineno, sitosterol e estigmasterol (Dias,

2011). Dentre esses estudos destacaram-se as furanocumarinas coriandrina e dihidro

coriandrina que possuem estrutura química semelhante ao psoraleno; coriandronas A

e B isoladas de extratos etereos de folhas de C. sativum (Baba et al., 1991);

coriandronas C, D e E isoladas a partir de extratos metanolicos das folhas de C.

sativum (Taniguchi et al., 1996).

A maior parte dos estudos farmacológicos sobre as diferentes propriedades

do C. sativum utilizou as sementes ou frutos secos da planta para obter os extratos

relatando a atividade anti-inflamatória, antinociceptiva e antiulcerogênica de extratos

brutos, no entanto nenhum demostrou a possível atividade simultânea das folhas de

C. sativum frente esses parâmetros.

Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar as propriedades antinociceptiva,

anti-edema e antiulcerogênica de uma fração de acetato de etila (FAc) do extrato

diclorometânico das folhas de C. sativum.

13

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Coriandrum sativum

O Coriandrum sativum Linn. pertence à família Apiaceae/Umbeliiferacea,

popularmente conhecido como coentro, é uma planta herbácea anual que alcança até

um metro de altura. Tem folhas fendidas (Figura 1A), semelhantes às da salsa, com

flores brancas e levemente rosadas, sendo que seus frutos (erroneamente

denominado de sementes) são arredondados (Figura 1B), medindo de 3 a 5 mm de

diâmetro. Apresentam coloração marrom quando maduros e exalam forte odor,

lembrando o cheiro do percevejo. Por essa razão, é denominado popularmente como

erva-de-percevejo (Bhattachacharjee, 2001).

1A

1B

Figura 1 - (1A) Foto ilustrativa da planta e (1B) frutos do Coriandrum sativum Linn

2.2 Histórico e Medicina tradicional

A partir de literatura antiga e relatos dos achados arqueobotânicos

formulou-se a hipótese de que a cultura de C. sativum originou no Oriente Médio,

região próxima ao Mediterrâneo e a partir desse ponto ocorreram várias distribuições

originando outras espécies da tribo Coriandreae, fato esse evidenciado a partir de

achados de antigas sementes localizados na caverna Nahal Hemar, em Israel em

6000 a.C (Camargo, 1976).

14

No uso cotidiano, as folhas frescas de C. sativum são utilizadas como

guarnição e enfeites de alguns pratos típicos da cozinha internacional (Leung, 1980),

muito apreciado principalmente em peixes, frutos do mar, sopas e também em

produção de vinhos devido ao aroma ímpar (Ceska et al., 1988).

Os frutos secos e moídos são empregados amplamente em cozinhas

internacionais na China, Sudeste da Ásia, Índia, América do Sul e Central, constituindo

um dos ingredientes do curry (juntamente com mais 30 especiarias) como as

sementes de gengibre, pimenta dedo de moça, canela, pimenta do reino, cardamomo,

cravo da índia, cúrcuma, entre outros (Chen et al., 2009) sendo também empregado

na produção de refrescos, tônicos, diuréticos e afrodisíacos (Mani et al., 2009).

Na medicina tradicional é descrito que a semente fresca de C. sativum deve

ser deixada de molho em vinho ou em vinagre durante uma noite, e no outro dia seca

(para a remoção dos compostos químicos responsáveis por causar tonturas) e

posteriormente mastigadas como remédio para a halitose (Diederichsen, 1996).

A apreciação do cheiro característico do C. sativum trata-se de uma

preferência cultural associada a presença de compostos aldeídico do óleo essencial

da planta verde, o qual após amadurecimento a concentração diminui ou são

eliminados passando a ser caracterizado por um fresco e sabor agradável, empregado

extensivamente em bebidas, cigarros, bolos e perfumes devido o aroma adocicado

(Rajeshwari e Andallu 2011).

Na medicina popular o C. sativum esteve presente há séculos utilizado na

dieta alimentar até como medicamento para tratamentos de várias patologias, lesões,

sendo as folhas empregadas na forma de infusão como carminativo, tratamento de

desordens intestinais, antiespasmódico, expectorante, cólicas abdominais; e

externamente na forma de pomada para tratamento de reumatismo, artrite (Leung,

1980; Ceska et al., 1988). Enquanto as decocção e tinturas das sementes são

empregadas para tratamentos de convulsão, insônia, ansiedade, problemas

gastrointestinais (Grieve, 1971) sendo também matéria-prima para preparações

laxativas (Leung, 1980).

Na medicina tradicional do Irã o suco ou chá das folhas frescas, ou o pó

das sementes moídas são utilizadas para auxiliar em desordens do Sistema Nervoso

Central (SNC) como: ansiedade, insônia, irritabilidade, depressão, sintomas de

15

excesso de nervosismo (Emamghoreishi e Heidari- Hamedani, 2006) usualmente (30

g) em uma única dose antes de dormir (Emamghoreishi et al., 2005).

Rajeshwari e Andallu (2011) mencionaram a presença de ferro, vitaminas

A e C, além da ação antibacteriana, antifúngica, antioxidante, anti-inflamatória do óleo

essencial de C. sativum, sugerindo que todos esses constituintes contribuem para

estimular e fortalecer o sistema imunológico, auxiliar na prevenção e cura de

patologias como a varíola, além de reduzir a dor e acalmar os efeitos da varíola em

pacientes.

A partir do uso milenar muitas pesquisas foram direcionadas com o objetivo

de validar cientificamente o emprego do C. sativum levando em consideração o uso

tradicional e seu potencial farmacológico. Alguns estudos foram conduzidos utilizando

sementes e folhas, em diferentes tipos de extrações originando extratos com

diferentes polaridade e atividade farmacológica, conforme Tabela 1.

Tabela 1 - Atividades farmacológicas de C. sativum nas citações na literatura

Extrato aquoso das sementes (EAS), Extrato etanolico das sementes (EES), Extrato aquoso das folhas (EAF), Extrato hidroalcoólico das sementes (EHS), Extrato metanólico das sementes (EMS), Extrato hidroalcólico das folhas (EHF), Óleo das sementes (OES), Óleo das folhas (OEF).

Atividades Amostra Partes da planta Referências

Antifúngico OEF Folhas Begnami et al., 2010

Anti-helmíntico EAS, EHS Sementes e folhas Eguale et al., 2007

Ansiolítico EAS Sementes Emamghoreishi et al., 2005

Ansiolítico EAF Folhas Latha et al., 2015

Ansiolítico EHS Sementes Mahendra e Bisht, 2011

Anti-acne, caspa EAS Sementes Sathishkumar, 2016

Anti-convulsivante EAS Sementes Emamghoreishi

e Heidari- Hamedani, 2008

Anti-enxaqueca EHS Sementes Kasmaei et al., 2016

Antihiperglicemiante EAS Sementes Gray e Flatt, 1999

Antihipertensivo/ diurético EAS Sementes Jabeen et al., 2009

Antimicrobiano OEF Folhas Matasyoh et al., 2009

Antioxidante EAF, EAS Sementes e folhas Wangensteen et al., 2004

Cardioprotetor SEM Sementes Patel et al., 2012a

Diurético EAS Sementes Aissaoui et al., 2008

Estresse Oxidativo Cerebral EHS Sementes Velaga et al., 2014

Estresse Oxidativo Cerebral EAS Sementes Anaeigoudari et al., 2016

Hipnótico EHF Folhas Rakhshandeh et al., 2012

Hipolipidêmico EAS Sementes Lal et al., 2004

Imunomodulador EAS Sementes Lee et al., 2017

Neuroprotetora para Doença de Alzheimer’s

EAS Sementes Liu et al., 2015

Sedativo/Hipnótico OES, EAS, EHS Sementes e folhas Emamghoreishi

e Heidari- Hamedani, 2006

Sedativo OEF, EHF Folhas Gastrón et al., 2016

16

2.3 Aspecto Nutricional

As propriedades funcionais do C. sativum estão diretamente relacionadas

ao seu forte potencial antioxidante, benefícios nutricionais e propriedades terapêuticas

(Rattanachaikunsopon e Phumkhachorn, 2010).

O suco das folhas frescas é recomendado para pacientes com deficiência

de vitaminas A, B, C devido a presença de minerais, proteínas, flavonoides,

glicosídeos (quercetina, isoquercetina, rutina), carotenos, fibras e carboidratos (Mani

et al., 2009) e pelo fato de possuir uma significante concentração do componente ferro

é indicado para tratamentos de anemias (Rajeshwari e Andallu, 2011).

Ao comparar a composição nutricional das sementes de C. sativum entre

as literaturas (100 gramas) verificou-se uma variação apontando valores inferiores

para o cultivo no Brasil: proteína (11,5 g), lipídeos (15,60 g), cálcio (110 mg), ferro (2

mg), fósforo (45 mg), Vitamina C (0,075 mg), tiamina (0,15 mg), riboflavina (0,28 mg),

niacina (1,6 mg); se comparados as referências de USDA (National Nutrition Data

Base) proteína (12,37 g), lipídeos (17,77 g), cálcio (709 mg), ferro (16,32 mg), fósforo

(409 mg), Vitamina C (21 mg), tiamina (0,239 mg), riboflavina (0,290 mg), niacina

(2,130 mg) (Franco, 2008; Bhat et al., 2014).

A composição e a concentração de princípios ativos, nutrientes,

macromoléculas e vitaminas, podem apresentar grande diferenças conforme origem,

espécie, variedade, controle genético, fase de desenvolvimento durante a colheita,

época da colheita e estímulos proporcionados pelo meio ambiente tais como fatores

climáticos, agentes agressores, exposição a microrganismos, insetos, poluentes, altas

temperaturas e tipo de processo pós-colheita. Todos esses fatores fornecem

propriedades sensoriais específicas ao C. sativum, como uma especiaria aromática,

interferindo diretamente no aumento ou diminuição da concentração dos seus

componentes, princípios ativos e consequentemente sobre suas propriedades

farmacológicas (Ré e Jorge, 2012).

2.4 Atividades Anti-inflamatória, Antinociceptiva e Gastroprotetora

As propriedades do C. sativum relacionadas aos processos inflamatórios

foram mencionadas por Jagtap et al. (2004) que investigaram a partir de um texto

17

originário da medicina indiana uma formulação Ayurvedica milenar composta por

Bilwa (Eagle marmeloes), Dhanyak (Coriandrum sativum), Musta (Cyperus rotundus)

e Vala (Vetiveria zinzanioids) utilizada na prática médica popular em forma de

decocção para tratamento de colites ulcerativas e doenças inflamatórias intestinais.

Os resultados obtidos comprovaram a eficácia da formulação contra doenças

inflamatórias do intestino, demonstrando que os três extratos possuem atividade

citoprotetora, antimicrobiana e anti-inflamatória, sugerindo que o mecanismo de ação

esteja relacionado à diminuição da síntese ou da liberação de mediadores

inflamatórios, corroborando com a validação da atividade anti-inflamatórias do C.

sativum.

Vedjani et al. (2006) investigaram a atividade de uma formulação

carminativa composta por três extratos (Melissa oficinalis, Mentha spicata e

Coriandrum sativum) no alívio da dor/desconforto abdominal e nas flatulências em

pacientes com síndrome inflamatória do intestino irritável (SII). Os resultados

demonstraram uma redução na gravidade e frequência das dores/desconfortos no

grupo que utilizou a formulação carminativa, sugerindo que as plantas contidas nessa

formulação possuem atividade antiespasmódica, analgésica e carminativa sendo

indicadas para tratamento da SII como coadjuvantes.

Reutere et al. (2008) também pesquisaram a atividade anti-inflamatória do

C. sativum por meio de duas preparações tópicas contendo 0,5% e 1% de óleo

essencial das sementes. O efeito das formulações sobre o eritema induzido por UV

foi mensurado por fotometria após 48 horas, e os resultados demonstraram que a

formulação contendo 0,5% de óleo essencial de C. sativum reduziu significantemente

os eritemas induzidos pela radiação UV, sugerindo o uso dessa formulação

concomitantemente na terapia medicamentosa de doenças inflamatórias da pele.

Wu et al. (2010) evidenciaram a atividade anti-inflamatória do extrato

etanólico das folhas de C. sativum frente ao teste de lipopolissacarídeos (LPS)

estimulados dos macrófagos de rato e os resultados revelaram uma significante

diminuição na produção de prostaglandinas (PGE2) e óxido nítrico (NO) devido a

inibição da expressão de COX-2 e iNOS, respectivamente, sugerindo que a atividade

inibitória de C. sativum ocorra, em partes, através da inibição desses mediadores pró-

inflamatórios.

18

Zanusso-Junior et al. (2011) relataram a atividade anti-inflamatória e

antiedematogênica do extrato hidroalcoólico das folhas de C. sativum através dos

testes de pleurisia em ratos, no entanto sem interferir na migração leucocitária.

Enquanto os testes tópicos de edema de orelha em camundongos reduziram tanto o

edema quanto a migração leucocitária. Os resultados revelaram que C. sativum possui

atividade anti-inflamatória, antiedematogênica, porém a inibição da quimiotaxia

somente foi observada por via tópica.

Abordando a atividade antiulcerogênica, Vasudevan et al. (2000)

mencionaram que o extrato aquoso de C. sativum aumenta a secreção gástrica, bem

como proporciona o aumento da secreção de ácidos durante a injúria estomacal,

sugerindo o envolvimento do mecanismo de ação colinérgico juntamente com outros

mecanismos.

Heidari et al. (2005) mencionaram que C. sativum é utilizado na medicina

popular para aliviar enxaquecas, artrite reumatoide, odontalgia, e a partir dessa

informação validaram cientificamente a ação analgésica do extrato metanólico das

sementes de C. sativum, sugerindo o envolvimento de receptores opiódes no

mecanismo de ação.

A atividade gastroprotetora de C. sativum foi descrita por Al-Moflesh et al.

(2006) utilizando extrato aquoso das sementes em modelos experimentais de lesão

gástrica induzida por etanol e determinação da atividade anti-secretora. A

identificação química evidenciou a presença de constituintes antioxidantes como

linalol, flavonóides, cumarinas, catequinas, terpenos e polifenóis, sugerindo que a

inibição da formação de úlceras possa estar relacionada a atividade antioxidante

desses compostos que atuam por sinergismo e também devida a formação de uma

camada protetora na mucosa gástrica através de uma interações hidrofóbicas, por

esses compostos.

Rajeshwari e Andallu (2011) relataram que C. sativum auxilia na secreção

de enzimas, estimulando a digestão e favorecendo movimentos peristálticos, além de

auxiliar na cicatrização de úlceras bucais devido a sua atividade antimicrobiana e

auxiliando na manutenção do hálito devido sua atividade antisséptica, destacando o

composto citronelol.

19

Zaidi et al. (2012) descrevem a significante supressão do extrato

hidroalcóolico de C. sativum frente as espécies reativas de oxigênios (ROS) das

células infectadas de Helicobacter pylori, evidenciando a propriedade citoprotetora

frente as células do epitélio gástrico devido forte atividade antioxidante.

2.5 Aspectos Fitoquímicos

2.5.1 Cumarinas e furanocumarinas lineares

As cumarinas constituem uma classe química dos metabolitos secundários

vegetais presente em diferentes partes das plantas (flores, frutos, caules) distribuídas

em diferentes famílias de Angiospermae : Apiaceae, Rutaceae, Asteaceae, Fabaceae,

Moraceae, Solanaceae, considerando um número de ocorrência (NO) maior

(Ebermann et al., 1996; Ribeiro e Kaplan, 2002), distribuída amplamente entre as

orquídeas, ervas, frutas cítricas, legumes e perfazendo parte essencial da dieta

humana há séculos ( Cai et al., 1993).

Entre as cumarinas destacam-se a furanocumarina linear ou

furoisocumarina que é um fitocomposto aromático tricíclico em que a ligação -(C2=C3)

- do grupo furano é fundida com a ligação -(C6=C7) - da porção bicíclica da cumarina

( Buckle, 2015) conforme Figura 2.

Figura 2 - Estruturas químicas do furano (A), cumarina

(B) e furanocumarina psoraleno (C)

A distribuição de furanocumarina varia muito entre as espécies de plantas,

localização geográfica e clima, sendo encontrada principalmente em frutas cítricas

como: lima, limão, laranja amarga, grapefruit, salsinha, aipo, cenoura, onde o óleo

essencial contém uma alta concentração desses compostos, os quais após

extração/destilação são removidos devido a sua baixa volatilidade (Raquet e Schrenk,

2009).

20

Em 1988, Ceska et al. isolaram a partir do extrato etanólico das sementes

de C. sativum duas isocumarinas fotoativas denominadas coriandrina (majoritária) e

di-hidrocoriandrina (menor proporção), e mencionaram a semelhança estrutural

desses compostos com o psoraleno, utilizado terapeuticamente para tratamentos de

pele, classificando-as como furoisocumarinas lineares ou furanocumarinas conforme

Figura 3.

Figura 3 - Estruturas químicas do psoraleno, coriandrina e

di-hidrocoriandrina.

Baba et al. (1991) a partir do extrato etéreo das folhas de C. sativum

descreveram o isolamento de duas furanocumarinas na forma de dímeros,

denominando-os como Coriandrona A e Coriandrona B.

Posteriormente Kraus e Ridgeway (1994) descreveram pela primeira vez a

síntese total da coriandrina elaborada em nove etapas.

Taniguchi et al. (1996) relataram a partir do extrato metanólico das folhas

de C. sativum o isolamento de três novas furanocumarinas denominando-os de

Coriandrona C, D e E. Após anos de estudos Chen et al. (2009) a partir de óleo

essencial das sementes de C. sativum isolaram e purificaram: coriandrona B,

coriandrina, dihidrocoriandrina e coriandrone A, conforme Figura 4.

21

Figura 4 - Furanocumarinas de C. sativum.

2.5.2 Furanocumarinas e Atividades Biológicas

As furanocumarinas são utilizadas desde épocas remotas para o

tratamento de doenças da pele como psoríase, hanseníase, vitiligo, micoses,

dermatite e eczemas, destacando no Egito Antigo a utilização de extrato de Ammi

Majus (Diederichsen, 1996).

Em um trabalho Ashwood-Smith et al. (1989) evidenciaram as propriedades

da furanocumarina coriandrina (isolada a partir das folhas de C. sativum) atribuindo

efeitos fotosensibilizadores letal e mutagênese frente as bactérias, superiores ao

psoraleno, 5 e 8 MOP (metoxipsoraleno). Mencionando que a faixa de espectro de

absorção da coriandrina é 276-340nm (enquanto psoroleno é 290-326nm) sendo 1,6

vezes mais bactericida que o psoraleno e 1,9 mais ativa que 8MOP.

Outro teste realizado com a coriandrina foi a reação de fotossensibilização

em peles humanas, onde não apresentou nenhuma reação tópica se comparado a

furanocumarina angelina, 8MOP, 5MOP e psoraleno, os quais apresentaram reações

de eritema. Sugerindo assim que a metabolização da coriandrina ocorra muito

22

rapidamente frente aos demais compostos, ou evidenciando a ineficácia da via tópica

devido inativação ou outros mecanismos de ação desconhecidos (Raquet e Schrenk,

2009).

Woo et al. (1983) relataram que a coriandrina foi metabolizada rapidamente

pelo fígado, sugerindo que após absorção atue diretamente com as enzimas

microssomais.

As furanocumarinas (presente na dieta cotidiana) são potentes inibidores

in vitro de monoxidase microssomal, cujo mecanismo de ação é a modulação/

inativação do citocromo P450. A coriandrina é um composto competitivo e não

competitivo frente à enzima citocromo P450 1A1 e P450 2B1,respectivamente

enquanto a di-hidrocoriandrina é apenas um inibidor competitivo. Sugerindo que a

coriandrina pode ligar-se não apenas ao substrato, mas também em um sitio adicional

e causar a inativação da atividade enzimática em maior proporção (Cai et al., 1993).

Posteriormente o mecanismo de ação da coriandrina foi elucidado por Cai

et al. (1996) que mencionaram ser metabolicamente ativada por microssomos

hepáticos, induzindo a formação de um intermediário eletrofílico (aducto) o qual se

liga covalentemente ao citocromo P450 1A1,inativando-o.

Cai et al. (1997a) descreveram a propriedade da coriandrina frente ao

bloqueio do início do tumorigênese em pele de cobaia e outros tecidos in vitro,

sugerindo que sua atividade anticarcinogênica seja devido o mecanismo de ação em

bloquear o DNA através da formação de um aducto e inibindo a iniciação do tumor,

citando também que esse mecanismo esteja interligados com a inibição do citocromo

P450s envolvido na ativação do processo tumoral (Cai et al., 1997b).

Quanto a elucidação do mecanismo de ação da coriandrina, Ashwood-

Smith et al. (1989) mencionaram que a coriandrina é muito mais potente que demais

furanocumarinas, no entanto não causou irritação cutânea, nem eritrema e formação

de bolhas durante o teste de atividade fotossensibilizante. Muitas reações de

sensibilidade cutanea estão relacionadass com a formação de ligação cruzada entre

as furanocumarinas com o DNA, no entanto, a coriandrina não apresentou esses

efeitos colaterias, sugerindo que seu mecanismo de ação não está intrinsicamente

relacionado com o entrelaçamento e ligação cruzada com o DNA, ou é relativamente

baixa a sua atividade fotossensibilizadora na pele ou ineficácia de ação cutânea

23

tópica. Sugerindo também um mecanismo de ação distinto das demais

furanocumarinas.

2.5.3 Sistema Nervoso Central e Atividade Antioxidante de C. sativum

Na medicina popular o suco de folhas frescas (30 g), o chá, ou o pó das

sementes moídas de C. sativum são recomendados em uma única dose antes de

dormir, para alivio da ansiedade, insônia e depressão evidenciando o seu uso para

desordens do SNC (Emamghoreishi et al., 2005).

Os prejuízos ocasionados pelo estresse oxidativo, seguido da elevação da

concentração de espécies reativas de oxigênio (ROS) na região cerebral contribuem

para danos oxidativos teciduais irreversíveis, desordens cérebrovascular (CVD),

deficiências neurocomportamentais, psiquiátricas e cognitivas como: depressão,

ansiedade e perda de memória (Qureshi et al., 2004; Reilly et al., 2011).

Diversos trabalhos foram publicados do C. sativum frente atuação no SNC

de maneira preventiva ao estresse oxidativo, inibindo a formação de ROS e evitando

a consequente injúrias teciduais. Emanghoreishi e Heidari-Hamedani (2008)

atribuíram atividade anticonvulsivante dos extratos hidroalcoólico, aquoso, e óleo

essencial das sementes de C. sativum, sugerindo que a forte atividade antioxidante

contribua para o mecanismo de ação. Os resultados de Anaeigoudari et al. (2016)

corroboram com essa afirmativa sugerindo que a forte atividade antioxidante do C.

sativum tenha contribuindo como pano de fundo para potencializar a atividade

anticonvulsivante.

Hosseinzadeh e Madanifard (2010) mencionaram a atividade

anticonvulsivante dos extratos aquoso e etanóico das sementes de C. sativum

diminuindo a duração das convulsões tônicas, atribuindo o mecanismo de ação aos

compostos furanocumarinas. Patel et al. (2012a) relatam que o extrato metanólico das

sementes de C. sativum possui ação cardio-protetora frente ao infarto de miocárdio,

atribuindo essa atividade a alta concentração de compostos polifenóis responsáveis

pela prevenção de danos oxidativos através da remoção efetiva de IROS.

Conforme Cioanca et al. (2014), a doença de Alzheimer (AD) é considerada

uma doença neurodegenerativa, com agressão progressiva/contínua pelo estresse

oxidativo, desencadeado o processo inflamatório, neurotoxicidade e perda neuronal,

24

contribuindo para aumento da severidade do declínio da cognição. A inalação do óleo

volátil de C. sativum pode ser considerado como coadjuvante em um processo

complementar tanto para o tratamento quanto na prevenção da condição de demência

da AD, pois o atua como neuroprotetivo devido ao bloqueio do estresse oxidativo. Liu

et al. (2016) relataram que o extrato etanólico das folhas de C. sativum tem ação

antioxidante, anti-inflamatória e neuroprotetiva para o paciente com AD, sugerindo sua

ingestão diária.

O extrato aquoso das sementes de C. sativum demonstrou efeito

ansiolítico, sedativo e relaxante muscular (Emamghoreishi et al., 2005).

Posteriormente Mahendra e Bisht (2011) elucidaram a atividade ansiolítica do extrato

hidroalcoólico das sementes de C. sativum. Enquanto Rakhshandeh et al. (2012)

mencionaram que a fração acetato de etila obtida das folhas de C. sativum possui

atividade hipnótica com o prolongamento do sono, sem causar efeitos nefrotóxicos.

Essa propriedade ansiolítica, sedativa, anticonvulsivante e depressora do C. sativum

tem sido atribuída a presença de composto polifenóis (flavonoides) e afinidade pelos

receptores benzodiazepínicos (Nassiri-Asl et al., 2010; Anaeigoudari et al., 2016). Os

resultados apresentados por Patel et al. (2013) demonstraram que o extrato

metanólico das sementes de C. sativum foi eficiente prevenindo a oxidação e

modificação de LDL devido a alta concentração de polifenóis, os quais atuam contra

os danos oxidativos, sugerindo assim que C. sativum tem potencial anti-aterogênico.

25

3 PROPOSIÇÃO

Foram objetivos do presente estudo:

Avaliar diferentes extratos e técnicas de extração objetivando o melhor

rendimento do extrato, bem como maior concentração das

furanocumarinas de interesse;

Identificar o melhor extrato purificado;

Identificar os principais compostos presentes no extrato

diclorometânico oriundo de folhas de C. sativum e da sua fração

etilacetato de etila (FAc);

Avaliar as atividades antiulcerogênica, anti-inflamatória e

antinociceptiva da FAc em modelos in vivo.

26

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Ensaios Fitoquímicos

4.1.1 Solventes e Reagentes

Foram utilizados o formaldeído da Chemco (Indústria e Comércio Ltda,

Hortolândia, SP) e o Tween 80 da Mapric (Produtos Farmacocosméticos ltda, São

Paulo, SP). Todos os demais reagentes, tais como cloreto de sódio, acetato de etila,

anidrido acético, diclorometano, ácido acético glacial, etanol, hexano, metanol e a

solução de anisaldeído (ácido acético: ácido sulfúrico: anisaldeído [50:1:0,5]) foram

obtidos da Labsynth (Produtos para Laboratórios Ltda, Diadema, SP), com grau P. A.

ou HPLC.

4.1.2 Equipamentos

Foram utilizados moinho de facas (Marconi Equipamentos para

Laboratórios Ltda, Piracicaba, SP), estufa de circulação de ar forçado (Blue M -

Thermal Product Solutions, New Columbia, Pennsylvania), dispersor mecânico (Ultra

Turrax T10,T50,basic IKA, Biovera, Rio de Janeiro, RJ), rotaevaporador (modelo 550

Fisaton, Quimis Aparelhos Cientificos, Diadema, SP), cromatógrafo a gás (HP-6890)

acoplado a detector seletivo de massa (HP-5975,Hexis Cientifica, Jundiai- SP), e

cromatógrafo líquido de alta eficiência (Sistema Alliance Waters) acoplado a detector

de arranjo de diodos (Waters 2996) e de massas (CLAE-DAD-EM- Analítica- São

Paulo- SP).

4.1.3 Material vegetal

O C. sativum foi adquirido no comércio regional (CEASA/Campinas-SP)

nas seguintes datas: 19/02/2008 (40,63 Kg), 20/01/2010 (10,44 Kg) e 07/04/2010

(34,61 Kg). A identificação botânica seguiu o sistema de classificação APGIII (2009),

sendo que o nível de espécie foi confirmado pelo taxonomista Dr. Luis Carlos

Bernacci, com base na literatura conforme Lorenzi e Matos (2002) e por comparação

com as amostras herborizadas da coleção interna Herbário do Instituto Agronômico

de Campinas- SP (IAC n° 6855,8814 e 44429).

27

4.1.4 Extração

As folhas e talos de C. sativum foram separados das raízes, secos em

estufa com circulação de ar forçado a 45°C durante três dias, submetidos à moagem

em moinho de facas, obtendo-se o material seco (Figura 5A-B).

Figura 5 - Foto ilustrativa do C. sativum fresco

adquirido no CEASA- Campinas-SP (A)

separado as folhas, talos e raízes (B)

secagem em estufa durante três dias.

O extrato de diclorometano foi preparado a partir de 1 kg de planta seca e

moída com 3,5 L de diclorometano, em dispersor mecânico durante 10 minutos, a

1600 rpm. O extrato foi filtrado em peneira metálica Granutest ABNT 70,abertura MM

0,210 e tyler 65,e o resíduo da planta re-extraído (2x) com 2,0 L de diclorometano. Os

filtrados foram agrupados, filtrados à vácuo em funil de placa porosa e secos no

rotaevaporador até remoção do solvente, originando o extrato diclorometano seco

(ED).

O resíduo da planta restante foi submetido à segunda extração sucessiva

com 2 L de EtOH (96%), utilizando-se o dispersor por 10 minutos. Após a filtração,

repetiu-se o procedimento (2x) e os extratos recolhidos foram concentrados em

evaporador rotativo até eliminação do etanol, obtendo-se o extrato etanólico seco

(EE).

28

4.2 Métodos de Separaçâo

4.2.1 Cromatografia em Coluna Clássica

A cromatografia em coluna clássica foi realizada a partir de 22 g do ED,

utilizando como suporte uma coluna de vidro de 40 cm de altura e 6 cm de diâmetro,

previamente empacotada com hexano e 66 g de silicagel 60 (Merk, 0,063-0,200mm)

como fase estacionária. Foi utilizado uma proporção de 1 parte de amostra/ 3 partes

de silicagel para a montagem da coluna (1:3).

Na fase móvel foram utilizados gradientes de hexano (1000 mL),

hexano:AcOEt (90:10 - 4000 mL), hexano: AcOEt (1:1- 3000 mL) e AcOEt (700 mL).

O gradiente de solventes foi aumentando de acordo com o perfil das frações

monitoradas por cromatografia de camada delgada (CCD). No total, trinta e seis

frações foram recolhidas, a cada 250 mL, as quais originaram 10 frações agrupadas.

As frações que apresentaram semelhança por CCD foram agrupadas, filtradas à

vácuo em funil de placa porosa e evaporadas até remoção do solvente (Figura 6).

29

Figura 6 - Fluxograma das etapas envolvidas nas diferentes formas de fracionamento do ED

e identificação de furanocumarinas.

4.2.2 Cromatografia Partição líquido-líquido

Parte do ED (10 g) foi solubilizado em 200 mL de solução EtOH:H2O (1:1),

transferido para um funil de separação, juntamente com 200 mL de hexano, submetido

à agitação vigorosa com posterior repouso até total separação visível das fases,

recolhendo-se a fase hexânica (orgânica). Repetiu-se três vezes o procedimento,

agrupou-se as fases orgânicas, obtendo-se uma fase hidroalcoólica e uma fase

hexânica, que foram secas em rotaevaporador, originando as frações: hexânica (FEH)

e hidroalcóolica (FHA).

30

4.2.3 Cromatografia em Coluna Seca

A cromatografia em coluna foi efetuada a partir de 570 mg da fração

hidroalcóolica (FHA), utilizando-se uma membrana de acetato de celulose (2 cm de

diâmetro, 35 cm de altura) como suporte, previamente empacotada com 1,7 g de

silicagel 60 (Merk, 0,063-0,200mm) como fase estacionária e acetato de etila:metanol

(95/5 v/v) para a fase móvel. Foi utilizada uma proporção de 1 parte de FHA/ 3 partes

de silicagel para a montagem da coluna seca (1:3). Após o término da elução, a coluna

cromatográfica foi cortada em sete partes, originando sete frações que foram

extraídas, filtradas e submetidas à secagem originando FHA1-2; FHA3; FHA4; FHA5;

FHA6 e FHA7.

4.2.4 Cromatografia em Coluna Filtrante

A cromatografia em coluna filtrante foi realizada a partir de 14 g de ED

utilizando como suporte um funil de placa porosa (n°3,9 cm de altura, 10 cm de

diâmetro, capacidade de 1000 mL), previamente empacotado com 42 g de sílicagel

60 umedecida com hexano, como fase estacionária. Foi utilizada uma proporção de 1

parte de ED/3 partes da silicagel para a montagem da coluna filtrante (1:3).

Para a fase móvel foram usados gradientes de hexano (500 mL); acetato

de etila (1000 mL) e acetato de etila:metanol (1:1 - 1000 mL). As frações foram

submetidas à secagem em rotaevaporador até remoção dos solventes originando as

frações hexânica (FHx), acetato de etila (FAc) e acetato de etila:metanol (FAcMe).

4.2.5 Cromatografia em Camada Delgada

As cromatografias em camada delgada (CCD) foram efetuadas utilizando

cromatofolhas de alumínio, de 20 cm x 20 cm, com fase estacionária de sílicagel 60

(F254 – Merck). Os eluentes utilizados foram Hex:AcOEt (70:30 v/v) e Hex:AcOEt (1:1

v/v). A detecção dos compostos foi realizada a partir da observação por irradiação sob

luz UV a 254 e 366 nm, com posterior pulverização com solução de anisaldeido,

seguidas de aquecimento em estufa a 100ºC durante cinco minutos.

31

4.3 Métodos de Identificação

4.3.1 Análise por Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas

As análises foram realizadas em um cromatógrafo a gás HP-6890 acoplado

a detector seletivo de massas HP-5975. Foi utilizada uma coluna capilar de sílica

fundida HP-5MS (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm) com hélio como gás de arraste (1,0

mL.min-1). As temperaturas do injetor detector foram 250°C e 300°C respectivamente,

com uma programação de temperatura para a coluna de 110°C a 280°C (5°C. min-1),

permanecendo nesta temperatura por 26 minutos. As análises de identificação foram

realizadas a partir da avaliação dos fragmentogramas dos principais picos presentes

na amostra, em comparação com os dados obtidos na biblioteca NIST do

equipamento CG-EM (HP6890/HP-5975) e posteriormente com os dados da literatura.

Para a avaliação dos resultados foi considerado cada pico cromatográfico

representado por um composto, o qual foi integrado de acordo com o seu tempo de

retenção, gerando uma percentagem relativa específica para cada composto químico.

A somatória de cada pico origina a somatória total do cromatograma, perfazendo uma

área de 100%. Assim, a percentagem relativa de cada composto é calculada em

função do número de picos detectados, em função de cada área.

4.3.2 Análise por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada a Detector

de Arranjo de Diodo e de massas CLAE-DAD-EM

As análises foram realizadas em Sistema Alliance Waters, composto por

bomba 2695,detector de arranjo de diodos 2996,injetor automático, detector de

massas 3100,forno para aquecimento de coluna e software Empower. Foi utilizada

uma coluna C-18,Symetry (100 x 2,1 mm, 3,5 µm (30°C) e como eluentes a água (A)

e metanol (B) em modo gradiente (Tabela 2), com vazão 0,25 mL/min. Foram

empregados detectores DAD (scan 200 a 400 nm, leitura a 254 nm) e MS/ESI positivo

(capilar 4kV; cone 30 V; extrator 2V; fonte 120ºC; dessolvatação 250°C; vazão do gás

de dessolvatação 400 L/h e cone 40 L/h). As amostras testadas foram preparadas em

metanol P.A. na concentração 400 µg/mL sendo injetados 10µL dessa solução.

32

Tabela 2 - Relação eluentes água (A) e metanol (B), em modo gradiente

Tempo (min) % A % B

0 50 50

40 20 80

45 20 80

55 50 50

70 50 50

4.4 Ensaios Farmacológicos In Vivo

Frente aos resultados apresentados pelas frações constituídas pelas

furanocumarinas versus o rendimento, optou-se em dar continuidade aos testes in vivo

a partir Fac e não de suas frações, considerando-se que essa técnica de extração

otimizou o tempo, atingindo melhores resultados de rendimento/ concentração de

duas furanocumarinas de interesses.

4.4.1 Material e Métodos

4.4.2 Fármacos e reagentes

Foram utilizados carbenoxolona dissódica, cimetidina, N-etilmaleimida

(NEM), cloridrato de dexametasona, indometacina, ácido acético, carragenina,

capsaicina (Sigma-Chemical Company-USA). A morfina foi adquirida da FHC (FHC

Farmacêutica, Lda., Laboratórios Basi Indústria Farmacêutica, S.A., Coimbra,

Portugal). Todas os fármacos foram solubilizados em solução salina (NaCl 0,9%),

juntamente com 0,5% de Tween 80.

4.4.3 Animais

Os animais foram obtidos do Centro de Bioterismo da UNICAMP (CEMIB)

e mantidos em câmaras com temperatura controladas (25 ± 2°C) em ciclos claro-

escuro de doze horas, com água e ração ad libidum. Foram utilizados camundongos

da linhagem Swiss, machos adultos, com a 5-8 semanas e com peso corporal variando

entre 25-30 g para os ensaios de toxicidade, atividade antinociceptiva e anti-

inflamatória. Para os testes de atividade antiulcerogênica, foram utilizados ratos da

33

linhagem Wistar, machos, adultos, com 5-8 semanas, com peso corporal variando

entre 250-350 g.

Todos os animais foram aclimatados às condições do laboratório por sete

dias, sendo agrupados ao acaso, em grupos de até 10 animais, dentro das normas de

boas práticas de manutenção e tratamento animal. Todos os experimentos foram

conduzidos com aprovação da Comissão de Ética em Experimentação Animal do IB-

UNICAMP, protocolo n°2483-1 (atividade antinociceptiva e anti-inflamatória, conforme

ANEXO I) e protocolo n°2484-1 (atividade antiulcerogênica, conforme ANEXO II).

4.4.4 Avaliação de toxicidade aguda (Screening Hipocrático)

Para a determinação do perfil de toxicidade aguda foram utilizados grupos

de três camundongos, os quais foram tratados por via intraperitoneal (i.p.) com doses

únicas de 300,500 e 1000 mg/kg do ED de C. sativum. Somente este extrato foi

utilizado, pois foi o que apresentou o maior rendimento.

Os grupos foram observados continuamente por período de 4 horas e,

então, diariamente em um intervalo de 15 dias. Foram avaliados sinais de toxicidade

geral, como os efeitos na locomoção, comportamento (agitação, atividade reduzida,

sonolência), respiração, salivação, lacrimejamento, cianose de extremidades e

mortalidade (Lapa et al., 2008).

A partir do ensaio de toxicidade aguda, foram determinadas as doses

tóxicas do ED que serviram como parâmetro para os ensaios posteriores, visando a

avaliação das atividades antinociceptiva, anti-inflamatória e antiulcerogênica in vivo.

Dentre as frações do ED, a fração acetato de etila (FAc) mostrou o maior

rendimento (61%) e a maior concentração das furanocumarinas coriandrina e di-

hidrocoriandrina, e por esse motivo os demais ensaios farmacológicos foram

conduzidos utilizando apenas essa fração (Figura 7).

34

Figura 7 - Fluxograma das etapas envolvidas nos testes in vivo da FAc obtida a partir do ED das folhas de C. sativum.

4.5 Atividades Antinociceptiva e Anti-Inflamatória

4.5.1 Avaliação da Atividade locomotora

Nesse ensaio, grupos experimentais de oito camundongos (Swiss) foram

tratados pela via intraperitoneal (i.p.) com solução de NaCl 0,89% (10 mL/kg) e com

FAc nas doses de 30,100 e 300 mg/kg. Após trinta minutos do tratamento, os animais

foram transferidos para o open-field (consiste em uma caixa plástica medindo

45x45x20 cm, com o fundo dividido em 9 áreas iguais - 15x15 cm), onde o número de

áreas cruzadas pelas 4 patas dos animais foi contado em sessões de 6 minutos e

tomadas como índice comportamental (Mattei e Carlini, 1996).

35

4.5.2 Teste de contorções abdominais induzidas por ácido acético

Grupos experimentais de seis camundongos (Swiss) foram tratados pela

via intraperitoneal (i.p.) e pela via oral (v.o), com 10 mL/kg de solução de NaCl 0,89%

(controle negativo), 20 mg/kg de Indometacina (controle positivo) e com FAc nas

doses de 10,30,100 e 300 mg/kg.

Os animais tratados pela via oral, após 60 minutos do tratamento,

receberam ácido acético a 0,8% (10 mL/kg i.p.) em solução salina, enquanto outros

grupos tratados pela via intraperitoneal receberam injeção i.p. de ácido acético a 0,8%

(10 mL/kg), 30 minutos após tratamento.

As contorções abdominais, seguidas de torções do tronco e extensão dos

membros posteriores foram contadas cumulativamente por 15 minutos, determinando

a atividade antinociceptiva por comparação com o controle negativo (Koster et al.,

1959,Vacher et al., 1964). Esse ensaio foi realizado por duas vias de administração

diferentes para comparação entre ambas (Rabelo et al., 2013).

4.5.3 Teste de Formalina

Para esse ensaio, grupos experimentais de seis camundongos (Swiss)

foram tratados pela via i.p. com 10 mL/kg de solução de NaCl 0,89% (controle

negativo), 20 mg/kg de morfina (controle positivo Fase I), 5 mg/kg de dexametasona

(controle positivo Fase II) e com FAc nas doses de 10,30 e 100 mg/kg. Após 30

minutos, foi administrada uma solução de formalina, na concentração de 2%, por via

intraplantar (20 μl/pata) na superfície ventral da pata posterior direita. Foi medido o

tempo em que os animais permaneceram lambendo as patas durante um período total

de 45 minutos, como indicativo de nocicepção. Os primeiros cinco minutos

determinam resposta à dor de origem neurogênica, enquanto dos 25-45 minutos

restantes determinam a resposta à dor de origem inflamatória (Soares et al., 2009;

Costa e Souza et al., 2010).

4.5.4 Teste de Edema de pata induzido por carragenina

Inicialmente o volume basal da pata traseira direita dos camundongos foi

avaliado em aparelho de hidropletismômetro. Grupos experimentais de oito

camundongos, foram tratados com 10 mL/kg de solução de NaCl 0,89% - pela via i.p.

36

(controle negativo), 20 mg/kg de dexametasona (controle positivo) e com FAc nas

doses de 30,100 e 300 mg/kg. Após 30 minutos, a inflamação foi induzida através da

injeção de carragenina (40 μL - diluída em solução salina na concentração de 3%) na

face ventral da pata traseira direita. A leitura do volume (edema) das patas traseiras

direitas foi realizada nos tempos 0h (basal), 2h, 4h e 6h (fase inicial) e 24h, 48h e 72h

(fase tardia), tendo como controle o volume basal antes da indução da inflamação.

Após 72 horas, os animais foram submetidos à eutanásia por deslocamento cervical

(Nunes et al., 2007).

4.5.5 Teste de Capsaicina

Grupos experimentais de seis animais (Swiss) foram tratados pela via i.p.

com 10 mL/kg de solução de NaCl 0,89% (controle negativo), 20 mg/kg de morfina

(controle positivo) e com FAc nas doses de 30,100 e 300 mg/kg. Após 30 minutos, foi

administrado solução de capsaicina (diluída em solução salina, na concentração de

1,6 µg/pata) na pata posterior direita do animal (50 μl/pata). O tempo que os animais

permaneceram lambendo as patas, durante um período de 5 minutos, foi indicativo de

nocicepção e dor de origem neurogênica (Lapa et al., 2008).

4.6 Atividade Antiulcerogênica

4.6.1 Testes de lesão gástrica induzida por etanol absoluto

Foram utilizados grupos experimentais de cinco ratos (Wistar), submetidos

a jejum de 12 horas e com livre acesso à água. Posteriormente, foram tratados por via

oral com NaCl 0,89% (10 mL/kg, controle negativo), carbenoxolona 200 mg/kg

(controle positivo) e FAc nas doses de 100,300 e 1000 mg/kg.

Após uma hora do tratamento, os animais receberam 1,0 mL de etanol

absoluto por via oral, independente do peso (Robert, 1979). Após uma hora da

administração do etanol absoluto, os animais foram anestesiados e submetidos à

eutanásia por deslocamento cervical, os estômagos foram retirados, abertos ao longo

da maior curvatura e lavados em solução NaCl 0,89% para realização da avaliação

visual das lesões produzidas e avaliação do índice de lesões ulcerativas (ILU).

37

O ILU foi calculado posteriormente por meio de somatória dos parâmetros

a seguir, de acordo com a seguinte classificação proposta por Gamberini et al., (1991):

Até 10 petéquias 1 ponto

Até 20 petéquias 2 pontos

Até 30 petéquias 3 pontos

Úlceras de até 1 mm n* x 2

Úlceras maiores que 1 mm n* x 3

Hemorragia 1 ponto

Perda de pregas 1 ponto

Perda de coloração 1 ponto

* n refere-se ao número de lesões encontradas

Para a determinação da porcentagem de inibição do ILU apresentados pelos

grupos tratados em relação ao grupo controle, foi usada a seguinte fórmula:

Inibição do ILU = Média Controle - Média tratado x 100

Média Controle

4.6.2 Estudo da participação da prostaglandina na citoproteção gástrica

Quatro grupos experimentais constituído por seis ratos (Wistar) foram

submetidos a jejum, por um período de 12 horas com livre acesso a água. Os grupos

foram distribuídos da seguinte forma:

Seis animais receberam solução de NaCl 0,89% (10 mL/kg, controle negativo).

Após 30 minutos, receberam novamente NaCl 0,89% (10 mL/kg);

Seis animais receberam indometacina (5,0 mg/kg/i.p.). Após 30 minutos,

receberam NaCl 0,89% (10 mL/kg);

Seis animais receberam solução de NaCl 0,89% (10 mL/kg, controle negativo).

Após 30 minutos, receberam FAc na dose de 300 mg/kg/i.p.;

Seis animais receberam indometacina (5,0 mg/kg/i.p.). Após 30 minutos,

receberam FAc na dose de 300 mg/kg/i.p.

Após uma hora dos tratamentos, todos os animais foram anestesiados e

eutanasiados por deslocamento cervical para retirada do estômago.

38

4.6.3 Estudo da participação das substâncias sulfidrílicas não protéicas na

citoproteção gástrica

Quatro grupos experimentais constituído por seis ratos (Wistar) foram

submetidos a jejum, por um período de 12 horas com livre acesso a água. Os grupos

foram distribuídos da seguinte forma:

Seis animais receberam solução de NaCl 0,89% (10 mL/kg, controle negativo).

Após 30 minutos, receberam novamente NaCl 0,89% (10 mL/kg);

Seis animais receberam N-etilmaleimida (alquilante de função sulfidrila), na

dose de 10 mg/ kg, por via subcutânea. Após 30 minutos, receberam NaCl

0,89% (10 mL/kg);

Seis animais receberam solução de NaCl 0,89% (10 mL/kg, controle negativo).

Após 30 minutos, receberam FAc na dose de 300 mg/kg/i.p.;

Seis animais receberam N-etilmaleimida (alquilante de função sulfidrila), na

dose de 10 mg/ kg, por via subcutânea. Após 30 minutos, receberam FAc na

dose de 300 mg/kg/i.p.

Após uma hora dos tratamentos, todos os animais foram anestesiados e

eutanasiados por deslocamento cervical para retirada do estômago.

4.6.4 Estudo da atividade anti-secretora

Três grupos experimentais de cinco ratos (Wistar) foram submetidos a

jejum, por um período de 12 horas com livre acesso a água. Os animais foram

anestesiados com pentobarbital sódico 3% para realização de tricotomia, incisão

abdominal e a ligadura do piloro. Logo após a ligadura cada grupo recebeu por via

intraduodenal os seguintes tratamentos:

Solução de NaCl 0,89% 10 mL/kg (grupo controle negativo);

Cimetidina 100 mg/kg (grupo controle positivo);

FAc 300 mg/kg.

O abdômen foi suturado e após 4 horas os animais foram anestesiados,

eutanaziados por deslocamento cervical, o abdômen foi aberto e o estômago retirado

para a determinação do volume do conteúdo estomacal, pH e concentração de íons

H+ (mEq/L/4h). A mucosa gástrica foi lavada com 2 mL de água deionizada,

39

recolhendo-se o suco gástrico e o lavado em tubos de ensaios para a centrifugação

(2500 rpm durante 10 minutos). Após a centrifugação, o volume gástrico foi

quantificado em proveta, o valor do pH foi medido por meio de pHmêtro e a acidez

total (mEq [H+]/mL/4 h) foi quantificada por titulação com NaOH 0,1 N (fator de

correção 1,087), utilizando fenolftaleína 2% como indicador ácido-base (Shay et al.,

1945; Domer, 1971).

4.7 Análise dos Dados

Os resultados foram submetidos ao teste de Bartlett para avaliar a

homogeneidade de variância e teste de Shapiro-Wilk para determinar a distribuição

dos dados.

Os dados obtidos na avaliação da atividade locomotora, nas contorções

abdominais induzidas por ácido acético, no teste da formalina e no teste de capsaicina

foram submetidos ao teste de Kruskal-Wallis, seguido do teste SNK, como post hoc.

Os resultados do edema de pata induzida por carragenina foram previamente

submetidos à prova Runs para determinar o desvio de linearidade. Em seguida, os

dados foram submetidos à análise de regressão linear.

Os resultados relativos à atividade antiulcerogênica foram submetidos à

one-way ANOVA e teste de Tukey, com correção para comparações múltiplas, exceto

para o teste da carbenoxolona, o qual foi submetido ao teste de Kruskal-Wallis e Dunn.

O nível de significância foi ajustado para 5% em todos os testes. Os

softwares GraphPad 7.0 e BioEstat 5.0 foram utilizados para analisar todos os dados.

40

5 RESULTADOS

5.1 Fitoquímica

5.1.1 Obtenção dos Extratos ED e EE

Os extratos ED e EE foram obtidos a partir de 1000 g das folhas secas e

moídas de C. sativum através de extração no sistema do tipo Ultra-Turrax, e após

secagem obteve-se 36,70 g (3,67%) e 27,30 g (2,73%), respectivamente.

A partir da avaliação dos fragmentogramas dos principais picos observados

nos cromatogramas obtidos por CG-EM dos extratos ED e EE, da comparação com

os dados obtidos da biblioteca NIST no CG-EM e dados da literatura (Ashwood-Smith

et al., 1989; Ceska et al., 1988; Hudson et al., 1993; Kraus e Ridgeway 1994) foi

possível sugerir a presença dos compostos apresentados na Tabela 3.

Tabela 3 - Compostos identificados no ED e EE a partir da análise comparativa dos

fragmentogramas e suas percentagens relativas (%).

Percentagem Relativa (%)

Compostos MM tR min ED EE

Ácido n-hexadecanóico 256 18,24 6,91 -

Palmitato de etila 284 18,80 - 1,79

di-hidrocoriandrina 232 19,53 15,64 13,36

coriandrina 230 20,04 5,37 5,04

Fitol 296 20,97 7,01 3,21

Ácido α-linolênico 278 21,84 12,58 1,45

Linoleato de etila 306 21,96 - 2,21

Estigmasterol 412 38,86 7,04 3,27

β-sitosterol 414 40,26 - 2,33

α- sitosterol 414 40,12 0,99 4,74

Massa Molecular (MM); tempo de retenção (tR).

Inicialmente o extrato diclorometânico (ED) foi obtido a partir das folhas

secas de C. sativum e os resíduos re-extraídos com etanol originando o extrato

etanólico (EE). Para o ED foi evidenciado a presença de ácidos de cadeia longa tais

como o ácido n-hexadecanóico (ácido palmítico, representando 6,91%) e o ácido 9(Z),

12(Z), 15(Z)-octadecatrienóico (ácido α-linolênico, representando 12,58%). Alguns

41

triterpenos, também foram identificados com tempo de retenção maior que 30 minutos

(tR>30 min), como o estigmasterol (7,04%) e α-sitosterol (4,74%), além da di-

hidrocoriandrina (15,64%), da coriandrina (5,37%) e do fitol (7,01%). Enquanto para o

EE foi possível sugerir a presença de ácido α-linolênico (1,45%), estigmasterol

(3,27%), β-sitosterol (2,33%), di-hidrocoriandrina (13,36%) e coriandrina (5,04%),

além do fitol (3,21%). No entanto, todos estes constituintes foram identificados em

menor proporção em comparação ao ED.

Após análise fitoquímica, se verificou que o ED tinha maior concentração

das furanocumarinas, com rendimento de 3,67%, enquanto que o EE apresentou

rendimento de 2,73% e menor proporção dos compostos de interesse. Por esse

motivo, o ED foi fracionado por métodos cromatográficos, em diferentes etapas

visando validar uma melhor técnica frente ao maior rendimento.

5.1.1.1 Fracionamento em Coluna Cromatográfica Clássica

O ED apresentou o maior rendimento e foi submetido ao fracionamento em

coluna cromatográfica clássica, com solventes de diferentes polaridades, originando

36 frações que foram agrupadas de acordo com semelhança no perfil cromatográfico

, conforme Tabela 4.

Tabela 4 - Massa das frações obtidas em coluna cromatográfica clássica do ED

Frações originais Eluente Frações agrupadas Massa (g)

F1-4 Hex 100% FAg1 0,20

F5-6 Hex : AcOEt (90:10) FAg2 2,02

F7-9 Hex : AcOEt (90:10) FAg3 5,32

F10-18 Hex : AcOEt (90:10) FAg4 1,49

F19-21 Hex : AcOEt (1:1) FAg5 0,19

F22 Hex : AcOEt (1:1) FAg6 0,13

F23-24 Hex : AcOEt (1:1) FAg7 3,10

F25-27 Hex : AcOEt (1:1) FAg8 1,12

F28-29 Hex : AcOEt (1:1) FAg9 0,97

F30-36 AcOEt 100% FAg10 1,73

42

Posteriormente as frações foram analisadas por Cromatograma em

Camada Delgada (CCD) utilizando-se como eluente hexano: AcOEt (70:30 v/v) e as

frações foram reagrupadas em 10 frações conforme a semelhança de polaridade

apresentada no perfil cromatográfico, conforme Figura 8.

Figura 8 - Perfil da CCD das frações

FAg1,FAg2,FAg3,FAg4,FAg5,FAg6,FAg

7,FAg8,FAg9 e FAg10 resultantes da

Coluna Cromatográfica Clássica do ED.

A partir da avaliação dos fragmentogramas dos principais picos observados

por cromatogafia gasosa evidenciou-se que as frações FAg7,FAg8,FAg9 e FAg10

apresentaram compostos com características de furanocumarinas, sendo submetidas

simultaneamente à análise por CG-EM para identificação dos compostos. A análise

por CG-EM sugeriu a presença da di-hidrocoriandrina nas frações FAg7 (21,64%),

FAg8 (78,84%), FAg9 (40,52%) e FAg10 (2,94%), e da coriandrina nas frações FAg7

(34,91) e FAg8 (14,65%) conforme Tabela 5.

Tabela 5 - Furanocumarinas identificadas nas frações FAg7 -FAg10 a partir da análise comparativa dos fragmentogramas e suas percentagem relativas (%).

Percentagem Relativa (%)

Compostos MM tR (min) ED FAg7 FAg8 FAg9 FAg10

di-hidrocoriandrina 232 19,52 15,66 21,64 78,84 40,52 2,94

coriandrina 230 20,05 5,37 34,91 14,65 - -

Massa Molecular (MM), tempo de retenção (tR), (%) Fração em porcentagem da área total integrada para o cromatograma

43

As frações FAg7 e FAg8 apresentaram uma maior concentração das

furanocumarinas de interesse, bem como maior rendimento. No entanto, essa técnica

de extração demonstrou-se muito onerosa e dispendiosa (36 frações).

5.1.2 Partição líquido-líquido

A partir de 10 g do ED obteve-se duas frações de diferentes polaridades

sendo 8,13 g da Fração Hexânica (FEH) e 0,89 g da Fração Hidroalcóolica (FHA), as

quais foram submetidas ao ensaio em CG-EM conforme descrito anteriormente, sendo

possível evidenciar na FHA a presença da di-hidrocoriandrina (21,64%) e coriandrina

(34,91%), enquanto na FEH essas furanocumarinas não foram identificadas. Ou seja,

a fração hexânica (FEH) apresentou um perfil de compostos de baixa polaridade

(apolar) e a fração hidroalcóolica (FHA) enriquecida nos compostos de média e alta

polaridade.

5.1.2.1 Fracionamento da FHA em coluna cromatográfica seca

Devido a presença das furanocumarinas de interesse na FHA realizou-se

um fracionamento em coluna cromatográfica seca da FHA (0,57 g) originando : FHA1-

2 (0,03 g); FHA3 (0,02 g); FHA4 (0,07 g); FHA5 (0,09 g); FHA6 (0,10 g) e FHA7 (0,25

g), as quais analisadas frente CG-EM , conforme descrito anteriormente, identificou-

se a presença das furanocumarinas nas frações FHA5 (75% de di-hidrocoriandrina e

18% coriandrina); FHA6 (44% di-hidrocoriandrina e 5% de coriandrina) e FHA7 (4%

de di-hidrocoriandrina e 1% de coriandrina). No entanto, as frações FHA5 e FHA6

apresentaram baixo rendimento e a fração FHA7 era constituída apenas por uma das

furanocumarinas de interesse para dar continuidade.

5.1.2.2 Obtenção da Fração Acetato de Etila (FAc) por Cromatografia em Coluna

Filtrante

A partir de 14g do ED foi efetuado o fracionamento em coluna

cromatográfica filtrante originando 0,41 g da Fração Hexânica (FHx 2,94%); 8,55 g

Fração Acetato de Etila (FAc 61%) e 2,86 g da Fração Acetato de Etila:Metanol

(FAcMe 20,43%).

A partir da avaliação dos fragmentogramas dos principais picos observados

por cromatografia gasosa na FAc, conforme descrito anteriormente foi possível sugerir

44

a presença dos seguintes compostos: di-hidrocoriandrina 34,52% (tR=19,32min);

coriandrina 14,39% (tR=19,83min); vitamina E 4,6% (tR=36,25min) e estigmasterol

7,85% (tR=38,58min), conforme apresentado na Figura 9, enquanto as

furanoumarinas não foram identificadas nas frações FHx e FAcMe.

Figura 9 - Perfil cromatográfico observado por CG-EM (HP-6890/ HP-

5975) da Fração Acetato de Etila (FAc) resultante do

fracionamento por Coluna Filtrante do Extrato

Diclorometânico.

Após submetida ao fracionamento em coluna cromatográfica de membrana

de celulose a FAc (0,54g) originou as seguintes frações: FAc1-2 (0,30g-55%); FAc3

(0,09g-17%); FAc4 (0,07g-13%) e FAc 5-6 (0,07g-13%), conforme Figura 9. A análise

por CG-EM das frações FAc1-2 e FAc3 evidenciou a presença de fitol (tR=20,74mim),

estigmasterol (tR=38,52mim) e vitamina E (tR=36,25mim). Por outro lado, na FAc4

foram identificadas as furanocumarinas di-hidrocoriandrina (64,85%) e coriandrina

(27%) e na FAc5 a presença apenas da di-hidrocoriandrina (34,17%).

5.1.2.3 Análise por Cromatografia Liquida de Alta Eficiência acoplada aos detectores

de Arranjo de Diodos e Massas

As condições analíticas foram baseadas no trabalho de Chen e

colaboradores (2009), que utilizaram o LC-ESI-MS para confirmação estrutural das

furanocumarinas (coriandrina e di-hidrocoriandrina) presentes no extrato das folhas

de C. sativum.

Para otimização das condições de ionização no LC-MS empregou-se o

padrão de cumarina, utilizando-se como eluente água: metanol, de modo gradiente.

Essas condições otimizadas foram empregadas na análise das amostras, juntamente

com a detecção por DAD, na faixa de 200 a 400 nm. Foram avaliados os extratos ED,

5 .0 0 1 0 .0 0 1 5 .0 0 2 0 .0 0 2 5 .0 0 3 0 .0 0 3 5 .0 0 4 0 .0 0 4 5 .0 0 5 0 .0 0 5 5 .0 0

0

5 0 0 0 0

1 0 0 0 0 0

1 5 0 0 0 0

2 0 0 0 0 0

2 5 0 0 0 0

3 0 0 0 0 0

3 5 0 0 0 0

4 0 0 0 0 0

4 5 0 0 0 0

T im e -->

A b u n d a n c e

T IC : C o e n t ro -C o l-A c O E t .D \ d a ta .m s

45

EE, FAc e FAcMe, sendo apresentados os cromatogramas (Figuras 10 e 11), os

espectros de UV (Figura 12) e os espectros de massas obtidos (Figura 13).

10ª

10B

Figura 10 - Cromatograma do ED (10A) e EE (10B) obtido por LC-DAD-EM. Condições

de análise: coluna C-18 Symetry, a 30°C, eluentes água e metanol em

gradiente, com vazão 0,25 mL/min e empregados detectores DAD (254 nm).

11ª

11B

Figura 11 - Cromatograma da FAc (11A) e FAcMe (11B) por LC-DAD-EM. Condições de

análise: coluna C-18 Symetry, a 30°C, eluentes água e metanol em gradiente,

com vazão 0,25 mL/min e empregados detectores DAD (254 nm).

Os espectros de massas de cada sinal observado nos diversos

cromatogramas indicaram a presença de coriandrina e di-hidrocoriandrina na forma

de adutos de sódio (M+Na)+ com íons de m/z 253 e 255 uma, respectivamente.

Adicionalmente, os espectros de UV característicos (Chen et al.,2009) para

estes compostos confirmaram a sua identificação no ED, sugerindo então a presença

dessas furanocumarinas (Figura 12).

4.28

14.

884

6.54

87.

658

8.75

1

AU

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

Minutes

0.00 10.00 20.00 30.00 40.00

4.2

02

6.4

73

12.7

15

13.4

47

AU

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

Minutes

0.00 10.00 20.00 30.00 40.00

3.6

68

4.2

85

4.8

90

6.5

56

9.9

10

15.3

13

AU

0.000

0.010

0.020

0.030

0.040

Minutes

0.00 10.00 20.00 30.00 40.00

4.3

45

4.9

59

6.6

29

12.9

11

13.6

65

43.7

89

AU

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

Minutes

0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00

DB

C

A

E

46

Figura 12 - Espectros de UV (200 a 400 nm)

dos picos do cromatograma do

ED, apresentado anteriormente na

Figura 11.

Figura 13 - Espectros de massas dos picos apresentados no

cromatograma do ED.

Na Tabela 6 estão apresentados os principais compostos identificados nas

diferentes amostras avaliadas por LC-DAD-EM. Além da coriandrina e di-

hidrocoriandrina, observou-se a presença de outra substância com características das

Coriandrina

Di-hidrocoriandrina

Coriandrona A ou

B

A

B

C

D

E

A

B

C

D

E

47

furanocumarinas, com fragmentos em m/z 293 [M+H]+; 315 [M+Na] + e 607 [2M +Na]+,

sendo que este último pode ser atribuído ao dímero do composto, na forma de aduto

com o Na+.

Por meio dessas análises não foi possível atribuir a estrutura correta deste

composto, sugerindo de que esta substância pode ser tanto a Coriandrona A como a

Coriandrona B, uma vez que ambas possuem a mesma massa molecular (m/z 292) e

o mesmo espectro de UV, que estão de acordo com dados descritos na literatura por

Chen e colaboradores (2009). Sendo que para a confirmação estrutural desse

composto seria necessário o isolamento e posteriores análises espectroscópicas.

Tabela 6 - Furanocumarinas identificadas nas amostras ED, EE, FAc e FAcMe a partir da

análise comparativa com dados da literatura.

tR (min) Composto [M]+ [M +1] + [M +Na] + [2M +Na] +

4,20 – 4,28 Di-hidrocoriandrina 232 233 255 487

4,85 – 4,90 Coriandrona A ou B 292 293 315 607

6,42 – 6,65 Coriandrina 230 231 253 486

5.2 Ensaios Farmacológicos In Vivo

5.2.1 Teste de toxicidade aguda (Screening Hipocrático)

Durante as primeiras 4 horas, os animais submetidos a dose de 1000 mg/kg

apresentaram letargia e isolamento dos demais animais no grupo. Na dose de

500mg/kg apresentaram piloereção, característica de toxidade. Assim, a dose de 300

mg/kg foi selecionada como maior dose possível para dar continuidade aos ensaios

farmacológicos, pois não apresentou sinais de toxicidade.

5.2.2 Avaliação da atividade locomotora

O ensaio avaliou as atividades exploratória e locomotora do animal após

administração intraperitoneal de salina e FAc nas doses de 30,100 e 300 mg/kg/i.p.

A Figura 14 mostra que a FAc, nas concentrações de 100 mg/kg (p=0,0211)

e 300 mg/kg (p=0,0019), diminuiu o número de quadrados cruzados pelos animais

48

quando comparados com o grupo controle. No entanto, a FAc 30 mg/kg não afetou

este parâmetro em comparação com o controle (p=0,10).

Figura 14 - Número de travessias entre as áreas determinadas pelo campo-

aberto por período de 6 minutos. Linha central: mediana 1° e

3° quartis; Suíças=mínimo e máximo valor, *p ≤ 0.05 em

comparação com o grupo controle.

5.2.3 Contorções abdominais induzidas por ácido acético

Para a realização desse teste utilizou-se duas vias de administração

distintas: via intraperitoneal e via oral (Figura 15 e 16) com o objetivo de avaliar se a

via de administração interferiria na atividade da FAc frente a atividade antinociceptiva

No ensaio utilizando a via intraperitoneal, a indometacina a 20 mg/kg

(controle positivo) reduziu significativamente (p=0,0069) o número de contorções

abdominais induzidas pelo ácido acético, em relação ao grupo controle, conforme a

Figura 15.

A FAc 10 mg/kg não demonstrou atividade e não diferiu significativamente

do controle (p=0,69). No entanto, a FAc, nas concentrações 30 mg/kg (p=0,0056), 100

mg/kg (p=0,0208) e 300 mg/kg (p<0,0001), induziu um menor número de contorções

abdominais quando comparada ao controle.

C o n t r o l e 3 0 1 0 0 3 0 0

0

5 0

1 0 0

1 5 0

Nú

me

ro

de

tra

ve

ss

ias

F A c ( e m m g / k g )

*

*

49

Figura 15 - Contorções abdominais induzidas por ácido acético em

camundongos previamente tratados (30 minutos)

intraperitonealmente com salina (10 mL/kg), indometacina (20

mg/kg) e doses de FAc. Linha central: mediana 1° e 3° quartis;

Suíças= valores mínimo e máximo valor. * - p ≤ 0.05 em

comparação com o grupo controle.

A indometacina reduziu significativamente o número de contorções

abdominais induzido pelo ácido acético, quando comparada à FAc na dose de 10

mg/kg (p=0,0301). Entretanto, não houve diferenças entre os tratamentos para as

doses de FAc de 30 mg/kg (p=0,9562), 100 mg/kg (p=0,6408) e 300 mg/kg (p=0,1742).

Por outro lado, a administração por via oral da FAc em diferentes

concentrações não foi capaz de reduzir as contorções abdominais (p=0,8101) quando

comparadas com o grupo de controle (salina), conforme Figura 16.

C o n t r o le I n d o 1 0 3 0 1 0 0 3 0 0

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6 0

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F A c ( i . p . , e m m g / k g )

*

*

*

*

50

Figura 16 - Contorções abdominais induzidas por ácido acético em

camundongos previamente tratados (60 minutos) por via oral

com salina (10 mL/kg) e doses de FAc. Linha central: mediana

1° e 3° quartis; Suíças = valores mínimo e máximo.

5.2.4 Teste de Formalina

A injeção intraplantar de formalina na pata posterior do camundongo,

produziu intensa resposta nociceptiva em duas fases distintas. A Fase I,

compreendendo entre 0 a 5 minutos, evidencia a dor neurogênica e a Fase II, entre

25 a 45 minutos, evidenciando a dor inflamatória (Figuras 17 e 18).

Na Fase I, morfina a 20 mg/kg (p=0,0035), FAc 30 mg/kg (p=0,0406) e FAc

100 mg/kg (p=0,0038) foram capazes de reduzir a dor neurogênica em comparação

com o grupo de controle. Contudo, a dexametasona (p=0,0902) e a FAc 10 mg/kg

(p=0,1401) não mostraram diferenças significativas com o grupo de controle (Figura

17).

Na Fase I, FAc 30 mg/kg, FAc 100 mg/kg e a morfina não apresentaram

diferenças entre si. Também não foram observadas diferenças significativas (p>0,05)

entre as concentrações de FAc utilizadas. No entanto, a FAc nas concentrações de

C o n t r o le 1 0 3 0 1 0 0 3 0 0

0

2 0

4 0

6 0N

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ero

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F A c ( p . o . , e m m g / k g )

51

30 mg/kg e 100 mg/kg diferiram do grupo controle, indicando efetividade independente

da dose contra a dor neurogênica.

Figura 17 - Tempo de reação na Fase I, frente a resposta da dor neurogênica

induzida pela aplicação intraplantar de formalina na pata posterior

de camundongos previamente tratados (60min) via i.p. com salina

(10 mL/kg – controle), morfina 20 mg/kg, dexametasona 5 mg/kg

e FAc. Linha central: mediana 1° e 3° quartis; Suíças= valores

mínimo e máximo. * - p ≤ 0.05 em comparação com o grupo

controle.

Os resultados da Fase II (dor inflamatória) são apresentados na Figura

18,demonstrando que o tempo de reação à injeção de formalina foi significativamente

diminuído pela morfina (p=0,0315), dexametasona (p=0,0214), FAc 30 mg/kg

(p=0,0023) e FAc 100 mg/kg (p=0,0046) quando comparado com o grupo de controle.

Apenas a FAc 10 mg/kg (p=0,12) não foi capaz de diminuir a dor

inflamatória. Não foram observadas diferenças significativas (p>0,05) entre as

concentrações de FAc. Na Fase II, não foram observadas diferenças significativas

entre as concentrações de FAc 30 mg/kg, FAc 100 mg/kg, morfina e dexametasona,

indicando efetividade contra a dor inflamatória. Evidenciando, assim, que a FAc tem

atividade em ambas as fases, similar a morfina e dexametasona, atuando tanto na dor

de origem neurogênica, quanto de origem inflamatória.

C o n t r o l e M o r f i n a D e x a 1 0 3 0 1 0 0

0

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F A c ( e m m g / k g )

*

**

52

Figura 18 - Tempo de reação na Fase II, frente a resposta da dor inflamatória

induzida pela aplicação intraplantar de formalina na pata posterior

de camundongos previamente tratados (60min) via i.p. com salina

(10 mL/kg - Controle), morfina 20 mg/kg, dexametasona 5 mg/kg

e FAc. Linha central: mediana 1° e 3° quartis; Suíças = valores

mínimo e máximo. * - p ≤ 0.05 em comparação com o grupo

controle.

5.2.5 Edema de pata induzido por carragenina

A regressão linear (Figura 19) mostrou que a dexametasona foi capaz de

reduzir significativamente (p<0,0001) as fases inicial e tardia do edema induzido pela

carragenina. A FAc nas concentrações 30 mg/kg (p<0,0001), 100 mg/kg (p<0,0001) e

300 mg/kg (p<0,0001) induziu significativamente menos edema do que o controle ao

longo de todos os períodos na fase inicial do edema.

No entanto, na fase tardia não houve diferenças estatisticamente

significantes entre o controle e FAC 30 mg/kg (p=0,7487), FAc 100mg/kg (p=0,0704)

e FAc 300mg/kg (p=0,7933) indicando que o efeito anti-edema ocorre apenas na fase

inicial, conforme Figura 19.

C o n t r o l e M o r f i n a D e x a 1 0 3 0 1 0 0

0

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* *

53

Figura 19 - Tempo de reação (média ± erro padrão) frente a resposta da variação de

volume de patas de camundongos, em modelo de inflamação induzido por

injeção intraplantar de carragenina na pata posterior previamente tratados

(30min) via i.p. com salina (10 mL/kg - controle), dexametasona 5 mg/kg

e FAc.

5.2.6 Teste de Capsaicina

A Figura 20 demonstra o efeito da FAc sobre a atividade nociceptiva

periférica induzida pela capsaicina, via sistema vanilóide (Santos e Calixto, 1997).

O tempo de reação à injecção de capsaicina foi significativamente

diminuído pela morfina 20 mg/kg (p<0,0001), FAc 30 mg/kg (p=0,0034), FAc 100

mg/kg (p=0,0123) e FAc 300 mg/kg (p=0,0371) quando comparado com o grupo de

controle. Não foram observadas diferenças significativas (p>0,05) entre as

0 . 1

0 . 2

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F a s e in i c ia l F a s e t a r d ia

54

concentrações de FAc, evidenciando um efeito independente da dose empregada,

conforme Figura 20.

Figura 20 - Tempo de resposta da dor neurogênica frente a aplicação intraplantar

de capsaicina na pata posterior de camundongos previamente tratados

(60min) via i.p. com na pata posterior previamente tratados (60min) via

i.p. com salina (10 mL/kg (controle), morfina (20 mg/kg) e FAc. Linha

central: mediana 1° e 3° quartis; Suíças = valores mínimo e máximo. * -

p ≤ 0.05 em comparação com o grupo controle.

5.3 Atividade Antiulcerogênica

5.3.1 Lesão Gástrica induzida por Etanol

Os resultados relativos ao índice de lesões ulcerativas estão apresentados

na Figura 21. A FAc na dose de 1000 mg/kg mostrou efeitos tóxicos, tais como

defecação e micção constantes, piloereção e letargia (Ullman-Cullere e Foltz, 1999) e

por esse motivo essa dose foi desconsiderada nos estudos subsequentes. Como a

dose de 100mg/kg mostrou pouco eficácia, também não foi utilizada. Como observado

anteriormente, a dose de 300 mg/kg foi selecionada, pois não apresentou sinais de

toxicidade.

C o n t r o l e M o r f i n a 3 0 1 0 0 3 0 0

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55

Figura 21 - Efeito sobre o índice de lesões ulcerativas - ILU (média ± desvio padrão)

da administração por via oral da carbenoxolona 200 mg/kg (CBX) e da

FAc 300 mg/kg em modelo de indução de úlcera por etanol, em ratos.

Letras distintas representam diferenças estatisticamente significantes

entre os grupos.

A Figura acima mostra o efeito citoprotetor da carbenoxolona (p<0.0001) e

da FAc (p=0,0037), as quais mostraram ILU significativamente menor do que o

controle. Não houve diferenças estatisticamente significantes entre a FAc e

carbenoxolona (p=0,3034).

5.3.2 Prostaglandina e citoproteção gástrica

Nesse modelo, as úlceras são induzidas pela inibição da síntese de

prostaglandinas. A indometacina é administrada (5 mg/kg, i.p.). previamente e a úlcera

é induzida por etanol absoluto. A inibição do ILU é apresentada na Figura 22.

C o n t r o le C B X F A c

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1 0 0

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56

Figura 22 - ILU (média±DP) em função dos tratamentos com Fac 300 mg/kg

e indometacina (Indo). Letras distintas representam diferenças

estatisticamente significantes entre os grupos.

A indometacina produziu maior (p<0,0001) ILU quando comparada aos

demais grupos. A FAc reduziu significativamente o índice quando comparada ao

controle (p<0,0001) e indometacina (p<0,0001). Quando associada à FAc, a

indometacina não foi capaz de aumentar significativamente (p=0,1001) o ILU,

demostrando que a Fac foi capaz de proteger a mucosa.

5.3.3 Substâncias sulfidrílicas não protéicas e citoproteção gástrica

Nesse modelo, a úlcera é induzida por etanol absoluto, com administração

prévia de N-etilmaleimida (NEM). As percentagens de inibição de ILU estão

apresentados na Figura 23.

C o n t r o l e I n d o F a c F a c

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c

57

Figura 23 - ILU (média±DP) em função dos tratamentos com Fac 300 mg/kg e NEM.

Letras distintas representam diferenças estatisticamente significantes

entre os grupos.

A Figura acima revela que a N-etilmaleimida (NEM) induziu

significativamente maior (p=0,0108) ILU do que o controle e que a FAc (p=0,0003). A

FAc não foi capaz de proteger efetivamente (p=0,3987) os animais dos efeitos da

NEM. Quando utilizada sozinha, a FAc reduziu (p=0,0018) o ILU em comparação ao

controle.

5.3.4 Atividade Antisecretora

Os resultados do modelo de ligadura do piloro evidenciaram que tanto a

FAc (p=0,0371) quanto a cimetidina (p=0,0339) reduziram o volume de secreção

gástrica quando comparadas ao controle, não havendo diferenças estatisticamente

significantes (p=0,9653) entre elas. A FAc não diminuiu (p=0,8602) a concentração de

prótons quando comparada ao controle, sendo que a cimetidina produziu menor

concentração de prótons tanto em relação ao controle (p=0,0074) quanto à FAc

(p=0,0050). O pH foi aumentado pela cimetidina tanto em relação ao controle

(p<0,0001) quanto à FAc (p=0,0002), não havendo diferenças estatisticamente

C o n t r o l e N E M F A c F A c

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a

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c

b

58

significantes (p=0,6252) entre a FAc e o controle conforme apresentados na Figura

24.

Figura 24 - Efeito da administração oral da FAc e cimetidina sobre o volume da

secreção ácida gástrica (A), concentração de prótons (B) e pH (C), em

modelo de ligadura de piloro em ratos.

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pH

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C

59

6 DISCUSSÃO

O rendimento obtido com as folhas de C. sativum (3,67%) foi muito maior

do que o rendimento habitual obtido com óleos essenciais (Laribi et al., 2015). Os

dados provenientes da cromatografia gasosa foram comparados com resultados

descritos em banco de dados da biblioteca NIST e da literatura (Ceska et al., 1988;

Kraus e Ridgeway 1994; Hudson et al., 1993). Alguns constituintes, incluindo duas

furanocumarinas, foram identificados e sua presença está em acordo com outros

estudos Hudson et al., 1993; Kraus e Ridgeway 1994 e Taniguchi et al., 1991).

Os estudos fitoquímicos prévios, observando extratos a partir das folhas,

mencionam o isolamento de furanocumarinas tais como a coriandrina, di-

hidrocoriandrina e as coriandronas A, B, C, D e E (Ceska et al., 1988; Ashwood-Smith

et al., 1989; Baba et al., 1991; Taniguchi et al., 1991; Hudson et al., 1993; Kraus e

Ridgeway 1994). No presente estudo, as análises em cromatografia gasosa indicaram

a presença da coriandrina e di-hidrocoriandrina nos extratos ED e EE, confirmando

estes relatos prévios.

A identificação e a confirmação estrutural da coriandrina e da di-

hidrocoriandrina nos extratos (ED, EE, FAc e FAcMe) das folhas de C. sativum no

presente estudo foi baseada no estudo de Chen et al. (2009), os quais utilizaram o

LC-ESI-MS. Tendo mostrado os compostos de maior interesse e exibido o melhor

desempenho de extração, a FAc foi utilizada para observar as atividades

antinociceptiva, antiulcerogênica e anti-inflamatória no presente estudo.

Apesar da extensa informação sobre a composição química dos vários

tipos de extratos de C. sativum, existem poucos estudos relacionando a eficácia

terapêutica dos extratos com seus constituintes isolados. De fato, estudos sobre a

atividade farmacológica de isolados de C. sativum são escassos na literatura. O

Linalol, um monoterpeno geralmente relacionado como o componente mais

abundante em óleos essenciais, é um dos mais estudados. Esta substância tem uma

variada gama de efeitos farmacológicos, tais como atividade antioxidante,

anticancerígena, neuroprotetora (atividade indireta), ansiolítica, analgésica e anti-

inflamatória, entre outras. O ácido ascórbico, taninos, alcaloides e esteroides foram

sugeridos como compostos-chave para a atividade terapêutica e profilática contra o

câncer de extrato (acetato de etila) de coentro (Calaresi et al., 2000). A coriandrina

mostrou atividade antiviral contra alguns vírus envelopados (Hudson et al., 1993). As

60

cumarinas, especialmente as furanocumarinas, foram capazes de inibir bactérias e

fungos, tendo também atividade anti-alérgica, anti-inflamatória (inibição da

prostaglandina E) e imunossupressão (Gomes et al., 2010).

Diferentes modelos em animais foram utilizados no presente estudo.

Apesar do potencial para sofrimento, os ensaios invasivos são os classicamente

usados para estudar as propriedades anti-inflamatórias e antinociceptiva de diversos

agentes (Prut e Belzung, 2003; Kumazawa, 1996). Além disso, os resultados destes

testes fornecem uma base sólida para comparar os resultados com outros estudos.

Inicialmente, o teste de screening hipocrático foi utilizado para definir a

toxicidade do ED, extrato que originou a FAc. Foram observados diversos parâmetros

tais como a coordenação motora, estado de consciência/disposição, tônus muscular,

reflexos e atividades sobre o SNC (excitação ou depressão), avaliando a presença de

ataxia, hipotonia, ptose, salivação, micção, diarreia, tremores, convulsão (Mattei e

Carlini, 1996). As doses de ED em tratamento único de 300,500 e 1000 mg/kg foram

utilizadas via i.p., sendo os animais observados 4h após administração e diariamente

durante 14 dias, para verificar a ocorrência de sinais de toxicidade. A dose de 500

mg/kg causou piloereção e de 1000 mg/kg causou letargia e isolamento. Embora

esses sinais não evidenciem grave toxicidade, a maior dose utilizada foi fixada em 300

mg/kg.

Patel et al. (2012b) não relataram sinais de toxicidade (salivação,

convulsão, diarreia, letargia ou sonolência) de extrato hidrometanólico de sementes

de C. sativum, nas doses de 1000,2000 e 5000 mg/kg mesmo após algumas horas da

administração por via oral. Também não relataram nenhuma letalidade ou

anormalidade, sugerindo que uma dose de até 3000 mg/kg seria segura para

consumo. Da mesma forma, Taherian et al. (2012) mencionam que o extrato aquoso

das sementes de C. sativum, nas doses de 125,250,500 e 1000 mg/kg (via i.p), não

causou mortalidade ou sinais de toxicidade. Provavelmente, as diferenças de

toxicidade observadas entre os estudos se devam às diferentes polaridades dos

extratos, da parte da planta utilizada e das vias de administração.

O teste de atividade locomotora além de minimamente invasivo, é

importante para observar distúrbios não específicos da atividade locomotora em

animais. Estes distúrbios são geralmente associados com excitação ou depressão dos

61

neurônios do sistema nervoso central (SNC), aumentando ou diminuindo o

metabolismo cerebral (Anaya-Eugenio et al., 2016).

No presente estudo, a FAc nas maiores concentrações utilizadas (100 ou

300 mg/kg/i.p.) claramente deprimiu o SNC dos ratos. Portanto, essas doses maiores

poderiam em tese interferir com a atividade antinociceptiva direta. De fato, três

estudos prévios mostraram o efeito ansiolítico potencial do C. sativum. Latha et al.

(2015) relataram que o extrato aquoso das folhas de C. sativum nas doses de

50,100,200 mg/kg/i.p. apresentou atividade ansiolítica, sem sinais toxicidade. Tanto

Emamghoreishi et al. (2005), testando o extrato aquoso a 100 e 500 mg/kg, quanto

Mahendra e Bisht (2011), testando o hidroalcoólico das sementes a 100 e 200 mg/kg,

também observaram o efeito ansiolítico.

Embora Emamghoreishi et al. (2005) tenham sugerido os flavonoides e o

linalol como os principais responsáveis pelo efeito ansiolítico observado com o

composto bioativo, eles não testaram a eficácia das substâncias isoladas. Estes

autores sugeriram que a dose efetiva e segura para um ser humano adulto (de até 75

kg) seria de 7,5 g de extrato seco da semente de C. sativum. Isso corresponderia a

uma infusão de aproximadamente 20 g do extrato em 100 mL de água, corroborando

com a quantidade de coentro utilizada empiricamente na medicina tradicional. Na

medicina tradicional, as sementes de C. sativum são empiricamente empregadas em

diferentes formas e dosagens. As sementes em pó ou extrato seco são usadas de 2

a 5 g/dia e o chá de 4 a 8 g/100 mL (podendo chegar até 30g). O chá é recomendado

para insônia e ansiedade e deve ser ingerido diariamente em dose única.

O ensaio de contorção abdominal tem sido usado para avaliar propriedades

analgésicas e anti-inflamatórias de muitas substâncias (Santos et al., 2005). A

intensidade da resposta depende de vários determinantes da nocicepção, tais como

as cininas, acetilcolina, substância P e prostaglandinas. O ácido acético induz

indiretamente a liberação desses mediadores, promovendo a estimulação dos

neurônios nociceptivos. Este modelo tem sido útil para estudar a atividade

farmacológica de substâncias com diferentes mecanismos de ação, tais como a

aspirina, os antagonistas dos receptores de cininas e os opióides (Florentino et al.,

2016). Permite a avaliação da atividade antinociceptiva causada pela dor neurogênica

e inflamatória. A transmissão da dor inflamatória envolve principalmente receptores

polimodais em torno de pequenos vasos que sinalizam ao SNC por meio de fibras tipo

62

C sensoriais aferentes, entrando no corno dorsal. Apesar da boa sensibilidade do

ensaio, este mostra uma especificidade questionável e erro potencial de interpretação

dos resultados devido a estímulos não-específicos na nocicepção. Outros modelos

nociceptivos têm sido utilizados para evitar esse problema (Wheeler-Aceto et al.,

1990).

No presente estudo, este foi o primeiro teste de triagem nas propriedades

antinociceptiva da FAc, a qual foi testada por via oral e intraperitoneal. As diferenças

entre os resultados obtidos usando essas vias revelaram algumas das características

farmacocinéticas da FAc, sugerindo que a ingestão de espécies de C. sativum, como

fonte de alimentação, não produz atividades antinociceptiva ou anti-inflamatória

consistentes. Assim, FAc foi administrada apenas por via intraperitoneal nos demais

ensaios no presente estudo.

No presente estudo, as maiores concentrações da FAc reduziram o tempo

de reação em ambas as fases do teste de formalina. A injeção intraplantar de formalina

estimula as fibras nervosas nociceptoras aferentes produzindo dor intensa, revelada

pelo ato de lamber, morder ou agitar vigorosamente a pata (Tjolsen et al., 1992). Este

teste é um modelo de nocicepção bifásico útil para distinguir a propriedade anti-

neurogênica (fase I) e as propriedades anti-inflamatórias (fase II) de uma substância

desconhecida (Santos et al., 1997).

A Fase I inicia imediatamente após a injeção da formalina e se estende

durante os primeiros cinco minutos, ocorrendo a dor aguda neurogênica. Esta é

mediada pela liberação da substância P e glutamato no SNC e é induzida pela

ativação direta de terminais nervosos nociceptivos e pela participação de mediadores

periféricos como a substância P, bradicinina, histamina e serotonina. Essa fase é

sensível a fármacos que interagem com o sistema opióde, sendo inibida por agonistas

opióides como a morfina (Hunskaar et al., 1985; Hunskaar e Hole 1987).

Já a dor inflamatória ocorre na fase II e é mediada por uma combinação de

estímulos periféricos (liberação de histamina, serotonina, bradicinina e

prostaglandinas) e pela sensibilização da medula espinhal (Szallasi et al., 1993).

Aparece entre 25 e 45 minutos após injeção da formalina esta fase é sensível aos

anti-inflamatórios esferoidais, AINES e aos analgésicos opióides de ação central

(Hunskaar e Hole 1987; Marinho et al., 2011).

63

A injeção de formalina também provoca um aumento significativo nos níveis

de outros mediadores relacionados à dor neurogênica (aminoácidos e cininas) e à

inflamação (prostaglandinas e leucotrienos) na medula espinhal (Pinto et al., 2015).

Como observado no presente estudo, a primeira e a segunda fase foram inibidas pelo

opióide, mas o anti-inflamatório utilizado apenas inibiu a segunda fase (Singh et

al.,2015). De fato, a indometacina e outros anti-inflamatórios não-esteroides não são

verdadeiramente eficazes para inibir o edema induzido pela formalina, o qual ocorre

após a segunda fase (Szallasi et al., 1993). A inflamação sozinha parece insuficiente

para provocar a segunda fase. Leveduras e carragenina são considerados estímulos

inflamatórios que induzem grande grau de inflamação, produzindo comportamentos

de dor em ratos (Bingham et al., 2005).

Alguns processos bioquímicos na medula espinhal são importantes para o

desenvolvimento da dor na segunda fase, pois foi demonstrado que a injeção de

anestésicos locais após a primeira fase seria capaz de impedir a segunda fase

(Szallasi et al., 1993). No entanto, quando a naloxona foi usada para reverter o

bloqueio da primeira fase induzido por opiáceos, a segunda fase também não ocorreu.

Na verdade, o comportamento de dor induzido pela formalina somente é abolido

quando os anestésicos locais são utilizados em ambas as fases. Claramente, tanto os

processos na medula espinhal envolvidos na primeira fase, quanto as alterações

inflamatórias da segunda fase são necessários para os comportamentos de dor

observados na segunda fase (Szallasi et al., 1993). Assim, a FAc no presente estudo

exibiu uma atividade similar aos opiáceos, inibindo ambas as fases do processo.

O modelo de edema nas patas traseiras induzido pela capsaicina e

carragenina foram feitos para observar as ações seletivas da FAc na dor neurogênica

e inflamatória, respectivamente. Este sistema de dor está envolvido na sensibilização

de diversos transtornos e é considerado um alvo importante para o controle da dor

(Pelissier et al., 2002). A capsaicina é o componente principal responsável pelos

efeitos irritantes e inflamatórios das pimentas do gênero Capsicum, pela ativação o

potencial transiente do receptor vaniloide tipo 1 ou canal TRPV1 e pela indução da

liberação de neuropeptideos (substância P, taquiquinina, serotonina e histamina). O

TRPV1 é expresso em nociceptores, media a dor neurogênica crônica/aguda e é um

alvo importante em estudos de dor. Assim, os agentes que bloqueiam este receptor

podem ser úteis para o tratamento da dor (Lopes et al., 2014). O edema ocorre devido

64

ao aumento da vasodilatação, do fluxo sanguíneo e da permeabilidade dos vasos

sanguíneos. Os glicocorticoides e as drogas anti-histaminergicas podem diminuir

efetivamente os efeitos da capsaicina (Boakye et al., 2016).

Alguns AINEs também têm demonstrado eficácia. A administração

intraperitoneal de diclofenaco a 25 mg/kg, 30 min antes da injecção de capsaicina,

diminui marcadamente os efeitos da injeção capsaicina (Zuntini-Viscardi et al., 2017).

No entanto, a administração oral de celecoxibe (dose única de 10 mg/kg)

ou rofecoxib (10 mg/kg duas vezes ao dia, por 5 dias) não teve efeito sobre a

frequência de retirada da pata, 30 min após a injeção de capsaicina, quando medidos

por filamentos de Von Frey (Chen et al., 2016).

Opioides exercem efeitos antinociceptivos pronunciados, particularmente

em tecidos inflamados, desde que os receptores opióides estejam presentes nos

terminais nervosos sensoriais periféricos, sendo excitados durante a inflamação. A

administração local de morfina inibe os efeitos da capsaicina e, no presente estudo,

seu efeito típico foi demostrado (Pelissier et al., 2002).

Assim, baseado nos resultados do presente estudo, sugere-se que a FAc

tem um efeito analgésico central, provavelmente inibindo receptores TRPV1.

O ensaio do edema induzido por carragenina foi usado no presente estudo

para observar a possível atividade da FAc contra mediadores pró-inflamatórios. Este

modelo também tem duas fases distintas: uma fase inicial que começa imediatamente

após a injeção de carragenina e tem duração de aproximadamente 6 h e uma fase

posterior, a qual começa 6 horas após a injeção de carragenina e termina 72 h após

a sua injeção. O pico de inflamação é observado entre 48 e 72 h (Lopes et al., 2014;

Nunes et al., 2007). Neste ensaio, o edema é mediado principalmente pela histamina,

pela serotonina e pelo aumento da síntese de prostaglandinas na fase inicial (entre 1

h e 2 h após a injeção). A liberação direta de prostaglandinas pelos tecidos

danificados, junto com a bradicinina, leucotrienos, células polimorfonucleares e pelas

prostaglandinas produzidas por macrófagos são responsáveis pela fase posterior do

edema (Boakye et al., 2016).

No presente estudo, como esperado, a dexametasona reduziu as fases

inicial e tardia do edema induzido pela carragenina. A FAc induziu significativamente

menor edema do que o controle durante todo o experimento. No entanto, não foram

65

observadas diferenças entre a FAc e o controle durante a fase posterior, indicando

que o efeito da fração só foi importante durante a fase inicial, considerando o modelo

proposto aqui (dose única da FAc). Assim, a atividade anti-inflamatória exibida pela

FAc poderia ser devida à inibição da síntese ou liberação de mediadores infamatórios

ou até mesmo pela a inibição direta de mediadores da inflamação induzida pela

carragenina.

Um estudo prévio demonstrou a atividade anti-inflamatória potencial do C.

sativum (Wu et al., 2010). Os autores mostraram a inibição in vitro de mediadores pró-

inflamatórios (PGE2 e óxido nítrico) produzidos por macrófagos. As atividades anti-

inflamatória e antinoceptiva de muitas plantas foram atribuídas aos flavonoides,

terpenos e esteroides (Santos et al., 2005). A composição essencial da FAc

(sesquiterpenos, furanocumarinas e esteroides) poderia explicar as atividades

farmacológicas observadas no presente estudo.

Segundo Carvalho (2006) a úlcera gástrica e a inflamação têm em comum

o estresse oxidativo, o qual é gerado pela atividade aumentada de células fagocitárias,

entre outros fatores. Assim, é possível que plantas que exibem propriedades anti-

inflamatórias poderiam apresentar atividade contra úlcera gástrica. De fato, muitos

novos agentes antiúlcera foram propostos a partir de fontes naturais utilizados na

medicina popular tais como o gengibre (Zingiber officinale), a gabiroba

(Campomanesia xanthocarpa) e a espinheira santa (Maytenus ilicifolia), resultando

em diversos compostos isolados.

A atividade antiulcerogênica da FAc foi monitorada utilizando a indução de

lesões gástricas por etanol, o qual é um conhecido agente irritante da mucosa gástrica

(Pacheco et al., 2006). As lesões gástricas induzidas por esse agente envolvem a

depressão dos mecanismos de defesa gástrica, assim como a redução da produção

do muco, do fluxo sanguíneo da mucosa gástrica, da secreção de bicarbonato, da

glutationa endógena e das prostaglandinas (Silvério et al., 2008). Também causa o

aumento da liberação de histamina, influxo de cálcio, produção de leucotrienos,

liberação de endotelinas e degranulação de mastócitos (Samonina et al., 2004), além

de espécies reativas de oxigênio e de um aumento de mediadores inflamatórios

expressos pelo aumento de IL-β e TNF-β, ocasionada pela peroxidação lipídica

(Miyahara et al., 2011).

66

O resultado da utilização do etanol é o aparecimento de lesões necróticas

na mucosa gástrica e o aumento da quantidade de ácido clorídrico, o qual acelera e

agrava o processo. As ulcerações não são inibidas por substâncias que interferem na

secreção de ácido (cimetidina), mas são inibidas por agentes que aumentam os

fatores de defesa da mucosa, tais como as prostaglandinas (Donatini et al., 2009). A

carbenoxolona sódica (utilizada como controle positivo nesse ensaio) causa aumento

dos níveis de prostaglandinas na mucosa gástrica, o que consequentemente promove

um aumento na produção de bicarbonato e muco garantindo uma maior proteção

contra ataques ácidos e outros agentes agressores (Foneska e Kaunitz, 2010).

Donatini et al. (2009) observaram que o Syzygium jambos apresentou um

excelente efeito preventivo de lesões gástricas, sendo que o mecanismo sugerido foi

a produção de fatores citoprotetores, devido a sua intensa atividade antioxidante. Leite

et al. (2005) também observaram um forte potencial antioxidante para a Momordica

charantia, associado à presença de compostos esteroides identificados em suas

folhas. Com efeito, Dias et al. (2009) observaram que compostos antioxidantes seriam

potentes agentes antiulcerogênicos, especialmente aqueles que teriam compostos

fenólicos, flavonoides, α-tocoferol. Na composição da FAc foi identificada a presença

desses compostos, o que poderia explicar a sua atividade antioxidante e citoprotetora.

Obviamente a atividade anti-inflamatória da FAc também pode ter

participação efetiva na sua atividade antiulcerogênica, estimulando a secreção de

bicarbonato e muco, auxiliando na manutenção do fluxo sanguíneo da mucosa e na

regulação da renovação e proteção das células da mucosa (Schubert, 2000).

Entretanto, os resultados do ensaio com a indometacina sugerem que o mecanismo

de ação antiulcerogênica da FAc não estaria relacionado com o aumento da síntese

de prostaglandinas ou da redução da sua degradação.

O segundo mecanismo avaliado neste estudo foi a participação dos grupos

sulfidrilas não-proteicos, principalmente a glutationa, encontrados em quantidades

elevadas na mucosa gástrica. Esses grupos atuam contra o efeito de espécies

reativas de oxigênio (ROS) sobre a mucosa gástrica (Popovic, 2009). O trato

gastrointestinal tem a capacidade de produzir grandes quantidades de ROS pelas

oxidases de mucosa, tais como a xantina oxidase, mieloperoxidase (MPO) e NADPH

oxidase, encontrada em leucócitos residentes (macrófagos, neutrófilos e eosinófilos)

da lâmina própria (Grisham e Granger, 1988). Diversos fatores podem acarretar o

67

aumento da produção de ROS. Entre eles, se destacam o processo inflamatório e o

consequente recrutamento de neutrófilos por citocinas pró-inflamatórias (IL-1 e IL-6)

e TNF-α (Dong e Kaunitz, 2006).

O envolvimento de ROS na patogênese das úlceras gástricas está

relacionado com o desequilíbrio entre a liberação de espécies reativas de oxigênio e

a capacidade de ação dos sistemas de defesa biológico antioxidante, promovendo o

estresse oxidativo. Esse quadro fisiológico reduz ainda mais o nível de antioxidantes

endógenos, resultando em uma mucosa gástrica mais vulnerável a danos, com células

parcialmente danificadas, levando a necrose, apoptose e formação de ulcerações da

mucosa gástrica decorrente do estresse oxidativo, provocado pelas ROS podendo

levar até a formação de processos tumorais (Bandyopadhyay et al., 2001).

No modelo experimental utilizado, os animais foram previamente tratados

com um agente alquilante das substâncias sulfidrílicas, a N-etilmaleimida (NEM), o

qual provoca a inativação das sulfidrilas e consequentemente à perda da capacidade

antioxidante (Arrieta, 2003). Os resultados demonstraram que a FAc mostrou uma

redução da sua atividade antiulcerogênica quando associada ao NEM, sugerindo que

o mecanismo de ação da FAc poderia ter relação com as substâncias sulfidrílicas. Al-

Mofleh et al. (2006) também observaram aumento dos níveis de substâncias

sulfidrílicas não protéicas, após pré-tratamento com suspensão aquosa das sementes

de C. sativum a 500 mg/kg.

A atividade antissecretória da FAc foi avaliada pelo modelo de ligadura do

piloro, desenvolvido por Shay et al. (1945). Este modelo induz a hipersecreção do

ácido gástrico por reflexo vagal, estimulado pela ligadura das fibras sensitivas da

parede gástrica, aumentando o tono muscular e a liberação de secreção ácida gástrica

(Lapa et al., 2008). Nesse modelo, após o tratamento intraduodenal com a FAc, a

concentração de íons H+ e o pH mantiveram-se inalterados.

Assim, a atividade antiulcerogênica observada para a FAc poderia estar

relacionada com a citoproteção, particularemente interferindo com substâncias

sulfidrílicas não-proteicas, e atividade anti-secretora, mas não com a sua interferência

no pH ou na concentração de íons H+.

68

7 CONCLUSÃO

Os resultados obtidos nos experimentos ao longo desse trabalho permitem

concluir que:

A FAc obtida a partir do ED apresentou melhor rendimento e maior rendimento,

sendo constituída pelas furanocumarinas di-hidrocoriandrina (34,52%),

coriandrina (14,39%), vitamina E (4,6%) e estigmasterol (7,85%).

A FAc foi submetida a testes in vivo, e apresentou atividades anti-inflamatória,

antinociceptiva e antiulcerogênica.

Frente às atividades farmacológicas obtidas nesse estudo, o C. sativum L. é

uma planta medicinal promissora para o desenvolvimento de futuros

fitoterápicos.

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83

APÊNDICE 1 - ETAPAS DAS DIFERENTES FORMAS DE FRACIONAMENTO DO ED

Figura 25 - Etapas envolvidas nas diferentes formas de fracionamento do ED

visando maior rendimento para isolamento das furanocumarinas.

ED 36,7g

FAc* 0,54g

F 1-2 0,03g

F 3 0,02g

F 4 0,07g

F 5* 0,09g

F 6* 0,10g

36 Frações

Solventes de Diferentes Polaridades

Partição Líquido-líquido 10,0g

Coluna cromatográfica Clássica 22,0g

FAg 7* 3,10g

FAg 8* 1,12g

FAg. 9 0,97g

FAg 10 1,73g

FEH 8,13g

FHA* 0,89g

Folhas Secas e Moídas 1.000g

Análise CG - EM

Análise CG - EM

F 7* 0,25g

FHA 5* 0,09g

FHA 6* 0,10g

FHA 7* 0,25g

Análise CG - EM

FHx 0,41g

FAc 8,55g

FAcME 2,86g

FAc 1-2 0,30g

FAc 3 0,09g

FAc 4* 0,07g

FAc 5-6*

0,07g

Presença

furanocumarinas

Presença furanocumarina * Baixo rendimento

Análise CG - EM

Extração Etanol (96%)

Resíduo

EE 27,3g

Extração com DCM Ultra-Turrax

Presença furanocumarina * Baixo rendimento

Presença furanocumarina *

Coluna cromatográfica Filtrante 14,0g

Método oneroso

84

ANEXOS

Anexo 1 – Comissão de Ética no Uso de Animais

85

Anexo 2 – Comissão de Ética no Uso de Animais