UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE BIOLOGIA

Roberta Aline Franco de Lima

“AVALIAÇÃO DE FORMULAÇÕES ANESTÉSICAS DE TETRACAÍNA EM

BETA-CICLODEXTRINA E HIDROXIPROPIL BETA-CICLODEXTRINA”

Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas para obtenção

do título de Mestre em Biologia Funcional e Molecular, na área de Bioquímica

Orientadora: Profa. Dra. Eneida de Paula

Co-Orientador: Prof. Dr. Leonardo Fernandes Fraceto

Campinas

2010

ii

FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA DO INSTITUTO DE BIOLOGIA – UNICAMP

Lima, Roberta Aline Franco de L628a Avaliação de formulações anestésicas de

tetracaína em beta-ciclodextrina e hidroxipropil-beta-ciclodextrina / Roberta Aline Franco de Lima . – Campinas, SP: [s.n.], 2010.

Orientadores: Eneida de Paula, Leonardo Fernandes

Fraceto. Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual de

Campinas, Instituto de Biologia.

1. Anestesia local. 2. Tetracaína. 3. Beta- ciclodextrinas. 4. Hidroxipropil-beta-cliclodextrina. 5. Liberação sustentada. I. Paula, Eneida de. II. Fraceto, Leonardo Fernandes. III. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia. IV. Título.

(rcdt/ib)

Título em inglês: Evaluation of tetracaine anesthetic formulations in beta-cyclodextrin and hydroxypropyl-beta-cyclodextrin. Palavras-chave em inglês: Local anesthesia; Tetracaine; Beta-cylodextrins; Hydroxypropyl- beta-cyclodextrin; Drug-delivery. Área de concentração: Bioquímica. Titulação: Mestre em Biologia Funcional e Molecular. Banca examinadora: Eneida de Paula, Luciana de Matos Alves Pinto, Sérgio Antonio Fernandes. Data da defesa: 09/02/2010. Programa de Pós-Graduação: Biologia Funcional e Molecular.

iii

iv

À DEUS pelo dom da vida

As profecias desaparecerão;o dom das línguas cessará;

o dom da ciência findará...

Nossa ciência é parcial, nossa profecia imperfeita

Quando chegar o que é perfeito, o imperfeito desaparecerá;

Hoje vemos como por um espelho, confusamente;

mas então veremos face a face.

Hoje conheço parte, mas então conhecerei o todo;

Mesmo que eu tivesse o dom da profecia,

e conhecesse todos os mistérios e toda a ciência;

mesmo que tivesse toda fé, à ponto de transportar montanhas,

se não tivesse amor; nada seria...

I Coríntios, 13

v

Agradecimentos

À Deus, por cada momento vivido, pelas alegrias e tristezas, pelas lágrimas e

risos, pelas derrotas e pelas vitórias. Por mais esta etapa cumprida.

Aos meus pais, Roberto e Cecília, pelo amor, apoio, confiança e dedicação

sempre. Por terem me educado para que me tornasse o que hoje sou. Amo

vocês!!!

Aos meus irmãos Jú, Sá e Gil, pelo amor, paciência e cumplicidade.

Aos meus sobrinhos João, Lucas, Clara e Pedro, pelas horas de muita risada e

muita bagunça, por permitirem que eu volte a ser criança!!!

À galerinha da farmácia, Dani, Fred, Dahene, Wanessa, Júlio, Janderson, Raul,

Jô, Vivi, Lenon, Leandro, Kory, Nego, Vera, Luiz pela paciência e apoio.

Aos amigos Welmara, Vanessa, Paula, Janderson, Roberta, Patrícia e Júlio por

existirem na minha vida.

Ao Bispo pela amizade, paciência, conselhos, companheirismo, por acreditar

em mim a cada momento. Por ter me dado a mão e me ajudado a caminhar,

não permitindo que eu desistisse, mesmo nas horas mais difíceis. Sem você

nada disso seria possível. Obrigada!!!

À Carol, amiga querida, pela motivação, apoio, pelo companheirismo, por todas

as conversas, choros e risos, pela amizade verdadeira!!!

À Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Departamento de

Bioquímica, pela oportunidade de desenvolver este trabalho.

À Profa. Dra. Eneida de Paula, ao Prof. Dr. Leonardo Fernandes Fraceto e

Prof. Dr. Marcelo Bispo de Jesus, pela orientação e profissionalismo.

Ao pessoal do laboratório de Biomembranas (Sheila, Beth, Angélica, Thaís,

Giovana, Cíntia, Cleyton, Daniele, Maribel, Márcio e Dona Cida), pela paciência

e apoio em todos os momentos que precisei.

vi

SUMÁRIO

I) INTRODUÇÃO......................................................................................................1

1.1 Dor.....................................................................................................................1

1.2 Anestésicos Locais (AL)..................................................................................3 1.2.1 Histórico.............................................................................................3

1.2.2 Propriedades .....................................................................................3

1.2.3 Mecanismo de ação ..........................................................................7

1.2.4 Toxicidade sistêmica dos anestésicos locais...................................11

1.2.5 Tetracaína........................................................................................11

1.3 Formulações farmacêuticas de AL em sistemas carreadores...................13

1.4 Ciclodextrinas ................................................................................................14

II) OBJETIVOS.......................................................................................................20

2.1 Objetivos gerais.............................................................................................20

2.2 Objetivos específicos....................................................................................20

III) MATERIAIS E MÉTODOS................................................................................21

3.1 Materiais..........................................................................................................21 3.1.1 Reagentes........................................................................................21

3.1.2 Equipamentos..................................................................................21

3.2 Métodos..........................................................................................................22 3.2.1 Espectrofotometria de UV/Vis.........................................................22

3.2.1.1 Princípio do método............................................................22 3.2.1.2 Caracterização da TTC por espectrofotometria UV/Vis......22

3.2.2 Preparo do complexo de inclusão TTC em β-CD e HP-β-CD..........23 3.2.2.1 Medidas de espectrofotometria para interação TTC:CD.....24

3.2.3 Fluorescência...................................................................................24 3.2.3.1 Princípio do método.........................................................24

3.2.3.2 Caracterização da TTC por fluorescência.......................25 3.2.3.3 Medidas de fluorescência para a interação TTC:CDs.....25

vii

3.2.4 Calorimetria diferencial de varredura............................................27 3.2.4.1. Princípio do método.........................................................27

3.2.4.2 Medidas de DSC para os complexos TTC: CDs...............28

3.2.5 Difração de raios X.......................................................................28 3.2.5.1. Princípio do método........................................................28 3.2.5.2 Medidas de raios-X para os complexos TTC: CDs..........28

3.2.6 Ressonância magnética nuclear...................................................29 3.2.6.1 Princípio do método.........................................................29 3.2.6.2 Aquisição dos espectros de RMN....................................30 3.2.6.3 Medidas de relaxação longitudinal T1...............................30 3.2.6.4 Medidas de coeficiente de difusão...................................30

3.2.6.5 Medidas de efeito nuclear de overhauser.........................33

3.2.7 Avaliação da toxicidade in vitro: cultura de células.......................34 3.2.7.1 Redução de brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-bifenil

tetrazolium (MTT).......................................................................................34 3.2.7.2 Incorporação de vermelho neutro.....................................34

3.2.8 Avaliação da atividade anestésica in vivo:bloqueio do infraorbital.35

3.2.8.1 Análise estatística............................................................36

IV) RESULTADOS..................................................................................................37

4.1 Caracterização dos Complexos de Inclusão................................................37

4.1.1 Análise por Espectrofotometria UV-VIS.........................................37 4.4.1.1 Coeficiente de absortividade molar de TTC em pH 7,4......37 4.1.1.2 Estudo do comportamento ótico da TTC em meios com dife-

-rentes constantes dielétricas (ε)..........................................................................38 4.1.1.3 Variação de absorbância de TTC em presença de CDs emn

diferentes razões molares de TTC:CD.................................................................41

4.1.2. Estudo do fenômeno de inclusão entre TTC e ciclodextrinas por ccc espectroscopia de fluorescência..........................................................................43

4.1.2.1 Fluorescência da TTC em meios com diferentes constantes dielétricas (ε).....................................43

4.1.2.2 Determinação da estequiometria de complexação da TTC e

ciclodextrinas utilizando espectroscopia de fluorescência..................................47

4.1.3 Análise da interação TTC e ciclodextrinas por calorimetria diferencial de varredura (DSC).................................................................................................52

4.1.4 Análise da interação TTC com ciclodextrinas por difração de raios-

viii

X..............................................................................................................................54

4.1.5 Avaliação dos complexos de inclusão entre TTC e ciclodextrinas cc determinado por Ressonância Magnética Nuclear.................................................56

4.1.5.1 Experimentos de 1H-RMN....................................................56 4.1.5.2 Determinação das propriedades dinâmicas da TTC em pres

presença e ausência de CDs, por medidas de tempo de relaxação (T1)...............64 4.1.5.3 Determinação da constante associação aparente (K) dq TTC e ciclodextrinas pela técnica de DOSY...................................................................66 4.1.5.4 Determinação da inserção da TTC na cavidade das ciclodextrinas, determinada por 1D-ROESY ..........................................................69

4.2 Avaliação da toxicidade in vitro da TTC e complexos de inclusão, em culturas de células de fibrosblastos 3T3............................................................73

4.2.1 Ensaios de Redução de MTT..........................................................73

4.2.2 Ensaio de incorporação de Vermelho Neutro ..................................76

4.3 Avaliação da atividade anti-nociceptiva pelo bloqueio do nervo infraorbital em ratos.............................................................................................77

V) CONCLUSÕES..................................................................................................80

VI) SEMINÁRIOS E CONGRESSO........................................................................82 VII) REFERÊNCIAS................................................................................................83

ix

LISTA DE FIGURAS

Figura 1- Representação da subunidade α do canal de sódio de cérebro de mamíferos

e arranjo dos quatro domínios ao redor deste. Cada domínio apresenta seis hélices

membranares (S1-S6).....................................................................................................8

Figura 2- Representação da β-CD................................................................................15

Figura 3- Representação da HP-β-CD e dois tipos de complexos................................16

Figura 4- Espectro de absorção ótica da molécula de tetracaína, [TTC]= 0,04 µM,

tampão PBS 5 mM, pH 7,4, temperatura ambiente.......................................................37

Figura 5- Determinação da constante de absortividade molar de TTC, [TTC]= 0,04 mM,

309 nm, tampão PBS pH 7,4, temperatura ambiente....................................................38

Figura 6- Espectros de absorbância de TTC de 250 nm a 350 nm e curva de variação

da absorbância de TTC 7,5 µM em λ = 309 nm em função da constante dielétrica do

meio...............................................................................................................................39

Figura 7- Variação de absorbância de TTC (0,04 mM) em água (ε= 78), em ε= 32

(água:etanol 20:80, v/v) e presença de CDs (1:500), à 25ºC........................................40

Figura 8- Variação da absorbância da TTC (0,04 mM) na presença de β-CD (A) e HP-

β-CD (B), em diferentes razões molares (PBS 5 mM pH 7,4, 25 ºC)............................42

Figura 9- Variação de fluorescência de TTC em meios de diferentes constantes

dielétricas, obtidos com misturas de água:etanol TTC= 7,5 µM, pH 7,4, 25ºC ............44

Figura 10- Variação do comprimento de onda de emissão de fluorescência da TTC, em

meios com diferentes constantes dielétricas. λexc: 309 nm, TTC= 7,5 µM, à 25ºC ......45

Figura 11- Variação de fluorescência de TTC em água (ε= 78), em água:etanol 20:80

v/v (ε= 32,8) e na presença da β-CD e HP-β-CD (r= 1:1000, em tampão PBS 5 mM pH

7,4) 25ºC, λexc=309 nm .................................................................................................46

Figura 12 Efeito dose-dependente de β-CD na intensidade de emissão da TTC em

função do tempo. [TTC]= 5 µM, pH 7,4, tampão PBS (5 mM, pH 7,4) à 25 ºC ............46

x

Figura 13- Aplicação da equação de Benesi-Hildebrand para determinação da

estequiometria da complexação entre TTC e β-CD: (A) TTC:β-CD 1:1 r = 0,99 e (B)

TTC:β-CD 1:2 r = 0,89...................................................................................................49

Figura 14- Aplicação da equação de Benesi-Hildebrand para determinação da

estequiometria da complexação entre TTC e HP-β-CD; (A) TTC:HP-β-CD 1:1 r = 0,99

e (B) TTC:HP-β-CD 1:2 r = 0,87....................................................................................51

Figura 15- Curvas de calorimetria diferencial de varredura das amostras de TTC, β-

CD, HP-β-CD e seus complexos de inclusão ou misturas físicas, na razão molar

1:1..................................................................................................................................53

Figura 16- Difratogramas de raios X para amostras de TTC, β-CD, HP-β-CD e

complexos de inclusão: TTC:β-CD e TTC:HP-β-CD.....................................................55

Figura 17- Espectr RM 1H da TTC, β- TTC:β-CD, 10 mM, 20 °C, em D2O,

pH 7,4, e 500MHz................................................... ......... .............................57

Figura 18- Espectr RM 1H: TTC, HP- e TTC:HP-β-CD, 10mM, 20°C, em

D2O, pH 7,4 e 500

Figura 19- Estrutur

bem como a identif

Figura 20- Variaçã

em função da co

espectros das Figu

Figura 21- Valores

β-CD ou HP-β-CD

Figura 22- Espect

..............................

Figura 23- Espectr

CD 10 mM em D2O

Figura 24- Espectr

β-CD 10 mM em D

o de

MHz ...

a quím

icação

o dos d

mplexa

ras 18

de T1 d

a 20 oC

ro de D

............

o de D

, pH 7,

o de DO

2O, pH

N de

................................

ica da TTC e repres

dos hidrogênios de c

eslocamentos químic

ção com β-CD e

e 19 e Tabelas 3 e 4

os hidrogênios da m

, 500 MHz em D2O..

OSY (1H, 500 MHz,

................................

OSY (1H, 500 MHz,

4...............................

SY (1H, 500 MHz, 2

7,4 ..........................

β-CD

...... ........ ............................58

enta

ada

os

HP-

......

olé

......

25 º

......

25

.....

5 ºC

......

.......

ção esqu

uma das

dos hidro

β-CD. D

..............

cula de T

...............

C) da TT

...............

ºC) do co

...............

) do com

...............

............

o de

N de

CD e

......

...........

emática das ciclodextrinas,

moléculas .....................59

gênios da molécula de TTC

ados obtidos a partir dos

........................................62

TC livre e complexada com

.......................................65

C (10 mM) em D2O, pH 7,4

........................................60

mplexo de inclusão TTC:β-

........................................67

plexo de inclusão TTC:HP-

........................................67

xi

Figura 25- Espectro de 1D-ROESY para o complexo TTC: β-CD 1:1 (1H, 500 MHz, 25

ºC, 10 mM ) em pH 7,4..................................................................................................70

Figura 26- Espectro de 1D-ROESY para o complexo TTC: HP-β-CD 1:1 (1H, 500 MHz,

25 ºC, 10 mM de amostra).............................................................................................71

Figura 27- Possíveis topologias de complexação para a molécula de TTC na cavidade

interna das ciclodextrinas. Representação proposta tanto para com β-CD (figura) como

para HP-β-CD ...............................................................................................................72

Figura 28- Efeito citotóxico induzido por concentrações crescentes de TTC, TTC:β-CD

e TTC:HP-β-CD (razão molar 1:1, n=8) após 24h de tratamento de células 3T3,

avaliado pelo teste MTT................................................................................................74

Figura 29 -Efeito citotóxico induzido por concentrações crescentes de TTC, TTC:β-CD

e TTC:HP-β-CD (razão molar 1:1, n=8) após 24h de tratamento de células 3T3,

avaliado pelo teste de incorporação de vermelho neutro..............................................75

Figura 30- Porcentagem de animais com analgesia após injeção de TTC livre ou

complexada: TTC:β-CD e TTC:HP-β-CD (1:1), na concentração de 0,5%. Teste de

bloqueio do nervo infraorbital em ratos ( n=7 animais/grupo).......................................77

xii

LISTA DE TABELAS

Tabela1 - Estrutura química e classe dos anestésicos locais. AA = amino-amida e AE

= amino-éster. L e C referem-se a lineares e cíclicos.......................................................5

Tabela 2- Relação entre propriedades físico-químicas e o perfil de atividade dos AL....6

Tabela 3- Propriedades físico-químicas das ciclodextrinas naturais............................ 15

Tabela 4- Variação das proporções água:etanol e suas respectivas constantes

dielétricas......................................................................................................................23

Tabela 5- Dados de ∆δ (ppm) e atribuição dos hidrogênios da TTC (em presença e

ausência de β-CD) e β-CD (em presença e ausência de TTC), a 20 oC, 10 mM em

D2O................................................................................................................................59

Tabela 6- Dados de ∆δ (ppm) e atribuição dos hidrogênios da TTC (em presença e

ausência de HP β-CD) e HP-β-CD (presença e ausência de TTC), 20 oC, 10 mM em

D2O................................................................................................................................60

Tabela 7- Valores de T1 para os hidrogênios da TTC em presença e ausência de β-

CD, 20 oC, 500 MHz em D2O........................................................................................64

Tabela 8- Valores de T1 dos hidrogênios da TTC em presença e ausência de HP-β-CD

(1:1), 20 oC, 500 MHz em D2O......................................................................................64

Tabela 9- Valores de coeficiente de difusão de fração molar e constante de associação

aparente determinados para o sistema TTC, β-CD e HP-β-CD....................................69

Tabela 10- Efeito total do bloqueio sensorial - ASC (área sob a curva) e tempo de

recuperação (Trec) para TTC, β-CD, HP-β-CD, TTC:β-CD e TTC:HP-β-CD,

concentrações: TTC em 0,5% e CDs em 16 mM. Dados expressos em mediana (mín

- máx) (n = 7 /grupo)......................................................................................................79

xiii

LISTA DE ABREVIATURAS 1H-RMN Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio

AL Anestésico Local

AUC (Area Under Curve) Área Sob a Curva

BZC enzocaína

β-CD Beta-Ciclodextrina

CD Ciclodextrina

D Coeficiente de Difusão (m2 s-1)

DL50 Dose letal capaz de induzir morte em 50% dos casos

DMEM Meio de Cultura Eagle Modificado por Dulbeco

DOSY (Diffusion Ordered Spectroscopy)Espectroscopia Ordenada por Difusão

DSC (Differential Scanning Calorimetry) Calorimetria Diferencial de Varredura

EPC (Egg Phosphatidylcholine) Fosfatidil Colina de Ovo

HP-β-CD Hidroxipropil-Beta-Ciclodextrina

I Número Quântico de Spin Nuclear

J Constante de Acoplamento

k Constante de Boltzman (1,380662 x 10-23 J)

Ka Constante de Associação Aparente

L Ligante

LDC Lidocaína

MTT 3-(4,5-dimetiltiazol-2il)-2,5-Bifenil Brometo de Tetrazolium

m/v razão massa/volume

NOE (Nuclear Overhauser Effect)Efeito Nuclear Overhauser

PABA (Para-Aminobenzoic Acid) Ácido) Ácido Paraaminobenzóico

PBS (Phosphate Buffered Saline) Tampão Fosfato Salino

r Raio Hidrodinâmico da Molécula

RMN Ressonância Magnética Nuclear

ROESY Rotating Frame NOE

S Soluto

S0 Solubilidade do Soluto na ausência de ligante

TTC Tetracaína

UV/VIS Ultravioleta/Visível

v/v razão volume/volume

VN vermelho neutro

ε Constante Dielétrica

xiv

RESUMO

A dor desempenha um papel biológico muito importante como indicador

da presença de um estímulo nocivo, que pode representar dano real ou

potencial ao organismo; entretanto, não é interessante que essa sinalização

persista além das necessidades fisiológicas a ponto de tornar-se um incomodo,

podendo dificultar o desempenho das atividades normais, comprometer a

qualidade de vida do indivíduo e impedir a realização de práticas cirúrgicas

curativas.

Os anestésicos locais são fármacos empregados para alívio da dor

aguda ou crônica, pois bloqueiam a condução do estímulo nervoso em

membranas neuronais. Dentre eles, está a Tetracaína (TTC) um amino-éster

de grande utilidade na prática clínica, empregado em procedimentos que

requerem anestesia tópica, como aqueles oftalmológicos que necessitam de

intervenções na córnea.

As limitações do uso clínico da TTC estão relacionadas à sua baixa

estabilidade química (hidrólise da ligação éster por esterases plasmáticas) e

sua toxicidade sistêmica. Sistemas de liberação modificada de fármacos, que

empregam carreadores como ciclodextrinas, constituem uma alternativa para

aumentar o tempo de ação anestésica e diminuir a toxicidade. As ciclodextrinas

são capazes de formar complexos de inclusão com diversos fármacos,

alterando propriedades como a solubilidade aquosa, o que torna esses

oligosacarídeos cíclicos promissores para este tipo de aplicação. Neste

trabalho, estudamos a complexação da TTC com beta-ciclodextrina (β-CD) e

hidroxipropil-beta-ciclodextrina (HP-β-CD) em pH fisiológico e sua influência na

toxicidade celular e efeito antinociceptivo, induzidos por aquele anestésico,

objetivando a preparação de novas formas farmacêuticas.

Para caracterização dos complexos de inclusão TTC:β-CD e TTC:HP-β-

CD foram empregados métodos espectroscópicos (Ressonância Magnética

Nuclear, fluorescência, absorção UV/VIS), difração de raios-X e calorimetria

diferencial de varredura. A partir das análises realizadas, encontrou-se que a

estequiometria de complexação da TTC com ambas as ciclodextrinas é de 1:1.

A constante de associação aparente da TTC, determinada por DOSY-NMR, é

de 777 M-1 e 2243 M-1, para β-CD e HP-β-CD respectivamente, indicando uma

xv

forte interação entre as moléculas de anestésico e das ciclodextrinas, em pH

fisiológico. Os dados de proximidade espacial, determinados por RMN (1D-

ROESY) revelaram interações entre os hidrogênios Hh e Hi, (que fazem parte do

anel aromático da TTC) e hidrogênios da cavidade interna das ciclodextrinas,

permitindo assim propor a geometria dos complexos de inclusão da TTC com

ambas ciclodextrinas.

Ensaios in vitro, em cultura de fibroblastos da linhagem 3T3, mostraram

aumento na viabilidade celular após complexação da TTC com β-CD e HP-β-

CD, em relação à TTC em solução. Testes de atividade biológica, de bloqueio

do nervo infraorbital em ratos, demonstraram aumento significativo do tempo

de duração da anestesia nos animais tratados com os complexos TTC:β-CD e

TTC:HP-β-CD (40 min e 40 min), em relação ao grupo tratado com 0,5% de

TTC livre (30 min).

Os resultados obtidos neste estudo demonstram a formação de

complexos de inclusão com forte interação entre TTC e β-CD e HP-β-CD;

indicam ainda que a utilização destes complexos de inclusão é promissora

como forma farmacêutica alternativa para este anestésico, devido ao aumento

da duração da anestesia (pois os complexos apresentaram maior eficácia

quando comparados à TTC livre nas mesmas doses), ou ainda a diminuição da

toxicidade (atingindo a mesma eficácia da TTC livre, com menores

concentrações de TTC complexada).

xvi

ABSTRACT

Pain plays an important biological role as a sign of the presence of a noxious

stimulus, that denotes actual or potential damage to the body. However, it is not

interesting this signal to persist beyond the physiological point, to become a

nuisance that impairs the performance of normal activities, the quality of life or

prevents the procedure of healing surgical practices.

Local anesthetics are used for the relief of acute or chronic pain since they

block the conduction of the painful stimulation in neuronal membranes. Among

them is Tetracaine (TTC) an amino ester useful in clinical procedures requiring

local anesthesia such as those ophthalmic ones with intervention in the cornea.

The clinical use of TTC is limited by its low chemical stability (hydrolysis of the

ester bond by plasma esterases) and systemic toxicity. The use of drug-delivery

systems, in carriers such as cyclodextrins is a good approach to improve the

duration of action and to diminish the toxicity of local anesthetics. Cyclodextrins

are suitable for this type of application since these cyclic oligosaccharides are

able to form inclusion complexes with several drugs improving their water

solubility. Here we have studied the complexation of TTC with beta (β-CD) and

hydroxypropyl-beta-cyclodextrin (HP-β-CD) and its influence in cell toxicity and

antinociceptive effects induced by that anesthetic, aiming the development of

new pharmaceutical forms.

TTC and β-CD or HP-β-CD inclusion complexes were characterized

using spectrophotometric methods (Nuclear Magnetic Resonance,

fluorescence, UV-VIS absorption), X-ray Diffraction and Differential Scanning

Calorimetry. A 1:1 stoichiometry of complexation was found for both complexes.

The association constant determined by DOSY was 777 M-1 and 2.243 M-1 for

TTC complexation with β-CD and HP-β-CD, respectively, indicating a strong

association between the anesthetic and both cyclodextrins, at physiological pH.

The nuclear overhauser NMR data (ROESY) had disclosed trough the

space proximities between hydrogens Hh and Hi - at the aromatic ring of TTC -

and hydrogens from the inner cavity of the cyclodextrins, allowing us to suggest

the geometry of TTC:β-CD and TTC:HP-β-CD complex formation.

xvii

In vitro culture tests on 3T3 fibroblasts cells revealed an increase in cell

viability after TTC complexation with β-CD and HP-β-CD, in comparison to the

effect of free TTC. Biological activity was assessed in rats, through the

infraorbital nerve blockade test. The results revealed a significant increase in

the duration of anesthesia in animals treated with TTC:β-CD and TTC:HP-β-CD

(40 min and 40 min), in comparison to a solution of 0.5% tetracaine (30 min).

The results presented here demonstrate the formation of strong

associated inclusion complexes between TTC and β-CD and HP-β-CD. The in

vivo results allow us to consider those complexes as promising pharmaceutical

forms to increase the duration of anesthesia induced by tetracaine (since both

complexes showed higher anesthetic potency when compared to free TTC at

equivalent doses) or to diminish its toxicity (since the same activity can be

achieved with lower concentrations of the complexed TTC formulations).

1

I) INTRODUÇÃO

1.1 Dor

A dor é definida pela psicanálise como “uma entidade sensorial múltipla

que envolve aspectos emocionais, sociais, culturais, ambientais e cognitivos”.

Ela possui um caráter muito especial, que varia para cada indivíduo, sob

influência do aprendizado cultural, do significado atribuído à situação em

experiências vividas anteriormente e recordações destas, bem como de nossa

capacidade de compreender suas causas e consequências (Oliveira et al.,

2005).

O organismo apresenta uma capacidade de percepção e resposta à dor,

denominada nocicepção, a qual se desenvolve através de um complexo

sistema nervoso. As experiências dolorosas podem ser classificadas

temporalmente em dois grandes grupos, onde temos a dor crônica e a dor

aguda (Sofaer, 1994).

A dor crônica pode ser identificada devido a sua persistência e

geralmente se apresenta relacionada a processos degenerativos. Ela tem

duração além do tempo razoável para a cura da lesão ou está associada a

processos patológicos crônicos, que causam estimulação nociceptiva contínua

ou recorrente em intervalos de meses ou anos (Teixeira et al., 1994). Já a dor

aguda está relacionada temporalmente à lesão causadora, devendo

desaparecer durante o período de recuperação do organismo ao evento que

induziu esta dor (Kapandji, 2000). Contudo, a dor aguda pode ter uma duração

muito curta, de alguns minutos, ou persistir por semanas (Guyton, 1996).

A dor aguda, ao contrário do que ocorre com a dor crônica, desaparece

juntamente com a cura do dano inicial. Ela apresenta ótima resposta aos

agentes terapêuticos como analgésicos, antiinflamatórios não–esteroidais,

opióides e agentes que induzem ao bloqueio nervoso (Guinsbug, 1999).

Apesar de sua importância biológica a dor, quando persistente, torna-se

um incômodo que muitas vezes compromete a qualidade de vida do indivíduo,

devido à dificuldade de desempenhar suas atividades normais. Com isso,

muitos estudos vêm sendo realizados com a finalidade de desenvolver novas

2

técnicas, agentes terapêuticos ou mesmo aprimorar fármacos já existentes,

para um eficiente tratamento da dor, seja ela aguda ou crônica.

O alívio da dor pode ser obtido tanto pela analgesia como pela

anestesia. Estes termos, muitas vezes confundidos, apresentam definições

diferentes. A anestesia é alcançada pela retirada da sensação durante uma

intervenção, seja ela cirúrgica ou não. Anestesia significa a perda da sensação,

seja ela dor, tato, temperatura, pressão ou posição. Já a analgesia é

caracterizada apenas pela ausência da sensação dolorosa, mantendo-se

preservadas as demais modalidades de sensações (Adams & Cashman, 1994).

Entre as opções terapêuticas disponíveis para alívio da dor, estão os

medicamentos antiinflamatórios (esteroidais e não-esteroidais), analgésicos,

anestésicos locais e sistêmicos, também conhecidos como anestésicos gerais.

Em nosso trabalho, temos os anestésicos locais (AL) como objeto de

estudo. Estes anestésicos têm como característica promover a perda reversível

de sensação numa dada área do corpo (de Jong, 1994), sem promover perda

de consciência e amnésia, a exemplo do que ocorre com os anestésicos

sistêmicos como por exemplo propofol e a ketamina, que mantêm apenas as

funções vitais do indivíduo (Catteral & Mackie, 1996).

Os anestésicos sistêmicos atuam diretamente nas transmissões

sinápticas, podendo ser administrados por diversas vias. As vias intravenosa e

inalatória são as mais frequentemente utilizadas, devido a possibilidade de

maior controle sobre a dose eficaz a ser aplicada e ao tempo de ação do

anestésico utilizado.

Já os AL, atuam nas terminações nervosas, promovendo depressão da

excitabilidade ou inibição da condução do estímulo nervoso, quando aplicados

em uma área restrita do tecido, em concentrações adequadas (Covino &

Vassalo, 1985). Suas principais vias de administração são: anestesia epidural,

bloqueios de plexos nervosos, administração local tópica e pequenas

infiltrações.

3

1.2 Anestésicos Locais

1.2.1 Histórico

O primeiro anestésico de ação local a ser isolado foi a Cocaína (em

1860, por Niemann), um alcalóide encontrado em folhas de Erithroxylon coca,

porém seu uso clínico foi iniciado somente em 1884, por Sigmund Freud e Karl

Koller (Covino & Vassalo, 1985; Vandam, 1987). As propriedades tóxicas e

indutoras de dependência da cocaína logo foram verificadas, o que resultou em

uma série de estudos em busca de outros agentes, levando a síntese da

procaína, em 1905.

O curto tempo de ação apresentado pela procaína levou a busca de

novos AL. A partir de então, ainda no início do séc. XX, análogos de procaína

foram sintetizados, como clorprocaína e tetracaína (Vandam, 1987).

A tetracaína (TTC) mostrou ter atividade anestésica mais duradoura e

um potencial de ação 16 vezes maior que o da procaína (Covino & Vassalo,

1985), sendo considerado um AL de longa duração.

A benzocaína, que tem como característica ser um éster não ionizável

em pH 7,4, teve seu uso introduzido na clínica como anestésico tópico.

À partir de 1940 foram sintetizados os primeiros anestésicos locais tipo

amino-amida, este fato se deu devido a necessidade de obtenção de AL que

apresentassem menor grau de toxicidade, sendo a lidocaína o primeiro

anestésico desta classe obtido (Covino & Vassalo, 1985; Vandam, 1987). Entre

os AL tipo amino-amidas temos compostos cíclicos (Mepivacaína, Ropivacaína

e Bupivacaína) e não cíclicos (Lidocaína, Prilocaína, Etidocaína e Dibucaína)

(de Jong, 1994). Nos anos 90, a busca por AL tipo amino-amidas mais potente

deu início a síntese de estereoisomêros, como Ropivacaína, que mostram que

a forma (S) apresenta menor toxicidade e maior duração no bloqueio nervoso

(Arvidsson et al, 1994).

1.2.2 Propriedades

Os AL de uso clínico apresentam uma estrutura geral com um domínio

hidrofóbico (grupamento aromático) e outro hidrofílico (grupamento amino),

separados por uma cadeia acila intermediária, com quatro ou cinco átomos

(Covino & Vassalo, 1985; Gupta, 1991). De acordo com o tipo de ligação entre

os grupos aromático e amino, os AL podem ser divididos em diferentes classes,

4

como os amino-ésteres (procaína, clorprocaína, tetracaína, proparacaína,

oxibuprocaína, etc), e os amino-amidas (lidocaína, mepivacaína, ropivacaína,

bupivacaína, levobupivacaína, etidocaína, prilocaína, etc), entre outros. A

Tabela 1 mostra a estrutura química de alguns AL de importância clínica.

A Tabela 2 apresenta algumas propriedades físico-químicas e

farmacológicas dos AL. As variações de potência, velocidade de ação, duração

da atividade anestésica e toxicidade dos AL, devem-se fundamentalmente, as

suas diferentes propriedades físico-químicas. Entre elas estão: pKa, coeficiente

de partição óleo/água, ligação às proteínas e vasoatividade.

5

Tabela1 - Estrutura química e classe dos anestésicos locais. AA = amino-amida e AE = amino-éster. L e C referem-se a lineares e cíclicos.

Anestésico

Local

Família

R1 R2 R3

Estrutura

Tetracaína

Procaína

Clorprocaína

AE

AE

AE

- C4H

9

- H

- H

-CH3

- C2H5

- C2H5

-

-

- Cl

C O

O ( C H 2 ) 2 N R 2

R

N H R 1

R3

Lidocaína

Prilocaína

Etidocaína

Mepivacaína

Bupivacaína

AAL

AAL

AAL

AAC

AAC

- CH3

- H

- CH3

- CH3

- CH3

CH2 NC2H5

C2H5

CH

CH3NH

C3H7

CH NC3H7

C2H5 C2H5

R1

NH

CH3

C R2O

6

Dibucaína

AAC

CO

NH (CH2)2 NC2H

C2H

N

H9C4O

Assim como a potência, a toxicidade destes agentes está diretamente

relacionada à absorção sistêmica, que sofre influência da hidrofobicidade, pKa

e taxa de ligação a proteínas plasmáticas (MClure & Rubin, 2005).

Devido à atividade dos AL no bloqueio reversível do potencial de ação

em membranas excitáveis, a absorção sistêmica destes agentes faz com que o

Sistema Nervoso Central e Sistema Cardiovascular, tornem-se particularmente

suscetíveis à atividade tóxica dos AL (Kenneth et al, 1997).

Tabela 2. Relação entre propriedades físico-químicas e o perfil de atividade

farmacológica dos AL.

AL pKaa Início de Açãob

Solubilidade aquosa da

forma neutra (mM)c

Partição da Forma

Neutra entre

EPC/águac

Toxicidadeb Potênciab Ligação Protéica

(%)a

Tempo de Açãob

Meia Vida (h)d

Procaína 8,9 Lento 16,3 84 Muito Baixa Média 6 Curto 0,1

Tetracaína 8,2 Lento 0,76 868 Alta Alta 94 Longo 2,5

Lidocaína 7,9 Rápido 13,1

144 Média Média 64 Interme-

diário 1,5

Prilocaína 7,9 Rápido 23,1

110 Baixa Média 55 Interme-

diário 1,5

Bupivacaína 8,1 Moderado 0,58 798 Alta Alta 95 Longo 2,5

a: Barash et al, 2001; b:Covino, 1986 & Malamed, 2001; c: de Paula & Schreier, 1995; d: Covino & Vassalo, 1985

De uma maneira geral, os AL do tipo amino-éster apresentam potência

maior do que os AL tipo amino-amidas (Covino e Vassalo, 1985), porém seu

uso é limitado na prática clínica devido à toxicidade. Estes agentes são

rapidamente hidrolisados pelas colinesterases, principalmente as plasmáticas e

em menor extensão pelas hepáticas. A única exceção ocorre com a cocaína,

7

que apesar de ser um AL amino-éster, não sofre hidrólise, apresentando

metabolismo predominantemente hepático (Malamed, 2001).

O resultado desta hidrólise é a formação do ácido para-aminobenzóico

(PABA) (Rang, 2004) e, em particular para a TTC, do ácido para-

butilaminobenzóico (Murtaza et al., 2002). Estes produtos metabólicos são

farmacologicamente ativos e estão relacionados ao aparecimento de efeitos

adversos como alergias, que geralmente são manifestadas por descoloração

da pele, dor, edema, dermatites e prurido (Swinyard, 1990). Sabe-se que

quanto menor a taxa de hidrólise dos AL do tipo éster maior sua potência

anestésica, porém também maior será sua toxicidade sistêmica (Carvalho &

Mathias, 1997).

Quando comparada aos demais AL amino-éster a Tetracaína é a mais

lentamente hidrolisada, o que implica em maior duração de ação (Tabela 2) e

toxicidade. Em seguida temos a Procaína com taxa de hidrólise intermediária e

a Cloroprocaína, cuja hidrólise é a mais rápida.

Embora os AL do tipo amino-amida, sintetizados a partir de 1940 sejam

atualmente os mais utilizados na clínica médica e odontológica devido ao seu

menor potencial tóxico (Malamed, 2001; Yagiela, 2000), os AL do tipo amino-

éster tem ainda grande utilidade em oftalmologia e em outros procedimentos

que requerem anestesia tópica, devido a sua potência ser, em geral, mais

elevada que os AL do tipo amino-amida.

1.2.3 Mecanismo de Ação

AL são em geral, bases fracas capazes de bloquear reversivelmente a

condução nervosa. Geralmente, são aplicados a uma superfície restrita do

corpo, em contraste com os anestésicos gerais, que são administrados por via

inalatória ou endovenosa, como citado anteriormente e que causam perda de

consciência e inibição dos reflexos sensoriais e autônomos.

Além de serem empregados para alívio da dor aguda como em

processos cirúrgicos, os AL também estão sendo associados ao tratamento da

dor crônica, juntamente com opióides, por exemplo, no tratamento da artrite

reumatóide e câncer (Rocha et al., 2002).

8

Muitas teorias foram propostas para explicar o mecanismo de ação dos

AL, porém algumas tiveram sua credibilidade diminuída por não conseguirem

elucidar todo o mecanismo (de Jong, 1994).

Entre as teorias propostas para explicar o mecanismo de ação dos AL,

temos aquela que atribui o efeito do AL à ligação desses compostos na

proteína canal de sódio voltagem-dependente e a que considera a interação

dos AL aos componentes lipídicos da membrana (hipótese do lipídio), como

fator determinante para o fechamento dos canais de sódio (de Araújo et al,

2008c).

Os canais de sódio voltagem-dependentes são glicoproteínas integrais

de membrana, presentes em altas concentrações nos axônios. Sua interação

com AL faz com que os poros do canal se fechem, tornando a proteína toda

inativa, temporariamente (Strichartz & Ritchie, 1987).

Alguns estudos demonstram que AL apresentam a capacidade de se

ligar não apenas as proteínas canais de sódio, mas também com outras

proteínas de membrana, dentre elas, proteínas sinalizadoras como:

calmodulina, canais de potássio, receptores de acetilcolina, ATPases

microssomais e mitocondriais, citocromo oxidase, proteína G, receptores de

serotonina 1A, proteína tirosina quinase e receptores de opióides (Cohen,

2003; de Paula & Schreier, 1996).

Em geral, as proteínas canais de sódio são formadas por uma unidade α

central e duas subunidades menores: β1 e β2. A subunidade α é o componente

mais importante da glicoproteína e forma o poro por onde haverá a ativação e

inativação da condução iônica (Catteral, 1992). Esta subunidade é formada por

quatro domínios homólogos (I-IV), cada um composto por seis segmentos

hidrofóbicos (S1-S6) que atravessam a membrana como α-hélices (Figura 1)

(Li et al., 1999).

9

Figura 1- Representação da subunidade α do canal de sódio de cérebro de mamíferos,

com quatro domínios de seis hélices membranares (S1-S6). As hélices S4 dos quatro

domínios formam o poro do canal (para passagem dos íons Na+). Notar ainda a alça

citoplasmática entre domínios III e IV (com motif IFM: isoleucina, fenilalanina,

metionina), que forma o portão de inativação do poro do canal e a hélice S6 do

domínio 4 (em vermelho), sítio de ligação de AL na forma neutra (adaptado de de

Araújo et al, 2008c).

A transmissão dos impulsos nervosos pode ser detectada pela variação

no potencial da membrana neuronal. Quando sofre um estímulo, que atinge

determinado limiar, a membrana é ativada e o canal se abre, permitindo que

ocorra influxo de sódio, levando a despolarização da membrana. Entre a região

despolarizada e a região adjacente, se dá a formação de um dipolo e a

corrente de sódio percorrerá toda a extensão do axônio. Em seguida, no local

onde ocorreu a despolarização, ocorrerá a repolarização com a saída dos íons

de potássio por canais específicos. As concentrações iônicas de repouso

podem então ser restabelecidas, através da atividade da bomba sódio, potássio

ATPase, finalizando o processo do impulso nervoso e fazendo com que o

estímulo elétrico seja transmitido ao longo de todo o axônio, de forma

unidirecional (Anger et al., 2001; Carvalho, 1994).

AL são moléculas anfifílicas e por este motivo apresentam grande

afinidade pela membrana celular. O resultado da interação dos AL com

membranas excitáveis é a diminuição do influxo de íons sódio nos canais de

sódio voltagem-dependente, impedindo a formação e a propagação do

potencial de ação.

Os AL podem apresentar diferentes graus de afinidade pelos canais de

sódio, de acordo com o estado funcional dos mesmos (ativo, inativo e repouso).

10

Estudos realizados em 1953, por Hodgkin e Huxley, atribuíram estes diferentes

graus de afinidade a presença das formas neutra e carregada dos AL. Esta

hipótese foi fortalecida na década de 70, quando alguns estudos com nervo

gigante de lula indicaram que os AL teriam acesso ao sítio de ação no canal

(levando ao bloqueio da condução do estímulo nervoso) apenas pela face

interna da membrana. Sendo assim, a forma neutra dos AL, mais hidrofóbica,

teria apenas a função de facilitar a entrada dos anestésicos na face interna da

membrana (Narahashi & Yamada, 1970).

No entanto, a elevada potência anestésica de compostos como a

benzocaína, que não se protona em pH fisiológico (Pinto et al, 2000) e a

grande variedade de moléculas com ação anestésica local, não poderia ser

explicadas por esta hipótese (Strichartz & Ritchie, 1987).

Em 1994, Catteral e colaboradores, conseguiram através de técnicas de

mutação sítio dirigida, comprovar a existência de um sítio de ligação

hidrofóbico, para AL em forma neutra, localizado no interior da bicamada, isto

é, em uma α-hélice transmembranar (S6, no domínio IV da subunidade α –

Figura 1), da proteína canal de sódio voltagem-dependente de cérebros de

rato (Rasgdale et al, 1994; 1996).

A teoria mais aceita para interpretação da ligação de AL e proteínas

canal de sódio nos dias atuais, admite a existência de um ou mais sítios de

ligação para AL e define o estado conformacional desses canais como fator

determinante dos diferentes graus de afinidade apresentados pelos

anestésicos. Sendo assim, maior será a afinidade do anestésico pelo estado

inativo ou em repouso e menor pelo estado aberto desses canais (Hille, 1977;

Hondeghem & Katzung, 1977).

Em 1987, Starmer, na tentativa de explicar o mecanismo de ação dos AL

propôs que esses fármacos apresentam afinidade constante pelo seu sítio

receptor e o que determinaria a interação com o canal de sódio, seriam os

rearranjos conformacionais do canal que acompanham a despolarização,

permitindo o acesso do AL ao seu sítio de ação. Desta forma os AL atuariam

como efetores alostéricos que, ao interagir com o receptor, estabilizariam o

canal em seu estado inativo, já que os quatro domínios da subunidade α,

apresentam-se envolvidos na inativação lenta produzida pelo AL. Esta proposta

11

é atualmente conhecida como “hipótese do receptor guardado” (Fraceto et al,

2006; O’Reilly, 1999; Starmer, 1987).

Na “hipótese do lipídio” é considerada a capacidade do AL se inserir na

matriz lipídica das biomembranas causando alterações estruturais e dinâmicas,

que levariam a mudanças conformacionais nos canais de sódio, o que

explicaria sua inativação. De fato, estudos demonstram que os AL agem sobre

sistemas membranares de diversas formas. Na fase lipídica membranar,

promovem alterações como expansão da bicamada, diminuição da temperatura

de transição de fases principal, aumento da fluidez e da permeabilidade de

membranas na fase líquido-cristalina (de Paula & Schreier, 1996).

A incorporação dos AL na fase lipídica leva a expansão de mono e

bicamadas lipídicas e diminuição da espessura da bicamada, favorecida pelo

menor comprimento das moléculas de AL em relação aos fosfolipídios

(Seeman, 1996; Skou, 1954). Sendo assim, a inserção do anestésico formaria

um volume, que seria compensado pela modificação conformacional das

cadeias acila dos lipídios adjacentes, causando diminuição no comprimento

total da bicamada e expansão lateral da mesma (Gallová & Balgavý, 1997;

Trudell, 1977). Nesta acomodação: i) modificam-se as propriedades estruturais

e dinâmicas da membrana como um todo e ainda ii) lipídios específicos

poderiam ser recrutados, modificando a distribuição de domínios (lipid rafts)

naturais nas membranas biológicas. Em ambos os casos a conformação de

proteínas integrais de membrana como o canal de sódio poderia ser afetada,

levando a estabilização da forma inativada (Fraceto et al, 2006).

Desta forma, tanto a ligação específica aos canais de sódio voltagem-

dependente quanto interações não específicas com a fase lipídica membranar

parecem estar relacionadas ao mecanismo de ação dos anestésicos locais,

ainda não completamente elucidado.

1.2.4. Toxicidade Sistêmica dos Anestésicos Locais

A neurotoxicidade dos AL se deve a capacidade destes em atravessar a

barreira hematoencefálica. O efeito no sistema nervoso central é manifestado

antes que no cardiovascular e se deve ao aumento da concentração do

fármaco (Whiteside & Wildsmith, 2001). Esta atividade ocorre como uma fase

12

excitatória (calafrios, tremores, contrações e convulsões), seguida de outra

fase inibitória, caracterizada pela depressão do sistema nervoso central

(Strichartz & Ritchie,1987; Yagiela et al, 2000).

Os AL podem exercer vários efeitos sobre o sistema cardiovascular,

atuando diretamente no miocárdio (modificando eventos eletrofisiológicos por

ação não específica em outros canais, como os canais de Ca2+, além dos

canais de sódio voltagem-dependente) e/ou alterando a vasoatividade na

vasculatura periférica (Strichartz & Ritchie, 1987; Yagiela et al, 2000).

1.2.5 Tetracaína

A Tetracaína (TTC) foi sintetizada em 1928 e teve seu uso introduzido

na clínica médica em 1932; dentre os AL de sua classe é o que apresenta

maior potência e duração de ação (Covino & Vassalo, 1985) (Tabela 2).

A TTC vem sendo usada atualmente na prática clínica, principalmente

em procedimentos que requerem anestesia tópica, como intervenções da

córnea (Rang et al., 2004). Pode ser aplicada para anestesia local em áreas

como nariz, boca, árvore brônquica (geralmente em spray), córnea, sistema

urinário, não sendo tão eficaz quando aplicada na pele (Rang et al., 2004). Em

oftalmologia pode ser empregada com segurança na concentração de 0,5%

(m/v), sendo indicada para realização de exames ou procedimentos cirúrgicos,

onde se deseja suprimir a dor corneana ou dos envoltórios externos do olho

(Fischer et al, 2004). As situações mais frequentes em que a TTC é empregada

incluem: exame do olho irritado, retirada de corpos estranhos da córnea,

cirurgias da conjuntiva e diagnóstico diferencial entre dor corneana e ciliar, não

sendo indicada para injeções subconjuntivais devido à possibilidade de

toxicidade sistêmica.

O uso tópico de TTC também pode ser verificado em procedimentos

dermatológicos simples. A TTC, na concentração de 4%, também tem se

mostrado mais eficaz para anestesia pré-vacinal em crianças, se comparada à

combinação comercializada atualmente de Lidocaína e Prilocaína em forma

neutra (EMLA®), devido ao fato de não ser necessária oclusão do local de

aplicação (Schechter, 2007). Outra desvantagem apresentada pela mistura

eutética de Lidocaína e Prilocaína, em relação à TTC, é o tempo necessário

13

para início de ação, aproximadamente 1 hora, devido ao pH apresentado pela

formulação (Cleary et al., 2003)

A TTC, devido a sua estrutura química, apresenta capacidade de formar

micelas (quando em sua forma ionizada), modificando sua eficácia. Um

significante número de moléculas agregadas pode aumentar o tempo de

duração de formulações transdérmicas, pelo aumento do conteúdo do fármaco

disponível (Miller, 1993). Quando aplicada sobre a pele, a formação de micelas

influencia na difusão do anestésico, alterando assim a concentração efetiva da

formulação utilizada. Em oftalmologia, pode ser verificado o desenvolvimento

de irritação ocular, conduzindo ao lacrimejamento, rápida drenagem e menor

absorção local (Santvliet, 1998). Além desse efeito, em altas concentrações o

efeito tóxico observado com o uso crônico da TTC sobre o tecido epitelial

corneano está relacionado a uma diminuição do metabolismo energético

daquelas células, tendo sido relatadas alteração na respiração celular, na

velocidade da glicólise, bem como dano às fibras de actina (Grant & Acosta,

1994). Outros estudos demonstram a ocorrência de danos para células da

córnea, quando expostas a outros AL como a lidocaína. Neste estudo, Kim e

colaboradores avaliaram a toxicidade in vitro de lidocaína 2% (hidrocloridro),

tanto para córnea humana, quanto para animais (coelhos). Esta exposição

levou a ocorrência de edemas nas células endoteliais para os dois casos (Kim

et al, 1998). Borazan e colaboradores demonstraram que o uso de ropivacaína

na concentração de 1% e levobupivacaína 0,75% podem levar a alterações

degenerativas graves no retículo endoplasmático e mitocôndrias, quando

avaliada a aplicação destes anestésicos por via infiltrativa, em células da

córnea de coelho; estas alterações foram avaliadas no primeiro dia após a

administração do fármaco, sendo que após 7 dias, houve a recuperação dos

danos causados inicialmente, sugerindo que estes agentes não causam danos

celulares permanentes (Borazan et al., 2009).

1.3 Formulações Farmacêuticas de AL em Sistemas Carreadores

Entre as principais características desejáveis para os AL, estão a longa

duração da ação anestésica, a baixa toxicidade sistêmica e a seletividade para

o bloqueio sensorial (de Araújo et al., 2003).

14

Na tentativa de melhorar o desempenho dos AL, tanto pela melhoria das

propriedades farmacocinéticas, como tempo de ação e latência, como pela

diminuição da toxicidade sistêmica, muitos estudos vêm sendo realizados,

considerando desde o uso de misturas de diferentes AL, até a utilização de

nanocarreadores de fármacos, a fim de modificar seus perfis farmacocinéticos

e farmacodinâmicos.

Estudos direcionados à combinação de AL de curta e longa duração,

ainda não permitem concluir a respeito da efetividade da mistura, além do fato

destas formulações apresentarem toxicidade sistêmica aditiva devendo,

portanto, serem utilizadas com cautela (Cleary et al., 2003).

Atualmente, o uso de sistemas de liberação modificada tem contribuído

na busca de anestésicos mais eficientes, melhorando de forma significativa a

eficácia e segurança dos AL. Esta forma de veiculação tem sido estudada em

nosso laboratório através da encapsulação em lipossomos (Cereda et al., 2004;

2006, 2008a; de Araújo et al., 2004, 2008b; Franz-Montan et al, 2007),

formação de complexos de inclusão em ciclodextrinas (Cereda et al, 2008b; de

Araújo et al., 2005a;b, 2006, 2008a; Moraes et al, 2007a, 2007b, 2007c; Pinto

et al., 2005 ) e calixarenos (Fernandes et al., 2007) apresentando resultados in

vivo bastante promissores. Outros pesquisadores têm avaliado AL carreados

em sistemas poliméricos nano (Colombo et al., 2005; Corre et al., 1994; Estebe

et al, 1995; Govender et al., 2000; Moraes et al, 2007, 2008; Polakovic et al.,

1999; Rose et al., 2005), também com bons resultados.

1.4 Ciclodextrinas

A hidrólise parcial do amido resulta na formação de glicose, maltose e

uma longa classe de dextrinas lineares e ramificadas. Alguns microorganismos

e plantas possuem enzimas denominadas ciclodextrina-glicosiltransferases que

realizam a degradação do amido em oligossacarídeos cíclicos, chamados

ciclodextrinas (Loftsson & Masson, 2001).

Ciclodextrinas (CD) são compostos não tóxicos, capazes de formar

complexos de inclusão e estabilizar um largo espectro de substâncias. Essa

característica, juntamente com outras propriedades, faz delas um grande

atrativo para variado número de aplicações industriais. As vantagens em

relação ao uso e a disponibilidade das ciclodextrinas explicam o crescente

15

interesse pelas mesmas. Suas aplicações práticas são numerosas: CD são

usadas na indústria alimentícia, farmacêutica, em cosméticos, pesticidas, em

tecnologia química, em química analítica, etc (Duchêne et al., 1999; Davis &

Brewster, 2004).

As três ciclodextrinas naturais mais comuns são: alfa, beta e gama-

ciclodextrinas, apresentando seis, sete e oito unidades de D-(+)-glicopiranoses,

respectivamente. Estas subunidades apresentam grupos hidroxila primários e

secundários em sua estrutura, orientados para o exterior da molécula (Figura

2), o que confere à superfície exterior um caráter hidrofílico, enquanto a

cavidade interior é hidrofóbica. A presença desta cavidade hidrofóbica permite

que a ciclodextrina forme complexos de inclusão com muitas moléculas,

alterando as propriedades físico-químicas das mesmas, em geral levando a um

aumento da solubilidade e estabilidade química, diminuição da volatilidade e

alterando a biodisponibilidade da molécula hóspede.

Figura 2 – Representação esquemática da β-ciclodextrina, com 7 unidades de

glicopiranose.

Entre as ciclodextrinas encontradas na natureza, as β-CD (Figura 2) são

as mais largamente utilizadas, devido ao fato de apresentarem uma cavidade

interna com cerca de 6 Å de diâmetro (Tabela 3), adequada para incorporar

anéis aromáticos, frequentemente encontrados em moléculas com atividade

biológica (Matioli, 2000).

Tabela 3 – Propriedades físico-químicas das ciclodextrinas naturais (del Valle, 2004)

Propriedade α- β-ciclodextrina γ-ciclodextrina

16

ciclodextrina

Resíduos de glicose 6 7 8

Massa molecular 972 1135 1297

Solubilidade 25 ºC(g/100 mL) 14,5 1,85 >50

Diâmetro externo (Å) 14,6 15,4 17,5

Diâmetro interno (Å) 4,7-5,3 6,0-6,5 7,5-8,3

Altura da cavidade (Å) 7,9 7,9 7,9

Volume da cavidade (Å3) 174 262 427

A limitada solubilidade aquosa da β-CD (1,85 g/100 mL a 25 °C) é

considerada um fator limitante para sua aplicação, principalmente quando

comparada as demais ciclodextrinas e decorre de ligações intramoleculares de

hidrogênio entre grupos hidroxil secundários (Rajewsky & Stella, 1996). Por

este motivo, modificações foram introduzidas na estrutura química das

ciclodextrinas naturais, em particular a β-CD, com a finalidade de melhorar esta

propriedade. Um dos derivados obtidos por estas modificações é a 2-

hidroxipropil-β-ciclodextrina (HP-β-CD) (Figura 3a), que apresenta uma maior

solubilidade aquosa que a β-CD natural (> 50 g/100 mL a 25 °C) (Irie &

Uekama, 1997; Matioli, 2000).

A alta afinidade da β-CD por colesterol e outros lipídios, faz com que

seja capaz de extrair estes componentes da membrana. Dependendo da

concentração administrada, as β-CD podem produzir hemólise de eritrócitos

(Irie & Uekama, 1997), devendo, portanto, sua administração por via infiltrativa,

ser evitada. Outro fator que deve ser considerado é o fato de que as β-CD

apresentam solubilidade relativamente baixa na corrente sanguínea. Isto

permite que haja uma formação de microcristais que se depositam nos rins.

Estes microcristais formam depósitos, podendo causar danos aos túbulos

renais por impedirem a filtração glomerular. Já ciclodextrinas modificadas como

a HP-β-CD, não apresentam estas características indesejáveis, ou seja, a

modificação da molécula de β-CD além de promover a melhora da solubilidade,

também promove a diminuição dos efeitos tóxicos apresentados, como a

hemólise de eritrócitos (Bekers et al., 1991; Davis & Brewster, 2004; Frank et

al., 1976; Frijlink et al., 1990). Os derivados hidroxialquilados de CDs são

17

poderosos solubilizadores de fármacos e não formam, nos rins, os precipitados

de complexos cristalinos observados quando a β-CD é utilizada (Carpenter et

al., 1995), porém são financeiramente menos viáveis, devido ao fato de serem

mais caros que a β-CD.

Figura 3 – Representação da hidroxipropil-β-ciclodextrina (a) e da formação de dois

tipos de complexos, de estequiometria 1:1 e 1:2 (ligante:HP-β-CD) (b).

Atualmente um interesse crescente pela aplicação de HP-β-CD como

sistema carreador de fármacos vem sendo verificado. Isto pode ser

comprovado pelo número de pesquisas realizadas, onde se utiliza a HP-β-CD

como carreadora em sistemas de liberação modificada. Esta ciclodextrina tem

demonstrado apresentar boa tolerância em humanos, sendo que a

administração intravenosa não é considerada tóxica em doses baixas e

moderadas (Carpenter et al, 1995; Thompson, 1997). A HP-β-CD teve seu uso

aprovado pelo FDA (Food and Drug Administration) e está presente em

produtos comerciais como Vibativ®, fármaco antibacteriano, produzido pelo

laboratório americano Theravance. A dose recomendada para uso oral é de 8 g

ao dia e para uso intravenoso de 16 g ao dia (Brewster & Loftsson, 2007).

As ciclodextrinas quando administradas por via oral, são facilmente

metabolizadas e sua absorção ocorre no trato gastrintestinal, onde interagem

com alguns componentes de membrana como colesterol e alguns tipos de

lipídios. Sua estrutura cíclica permite que sejam resistentes às variações de pH

do estômago e intestino delgado, porém são degradadas no cólon e intestino

grosso, pela ação de bactérias da flora intestinal (Uekama, 1994). Quando

administradas pela via intravenosa, a excreção das CDs ocorre de forma

a b

18

intacta pelos rins (Davis & Brewster, 2004). Isto ocorre, em particular com a β-

CD, devido à sua baixa solubilidade aquosa, o que representa uma

desvantagem quando comparada aos seus derivados como a HP-β-CD. Já

bactérias e fungos, possuem uma amilase específica, capaz de degradar as

ligações alfa-1,4 das unidades glicopiranosídicas das ciclodextrinas.

Os complexos de inclusão formados entre ciclodextrinas e moléculas

hóspede são mantidos por ligações não covalentes. Esta interação consiste em

um equilíbrio dinâmico, onde a molécula hóspede está constantemente se

associando e desassociando da cavidade da CD (Loftsson & Brewster, 1996;

Rajewsky & Stella et al., 1996).

Quando em solução aquosa, as ciclodextrinas acomodam moléculas de

água em sua cavidade parcialmente apolar, entretanto, essa interação é

energeticamente desfavorável, uma vez que requer um aumento da entropia

das moléculas de água. Estas moléculas de água podem então ser facilmente

substituídas por moléculas hóspedes, que apresentem menor polaridade que a

água. Quando ocorre este tipo de interação, a estequiometria mais

frequentemente encontrada entre molécula hóspede e CD é de 1:1, porém

outras estequiometrias podem ser verificadas, como 1:2 (Figura 3b), 2:1 e 2:2

(Duchêne et al., 1999; Szejtli, 1998).

A interação molecular pode ser avaliada pelas modificações que

ocorrem nas propriedades tanto da molécula hospedeira, como na molécula

hóspede, podendo ser detectada por diversas técnicas espectroscópicas, como

a fluorescência, a espectroscopia UV/Vis, a ressonância magnética nuclear

(RMN), o infravermelho, entre outras.

A formação de complexos de inclusão sólidos garante uma maior

proteção da molécula hóspede contra reações químicas, diminui a sublimação

e volatilização, diminui a reatividade da molécula, garantindo uma estabilidade

maior e também aumenta a solubilidade (Loftsson & Brewster, 1996; Rajewsky

& Stella, 1996).

Estas características das ciclodextrinas tornam seu uso para formação

de complexos de inclusão com AL bastante promissor, além do que, muitos

estudos já realizados demonstram os efeitos satisfatórios desta interação.

Entre eles, estão descritos aumento da solubilidade de anestésicos como

Lidocaína, Etidocaína, Mepivacaína, Bupivacaína (de Araújo et al 2005; 2006;

19

Dollo et al., 1996a, 1996b, 1998; Moraes et al, 2007, Pinto, 2002), Benzocaína

(Pinto et al, 2002), Tetracaína (Miyoshi et al., 1998), bem como a melhora dos

índices terapêuticos dos anestésicos locais (de Araújo et al., 2005a; 2005b;

2006; 2008a; Dollo et al., 1998; Pinto, 2002).

Estudos da interação molecular da Tetracaína com ciclodextrinas

indicaram um aumento em sua estabilidade química (Miyoshi et al., 1998),

incluindo proteção contra a hidrólise alcalina (Fernandes et al., 2007) além de

diminuição do potencial de irritação ocular (Santvliet et al., 1998).

Estudos de caracterização molecular dos complexos de inclusão

formados entre TTC e β-CD foram realizados em nosso laboratório com uso de

RMN em pH 5,5 e pH 10 (Fernandes et al., 2007), demonstrando forte

interação entre a TTC neutra e β-CD.

Neste contexto, os benefícios de uma anestesia profunda produzida por

AL estão sendo cada vez mais bem conhecidos, o que tem levado a um

aumento de novas técnicas de anestesia local e regional. Porém, o tempo de

ação relativamente curto desses fármacos quando comparados à duração da

dor (Duncan & Wildsmith, 1995) é um fator limitante para o uso dos AL.

Um AL ideal, deve apresentar ação longa, ser livre de efeitos tóxicos, ter

baixo potencial alergênico, alto índice terapêutico e atuar seletivamente sobre

as fibras sensoriais, mas não sobre as motoras (Kuzma et al., 1997).

Abordagens que levem ao aumento da duração de ação dos AL são

desejáveis, pois com elas poderia ser diminuída a frequência de

administrações, aumentando assim a eficácia pelo maior tempo de bloqueio

anestésico. Uma das primeiras tentativas de melhorar estas características foi

realizada através da modificação química de AL já existentes, obtendo-se os

análogos hoje disponíveis no mercado, porém com melhorias nem sempre tão

satisfatórias, pois o aumento da potência é, em geral, acompanhado por

aumento da toxicidade sistêmica dos AL (Strichartz & Ritchie, 1987).

A TTC é bastante utilizada na prática clínica, principalmente em

procedimentos que requerem anestesia tópica, devido à sua alta potência.

Porém, um fator que torna a aplicação da TTC limitada é sua toxicidade local e

sistêmica (Rang et al, 2004). Objetivamos, através da incorporação deste AL

com ciclodextrinas, diminuir os efeitos tóxicos da TTC, aumentando assim a

segurança para administração deste AL e aplicabilidade na prática clínica.

20

Desta forma propusemo-nos a preparar e caracterizar complexos moleculares

da TTC com ciclodextrinas em pH fisiológico e testar sua atividade biológica.

Para tanto, análises da citotoxicidade in vitro de TTC, foram realizadas através

de ensaios de culturas de células, com fibroblastos da linhagem 3T3. Já o

efeito da complexação na eficácia anestésica da TTC foi avaliado através de

ensaios de bloqueio do nervo infraorbital, em ratos Wistar, segundo protocolo

(no. 824-1) aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da

Unicamp.

21

II) OBJETIVOS

2.1 Objetivos Gerais

O presente trabalho teve como objetivo preparar, caracterizar os

complexos de inclusão e avaliar a eficácia de formulações anestésicas de

liberação modificada de TTC complexada com β-CD ou HP-β-CD a fim de

promover a redução das propriedades tóxicas deste AL e melhorar seu perfil de

atividade farmacológica.

2.2 Objetivos Específicos

• Caracterização da interação da TTC com β-CD e HP-β-CD

em pH fisiológico, determinando a estequiometria de formação do

complexo e sua constante de associação aparente.

• Realização de testes in vitro de citotoxicidade, em células

de fibroblastos da linhagem 3T3, para os complexos formados com

TTC:β-CD e TTC:HP-β-CD, em comparação com TTC livre.

• Avaliação da atividade biológica dos complexos formados,

através de testes de atividade anestésica em animais, tanto para

TTC:β-CD quanto para TTC:HP-β-CD, comparadas a TTC livre.

22

III) MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Materiais

Para a realização de ensaios de citotoxicidade, utilizou-se células de

fibroblastos da linhagem 3T3. Para ensaios in vivo utilizou-se ratos Wistar,

adultos, machos, pesando entre 350-350 g, obtidos do Biotério da Unicamp.

3.1.1 Reagentes

• Anestésico local: Tetracaína (Sigma Chem. Co.)

• Ciclodextrinas: β-CD (Sigma Chem. Co.) e HP-β-CD (Roquette

Serv. Tech. Lab.)

• Tampão PBS (tampão fosfato 5 mM com 154 mM NaCl), pH 7,4

• MTT – Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-bifenil tetrazólio

(Calbiochem)

• DMEM – Meio Eagle modificado por Dulbeco (Nutricell)

• Antibióticos Penicilina G e Estreptomicina (Cultilab)

• Soro fetal bovino (Cultilab)

• Corante vermelho Neutro (Sigma Chem. Co)

• Formaldeído (Labsynth Ltda.)

• Etanol (Ecibra Reag. Anal.)

• Tiopental Sódico (Thiopentax® Cristália Ind. Quím. Farm.)

3.1.2 Equipamentos

• Liofilizador Labconco-freeze dry system/Freezone

• Espectrofotômetro Beckman DU 70 UV-Vis

• Fluorímetro Hitachi modelo F-4500

• Calorímetro DSC Q100 TA Instruments

• Espectrômetro de RMN Varian INOVA 500

• Espectrômetro de RMN Varian Unity 500

• Placa de cultura de células de 96 poços

• Estufa de CO2 Lab-Line

• Capela de fluxo laminar Veco

• Leitor de placas Spectramax ( Molecular Devices)

23

3.2 Métodos

3.2.1 Espectrofotometria de UV/Vis

3.2.1.1 Princípio do método

A espectroscopia no ultravioleta-visível (UV/Vis) é um método

espectroscópico de análise que visa a utilização de radiação eletromagnética

na faixa de comprimentos de onda na região do visível e ultravioleta próximo.

Nessas faixas de energia as moléculas podem absorver energia fazendo com

que ocorram transições eletrônicas moleculares (Karplus & Porter, 1970).

Neste contexto, a espectrofotometria pode ser utilizada para avaliar

alterações nas propriedades de compostos em solução. Após a inclusão na

cavidade das ciclodextrinas, as moléculas hóspedes (“guest”) podem perceber

a mudança do ambiente químico, refletindo em um deslocamento ou mudança

de intensidade (deslocamentos hipso e bato, hipo ou hipercrômico) no pico de

absorção máxima, de forma similar aos efeitos causados por solventes com

diferentes polaridades. Estas alterações indicam a transferência da molécula

hóspede para a cavidade hidrofóbica das ciclodextrinas (Paavola et al., 1995).

As alterações verificadas se devem a perturbações eletrônicas na

molécula que foi inserida na cavidade da ciclodextrina, sendo causadas pela

interação direta com as ciclodextrinas, pela exclusão de moléculas de água da

cavidade ou pela combinação destes dois efeitos (Dodziuk, 2006).

3.2.1.2 Caracterização da TTC por espectrofotometria de UV/Vis

A fim de avaliar o comprimento de onda máximo da TTC foi preparada

uma solução estoque de TTC 1 mM em tampão PBS 5 mM, pH 7,4. Esta

solução foi posteriormente diluída, utilizando-se o mesmo tampão para a

concentração de 0,04 mM e observado o espectro de absorção desta, na faixa

de 250 nm a 350 nm (espectrofotômetro UV/Vis Beckman DU 70), utilizando-se

uma cela de qurtzo com caminho ótico de 1 cm.

A absortividade molar da TTC foi determinada através dos valores de

absorbância de soluções de concentrações crescentes de TTC, variando de 10

à 40 µM (PBS 5 mM, pH 7,4; λmáx= 309 nm).

Posteriormente, outros espectros da TTC (7,5 µM) foram obtidos (na

faixa de 250 até 350 nm) em meio contendo diferentes proporções de água (ε

=78) /etanol (ε =24,5), a fim de simular o comportamento da TTC em ambientes

24

químicos de diferentes constantes dielétricas (Deyhime et al., 2004). As

proporções água:etanol utilizadas e respectivas constantes dielétricas podem

ser verificadas na Tabela 4.

Tabela 4- Variação das proporções água:etanol e suas respectivas constantes

dielétricas.

3.2.2 Preparo do

O complex

utilizando-se o m

anteriormente (d

foram preparadas

água, na razão

suficiente para q

67,0 20 80 72,8 10 90 78,3 0 100

ε

(constante dielétrica)

etOH

(%) H2O

(%)

- POLAR

+ POLAR

Complexo de Inclusão TTC com β-CD e HP-β-CD

o de inclusão entre a TTC e as ciclodextrinas foi preparado

étodo de co-solubilização, conforme metodologia descrita

e Jesus et al, 2006; Pinto, 2002; Pinto et al, 2005). Neste,

soluções de fármaco e ciclodextrinas (β-CD ou HP-β-CD) em

molar de 1:1, mantidas sob agitação por 12 h (tempo este

ue o sistema atingisse o equilíbrio de complexação) (de

24,3 100 0 28,1 90 10 32,8 80 20

38,0 70 30 43,4 60 40 49,0 50 50 55,0 40 60 61,1 30 70

25

Araújo, 2005a), em temperatura ambiente. Após esta etapa os complexos

foram liofilizados e armazenados em dessecador para posterior utilização.

Misturas físicas foram obtidas adicionando-se TTC e ciclodextrina em

grau, de modo que a razão molar obtida fosse de 1:1. Posteriormente as

substâncias foram misturadas manualmente com a ajuda de um pistilo.

3.2.2.1. Medidas de espectrofotometria UV/Vis para a interação

TTC: ciclodextrinas

Para a avaliação da interação entre a molécula de TTC e ciclodextrinas,

foi observado o efeito das ciclodextrinas no espectro de absorção UV/Vis da

TTC. Para isso, foram preparadas soluções de TTC:β-CD e TTC:HP-β-CD na

proporção de 1:500 ([TTC] = 0,04 mM) em tampão PBS e coletados espectros

de absorção na faixa de 250 nm a 350 nm. Também foi verificado o efeito de

concentrações crescentes de CD nos espectros da molécula de TTC, para isso

foram coletados espectros de absorção TTC:CD nas proporções molares 1:0,

1:1, 1:100, 1:500.

3.2.3 Fluorescência

3.2.3.1. Princípio do método

Fluorescência é um fenômeno que ocorre com alguns compostos

químicos onde a substância, após sofrer um processo de excitação (absorção

de um fóton), apresenta a capacidade de emitir luz (Lackowicz, 1983).

A explicação teórica da fluorescência pressupõe que fótons, quantum de

energia eletromagnética (luz), ao serem absorvidos pela molécula fluorescente,

excitam seus elétrons, fazendo com que saiam do estado fundamental (S0)

para o estado excitado (S1). Esse excesso de energia pode ser liberado através

da emissão de radiação (λ maior que o da radiação incidente). Quando ocorre

retorno do elétron a seu nível energético fundamental, este evento é

acompanhado da emissão de radiação, originando o fenômeno de

fluorescência (Lackowicz, 1983).

Numerosas substâncias apresentam fluorescência, entre elas, muitas

moléculas que possuem em sua estrutura anéis aromáticos. Este fenômeno é

significativamente influenciado pela conjugação destes anéis, produzindo um

sistema com alto grau de conjugação eletrônica (Senesi et al., 1991).

26

Anestésicos locais como a tetracaína (Desai et al 1994), benzocaína (Pinto et

al., 2000) e dibucaína (Louro et al., 1994), entre outros, têm fluorescência

intrínseca significativa.

Assim como medidas de absorção na região do UV-Vis, a fluorescência

nos permite avaliar o efeito da formação do complexo de inclusão de

compostos orgânicos com as CDs, pois a cavidade das moléculas hospedeiras

apresenta uma relativa hidrofobicidade e a inserção do composto hóspede é,

em geral, acompanhada por aumento do rendimento quântico de fluorescência

(Szejtli, 1998).

3.2.3.2. Caracterização da fluorescência da TTC

A fim de avaliar a emissão de fluorescência intrínseca da tetracaína, foi

preparada uma solução estoque de 1 mM de TTC em tampão PBS. Esta

solução foi posteriormente diluída utilizando-se o mesmo tampão, até que fosse

encontrada a concentração ideal do fármaco para leituras em fluorímetro (abs.

ca. 0,1, λexc = 309 nm), de 7,5 µM.

Para avaliar a interferência da polaridade do meio no comprimento de

onda de máxima emissão de fluorescência da molécula de TTC, foi preparada

uma solução com concentração de 7,5 µM e realizadas leituras do fármaco em

meio contendo diferentes proporções de água/etanol, a fim de simular o

comportamento da TTC em ambientes com diferentes constantes dielétricas.

As proporções de água: etanol utilizadas e as constantes dielétricas obtidas

foram as mesmas descritas no item 3.2.1.2, Tabela 4.

O experimento foi feito em fluorímetro Hitachi modelo F-4500, utilizando

uma cela com caminho ótico de 10 mm, a temperatura ambiente.

3.2.3.3. Medidas de fluorescência para medir a interação TTC:CD

Com a finalidade de comparar o comportamento da molécula de TTC

quando em ausência, presença de ciclodextrinas e meio com polaridade similar

ao apresentado por estes carreadores, realizou-se leituras de fluorescência de

TTC (7,5 µM) em água (ε= 78), água:etanol (20:80, v/v) (ε = 32,8) e na

presença de ambas as CDs, na razão molar de 1 TTC para 1000 CDs, a

temperatura ambiente (Deyhimi et al., 2004).

27

Já para avaliação do comportamento de TTC em presença de

concentrações crescentes de ciclodextrina, foram preparadas amostras de TTC

na concentração de 5 µM e adicionadas concentrações de 20, 35 e 50 µM de

CD. Espectros de emissão de fluorescência foram coletados, durante 300”, nas

mesmas condições analíticas descritas no item 3.2.3.2.

3.2.3.3.1. Medidas para determinação da estequiometria dos complexos

TTC: ciclodextrinas

Uma das principais técnicas utilizadas atualmente para determinação da

estequiometria de complexos de inclusão é a solubilidade de fases. Porém a

aplicação deste método, para avaliação dos complexos formados com TTC

pode ser considerada inviável, devido à alta solubilidade apresentada por este

AL na sua forma protonada (> 200 g/L ou 0,67 M) (Miller et al., 1993). Sendo

assim, para determinação da estequiometria apresentada pelos complexos de

inclusão formados entre TTC e β-CD ou TTC e HP-β-CD, foram aplicadas

técnicas de titulação, que permitem o acompanhamento da variação de um

comportamento químico do fármaco, neste caso, a emissão de fluorescência

pela TTC, sensível a formação do complexo de inclusão (Sosnowska, 1997).

Foi preparada uma solução de TTC na concentração de 7,5 µM em

tampão PBS e coletado espectro de emissão de fluorescência desta amostra.

Em seguida, novas análises foram realizadas, adicionando-se concentrações

crescentes de ciclodextrinas e mantendo-se fixa a concentração de TTC. As

leituras de fluorescência foram realizadas nas razões molares de 1:50, 1:100,

1:200 até a razão de 1: 1000 TTC:CD.

Os resultados obtidos foram tratados de acordo com a equação de

Benesi-Hildebrand modificada, conforme descrito na equação 1 (Banerjee et

al, 2004):

CTTC/(F-Fo)=1/[CCD]n (1)

Onde CTTC e CCD representam a concentração analítica de tetracaína e

ciclodextrina respectivamente; F (Fo) representam a intensidade de

fluorescência da TTC em presença (ausência) de ciclodextrina e n é o

coeficiente estequiométrico de complexação. Para tratamento dos dados,

28

utilizou-se a área sob a curva, AUC, ao invés dos valores de intensidade de

fluorescência, ficando a fórmula:

CTTC/(AUC-AUCo)=1/[CCD]n (2)

Para os dois complexos formados, avaliou-se tanto a possibilidade de

apresentarem estequiometria 1:1 quanto 1:2, aplicando-se os respectivos

tratamentos matemáticos.

3.2.4 Calorimetria Diferencial de Varredura

3.2.4.1. Princípio do método

A Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC) mede a diferença dos

fluxos de calor entre uma célula contendo amostra e uma célula de referência

que estão sujeitas a aquecimento/resfriamento incremental constante. O fluxo

de calor corresponde à potência transmitida pelo calorímetro, é medido em

watts (W) ou miliwatts (mW). Se o fluxo de calor ou energia estiver integrado

com relação ao tempo, então uma quantidade de energia será obtida e será

expressa em mWs = mJ. Se a amostra absorve energia, o fenômeno de

variação de energia (entalpia) é denominado endotérmico, enquanto se a

amostra libera energia este corresponde a um processo exotérmico (Verdonck

et al, 1999). Efeitos térmicos caracterizados por mudanças de entalpia em

função da temperatura como fusão, cristalização, transições sólido-sólido e

reações químicas podem ser acompanhadas por DSC.

Análises térmicas como a DSC e a Análise Termogravimétrica, são

muito empregadas para o estudo de complexos de inclusão no estado sólido,