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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA ANÁLISE TRANSCRIPTÔMICA COMPARATIVA DA INFECÇÃO POR PAPILOMAVÍRUS BOVINO GERLANE DOS SANTOS BARROS SÃO CRISTÓVÃO - SE 2018
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA
ANÁLISE TRANSCRIPTÔMICA COMPARATIVA DA
INFECÇÃO POR PAPILOMAVÍRUS BOVINO
GERLANE DOS SANTOS BARROS
SÃO CRISTÓVÃO - SE 2018
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GERLANE DOS SANTOS BARROS
ANÁLISE TRANSCRIPTÔMICA COMPARATIVA DA INFECÇÃO POR
PAPILOMAVÍRUS BOVINO
SÃO CRISTÓVÃO - SE
2018
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Biologia Parasitária
da Universidade Federal de Sergipe como
parte dos requisitos exigidos para
obtenção do título de Mestre em Biologia
Parasitária.
Orientador: Prof. Dr. Marcus Vinicius de
Aragão Batista
i
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
Barros, Gerlane dos Santos
B277a
Análise transcriptômica comparativa da infecção por papilomavírus bovino / Gerlane dos Santos Barros; orientador Marcus Vinicius de Aragão Batista. – São Cristovão, 2018. 56 f. : il.
Dissertação (mestrado em Biologia Parasitária) – Universidade Federal de Sergipe, 2018.
1. Papilomavirus. 2. Expressão gênica. 3. Relações
hospedeiro-parasita. 4. Bovino - Doenças I. Batista, Marcus Vinicius de Aragão, orient. II. Título.
CDU 636.2.09:578
ii
A Deus, por me permitir chegar até aqui, aos
meus Pais, por dispensarem em meu favor
palavras de fé e honradez, e aos meus irmãos,
por se fazerem presentes nos momentos mais
valorosos.
iii
AGRADECIMENTOS
A Deus, pelo simples fato da existência!
Aos meus pais, Ivanildo e Valderês, que como materialização do amor
incondicional, nunca mediram esforços para me apoiar em busca dos meus ideais,
sempre se fazendo presentes nos momentos árduos e felizes de minha vida.
Ao meu orientador, Marcus Batista, pelo exemplo de pessoa, pelos
ensinamentos, oportunidades e orientações. Agradeço pela confiança que depositou
em mim e no meu trabalho.
A coordenação de Aperfeiçoamento de Nível Superior (CAPES) por apoiar o
meu projeto de dissertação, concedendo bolsa para a execução do mesmo.
Aos meus irmãos, por vibrarem com as minhas conquistas, e torcerem pelo
meu sucesso profissional.
Aos meus familiares e amigos, que souberam compreender a minha
ausência, me apoiando incansavelmente, na torcida pelo meu triunfo.
Aos meus professores, cujos conhecimentos permitiram-me novas
percepções e motivações. Obrigada por contribuírem para meu crescimento
intelectual e pessoal.
A vocês do “Quarteto”, Jaqueline, Kelly Francielly e Valquiria, obrigada pelas
alegrias, momentos de descontração e por toda ajuda que vocês me apresentaram.
Aos meus amigos Marcela e José Luiz, pelo apoio, carinho, pelos momentos
de risos, pelas conversas construtivas e descontraídas. Obrigada amigos!
Aos meus colegas do laboratório de Genética Molecular e Biotecnologia
(GMBio), Débora, Myrela, Lucas, Everton, Melina, Edilaine, Luana, Fernanda,
Conceição, Lidiane, Wilson e Jordana, por tornar o trabalho mais alegre e o
ambiente descontraído. Vocês são definitivamente o melhor grupo de laboratório.
Enfim, a todos aqueles que torceram por mim, que disseram “você consegue”
e, direta ou indiretamente, contribuíram para a consolidação deste trabalho.
iv
“Lembre-se de olhar para cima, em direção as
estrelas, e não para baixo, para seus pés.
Tente entender o que você vê e se pergunte o
que faz o universo existir. Seja curioso.”
Stephen Hawking
v
RESUMO
ANÁLISE TRANSCRIPTÔMICA COMPARATIVA DA INFECÇÃO POR
PAPILOMAVÍRUS BOVINO.
O papilomavírus bovino (BPV) é o agente causador da papilomatose no gado. A
doença causa lesões cutâneas e mucosas que podem ser minimizadas ou levar ao
aparecimento de tumores malignos. Ocorre no Brasil e em vários outros países,
afetando principalmente os animais jovens. Além da aparência desagradável do
animal afetado pela papilomatose cutânea, o problema pode causar danos
incalculáveis aos diferentes criatórios, principalmente no que diz respeito à
diminuição da produtividade. Sabendo que o Brasil é um dos grandes produtores de
carne e leite do mundo, este estudo busca identificar possíveis mecanismos
moleculares que estão por trás dos processos patológicos associados à
papilomatose bovina através da identificação de genes relacionados ao
desenvolvimento das lesões. Para isso, sequenciamento de RNA de nova geração
foi utilizado para avaliar genes diferencialmente expressos em bovinos infectados e
não infectados por BPV. Foram estudados três animais com lesão papilomatosa e
três sem lesão. A plataforma Galaxy foi utilizada para análise dos dados gerados
pelo sequenciamento. Os arquivos de saída Illumina foram convertidos em formato
de arquivo FASTQ. Avaliação de qualidade foi realizada utilizando FastQC e o corte
de qualidade de sequência foi realizado usando Trimmomatic, TopHat e Bowtie
foram utilizados para mapear e alinhar os reads com o genoma de referência. A
abundância dos genes expressos foi verificada utilizando Cuffilinks. Para análise da
expressão diferencial foi utilizado Cuffdiff. A anotação funcional dos genes
diferencialmente expressos foi realizada utilizando o banco de dados do Gene
Ontology (GO). O sequenciamento de RNA gerou um total de 121.722.238 reads. Na
análise de expressão gênica foi identificado um total de 13.421 genes expressos e
destes 1343 foram diferencialmente expressos. A anotação funcional dos genes
diferencialmente expressos mostrou que muitos genes apresentaram funções ou
estavam relacionados a vias metabólicas associadas à progressão de lesões de
papilomatose e desenvolvimento de câncer em bovinos. Embora sejam necessários
mais estudos, este é o primeiro estudo que se concentrou em uma avaliação em
larga escala da expressão gênica associada à infecção por BPV, o que é importante
para identificar possíveis mecanismos regulados pelos genes hospedeiros que são
necessários para o desenvolvimento da lesão.
Palavras-chave: Papilomavírus bovino; Expressão gênica diferencial; RNA-seq;
Anotação funcional; Interação parasito-hospedeiro.
vi
ABSTRACT
COMPARATIVE TRANSCRIPTOMAL ANALYSIS OF BOVINE PAPILOMAVIRUS
INFECTION.
Bovine papillomavirus (BPV) is the causative agent of papillomatosis in cattle. The
disease causes cutaneous and mucosal lesions that can be minimized or lead to the
appearance of malignant tumors. It occurs in Brazil and in several other countries,
mainly affecting young animals. In addition to the unpleasant appearance of the
animal affected by cutaneous papillomatosis, the problem can cause incalculable
damage to the creative differences, especially in regard to the decrease of
productivity. Knowing that Brazil is one of the great producers of meat and milk in the
world, this study aims to identify possible molecular mechanisms that are behind the
pathological processes associated with bovine papillomatosis through the
identification of genes related to the development of the lesions. For this, next-
generation RNA sequencing was used to assess differentially expressed genes in
infected by BPV and non-infected bovines. Three animals with papillomatosis lesion
and three without papillomatosis lesion were studied. The Galaxy platform was used
to analyze the data generated by the sequencing. The Illumina output files were
converted to FASTQ format. Quality evaluation was performed using FastQC and the
sequence quality cut was performed using Trimmomatic. TopHat and Bowtie were
used to map and align the reads with the reference genome. The abundance of the
expressed genes was verified using Cuffilinks. Cuffdiff was used for differential
expression analysis. Functional annotation of the differentially expressed genes was
performed using Gene Ontology (GO) databases. RNA-sequencing generated a total
of 121,722,238 of reads. In the gene expression analysis, a total of 13,421 genes
expressed were identified and of these 1343 were differentially expressed. The
functional annotation of differentially significant genes showed that many genes
presented functions or they were related to metabolic pathways associated with the
progression of papillomatosis lesions and cancer development in cattle. Although
more studies are needed, this is the first study that focused on a large-scale
evaluation of gene expression associated with the BPV infection, which is important
to identify possible mechanisms regulated by the host genes that are necessary the
development of the lesion.
Keywords: Bovine papillomavirus; Differential gene expression; RNA-seq;
Functional annotation; Host-parasite interaction.
vii
LISTA DE ABREVIATURAS
BPV Papilomavírus Bovino
cDNA Ácido Desoxirribonucleico complementar
FPKM/RPKM Fragments per kilobase of transcript per million mapped reads
GO Gene Ontology
INF Interferon
LCR Região Longa de Controle
Ori Origem de replicação
KEGG Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes
MHC I Complexo Principal de Histocompatibilidade de classe I
p53 Proteína supressora de tumor
PCR Reação em Cadeia da Polimerase
pRb Proteína do Retinoblastoma
PV Papilomavírus
RNAm Ácido Ribonucleico Mensageiro
RNA-seq Tecnologia de sequenciamento de RNA de nova geração
viii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Representação esquemática da estrutura do capsídeo do papilomavírus
humano tipo 16 (Fonte: Buck et al., 2013).................................................................3
Figura 2. Genoma viral de BPV-1, evidenciando a região controladora (URR), os
genes de expressão precoce (E) e de expressão tardia (L) (Fonte: Christensen et al.,
2017)............................................................................................................................4
Figura 3. Ciclo de infecção de papilomavirus (Mckinney et al., 2015).........................8
Figura 4. Fotomicrografias da verruga pela coloração de hematoxilina e
eosina.........................................................................................................................20
Figura 5. Gráficos de qualidade da biblioteca 01 gerados pelo FastQC....................22
Figura 6. Distribuição da anotação funcional pelo GO...............................................29
Figura 7. Via metabólica identificada pelo KEGG para o gene Up-regulado (ISG15)
no grupo de vacas infectadas pelo BPV.....................................................................32
Figura 8. Interação entre o gene up-regulado ISG15 e seus parceiros celulares.....33
ix
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Reads e estatísticas de montagem............................................................23
Tabela 2. Número de genes expressos em animais infectados e não infectados pelo
papilomavírus.............................................................................................................24
Tabela 3. Trinta e um genes expressos e suas funções............................................25
x
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 1
1.1 Estrutura do papilomavírus bovino ...................................................................... 3
1.2 Proteínas dos papilomavírus bovino ................................................................... 4
1.3 Ciclo de infecção de papilomavírus bovino ......................................................... 7
1.4 Classificação de papilomavírus bovino ............................................................... 9
1.5 Dogma central da biologia molecular e transcriptômica .................................... 10
1.6 Tecnologia de sequenciamento de RNA de nova geração (RNA-seq) ............. 12
2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 14
2.1 Objetivo geral ................................................................................................... 14
2.2 Objetivos Específicos ....................................................................................... 14
3 MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................................... 15
3.2 Detecção da lesão papilomatosa ..................................................................... 15
3.3 Detecção molecular de BPV ............................................................................ 16
3.4 Isolamento de RNA e sequenciamento ............................................................ 17
3.5 Identificação dos genes diferencialmente expressos ....................................... 17
3.6 Anotação funcional e análise das vias moleculares dos genes diferencialmente
expressos ............................................................................................................... 18
4 RESULTADOS ...................................................................................................... 19
4.1 Análise histopatológica e detecção do DNA viral ............................................. 19
4.2 Sequenciamento de RNA e avaliação das sequências .................................... 21
4.3 Mapeamento dos transcritos e expressão gênica ............................................ 23
4.4 Anotação funcional dos genes diferencialmente expressos ............................. 27
5 DISCUSSÃO ......................................................................................................... 33
6 CONCLUSÃO ....................................................................................................... 37
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 38
1
1 INTRODUÇÃO
A agropecuária é uma importante atividade para a economia brasileira,
entre os diversos setores, destaca-se a bovinocultura. O Brasil possui o
segundo maior rebanho bovino do mundo, com 218,23 milhões de cabeça de
gado (IBGE, 2017), ficando atrás somente da Índia (LIVESTOCK, 2013;
LANDES et al., 2016). Dados do Departamento de Agricultura dos Estados
Unidos (USDA, 2017) mostram que o Brasil é o segundo maior produtor
mundial de carne bovina comercial, perdendo apenas para os Estados Unidos
com 2,586 milhões de toneladas. Em 2012, as exportações brasileiras de carne
bovina foram avaliadas em US$ 4,4 bilhões (USDA, 2012). Além disso, o Brasil
ocupa a quinta posição mundial na produção de leite, com 33,62 bilhões de
litros (IBGE, 2017), ficando atrás da União Europeia (se vista como um todo),
Índia, Estados Unidos, China e Rússia (DAIRY, 2013).
No ano de 2012 foi registrada a produção de 32,304 bilhões de litros de
leite, gerando o equivalente a R$ 26,797 bilhões (IBGE, 2012). Dados do
Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE) indicam que no ano de
2017 a agropecuária teve aumento de 14,5% em sua produção contribuindo
com 5,7% do Produto Interno Bruto (PIB) (IBGE, 2017). Estes dados mostram
que a produção de gado se coloca em uma posição estratégica para a
economia do país, e desta forma, o Brasil precisa investir cada vez mais no
aumento da qualidade e da quantidade dos produtos provenientes da pecuária.
Entretanto, alguns patógenos são conhecidos por interferir na eficiência
produtiva da bovinocultura de corte e leite, causando danos aos animais e
perdas para os produtores. Dentre estes patógenos, destaca-se o
papilomavírus bovino (BPV), que causa lesões cutâneas e mucosas, que
podem inclusive levar ao surgimento de câncer no animal.
O BPV pertence à família Papillomaviridae, e infecta células epiteliais de
bovinos e animais que estão próximos fisicamente, como cães e gatos
domésticos, causando lesões hiperproliferativas conhecidas como verrugas ou
papilomas, que podem regredir ou levar ao surgimento de tumores benignos e
2
malignos (BAM et al., 2012; VILLIERS et al., 2004). Esses vírus evoluíram para
explorar os queratinócitos, que compõem a superfície da pele, bem como a
superfície do epitélio oral e genital (BUCK & TRUS, 2012). No gado saudável,
normalmente o sistema imunológico é capaz de combater as lesões
papilomatosas. Entretanto, em animais mal nutridos ou imunocomprometidos,
além daqueles que se alimentam de brotos de samambaia (Pteridium
aquilinum), há uma grande correlação entre papilomatose persistente e câncer.
O broto de samambaia possui substâncias toxicas que deixam o animal
imunocomprometido e susceptível ao desenvolvimento da papilomatose
(BORZACCHIELLO; ROPERTO, 2008).
A papilomatose bovina ocorre no Brasil e em vários outros países do
mundo e acometem principalmente bovinos jovens menores de dois anos.
Entretanto, bovinos de todas as idades podem ser afetados, estando
normalmente mais presentes em propriedades nas quais os animais
encontram-se agrupados como em confinamentos ou em rebanhos de leite
(LEISHANGTHEM et al., 2008).
Além da aparência desagradável do animal acometido pela
papilomatose cutânea, esta doença pode causar prejuízos incalculáveis às
diferentes propriedades, principalmente no que diz respeito à diminuição da
produção de carne, uma vez que os animais acabam ficando caquéticos. Há
ainda a desvalorização do couro do animal, desenvolvimento retardado,
cegueira, depreciação do valor do bovino em função da dificuldade em
comercializá-lo, além de problemas relacionados à fertilidade quando o
papiloma localiza-se no órgão reprodutor do animal fazendo com que este evite
a cópula (CARVALHO et al., 2013).
A presença das lesões papilomatosas no úbere de vacas em lactação
desvaloriza os animais e torna o úbere susceptível a infecções secundárias
resultando em mastites, que influenciam negativamente na produção de leite
(CARVALHO et al., 2013; BOCANETI, 2014). Em casos extremos, esta
enfermidade pode levar o animal à morte (JARRETT et al., 1978; FREITAS et
al., 2011; CARVALHO et al., 2012; BATISTA et al., 2013).
3
1.1 Estrutura do papilomavírus bovino
O BPV, agente causador da papilomatose bovina, é um vírus não-
envelopado de estrutura icosaédrica com 55-60 nm de diâmetro. Seu genoma
consiste de uma única molécula de DNA de cadeia dupla circular com
aproximadamente 8 Kilobases (Kb) de tamanho e se encontra associado com
proteínas do hospedeiro, as histonas (BORZACCHIELLO; ROPERTO, 2008;
BOCANETI et al., 2014) (Figura. 1).
Figura 1: Fotomicrografia por microscopia eletrônica criogênica (CryoEM) da estrutura
do capsídeo do papilomavírus humano tipo 16 (Fonte: Buck & Trus, 2012).
O genoma dos BPV pode ser dividido em três regiões: a região longa de
controle (LCR – Long Control Region, ou URR – Upstream Regulatory Region),
não codificante, e duas outras regiões que contem regiões de leitura aberta
(ORF – Open Reading Frames), a região de expressão precoce (E – Early) e a
região de expressão tardia (L – Late). A LCR é uma região com
aproximadamente 1000 pares de bases (pb), que compõe aproximadamente
12,5% do genoma, contém a região promotora onde o aparato de transcrição
viral irá se ligar e iniciar a transcrição dos genes virais. Essa região possui
vários elementos reguladores para a replicação do genoma e a transcrição dos
4
genes virais. A região E corresponde à 47,5% do genoma e codifica proteínas
não estruturais designadas E1-E8 que exercem funções reguladoras
importantes no ciclo de infecção do vírus. A região L codifica duas proteínas
estruturais, L1 e L2 que formam o capsídeo viral e compõem 40% do genoma
do vírus (ZHENG & BAKER, 2006; BORZACCHIELLO; ROPERTO, 2008;
BOCANETI et al., 2014) (Figura. 2).
Figura 2: Representação esquemática do genoma de BPV-1 evidenciando a região
controladora (URR), os genes de expressão precoce (E) e de expressão tardia (L)
(Fonte: Christensen et al., 2017).
1.2 Proteínas dos papilomavírus bovino
Dentre as proteínas dos BPV, E1 e E2 são as mais importantes na
replicação e transcrição do genoma do vírus. A proteína E1 é a mais
conservada, sendo importante para reconhecimento da origem de replicação
(ori), tem atividade de helicase dependente de ATP, e desempenha o seu papel
na replicação viral.
A proteína E2 é responsável pelo reconhecimento e ligação à origem de
replicação e recrutamento da proteína E1 especificamente na ori. Quando as
5
proteínas E2 e E1 se ligam, formam um complexo E2-E1-ori. Esse complexo
auxilia na montagem de um duplo hexamero de E1 com atividade de
deselicoidização da fita de DNA (SANDERS & STENLUND, 1998; SANDERS &
STENLUND, 2001; SANDERS, 2008; BERGVALL & MELENDY, 2013). Além
disso, E2 possui atividade de ligação ao cromossomo mitótico, a fim de
assegurar uma distribuição igual de epissomas virais entre as células-filha.
Essa proteína também exerce um papel na ativação ou inativação do processo
de transcrição do vírus. O gene E4 está completamente sobreposto em E2,
mas se encontra em uma matriz de leitura diferente. Ele produz uma pequena
proteína encontrada no citoplasma de queratinócitos durante a replicação. O
gene E4 está situado centralmente dentro do gene E2, numa região que
codifica o domínio flexível da proteína E2 (DOORBAR, 2013).
Três proteínas precoces são necessárias para o processo carcinogênico
do BPV, por isso são chamadas de oncoproteínas: E5, E6 e E7. E5 é uma
proteína associada à membrana hidrofóbica, que desempenha um papel
perturbando o controle do crescimento celular. E5 interage com várias
proteínas celulares exercendo um papel importante na transformação da célula
hospedeira e na evasão da resposta imune (DiMaio & Mattoon, 2001). E5
interfere na capacidade de comunicação das células através da comunicação
mediada pelas junções gap, ao bloquear a conexina 43, podendo tornar as
células transformadas insensíveis aos sinais de controle de crescimento das
células normais adjacentes (TOMAKIDI et al., 2000; VENUTI et al., 2011;
DIMAIO & PETTI, 2013). O primeiro domínio transmembranar de E5 interage
com elementos do Complexo Principal de Histocompatibilidade de classe I
(MHC I) através dos pares de leucina (REGAN & LAIMIN, 2008; CORTESE et
al., 2010). A regulação negativa do MHC I mediada por E5 leva a uma
diminuição desse complexo na superfície celular e acumulação do mesmo no
Complexo de Golgi. Esses eventos provocam uma redução do reconhecimento
ao vírus por células T CD8+ e, desta forma, ele pode burlar o sistema imune
(ARAIBI et al., 2006).
Outra função de E5 é a regulação negativa da expressão das proteínas
supressoras tumorais p21 e p27. Estas proteínas por sua vez estão fortemente
6
envolvidas na inibição das proteína-quinases dependente de ciclina (CdK),
promovendo a progressão do ciclo celular e a síntese de DNA na fase S da
interfase (DIMAIO & PETTI, 2013). A associação de E5 e E6 induz a formação
de coilócitos, células vacuolizadas com núcleos basofílicos circundado por um
halo claro (LETO et al., 2011).
A proteína E6 é conhecida por ter um grande número de parceiros
proteicos do hospedeiro e conduzir junto com a proteína E7 a progressão do
ciclo celular acima da camada basal, de modo a facilitar a amplificação do
genoma do viral. E6 atua inibindo a proteína supressora de tumor p53, com
isso garante que o vírus amplifique seu genoma. A p53 interrompe o ciclo
celular na presença de dano ao DNA e ativa a p21 (POL & KLINGELHUTZ,
2013).
A proteína E7 atua de forma sinérgica com E5 e E6 para a
transformação celular, cuja produção com as duas outras oncoproteínas
aumenta a eficiência de transformação. Além disso, E7 inibe as proteínas do
Retinoblastoma (pRb) através da via de ubiquitinação, resultando numa
estabilização da p53 e parada do ciclo celular. Para que isso não aconteça, E6
inibe a função da p53 e a célula segue no ciclo celular (EICHTEN et al., 2002).
A pRb regula o ciclo celular formando complexo com o fator de transcrição E2F
impedindo a progressão do ciclo para a fase S.
A ação combinada das proteínas E2, E5, E6 e E7 dos BPVs levam ao
aparecimento de acantose (MOODY & LAIMINS, 2010). E7 está associada à
hiperplasia das células da camada espinhosa, ocasionando um aumento no
número de desmossomos e tonofibrilas (FERNANDES et al., 2009).
A estrutura do capsídeo viral é constituída por duas proteínas
codificadas pelos genes de manifestação tardia em genomas virais, L1 e L2. O
gene L1 apresenta a região do genoma viral mais conservada, assim, é
importante para a classificação dos tipos, subtipos e variantes dos
papilomavírus (VILLIERS et al., 2004). O capsídeo é formado por 360 cópias
de proteína L1, organizadas em 72 capsômeros, e 12 cópias da proteína L2.
Apesar de estar presente em menor número, a proteína L2, que é a menor
7
proteína do capsídeo, é necessária para a morfogênese viral (revisado por
FREITAS et al., 2011).
1.3 Ciclo de infecção de papilomavírus bovino
A infecção pelo BPV ocorre na camada basal do epitélio, onde o genoma
viral apresenta-se em baixo número de cópias e em seu estado epissomal
(MOODY & LAIMINS, 2010; MCBRIDE et al., 2012). A entrada do vírus tem
início a partir de uma microlesão que expõe os peptideoglicanos de sulfato de
heparina da membrana plasmática (CULP et al., 2005; MCKINNEY et al.,
2015). A proteína L1 se liga ao sulfato de heparina, levando a uma mudança
conformacional que expõe a proteína L2 e esta é clivada pela furina, resultando
em uma segunda alteração estrutural que permite a ligação do vírus à integrina
α6. Esse processo permite a internalização do vírus por endocitose e
transferência do genoma viral para o núcleo, por volta de 2-4 horas após a
ligação do vírus à superfície da membrana (BOORBAR, 2005; KINES et al.,
2009; DOORBAR et al., 2012; MCBRIDE et al., 2012).
A expressão dos genes precoces virais é relativamente baixa, incluindo
os oncogenes E5, E6 e E7, o gene E1, e o fator de transcrição E2. As proteínas
produzidas por esses genes conduzem em conjunto a divisão dos
queratinócitos na camada basal do epitélio e estimulam baixos níveis de
replicação do DNA viral em sincronia com elementos extracromossômicos do
hospedeiro (BUCK & TRUS, 2012).
O fator de replicação viral E1 com sua atividade de helicase e a proteína
auxiliar E2, que também é um fator de transcrição viral, são expressos no início
da infecção. Quando as células infectadas entram na camada epitelial
suprabasal, as proteínas E6 e E7 promovem a progressão do ciclo celular não
programada e manipulam os programas de diferenciação celular. Nesta fase,
outras proteínas reguladoras virais, E4 e E5, são expressas. À medida que
essas células avançam na camada epitelial ocorre uma amplificação produtiva
do DNA viral com aumento na síntese das proteínas E1 e E2. Finalmente,
8
ocorre a síntese das proteínas da cápside, L1 e L2, na camada granular do
epitélio e as partículas virais são montadas (MCKINNEY et al., 2015; EGAWA
et al., 2015) (Figura. 3).
O processo de infecção do vírus é acoplado à replicação do genoma
viral, esse processo depende dos fatores do hospedeiro. Durante a infecção, os
fatores do hospedeiro são inibidos ou ativados por proteínas do patógeno
(KLYMENKO et al., 2017). Estudos têm demonstrado que o vírus regula esses
fatores para garantir o aumento do número de cópias do genoma viral e assim
desencadear o processo infeccioso (CULP et al., 2005; MCKINNEY et al.,
2015; KLYMENKO et al., 2017). Ainda não se sabe quais são esses genes do
hospedeiro que são regulados pela infecção por vírus, dessa forma, este
trabalho é relevante para conhecer como ocorre o processo patogênico no
animal, e também para encontrar alvos para possíveis drogas que interrompem
o ciclo de infecção do vírus do papiloma, evitando assim a papilomatose.
Figura 3: Ciclo de infecção de papilomavirus bovino (modificado de Mckinney et al.,
2015).
Manutenção
do genoma
Amplificação
do genoma
Montagem
do virion
D
i
f
e
r
e
n
c
i
a
ç
ã
o
9
1.4 Classificação de papilomavírus bovino
Os papillomavírus bovino são classificados em cinco diferentes gêneros:
Deltapapillomavirus, Xipapillomavirus, Epsilonpapillomavirus,
Dyoxipapillomavirus, e Dyokappapapillomavirus (ZHU et al., 2012; RECTOR;
RANST, 2013). Atualmente são conhecidos 21 tipos de BPV. Os BPV -1, -2, -
13, e -14 são classificados como Deltapapillomavirus; BPV -3, -4, -6, -9, -10, -
11, -12, -15, -17, e -20 pertencem ao gênero Xipapillomavirus; BPV -5 e -8
pertencem ao gênero Epsilonpapillomavirus; BPV-7 ao gênero
Dyoxipapillomavirus; e BPV -16 e -18 pertencem ao gênero
Dyokappapapillomavirus (VILLIERS et al., 2004; RECTOR; RANST, 2013;
BOCANETI et al., 2014; MONDAY at al., 2015; DAUDT et al., 2016). Os BPV -
19, e -21 ainda não foram classificados em nenhum dos gêneros descritos.
Provavelmente esses tipos serão agrupados em novos gêneros (DAUDT et al.,
2016).
Os tipos de BPV que são classificados no gênero Deltapapillomavirus
induzem fibropapilomas cutâneos que consistem de componentes epiteliais e
dérmicos, já os tipos do gênero Xipapillomavirus são responsáveis pela
ocorrência de verdadeiros papilomas, principalmente epiteliotrópico, e os dos
gêneros Epsilonpapillomavirus e Dyokappapapillomavirus induzem
fibropapilomas e papilomas verdadeiros (BOCANETI et al., 2014; DAUDT et al.,
2016; BAUERMANT et al., 2017).
Os diferentes tipos de BPV podem causar lesões em diferentes locais do
corpo do animal. O BPV-1 tem sido relacionado com lesões nos tetos, pênis,
papadas, costas e fibropapilomas cutâneas; BPV-2 com verrugas de pele e
fibropapilomas gastrointestinais; BPV-3 com papilomas da pele; BPV-4 com
papilomas epiteliais do trato gastrointestinal e pele; BPV-5 com verrugas no
ombro, ao redor dos olhos e úbere e fibropapilomas; BPV-6 com papilomas nos
tetos, ombro e ao redor dos olhos; BPV-7 e BPV-8 com verrugas cutâneas na
região das costas; BPV-9 e BPV-10 com papilomas epiteliais escamosos nos
tetos e úbere; BPV-11 com verrugas nos tetos e fibropapilomas; BPV-13 tem
sido associado com papiloma cutâneo da orelha, e tumores de bexiga; e BPV-
10
14 com tumores de bexiga (BATISTA et al., 2013; BOCANETI et al., 2014,
ROPERTO et al., 2016, ROPERTO et al., 2016).
Alguns tipos de BPV estão associados com câncer em bovinos,
especialmente quando combinado com co-fatores ambientais, como a ingestão
de brotos de samambaia (FREITAS et al., 2011). O BPV-1 e BPV-2 estão
associados com câncer da bexiga urinária que resulta em hematúria, levando à
morte do animal, e o BPV-4 desenvolve papilomas no trato gastrointestinal
superior que pode evoluir para carcinomas (HAGA et al., 2013). É sabido que
os BPV tipo 3, 5 e 6 não estão relacionados com câncer em bovinos. No
entanto, existe apenas uma quantidade muito limitada de informações
disponíveis sobre a patologia associada com os outros tipos de BPV, tornando
importantes estudos que visem identificar os mecanismos moleculares pelos
quais estes vírus desenvolvem o ciclo de infecção. Mais informações precisam
ser acumuladas de forma a elucidar a associação do BPV e a doença que ele
desenvolve no hospedeiro. Entender a relação hospedeiro-patógeno no
desenvolvimento da papilomatose bovina é crucial para o desenvolvimento de
métodos diagnósticos e de tratamento mais eficientes para o controle desta
patologia.
1.5 Dogma central da biologia molecular e transcriptômica
O dogma central da biologia molecular estabelece que o fluxo da
informação genética seja passado de uma molécula de DNA para outra
molécula de DNA por meio da replicação do material hereditário, essa molécula
é transcrita em uma molécula de RNA e por fim traduzida em uma molécula de
proteína para manifestação do fenótipo (CRICK, 1958; CRICK, 1970). O
conjunto completo dos genes de uma molécula de DNA que foram transcritos
em moléculas de RNA formam o transcriptoma de uma célula. Essas moléculas
de RNA regulam boa parte da atividade biológica da célula, sendo de suma
importância para manutenção do metabolismo celular. Compreender a
abundância e funcionamento das moléculas de RNA na célula, tecidos ou
11
órgãos sob uma condição fisiológica específica é o principal objetivo dos
estudos com RNA (WANG et al., 2009).
O transciptoma é formado por diferentes classes de RNA, abrange desde RNA
que codificam proteínas, tal como o RNA mensageiro (RNAm), a RNA não
codificantes, como RNA transportador (tRNA), RNA ribossômico (rRNA), RNA
de interferência (siRNA), RNA nuclear (snRNA), RNA nucleolar (snoRNA),
micro RNA (miRNA) e outras variedade de RNA (MATTICK & MAKUNIN, 2006;
STEFANI & SLACK, 2008; KUKURBA & MONTGOMERY, 2015). Dentre todos
as classes de RNA, o mRNA é o mais estudado já que produz proteína e estas
estão fortemente associadas com o desenvolvimento do corpo e surgimento de
doenças (KUKURBA & MONTGOMERY, 2015).
Estudos pioneiros de expressão gênica basearam-se em métodos, como
reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR), que se limita ao estudo
de transcritos únicos. Ao decorrer do anos, os métodos evoluíram para permitir
a quantificação transcriptômica em larga escala. A primeira tecnologia
desenvolvida para estudar o transcriptoma foi a do microarranjos de DNA
baseada em hibridação de genes marcados com fluoróforos (SCHENA et al.,
1995).
Apesar da tecnologia de microarranjos de DNA ser de mais acessível do
ponto de vista financeiro, ela possui algumas limitações. O método possui uma
capacidade limitada de quantificar os genes expressos, pois a hibridização
cruzada diminui a especificidade e sensibilidade da técnica (SHENDURE,
2008). Além disso, é necessário ter um conhecimento prévio das sequências
do organismo em estudo para que se possa inferir algo (CASNEUF et
al., 2007; SHENDURE, 2008).
Com o objetivo de suprir essas limitações, métodos baseados em
sequenciamento foram desenvolvidos. Os novos métodos de sequenciamento
de nova geração (NGS) permitem a análise de moléculas de RNA a partir de
DNA complementar (cDNA). Este método é conhecido como sequenciamento
de RNA (RNA-seq) e apresenta várias vantagens em relação aos métodos
anteriores, fornecendo uma visão mais ampla e quantitativa da expressão
gênica (WANG et al., 2009).
12
A análise do transcriptoma é importante para entender a relação entre o
genótipo e fenótipo e compreender as vias e os mecanismos de controle
celular, desenvolvimento e progressão das doenças.
1.6 Tecnologia de sequenciamento de RNA de nova geração (RNA-seq)
A tecnologia de sequenciamento de RNA de nova geração (RNA-seq)
permite o sequenciamento em larga escala do transcriptoma de uma célula que
é expresso sob uma determinada condição. Neste tipo de sequenciamento são
geradas grandes quantidades de dados, ou seja, são produzidas grandes
quantidades de sequências de RNA que precisam ser analisadas de forma
automatizada, tornando estas informações mais claras aos pesquisadores que
as utilizam em novas pesquisas e comparações de organismos (ZHONG et al.,
2009). Essa técnica é utilizada para determinar o nível de expressão gênica de
forma acurada, podendo ser aplicada na avaliação da expressão diferencial de
genes envolvidos na relação hospedeiro-patógeno, como foi visto com
papilomavírus humano (CHEN et al., 2014), e também na relação planta-
patógeno (SEDANO; CARRASCAL, 2012; PROGAR, et al., 2017).
RNA-seq mostra com detalhes o perfil do nível de expressão dos genes,
identifica genes diferencialmente expressos em duas ou mais condições e
mostra a caracterização do transcriptoma de todos os genes expressos. Este
método foi bem-sucedido no estudo de tecidos mamários bovinos
(WICKRAMASINGHE et al., 2012; CUI et al., 2014; CANOVAS et al., 2014;
IBEAGHA-AWEMU et al., 2016) e na analise de diferencial de queratinócitos
durante a infecção por papilomavírus humano (KLYMENKO et al., 2017).
Entretanto, nenhum desses estudos considerou o efeito da expressão gênica
durante a infecção por BPV.
Desta forma, este estudo se torna relevante por propor aumentar o
conhecimento da interação hospedeiro-patógeno no desenvolvimento das
lesões papilomatosas em bovinos, e assim fornecer subsídios para a
identificação de genes diferencialmente expressos que podem estar envolvidos
13
nestas lesões, podendo ser utilizadas para auxiliar no desenvolvimento de
estratégias de controle das doenças associadas ao papilomavírus bovino.
14
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Identificar genes bovinos diferencialmente expressos associadas com a
infecção por papilomavírus bovino utilizando a tecnologia de RNA-Seq.
2.2 Objetivos Específicos
Obter transcritos de lesões papilomatosas e de tecidos normais;
Construir uma biblioteca de cDNA associada com transcritos isolados de
lesões papilomatosas e de tecidos saudáveis;
Avaliar o transcriptoma relacionado com a infecção por papilomavírus
bovino;
Identificar genes regulados devido à infecção pelo BPV;
Avaliar funcionalmente os genes do hospedeiro regulados pelo vírus;
15
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Coleta das Amostras
Foram coletadas três amostras de lesões papilomatosas cutâneas e três
amostras de tecido epitelial saudável (controle) de seis diferentes bovinos
fêmeas leiteiras, da raça girolando, com até dois anos de idade na Fazenda
São José – Aquidabã, região Central Agreste do estado de Sergipe, Nordeste
do Brasil. A coleta foi realizada por profissional médico veterinário qualificado e
registrado no conselho da classe, de acordo com os procedimentos
estabelecidos pelo comitê de ética correspondente. Inicialmente foi efetuada a
limpeza local com água e sabão e anti-sepsia da área ao redor das verrugas
com álcool a 70ºC. Em seguida, foi realizada incisão de parte dos papilomas
com tesoura de Mayo® e/ou lâmina de bisturi, utilizando-se para tal, luvas
descartáveis para cada animal. Após a retirada da lesão, foi utilizada pomada
veterinária cicatrizante do tipo Vetaglós® (que possui como princípio ativo
gentamicina, sulfadiazina de prata e vitamina A), aplicando uma fina camada
em cima da área afetada. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em
Pesquisa com Animais de Produção da Universidade Federal de Sergipe
(Protocolo: 05/14).
As amostras do tecido coletado de cada animal foram fragmentadas em
três porções utilizando lâmina de bisturi estéril. Uma porção foi destinada à
identificação molecular do vírus presente na amostra, sendo transportada em
caixa térmica e mantida a -20ºC para posterior manuseio. A segunda porção foi
destinada à análise histopatológica para a confirmação da lesão papilomatosa,
sendo fixada em solução de formalina tamponada a 10% em PBS. E a terceira
porção foi coletada utilizando RNAlater (Qiagen, SP, Brasil), e o tecido extraído
foi prontamente congelado com nitrogênio líquido para posterior manipulação e
avaliação da expressão gênica.
3.2 Detecção da lesão papilomatosa
O material fixado em solução de formalina tamponada a 10% em PBS foi
desidratado em diferentes concentrações de álcool, infiltrado em parafina,
16
submetido a cortes de 3-5 µm no micrometro e corado com hematoxilina-eosina
(HE). As lâminas foram analisadas em microscópio óptico binocular, com
objetivas de 5X, 10X, 20X e 40X.
3.3 Detecção molecular de BPV
Para verificar a presença de BPV na lesão, cada amostra foi macerada
individualmente para extração de DNA total com o auxílio do kit Wizard®
Genomic DNA Purification (Promega, SP, Brasil), seguindo instruções do
fabricante. A quantificação do DNA extraído foi realizada utilizando
espectrofotômetro Nonodrop. A integridade do DNA extraído foi confirmada
através de PCR para o gene da beta-globina bovina (primer forward 5’- AAC
CTC TTT GTT CAC AAA GAG -3’ e primer reverse 5’- CAG ATG CTT AAC
CCA CTG AGC -3’) (YAGUIU et al., 2008). Cerca de 20 ng de DNA foi utilizado
para a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) utilizando os primers de
detecção geral FAP59/64 para BPV (FORSLUND et al., 1999).
Todas as reações de amplificação foram preparadas para um volume
final de 25 μL, sendo estas compostas de 12 μL de PCR Master Mix (Promega,
SP, Brasil), 1 μL do primer forward, 1 μL do primer reverse, 2 μL de DNA e 9 μL
de água ultrapura. Todos os primers utilizados estavam na concentração de 10
μM. A solução foi levada ao termociclador e submetida desnaturação inicial a
94ºC durante 10 min, 35 ciclos de 94ºC durante 1 min, 50ºC durante 1 min,
72ºC durante 1 min, seguido por uma fase de extensão final a 72ºC por 10 min.
Os produtos da PCR foram submetidos à eletroforese utilizando gel de agarose
1,5%, 1x TBE buffer, peso molecular (DNA step Ladder), corado com
Diamond™ Nucleic Acid Dye e fotografado com transluminador UV.
Os produtos da PCR foram purificados usando o kit Wizard® SV and PCR
Clean-Up System (Promega) e submetidos a sequenciamento automático pelo
Applied biosystems 3500 utilizando o kit BigDye® Direct Sanger Sequencing
(ThermoFisher, Brasil). A qualidade do sequenciamento e montagem dos
contigs foi realizada usando os programas Pregap4 e Gap4 contidos no pacote
de programas Staden v.2.0 (STADEN, 1996). Somente as sequências com
valor de Phred acima de 30 foram consideradas para a montagem dos contigs.
17
O programa Nucleotide Blast (ALTSCHUL et al., 1990) foi utilizado para
comparar as sequências de nucleotídeos com as de referência, depositadas no
GenBank do National Center for Biotechnology Information (NCBI)
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
3.4 Isolamento de RNA e sequenciamento
O RNA total (~15 µg/amostra) foi purificado utilizando ReliaPrep™ RNA
Tissue Miniprep System (Promega), de acordo com as instruções do fabricante.
A concentração do RNA foi mensurada com Nanodrop ND-2000 (NanoDrop
Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA) e a qualidade foi verificada com
Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA).
As bibliotecas foram confeccionadas a partir de 250 ng de RNA total
usando o TruSeq Stranded mRNA Sample Preparation LS Protocol Kit (Illumina
Inc. San Diego, CA, USA), seguindo as orientações do fabricante. As
bibliotecas foram quantificadas usando Library Quantification Kits (Illumina Inc.
San Diego, CA, USA). O tamanho do fragmento foi avaliado utilizando
Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies). A formação dos clusters na célula de
fluxo foi realizada usando cBot instrument (Illumina Inc). As bibliotecas foram
sequenciadas como multiplex em proporções iguais, na forma de 50 ciclos de
100 bp paired-end reads, no HiSeq 2000 system (Illumina Inc. San Diego, CA,
USA) rodada no HCS software v2.2.58.
3.5 Identificação dos genes diferencialmente expressos
Os dados obtidos a partir das imagens adquiridas após o
sequenciamento foram transformados por base calling em reads e
armazenados no formato FASTQ. A plataforma Galaxy foi utilizada para análise
dos dados gerados pelo sequenciamento (BLANKENBERG et al., 2010). Os
reads foram submetidos à avaliação de qualidade utilizando FastQC
(ANDREWS, 2010). O algoritmo Phred foi utilizado para a avaliação da
qualidade do sequenciamento e do base calling (EWING & GREEN, 1998;
EWING et al., 1998). As sequências adaptadoras, homopolímeros e as bases
18
com baixa qualidade foram retirados dos dados FASTQ utilizando o programa
Trimmomatic (BOLGER et al., 2014). Os reads que possuíam menos que 70 pb
após o processamento foram removidos. Após, os reads foram montados em
contigs e alinhados com o genoma de bovino de referência utilizando os
programas TopHat e Bowtie (TRAPNELL et al., 2013).
Os reads mapeados, pertencentes aos bovinos, foram analisados
usando Cufflinks (TRAPNEL et al., 2013) para quantificar a expressão de cada
gene do animal, para calcular o FPKM/RPKM (fragments per kilobase of
transcript per million mapped reads) e para gerar informações sobre a
cobertura do genoma. A análise de expressão diferencial dos genes foi
realizada usando a ferramenta Cuffdiff (TRAPNEL et al., 2013) e visualizado
por meio do programa CummeRbund (TRAPNEL et al., 2013). Os genes
diferencialmente expressos foram definidos como significativos quando tendo
uma taxa de descoberta falsa (FDR) (BENJAMINI & HOCHBERG, 1995) com
valor corrigido de p<0,1 (ANDERS & HUBER, 2010; IBEAGHA-AWEMU et al.,
2016).
3.6 Anotação funcional e análise das vias moleculares dos genes
diferencialmente expressos
A anotação funcional dos genes diferencialmente expressos foi realizada
utilizando os bancos de dados do Gene Ontology (GO)
(http://www.geneontology.org/) e da Universal Protein knowledgebase (UniProt)
(http://www.uniprot.org/). Os genes que apresentaram funções associadas com
a progressão da lesão papilomatosa em bovino tiveram sua via mapeada
utilizando o banco de dados do Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes
(KEEG) (http://www.genome.jp/kegg/) e seus parceiros foram analisados
usando STRING (https://string-db.org/).
19
4 RESULTADOS
4.1 Análise histopatológica e detecção do DNA viral
A análise histopatológica comprovou a presença de lesão papilomatosa
em todas as amostras de animais que apresentavam sinais clínicos
condizentes com a papilomatose. Foram visualizados através de
fotomicrografia a presença de hiperqueratose da camada epitelial, coilocitose e
acantose (Figura. 4, a-c). Nas análises realizadas em amostras de tecidos
saudáveis não foi encontrado nenhum indício de hiperqueratose, coilocitose e
acantose (Figura. 4, d-e).
20
Figura 4:.Fotomicrografias da verruga pela coloração de hematoxilina e eosina. a)
fragmento de um papiloma. Hiperqueratose (Q) da camada epitelial e com
irregularidade da epiderme (E). Aumento de 40x. b) visualização de coilocitose (C).
Aumento 40x. c) acantose (A). Aumento de 10x. d) tecido animal sem o vírus,
evidenciando a camada epitelial sem presença de hiperqueratose e núcleos normais.
E Q
a)
b)
C
c)
A
d) e)
21
Aumento de 40x. e) células da camada espinhosa sem presença de acantose.
Aumento de 10x.
O DNA viral foi identificado nas amostras dos três animais que
apresentaram sinais clínicos de lesões papilomatosas, as quais foram
confirmadas por sequenciamento e comparação no banco de dados pelo
algoritmo Blastn.
4.2 Sequenciamento de RNA e avaliação das sequências
Seis bibliotecas de cDNA foram construídas em duplicata, sendo três de
animais saudáveis e três de animais com lesões papilomatosas, e
sequenciadas pela plataforma Illumina. O sequenciamento de RNA gerou um
total de 121.722.238 reads paired-ends com uma cobertura de
aproximadamente 20 milhões de reads por biblioteca. O comprimento médio
das sequências contidas nos arquivos R1 (Forward) e R2 (Reverse) foram de
101 pares de bases (pb).
A análise da qualidade das sequências mostrou que todas as reads
possuíam boa qualidade, tendo um valor de Phred médio acima de 32,
significando que há uma chance em mil de cada uma das bases terem sido
inseridas incorretamente durante o sequenciamento. Levando em consideração
que cada read possuía aproximadamente 101 pb, poucos erros são esperados
(Figura. 5).
22
Figura 5: Distribuição dos valores de qualidade Phred por posição no read em pares
de base (pb) evidenciando os altos valores na camada verde do gráfico. A) Gráfico de
qualidade do arquivo R1 (Forward); B) Gráfico de qualidade do arquivo R2 (Reverse).
A)
B)
23
Após a remoção dos adaptadores e das sequências de baixa qualidade,
o número de reads contidos nos arquivos R1 e R2 foram reduzidos em torno de
2 milhões, ficando um total de mais de 17 milhões de reads por arquivo. Ao
final da filtragem, foram gerados quatro arquivos, sendo dois arquivos paired-
end com as sequências pareadas e dois arquivos unpaired, que contém as
sequências cujo par foi removido durante a análise.
4.3 Mapeamento dos transcritos e expressão gênica
O alinhamento mostrou que 87,56% (93.261.478) das sequências foram
mapeadas com o genoma bovino de referência (UMD3.1 Bos taurus 8). Das
sequências mapeadas, 94,29% (87.934.570) tiveram posições únicas, 16,20%
(15.106.598) foram mapeadas em múltiplas posições e 4,1% (3.868.570)
tiveram alinhamentos discordantes (Tabela 1).
Tabela 1. Reads e estatísticas de montagem
Biblioteca paired
reads
trimmed
pairs
Total de
reads
alinhados
no genoma
Alinhamentos
múltiplos
Alinhamentos
discordantes
Alinhamentos
de posições
únicas
1 20335461 17917849 15920141 2740052 649007 15011438
2
3
19950125
20407539
17165233
17796330
15573331
15831717
4947482
2041789
543712
681433
14744157
14913038
4 19266702 17389959 15142172 2013621 683536 14191137
5 21908947 19081327 15028129 1730788 586840 14203296
6 19853464 17389655 15765988 1632866 724042 14871504
A análise de expressão gênica identificou um total de 14.213 genes
expressos. Usando os valores de RPKM, os genes foram classificados em
muito altamente expressos (>2% do total de valores RPKM), altamente
expressos (0.1 para 1.99%), mediamente expressos (0.01 para 0.099%), pouco
24
expressos (0.001 para 0.0099%) e muito pouco expressos (<0.0099%) (Tabela
2).
Tabela 2: Número de genes expressos por categoria em animais infectados e
não infectados por papilomavírus bovino
Categoria RPKM
Range (% of total) Infectados Não infectados
Muito altamente expressos >2% 6 5
Altamente expressos 0,1 a 1,99% 114 107
Mediamente expressos 0,01 a 0,099% 849 872
Pouco expressos 0,001 a 0,0099% 5082 5334
Muito pouco expressos < 0,00099% 8123 6354
Nossas análises revelaram que 1343 genes foram diferencialmente
expressos (FDR <0,1). Na comparação dos genes expressos em bovinos
infectados e não infectados pelo vírus, foi encontrado 650 genes com
regulação ascendente e 693 genes com regulação descendente no grupo de
bovinos com o vírus.
Trinta e um dos principais genes diferencialmente expressos e suas
funções estão listados na Tabela 3. No grupo de vacas com o vírus foram
encontrados 14 genes regulados de forma ascendente e no grupo de vacas
sem o vírus 17 genes foram regulados de forma ascendente. Dentre os
principais genes listados destacam-se como regulados de forma ascendente
pelo vírus os genes IFI6, IVL, FABP4, BNIP3, ISG15, OAS1Y e SERPINA 12.
Como regulados de forma descendente temos BOLA-DYB, KRT78, KRTAP3-1,
CST6, HEPACAM, ZBTB16, KRT35 e SPP1. Todos esses genes
diferencialmente expressos estão fortemente associados com a presença do
vírus no animal.
25
Tabela 3: Genes diferencialmente expressos e suas funções
Símbolo do gene
Nome do gene
% RPKM em vacas infectadas com BPV
% RPKM em vacas
sem o BPV
Função do gene
BOLA-DYB Principal de
Histocompatibilidade de classe II, DY beta
0,129 0,975
Participa da resposta imune; ligação do peptídeo a molécula de MHCII
DAPL1 Proteína associada à
morte 1 0,798 5,430
Desempenha um papel na diferenciação do epitélio e apoptose
IFI6 Proteína induzível de
interferon alfa 6 1,934 0,453
Contribui para apoptose induzida por interferon através da perturbação normal da função da mitocôndria
KRT78 Queratina, tipo cito
esqueleto 78 0,137 1,355
Principal proteína estrutural do cabelo
IVL Involucrina 4,097 0,439 Participa da diferenciação dos queratinócitos
FABP4
Proteína de ligação a ácidos graxos
114,396
3,280
Participa da regulação positiva da proliferação celular e regulação da resposta inflamatória
KRTAP3-1
Queratina associada a proteína 3-1
0,939
9,875
Possui atividade estrutural
UBA7
Proteína UBA7
0,349
0,147
Atividade de ubiquitinção; participa da ativação da enzima ISG15
CST6
Cistatina-B
50,470
272,66
Inibidor de cisteína tipo endopeptidase
BNIP3
Proteína 3 interagindo com BLC2
7,220
0,422
Participa da defesa a resposta a vírus; regulação negativa do processo apoptótico
HEPACAM
Molécula de adesão celular de hepatócitos
0,006
0,029
Envolvida na regulação da mobilidade celular; contribui para inibição do crescimento e proliferação celular
...Continua...
26
Cont. Tabela 3.
ISG15
Proteína semelhante à ubiquitina ISG15 U
3,406
0,165
Participa da resposta a vírus. Envolvido na via de infecção do papilomavírus humano
BLA-DQB
Antígeno MHC classe II
0,569
2,141
Participa da resposta imune
ZBTB16
Domínio de zinco e BTB contendo 16
0,001
0,019
Repressor da atividade transcricional
GGCT
gamma-glutamylcyclotransferase
2,707
0,32
Papel na homeostase da gluationa; indução da apoptose
IFI27
Proteína indutível de ISG12(a)
0,712
0,113
Contribui para apoptose induzida por interferon através da perturbação normal da função da mitocôndria
OAS1Y
Proteína não caracterizada
0,973
0,134
Participa na defesa a resposta a vírus
RXRG
Receptor gama de retinóide x
0,005
0,025
Regulação da expressão gênica
BLK
BLK proto-oncogene, Src família da tirosina
quinase
0,021
0,039
Participa da regulação da proliferação e diferenciação celular; atua na resposta imune inata
KRT35
Queratina 35
0,127
1,178
Repressor da atividade transcricional
SERPINA12
Serpina 12
4,932
0,472
Atua no processo inflamatório e supressão do tumor
ZNF385B
Proteína de dedo de zinco 385B
0,008
0,036
Participa do processo apoptótico via sinalização da p53
...Continua...
27
Cont. Tabela 3.
PRSS23
Protease, serina 23
0,633
0,14
Atua no processo inflamatório e supressão do tumor
VEGFD
Fator D de crescimento vascular endotelial
0,021
0,032
Atividade de fator de crescimento; participa da proliferação celular
PHLDA1
Proteína PHLDA1
0,786
0,14
Participa da via do câncer (promotores do câncer)
FGFR1
Receptor 1 do fator de crescimento do
fibroblasto
0,084
0,573
Participa do ciclo celular; atividade de crescimento, proliferação e diferenciação celular
LOC785756
Proteína beta de ligação ao andrógeno
1,746
109,783
Atividade anti-inflamatória e imunomodulatória
SPP1
Osteoproteína
0,231
0,981
Atua como citosina, envolvido no aumento da produção de interferon-gama e interleucina-12
PTGS2
Prosteoglandina G
0.409
0,026
Principal mediador da inflamação; desempenha um papel na motilidade, proliferação e resistência a apoptose
OSM
oncostatina M
0,258
0,001
Regulador do fator de crescimento; inibe a proliferação de células tumorais
4.4 Anotação funcional dos genes diferencialmente expressos
Foi realizada a anotação funcional dos 1343 genes diferencialmente
expressos presentes em bibliotecas de tecidos infectados e não infectados. As
anotações foram feitas para as três categorias do Gene Ontology (GO), sendo
28
que a maioria dos genes tiveram anotações para Componente Celular
(85,55%), seguido de Função Molecular (78,55%) e Processo Biológico
(73,79%).
Dentro da categoria de Componente Celular, a grande maioria dos
genes compõem os componentes de membrana, citoplasma e núcleo. Os
genes que atuam no citoplasma não estão associados a organelas e nem a
membrana plasmática (Fig. 6).
Na categoria Função Molecular boa parte dos genes apresentaram
função estrutural, de transcrição e de ligação ao RNA. Atividade de transferase
e transcrição foram as principais funções moleculares envolvendo
respectivamente 42 (p-valor 0,001) e 32 (p-valor 0,001) dos genes
diferencialmente expressos em vacas infectadas com BPV. O número de genes
com atividade estrutural foi reduzido consideravelmente em vacas com o vírus
(Figura. 6).
29
Figura 6: Anotação funcional por Gene Ontology. Genes Up-regulados em
grupo de vacas infectadas pelo BPV.
Na categoria de Processo Biológico, a maioria dos genes estavam
associados à regulação da transcrição, ciclo celular, proliferação, diferenciação
celular e processo imune.
Expressão gênica
Proliferação celular
Apoptose
Resposta imune
Ciclo celular
Diferenciação celular
Ubiquitinação
Queratinização
Resposta a vírus
Crescimento celular
Membrana
Citoplasma
núcleo
Extracelular
Intracelular
Transmembrana
Queratina
Transferase/Acyltransferase
Transcrição
Hemodimerização
Ligação ao RNA
Ubiquitinização
Ligação ao DNA
Estrutural
Crescimento celular
Apoptose
Pro
ce
sso B
ioló
gic
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om
po
nen
te C
elu
lar
Fun
çã
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cu
lar
85
65
64
55
52
38
33
13
14
8
284
201
91
17
10
10
10
42
38
34
29
23
23
22
19
5
Número de genes
30
Entre as funções moleculares e celulares, destacou-se a morte, o
crescimento, a proliferação e o ciclo celular. A anotação dos genes
diferencialmente expressos revelou funções associadas com a progressão da
lesão papilomatosa e o desenvolvimento de câncer no gado. A anotação
funcional desses genes mostrou que muitos estavam associados à função
molecular estrutural (TUBB2B, KRT28, KRT79, KRT25), ligação ao RNA
(FSCN1, OAS1Y, TRIM25), ao antígeno e ao domínio da morte (CASP14,
CSTB, CST6), desencadeadas pelo vírus no hospedeiro. Outros estavam
envolvidos em processos biológicos como, ciclo celular (BMP7, WNT5B,
TP53INP1), regulação da transcrição gênica (FDFT1, GGCT, MX1) e
imunidade (DLX2, SOSTDC1, DLX1). E outros associados ao componente
celular do hospedeiro tais como, componente de membrana (AK1, SLC52A3,
TMEM79) transmembrana (CREM, JUNB, ELL2), região intracelular (KRT28,
KRT79, KRT25), núcleo (UACA, HES2, FABP4), citoplasma (ZEB1, SEPT8,
ADA) e filamento intermediário (SYNM, VIM, KRT24).
Na análise realizada no KEGG foi possível identificar que 116 genes
associados à progressão da lesão apresentaram via metabólica. As vias mais
comumente encontradas foram as de adesão celular de moléculas,
processamento e apresentação de antígeno, diferenciação de células TH1 e
TH2, e via da infecção pelo papilomavírus humano.
Dentre as vias metabólicas estudadas foi encontrada a via de infecção
do papilomavírus humano, como referência, via ativação do gene ISG15
(Figura. 7).
31
Figura 7: Via metabólica identificada pelo KEGG para o gene regulado de forma
ascendente (ISG15) no grupo de vacas infectadas pelo BPV.
Os parceiros celulares do ISG15 foram analisados e dentre as muitas
funções, todos tinham em comum a resposta celular a vírus e função de
ubiquitinação (Figura. 8). Dois dos parceiros de ISG15 foram diferencialmente
expressos nesse estudos, são eles UBA7 e HERC5. É importante destacar que
esses foram regulados de forma ascendente em vacas infectadas pelo vírus.
32
Figura 8: Interação entre o gene regulado de forma ascendente ISG15 e seus
parceiros celulares.
Em geral, os principais genes que foram significativamente modulados
pela presença do vírus em vacas em comparação com o controle foram genes
com função estrutural, transcrição, morte celular e crescimento celular.
33
5 DISCUSSÃO
Neste estudo, a tecnologia de sequenciamento de RNA de nova geração
foi utilizada para apresentar o repertório de moléculas de RNA de um sistema
biológico no tecido epitelial bovino após a infecção por BPV. Os dados dos
controles e do grupo de infeção foram todos tirados de animais diferentes, com
e sem a presença do vírus e na mesma propriedade, dando a oportunidade de
medir o efeito dos tratamentos sobre a expressão gênica. Além disso, os
animais experimentais estavam todos no mesmo estágio de maturidade, o que
implica que as alterações na expressão gênica devido à idade não deveriam
influenciar os resultados da expressão gênica neste estudo.
A infecção pelo BPV no animal modificou o perfil de expressão de alguns
dos genes do hospedeiro. Nossos dados corroboram com os dados dos
estudos de EGAWA et al., (2015) e KLYMENCO et al., (2017), quando eles
apresentam uma mudança no perfil de expressão dos queratinócitos em
células com HPV. A alta expressão dessas células é diretamente influenciada
pelo patógeno, uma vez que o vírus infecta essas células e usa de sua
maquinaria para replicar-se e transcrever os genes virais.
Nossos resultados também sugerem um aumento da expressão dos
genes de queratina TMEM79, IVL, KRT10, FOXN1 e SOSTDC1 no animais
infectados quando comparada ao controle. Isso acontece devido à infecção
pelo BPV, uma vez que o patógeno se utiliza das células dos queratinócitos
para amplificar seu genoma e sintetizar suas proteínas (KLYMENKO et al.,
2017). Os queratinócitos são os principais componentes na resposta imune,
induzem a produção de moléculas envolvidas na defesa do hospedeiro contra
patógenos (KLYMENKO et al., 2017).
A alta expressão de IVL e KRT10, marcadores-chave de diferenciação
de queratinócitos, em animais com BPV é esperada, uma vez que, a infecção
pelo vírus prejudica a diferenciação epitelial tornando os níveis de expressão
desses dois genes elevada (EGAWA et al., 2015; KLYMENCO et al., 2017).
Os genes diferencialmente expressos regulados de forma ascendente
(≥2 do valor de RPKM) S100A9, P28782, S100A12 e CAAF1 podem ser
34
candidatos importantes na via de infecção por papilomavírus bovino visto que,
todos estes genes codificam proteínas com funções metabólicas, imunes e
inflamatórias conhecidas no epitélio normal. Os genes S100A9 e P28782 estão
envolvidos na resposta inflamatória e indução do apoptose via ativação de p53;
S100A12 e CAAF1 atuam na resposta inflamatória promovendo produção de
citosinas pro-inflamatórias.
Esse estudo também revelou que genes com função de morte celular
(UBA7 e BNIP3) foram afetados no grupo de vacas infectadas (Tabela 3). A
morte celular controlada é importante para manter o funcionamento dos
processos biológicos e fisiológicos de forma adequada. O aumento na
expressão de genes de morte celular leva uma diminuição no número de
células, visto que essas são fagocitadas antes do tempo excedendo então, a
taxa de renovação celular, ou seja, ocorre um desequilíbrio entre a taxa de
morte e renovação das células. Isso pode comprometer o funcionamento
adequado das funções fisiológicas e consequentemente do desenvolvimento
do organismo. As proteínas virais E6 e E7 podem controlar a expressão de
genes de morte celular via ativação ou inativação da p53 e pRb (DEMASI et al.,
2007).
A oncoproteína E7 induz a apoptose independente e dependente de
p53. E7 conduz à degradação de pRb através da associação e reprogramação
do complexo de ubiquitina ligase de culina (GHIM et al., 2008; ); E5 por sua vez
pode regular negativamente a expressão das proteínas supressoras tumorais
p21 e p27. A ação dessas proteínas do vírus garante a amplificação do
genoma viral e consequentemente aumento da proliferação celular e indução
de morte celular, uma vez que o vírus utiliza-se da célula hospedeira para
amplificar seu genoma. Tal resultado também foi encontrado nos estudos de
Capuco et al., 2001 e Ibeagha-Awemu et al., 2017. No entanto, esses estudos
se concentraram na avaliação da ação de óleos de linhaça na dieta de vacas.
Para nosso conhecimento, esse é o primeiro estudo em larga escala que
mostra genes de morte celular sendo regulado pelo BPV, isso é de suma
importância no processo de infecção do vírus, uma vez que genes do patógeno
estão sendo regulados para manutenção do ciclo de vida de BPV.
35
A maioria dos genes anotados neste estudo está envolvida com a
resposta imune, transcrição, proliferação e ciclo celular, possivelmente
envolvidos no desenvolvimento da lesão papilomatosa e transformação
maligna em bovinos desencadeada pela presença do vírus. Os genes ISG15,
BMP7 e SERPINB5, respectivamente envolvidos na resposta imune e
proliferação celular. O gene ISG15 desempenha um papel importante na
resposta à infecção viral, quer pela conjugação com uma proteína alvo
(ISGylation) quer pela sua ação como uma proteína livre. A ISGilação envolve
uma cascata de reações enzimáticas envolvendo enzimas que catalisam a
conjugação de ISG15 com um resíduo de lisina na proteína alvo. Ela
desempenha atividade antiviral e exerce seu papel sobre vírus de DNA e RNA.
A forma segregada de ISG15 induzir a proliferação de células assassinas
naturais, induz a maturação das células dendríticas e atua como uma citocina
de indução de IFN-gamma desempenhando um papel fundamental na
imunidade a vírus (HERNÁEZ et al., 2017), BMP7 atua na síntese de citosinas
pro inflamatórias e proliferação celular . SERPINB5 é essencial para regulação
da proliferação celular do epitélio. Em nosso estudo SERPINB5 foi regulado de
forma descendente no grupo de vacas infectadas, ou seja, o vírus está
regulando de forma negativa genes primordiais para desenvolvimento do
epitélio.
Quando o vírus infecta a célula hospedeira ele consegue inibir a
resposta antiviral através da ação da proteína E5, permitindo que seu genoma
se replique e seus genes sejam expressos (GRCE et al., 2012). As proteínas
E6 e E7 aumentam os níveis de replicação promovendo quebras no DNA,
instabilidade genômica e posteriormente transformação celular (DOORBAR et
al., 2012). A identificação de genes regulados pela presença do vírus é de
suma importância para conhecermos como ocorrem as alterações estruturais e
o processo de transformação maligna no animal.
O número elevado de genes encontrados na categoria de componente
celular é esperado, uma vez que a maioria dos processos metabólicos e
celulares necessários para manutenção do organismo ocorre na membrana
plasmática e citoplasma (CARBON et al., 2009). Os genes que compõem o
36
núcleo são fundamentais para o funcionamento da célula, estão associados à
síntese e transporte de biomoléculas, síntese de DNA e RNA. Esses dados
mostram que o patógeno está regulando a expressão de alguns genes para
garantir sua permanência no hospedeiro.
Os genes relacionados a processos celulares são abundantes já que
estão relacionadas a atividades celulares como crescimento, manutenção e
comunicação entre células via junções gaps (JUNG et al., 2014). Esses
processos são fundamentais para o funcionamento e manutenção dos
organismos.
As proteínas E5, E6, E7 e E2 de PVs são conhecidas por controlar a
expressão dos genes do hospedeiro. E6 e E7 controlam o ciclo celular dos
queratinócitos, programas de diferenciação celular e apoptose. Assim, as
alterações na expressão gênica que observamos podem ser atribuídas a
funções das oncoproteínas do BPV. Essas mudanças são importantes para o
ciclo de vida do vírus e infecção persistente (EGAWA et al., 2015; KLYMENKO
et al., 2017).
37
6 CONCLUSÃO
A análise do perfil transcriptômico durante a infecção no hospedeiro
possibilitou identificar genes regulados pelo vírus que podem estar
relacionados ao desenvolvimento da infecção por BPV nos bovinos. A
avaliação funcional desses genes contribuiu para o melhor entendimento da
relação parasita-hospedeiro e, consequentemente, serve de base para
entendermos melhor como ocorre à infecção e as manifestações patológicas
decorrentes da infecção por BPV no animal. Embora sejam necessários mais
estudos, este é o primeiro estudo que se concentrou em uma avaliação em
larga escala da expressão gênica associada à infecção por BPV, o que é
importante para identificar possíveis mecanismos regulados pelos genes
hospedeiros que são necessários para o desenvolvimento da lesão. Desta
forma, este estudo pode contribuir para a identificação de possíveis alvos para
o desenvolvimento de estratégias mais específicas de tratamento.
38
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